Dako LSAB2 System-HRP Kódszám: K0672 15 ml Kódszám: K0673 15 ml Kódszám: K0675 110 ml Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai alkalmazásra. Ez az útmutató a Universal Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System, HRP) termékre vonatkozik. A rendszer a felhasználó által biztosítandó nyúl vagy egér eredető primer antitesttel használható az antigének paraffinba ágyazott szövetekbıl, fagyasztott szövetekbıl vagy sejtpreparátumokból fénymikroszkóppal és immunhisztokémiai módszerekkel történı kvalitatív azonosításához a patológiás folyamatok diagnosztizálását elısegítendı. Többféle fixálószerrel, például etanollal, B-5-tel, Bouin-szerrel, cink-formalinnal vagy semlegesre pufferelt formalinnal kezelt szövetek használhatók fel. Lásd a Dako Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez címő kiadványát, illetve az IHC-eljáráshoz alkalmazott detektálórendszer útmutatóját az alábbiak tekintetében: 1) Az eljárás elve, 2) Szükséges, de nem biztosított anyagok, 3) Tárolás, 4) Minta-elıkészítés, 5) A festési eljárás, 6) Minıség-ellenırzés, 7) Hibaelhárítás, 8) A festés kiértékelése, 9) Általános korlátozások. Összefoglaló és magyarázat Az LSAB2 System, HRP a módosított jelölt avidin-biotin (LAB) technikán alapul, melynek során a biotinilált szekunder antitest a peroxidázzal konjugált streptavidin molekulákkal képez komplexet.1 A beszámolók szerint az LAB/LSAB-módszer az ABC-módszerrel összehasonlítva négyszer-nyolcszor érzékenyebb.2 Giorno, et al,2 a fokozott érzékenységet annak tulajdonítja, hogy az LAB/LSAB-módszer során alkalmazott enzimmel jelölt (strept)avidin komplex mérete kisebb, mint az ABC-módszer avidin-biotin enzim-komplexé. Bármilyen pozitív festıdés illetve a festıdés hiányának klinikai értelmezését megfelelı kontrollokkal végzett morfológiai és hisztológiai vizsgálatokkal kell kiegészíteni. Az értékelést szakembernek kell elvégeznie a páciens klinikai kórtörténetének és a többi diagnosztikus vizsgálat eredményének figyelembevételével. Az eljárás elve Az LSAB2 System, HRP érzékeny és sokoldalú IHC-eljárás, amely lehetıvé teszi számos minta egyidejő, egy órán belüli feldolgozását nyúl vagy egér eredető primer antitestekkel. Az endogén peroxidáz-aktivitás leállítása a minta 3%-os hidrogén-peroxidázzal történı ötperces inkubálásával történik. A mintát ezután jól meghatározott jellemzıkkel rendelkezı és hígított nyúl vagy egér eredető primer antitesttel kell inkubálni, amelyet egymás utáni 10 perces inkubálások követnek biotinilált kötı antitesttel (amely anti-nyúl és anti-egér immunglobulinokat tartalmaz), valamint peroxidázzal jelölt streptavidinnel. A festést a kromogén szubsztráttal (AEC vagy DAB) történı inkubálás után kell elvégezni. Az AEC K0672-ben történı inkubálása esetén a festés 3-amino-9-etilkarbazol (AEC) kromogén szubsztrát készítménnyel végzett 10 perces inkubálást jelent, ami piros csapadékot eredményez az antigén helyén. Az DAB K0673-ban történı inkubálása esetén a festés 3-3'-diaminobenzidin (DAB) kromogén szubsztrát készítménnyel végzett 5-10 perces inkubálást jelent, ami barna csapadékot eredményez az antigén helyén. Biztosított reagensek Kódszám: K0672 A készletben található alábbi anyagok 150 szövetmetszethez elegendık, metszetenként 100 µl-t számolva: Mennyiség 1x15 ml
Leírás Peroxidáz blokkoló 3%-os hidrogén-peroxid vízben.
1x15 ml
Kötı antitest Biotinnal jelölt és affinitás-kromatográfiával izolált kecske eredető anti-nyúl és kecske eredető anti-egér immunglobulinok foszfát-pufferes sóoldatban (PBS). Stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmaz.
