Transcriptie en de Genetische code DNA getranscripteerd tot RNA, 3 grote groepen •
mRNA: codeert voor proteïnen
•
rRNA: onderdeel van de Ribosomen
•
tRNA: koppeling tussen AZ en het mRNA
De informatieflow gaat van DNA → RNA → Polypeptiden → Functionele proteïnen
De genetische code Code wordt gelezen door de ribosomen. Enkele belangrijke punten •
triplet code: basen worden per 3 afgelezen in 5’-3’ richting
•
Ze is niet overlappend en gedegenereerd. Elke base wordt maar in1 triplet gelezen. sommige AZ hebben meerde triplet codes (enkele uitzonderingen hebben wel overlappende genen)
•
De Code is universeel: alle organismen gebruiken dezelfde codons voor dezelfde AZ (sommige organismen hebben 21ste of 22ste aminozuur, uitzonderinkjes)
Meer hierover in het volgende hoofdstuk
Transcriptie Proces waarbij er een 5’-3’ RNA molecule gevormd wordt. Gekatalyseerd door RNA polymerase met 3’-5’ DNA streng als template. Transcriptie begint bij promotor regio, hierop binding van verschillende transcriptie factoren alvorens RNA PM zijn werk doet. Transcriptie in Bacteriële cellen Relatief simpel proces. Eerst de structuur van de promotor regio Het Start punt is meestal Adenine nucleotide. Deze wordt genummerd +1.
Stroomopwaarts hiervan ligt een sequentie nmlk: TATAAT. (Pribnow box)ofwel de -10 sequentie Nog verder stroomopwaarts : TTGAC, de -35sequentie. Deze promotor sequenties kunnen licht verschillen naargelang activiteit en bacterie. Grote verschillen kunnen de promotor activiteit stilleggen. Het RNA polymerase bestaat uit 2 α-subeenheden een β en β’ subeenheid en een σ(sigma) factor dat los kan laten. Het holoenzym(volledig enzym) is nodig om de polymerase te initiëren op de juiste plek. 1. Het RNA PM bind m.b.v. σ-factor aan de promotor regio en ontwind hier het DNA over een lengte van ±18bp 2. 3’-5’ DNA wordt gebruikt als template, vrije basen worden gepaard met rNTP’s (ribonucleoside trifosfaat). Elongatie gelijkaardig aan DNA synthese. Wanneer RNA PM 8 nucleotide ver is laat σ-factor los. 3. Keten groeit in 5’-3’ richting. rNTP’s die worden toegevoegd aan de 3’ zijde. DNA-RNA hybride over lengte van 8 nucleotiden. Incorrecte basen worden verwijdert doordat RNA PM beetje achteruit gaat en de nucleotide zichzelf laat weg katalyseren(autohydrolyse) samen met enkele voorgaande nucleotiden. 4. Het terminatie signaal is ofwel een ρ (rho)-factor ofwel een speciale DNA sequentie. Eerst wordt er een GC rijke regio overgeschreven, deze vormt spontaan een lus die het RNA wegtrekt van het DNA. Daarna komt een U rijke regio die zo losgetrokken wordt door de CG lus. Het RNA is nu los.
Transcriptie bij Eukaryoten RNA polymerasen Eukaryotische transcriptie maakt gebruik van verschillende polymerasen die elks verschillende transcripten maakt.
Promotor Regio’s Verschillen voor elk type polymerase. Sommige bezitten ook downstream of upstram promotor sequences. Promotor voor RNA Polymerase I 2 Onderdelen de Core Promotor en de Upstream promoting elements.
De Core promotor is voldoende voor transcriptie initatie, maar om een efficient transcriptie rate te hebben moet er een upstream control element zijn. Promotoren voor RNA Polymerase II Zijn core promotor kan 4 typen DNA sequenties hebben en komt in 2 typen voor initiator (Inr), TATA box, TFIIB recognition elements(BRE), Downstream Promotor Elements (DPE) TATA-driven promotors: Inr + TATA-box, soms BRE DPE-driven promotors: Inr + DPE
De Core promotor alleen geeft een basale (lage) productie. Voor hogere productie stimulatie van upstream control elements (bv CAAT-box en GC-box). Wanneer deze op 100-200 nucleotiden weg liggen zijn dit proximal control elements. Verder weg worden ze enhancers genoemd. Promotoren voor RNA Polymerase III De Core promotors voor de tRNA en 5s-RNA zijn volledig Downstream, er is nog een derde soort promotor voor kleine RNA moleculen dat wel up stream control elements heeft.
Binding van RNA Polymerase op de Promotor Altijd nood aan transcriptie factors, als voorbeeld RNA PM II 1. TFIID (mutli-subunit complex) bind aan TATA-Box m.b.v. sub-unit TBP (TATA binding protein). TBP kan ook RNA PM I en III promotors binden of de DPE, TATA moet nieteens aanwezig zijn. Enkel de juiste combinatie van sub-units. 2. TFIIA en TFIIB binden naast TFIID, interageren grotendeels onderling 3. Binding van RNA PM II via TFIIF, en de binding van TFIIE en TFIIH leidt tot de vorming van het Preinitiatie complex 4. TFIIH fosforyleert RNA PMII en heliceerd het DNA, waardoor RNA PMII het Preinitiatie complex loslaat en de transcriptie begint. Beëindiging van transcriptie Beëindiging van RNA Polymerase I Proteïne factor herkent 18nucleotide lange terminatie signaal. Beëindiging van RNA Polymerase II RNA transcript wordt gekliefd op bepaalde site voordat transcriptie beëindigd is. Signaal is AAUAAA sequentie. 20-35nct verder klieving. Transcriptie gaat vaak nog honderden tot duizenden nucleotiden door. De klievingsite is aanhechtingspunt voor de poly-A staart. Beëindiging van RNA Polymerase III Terminatie zonder bijkomende eiwitten door korte U-regio. Er wordt echter geen loop gevormd zoals bij bacteriën.