1x15 ml
Streptavidin-HRP Torma peroxidázzal konjugált streptavidin PBS oldatban, amely stabilizáló proteint és mikrobaellenes szereket tartalmaz.
1x15 ml
AEC kromogén szubsztrát
AEC N,N-dimetilformamidban (DMF) és acetát-pufferben, 5,0-ös pH-val. Hidrogén-peroxidot, stabilizátorokat, stimulálószereket és egy mikrobaellenes szert tartalmaz. 2–8°C-on tárolandó.
(113271-002)
302289HU_001 p. 1/8 oldal
Kódszám: K0673 A készletben található alábbi anyagok 150 szövetmetszethez elegendık, metszetenként 100 µl-t számolva: Mennyiség
Leírás
1x15 ml
Peroxidáz blokkoló 3%-os hidrogén-peroxid vízben.
1x15 ml
Biotinilált kötı antitest Biotinnal jelölt és affinitás-kromatográfiával izolált kecske eredető anti-nyúl és kecske eredető anti-egér immunglobulinok foszfát-pufferes sóoldatban (PBS). Stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmaz. Streptavidin-HRP
1x15 ml Torma peroxidázzal konjugált streptavidin PBS oldatban, amely stabilizáló proteint és mikrobaellenes szereket tartalmaz. Szubsztrát 1x18 ml 7,5-es pH-jú imidazol-HCl puffer, amely hidrogén-peroxidot és egy mikrobaellenes szert tartalmaz. DAB kromogén 1x1 ml 3,3’-diaminobenzidin kromogén oldatban. Tartozékok 1 1
Kalibrált kémcsı Mőanyag Pasteur pipetta
Kódszám: K0675(11) A készletben található alábbi anyagok 1100 szövetmetszethez elegendık, metszetenként 100 µl-t számolva: Mennyiség 1x110 ml
Leírás Biotinilált kötı antitest Biotinnal jelölt és affinitás-kromatográfiával izolált kecske eredető anti-nyúl és kecske eredető anti-egér immunglobulinok foszfát-pufferes sóoldatban (PBS). Stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmaz.
1x110 ml
Streptavidin-HRP Torma peroxidázzal konjugált streptavidin PBS oldatban, amely stabilizáló proteint és mikrobaellenes szereket tartalmaz.
Kódszám: K0675(89) A készletben, amelyet a Dako Autostainer (kódszám: S3400) termékkel történı használathoz állítottak össze, az alábbi anyagok találhatók: Mennyiség 10x11 ml
Leírás Biotinilált kötı antitest Biotinnal jelölt és affinitás-kromatográfiával izolált kecske eredető anti-nyúl és kecske eredető anti-egér immunglobulinok foszfát-pufferes sóoldatban (PBS). Stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmaz.
10x11 ml
Streptavidin-HRP Torma peroxidázzal konjugált streptavidin PBS oldatban, amely stabilizáló proteint és mikrobaellenes szereket tartalmaz.
(113271-002)
302289HU_001 p. 2/8 oldal
Szükséges, de nem biztosított anyagok Abszorbens törlık Antitestek: N-Series, használatra kész vagy koncentrált antitestek Antibody Diluent (kódszám: S0809 vagy S3022) oldatban hígítva Antibody Diluent (kódszám: S0809 vagy S3022) Kontrollszövetek, pozitív és negatív Kontrasztfesték; vizes alapú, például Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (kódszám: S3309) Fedõlemezek Desztillált víz Szárítókemence, amely képes legfeljebb 60°C-os h ımérséklet fenntartására. Etanol, abszolút és 95%-os Fénymikroszkóp (20x–800x) Rögzítıszer, például Faramount (kódszám: S3025) vagy Glycergel (kódszám: C0563) Negatív kontroll reagensek Tárgylemezek, poli-L-lizin bevonattal vagy Silanized Slides (kódszám: S3003) Festıedények vagy fürdık Stopperóra (2-10 perces idıszakok mérésére alkalmas) Mosópalackok Mosópuffer-oldat Xilol, toluol vagy xilolt helyettesítı anyagok A K0675 LSAB2 rendszerhez (110 ml) a fenti listán kívül a következı reagensek szükségesek: Hidrogén-peroxid 3%-os oldata vagy a Peroxidase Block (kódszám: S2001) Kromogén szubsztrát oldat, például AEC Substrate-Chromogen (kódszám: K3464, 110 ml, használatra kész) vagy Liquid DAB (kódszám: K3466) Nem biztosított, opcionális anyagok Pufferek: Wash buffer (kódszám: S3006) automatizált és manuális használathoz Phosphate buffered saline (kódszám: S3024) Tris-buffered saline (kódszám: S3001 vagy S1968) Proteolítikus enzimek: Pepsin (kódszám: S3002) Proteinase K (kódszám: S3004 vagy S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (kódszám: S3007) Egyebek: Pozitív kontroll metszetek (megrendelhetı a Dakótól) Target Retrieval Solution (kódszám: S1699 vagy S1700) Target Retrieval Solution, High pH (kódszám: S3307 vagy S3308) Target Retrieval Solution, pH 9 (kódszám: S2367 vagy S2368) Párakamra Ammónium-hidroxid, 15 mol/l 0,037 mol/l-re hígítva Óvintézkedések Termékspecifikus óvintézkedések 1. Foglalkozásszerő felhasználóknak. 2. A termék nátrium-azidot (NaN3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz csıvezetékekkel, és ennek során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Kiöntésekor, a fém-azidok vezetékekben történı lerakódását megelızendı, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni.3,4 3. Az AEC és a DAB kromogén szubsztrát érzékeny a különbözı oxidálószerek – például fémek, baktériumok, por és az általánosan elterjedt laboratóriumi üvegedények – által okozott szennyezıdésre. A szennyezıdés és a lejárati idı elıtti minıségromlás elkerülése érdekében ne tegye ki az AEC és a DAB oldatot potenciális szennyezıforrásnak, és soha ne pipettázza közvetlenül a palackból. Öntse ki a kívánt mennyiséget egy tiszta tartályba, és abból pipettázzon. A megmaradt AEC vagy DAB oldatot ne töltse vissza az eredeti tárolóedénybe. 4. A biztosított reagensek hígítása optimális. A további hígítás azt eredményezheti, hogy az antigén nem fog festıdni. Az ilyen jellegő változtatások hatását a felhasználónak kell ellenıriznie. A felhasználó laboratóriumban végzett szövetfeldolgozás és technikai eljárások eltérései jelentısen módosíthatják az eredményeket, ezért belsı kontrollok rendszeres alkalmazására van szükség. 5. A reagenseket ne pótolja más tételekbıl vagy más gyártóktól származó készletekbıl. 6. A megadottaktól eltérı inkubálási idık és hımérsékletek hibás eredményeket adhatnak; az ilyen módosítások hatásait a felhasználónak ellenıriznie kell. 7. Az enzimeket és kromogéneket károsan befolyásolhatja a túlzottan erıs fény. Ne tárolja a készlet komponenseit, és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napsütésben. Általános óvintézkedések 1. Bármely biológiai eredető termékhez hasonlóan a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 2. A reagensek mikrobiális kontaminációját minimalizálni kell, különben hibásak lehetnek az eredmények. 3. Ügyeljen arra, hogy a reagensek ne loccsanjanak ki, és ne képzıdjön aeroszol. 4. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználóknak alaposan ismerniük kell a helyes eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket. 5. Megfelelı személyi védıfelszerelést kell viselni, hogy a termék ne kerüljön a szembe vagy a bırre. A fel nem használt reagenseket a helyi jogszabályoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. 6. Foglalkozásszerő felhasználóknak kérésre biztosítjuk az anyagbiztonsági adatlapot. (113271-002)
302289HU_001 p. 3/8 oldal
A veszélyekre és a biztonságra vonatkozó megjegyzések K0672 - AEC kromogén szubsztrát, használatra kész: 1-<10% N,N-dimetilformamid / veszélyre figyelmeztetı szimbólum: Mérgezı R61 S35 S45 S53
A születendı gyermekre ártalmas lehet. Az anyagot és az edényzetét megfelelı módon ártalmatlanítani kell. Baleset vagy rosszullét esetén azonnal orvoshoz kell fordulni. (Ha lehetséges, a címkét meg kell mutatni.) Kerülni kell az expozíciót – használat elıtt szerezze be a speciális utasításokat. Kizárólag foglalkozásszerő felhasználóknak.