RNA Processing Primair transcript is niet klaar voor gebruik en moet worden geprocessed voordat het matuur is rRNA Maturatie rRNA is meest stabiele en voorkomende RNA in de cellen. 70-80%. rRNA wordt gebruikt in de ribosomen 4 soorten rRNA, 3 ervan voor de grote subeenheid de andere in de kleine. Verschil wordt meestal gemaakt in de sedimentatiegraad coëfficiënt.
28s,18s en 5.8s worden uit 1 transcript geschreven door RNA PM I = Pre-rRNA. Transcribed Spacers tussen rRNA’s bakenen ze af. Mens bezit 150-200 kopies van dit gen. Tussen elk gen nontranscirbed spacer om elk transcriptie unit te scheiden. Maturatie van Pre-rRNA door verwijdering transcribed Spacersen methylering van 2’hydroxyl op de Ribose. Begeleiding door SnoRNA’s (small nucleolar RNA’s). methylering beschermt tegen nucleasen. Maturatie verloopt gelijktijdig met de assemblage. 5s eenheid wordt niet in nucleolus getranscribeert en heeft weinig tot geen assemblage nodig. tRNA (Transfer RNA) brug tussen de AZ en het mRNA. 30 tal verschillende maar allemaal gelijkaardige structuur. 10-20% van RNA’s Het Pre-tRNA ondergaat aantal klievingen en basenparenmodificaties (10-15% wordt gemodificeerd). Een leader sequentie (16nct) en soms een intron worden verwijderd (m.b.v. endonuclease en ligase)
mRNA heterogeneous nuclear RNA (hn RNA) = niet ribosomaal of transfer RNA. →mengeling mRNA en Pre-mRNA. Pre-mRNa: meestal zeer lang, van 2000 tot 20.000 nucleotiden. 5’Cap en poly (A) staart. Beschermingen tegen exonucleasen. 5’Cap is 7-methylguanosine dat met 5’-5’ binding vastgemaakt wordt. zoals gezeg, bescherming tegen exonnucleasen, maar ook belagrijk in positionering mRNA in ribosoom voor translatie initiatie. Poly(A) staart wordt toegevoegd aan het transcript. 50-250 nct. Beinvloed levensduur mRNA (hoe langer de staart, hoe langere levensduur), beschermt ook tegen nucleasen. Wordt herkend door exporterende proteïnen en door de Ribosomen.
Introns Introns zijn sequenties binnen het pre-mRNA die verwijderd worden bij maturatie. Varieren in lengte en hoeveelheid voor elk verschillend mRNA. Hetgene dat uiteindelijk in een proteïne verwerkt wordt zijn de exons die tussen de introns liggen. Het proces van introns verwijderen staat bekend als RNA splicing. Een intron heeft meestal een 5’ GU splice site, een (A) branch point een tiental nucleotiden stroomopwaarts van een 3’ AG splice site. Spliceosoom Het Spliceosoom is een complex van +200 proteïnen dat splicing van sommige introns katalyseerd. Ze worden geassembleerd op small nuclear RiboNucleoProteins (snRNP’s). elks heeft een snRNA bij (small nuclear RNA).
De snRNP met hun snRNA worden genummerd U1 t.e.m. U6 (U4/U6 zijn samen). 1. U1 bind aan 5’ splice site. 2. U2 bind aan het branch point 3. U4/U6 en U5 brengen 5’ splicepoint en branch point samen. Hier vormt zich het ‘volwassen’ spliceosoom ter grote van een ribosoom.
4. Vorming van de Lariat structuur 5. Verwijdering van de intron en verzegeling van de exons met Exon Junction Complex.
SelfSplicing Groep I en Groep I introns kunnen aan zelfsplicing doen (ribozymatische werking) Groep I komt voor in: schimmel mitochondriaal rRNA, planten mitochondriaal en chloroplastisch rRNA en tRNA, nuclear rRNA van protisten tRNA van bacteriën.sommige bacteriofagen hebben mRNA introns. Deze worden verwijderd als lineaire RNA’s. Groep II komt voor in mitochondiraal en chloroplastische genen van protisten, planten en Archaea ,bacterie genomen . Ze verwijderen in Lariat structuur. Hiervan zijn waarschijnlijk de spliceosomen ontstaan.
Alternative Splicing. Het nut van exonen zit in de altenative Splicing, op deze manier kan er uit 1 polypeptide afhankelijk van het aantal introns een groot aantal eiwitten gemaakt worden. Dit verklaart de grote diversiteit aan proteïnen uit een niet substantieel groter genoom. (een exon komt vaak overeen met een proteïnen domein) Dit wordt geregeld met splice enhancers en splice silencers sequenties. Op deze binden zich snoRNA’s en regulatorische proteïnen. Iets anders is het exon shuffelen dat het vormen van nieuwe exoncombinaties mogelijk maakt via recombinatie. Ook kan het duplicatie van exons veroorzaken. RNA editing Posttranscriptionele veranderingen in de nct sequenties van het mRNA. •
Deaminering van C naar U (en vice versa) in mitochondrien en chloroplasten van bloemen.
•
Chemische altering van A naar I (inosine), meestal in niet coderende regios
•
Deleties en inserties van U in trypanosomen geleid door guide-RNA