K0673 - DAB kromogén: 1-5%-os bifenil-3,3’,4,4’-tetrailtetraammónium-tetraklorid / veszélyre figyelmeztetı szimbólum: Ártalmas R40 R43 R68 S35 S36/37
A rákkeltõ hatás korlátozott mértékben bizonyított. Bırrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. Maradandó egészségkárosodást okozhat. Az anyagot és az edényzetét megfelelı módon ártalmatlanítani kell. Megfelelı védıruházatot és védıkesztyőt kell viselni.
Tárolás Az LSAB2 System, HRP reagenseit 2–8°C-on kell tárol ni. Nem szabad lefagyasztani. Nem használható a reagens üvegén és a készlet címkéjén feltüntetett lejárati idın túl. Ha a reagenseket a megadottaktól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak a feltételek megfelelıségét ellenıriznie kell.5 Az AEC és a DAB kromogén szubsztrát oldat 8°C-nál m agasabb hımérsékleten lebomlik. Ezért az AEC és DAB kromogén szubsztrát oldatot az ajánlott 2–8°C-os h ımérsékleti tartományban használja és tárolja. Ezek az oldatok a hőtıszekrénybıl kivéve azonnal felhasználhatók. Használat után tárolás céljából az oldatokat a lehetı leggyorsabban tegye vissza a 2–8°C-os h ımérséklető tárolóba. A termék instabilitásának semmilyen nyilvánvaló jele nincs. Ezért a páciens mintáival együtt pozitív és negatív kontrollok vizsgálatát is el kell végezni. Ha olyan nem várt festıdés figyelhetı meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi eljárásokban rejlı eltérésekkel, és a készlet hibája gyanítható, forduljon a Dako Mőszaki Vevıszolgálatához. A reagensek elıkészítése Érdemes a következı reagenseket a festés elıtt elkészíteni. Mosópuffer-oldat TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (kódszám: S3006) az ajánlott mosópuffer automatikus és manuális IHC-vizsgálathoz. A TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (kódszám: S1968) és a PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (kódszám: S3024) is megfelelı mosóoldat manuális festéshez. A nátrium-azidot tartalmazó pufferoldatok használata nem ajánlott. A nátrium-azid inaktiválja a torma peroxidázt (HRP), ami negatív festıdést eredményez. A fel nem használt puffer 2–8°C-on tárolandó. Ha za varos a puffer, öntse ki. A hidrogén-peroxidáz, a kromogén szubsztrát oldat és a kontrasztfesték öblítéséhez desztillált víz használható. Primer antitest A használatra kész N-Series primer antitestek és negatív kontroll reagensek széles választéka áll rendelkezésre az LSAB2 rendszerekhez. A Dako koncentrált antitesteket is kínál, az optimális hígítást azonban a felhasználónak kell kísérleti úton meghatároznia. A hígításokat az Antibody Diluent (kódszám: S0809) termékkel kell végezni, amely 0,05 mol/l 7,2–7,6 pH-jú Tris-HCl puffert, valamint 1% marhaszérum albumint (BSA) tartalmaz. A BSA proteinblokkolóként hat, így szükségtelenné teszi a proteinblokkoló reagenssel történı külön inkubálást. Az Antibody Diluent with Background Reducing Components (kódszám: S3022) szintén alkalmas hígítószerként. Hordozó fehérjét nem tartalmazó hígítószer alkalmazása nem javasolt. Az LSAB2 rendszerekkel használt legtöbb primer antitest esetében 10 perces inkubálás elegendı. Negatív kontroll reagens Ideális esetben a negatív kontroll reagens olyan antitestet tartalmaz, amely a primer antitestével azonos mátrixban/oldatban nem mutat specifikus reaktivitást humán szövetekkel (humán szövetekkel nem reaktív). A humán szövetekkel reaktivitást nem mutató antitestnek ugyanabba az alosztályba kell tartoznia, és ugyanabból az állatfajból kell származnia, mint a primer antitestnek, és a primer antitestével megegyezı immunglobulin-, illetve fehérjekoncentrációra kell hígítani, ugyanazzal a hígítószerrel, mint a primer antitestet. Az alkalmazott primer antitest/antiszérum típusától függıen a primer antitestével azonos fajból származó normál/nem immun szérum a primer antitestével megegyezı hígítószerben és protein-koncentrációra hígítva alkalmas lehet a használatra. A negatív kontroll reagens inkubálási idejének a primer antitest/antiszérum inkubálási idejével kell megegyeznie. A Dako N-Series használatra kész antitestjeinek alkalmazása esetén negatív kontroll reagensként a Universal Negative Control termékek ajánlottak. Ezek a kontrollok egér (kódszám: N1698) vagy nyúl (kódszám: N1699) N-Series használatra kész antitestekhez vannak optimalizálva. Kromogén szubsztrát oldat A K0672 LSAB2 rendszer használatra kész AEC-oldatot tartalmaz, amely készen áll a szövet- vagy sejtmintákon történı alkalmazásra. A K0673 LSAB2 rendszer DAB-oldatot tartalmaz, amelyet a következı módon kell elkészíteni: A szubsztrát pufferhez adagoljon mlenként 1 csepp (vagy 20 µl) DAB kromogén oldatot. A szükséges szubsztrát puffer mennyiségének kiméréséhez használja a mellékelt, beosztással rendelkezı kémcsövet. Jól keverje össze, majd vigye fel az oldatot a mellékelt transzfer-pipetta segítségével. Használat után a beosztással rendelkezı kémcsövet és a pipettát alaposan öblítse el desztillált vízzel. A fel nem használt DAB munkaoldat 2–8°C-on tárolva legfeljebb 2 hétig marad stabil. H a csapadékképzıdés észlelhetı, akkor használat elıtt jól keverje össze. Ready-to-use AEC Substrate-Chromogen Solution (kódszám: K3464, 110 ml) vagy Liquid DAB (kódszám: K3466) használata javasolt az LSAB2 System, HRP, 110 ml (kódszám: K0675) termékhez. A kromogén szubsztrát elkészítése vonatkozásában kérjük, hogy kövesse az egyes kromogén szubsztrát rendszerekhez biztosított útmutatót. (113271-002)
302289HU_001 p. 4/8 oldal
Kontrasztfestés A DAB kromogén alkoholban oldhatatlan végterméket eredményez, ezért használható alkohol alapú hematoxilinnal. Ha az AEC kromogén szubsztrátot használja, akkor a festési reakció színes végtermékeként alkoholban oldható vegyületet fog kapni, ezért ez csak vizes alapú kontrasztfestékekhez, például Mayer’s hematoxilinhez használható. A hematoxilines kontrasztfestés után végezzen alapos öblítést desztillált vízzel, majd merítse a szövetmetszeteket 0,037 mol/l szalmiákszeszt tartalmazó fürdıbe. A 0,037 mol/l-es szalmiákszesz 2,5 ml 15 mol/l-es (koncentrált) ammónium-hidroxid és 1 liter víz összekeverésével készül. A fel nem használt 0,037 mol/l-es szalmiákszesz szobahımérsékleten (20–25°C), szorosan lezárt palackban le gfeljebb 12 hónapig tartható el. Az egyéb kontrasztfestési eljárásokkal kapcsolatosan olvassa el a gyártó által kiadott irányelveket. Rögzítıszer Használatra kész Faramount Aqueous Mounting Medium (kódszáma: S3025) vagy Glycergel Mounting Medium (kódszáma: C0563) ajánlott a vizes rögzítéshez. Felhasználás elıtt körülbelül 40(±5)°C-ra melegítve folyósítsa meg a Glycergel. Minta-elıkészítés Lásd az „Általános utasítások az immunhisztokémiai festésekhez” címő kiadványt illetve az antitest specifikációs lapját. Az IHC-festés elıtt a szöveteket fixálni kell és fel kell dolgozni. A fixálás megakadályozza a kimetszett szövetek autolízisét és putrefactióját, megırzi az antigenicitást, növeli a szöveti alkotóelemek törésmutatóját és a sejtes elemeknek a szövetfeldolgozással szembeni ellenálló képességét. A szövetfeldolgozás dehidratálásból, a dehidratáló szerek eltávolításából, a beágyazó anyag infiltrálásából, a szövet beágyazásából és metszetkészítésbıl áll. Az IHC szövetpreparátumok leggyakoribb fixálószereirıl az „Általános utasítások az immunhisztokémiai festésekhez” címő kiadványban olvashat. A fentiek csak irányelvekként szolgálnak. Az optimális eljárást a felhasználónak kell meghatároznia és ellenıriznie. A festési eljárás Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A felhasználó figyelmesen olvassa el az útmutatót, és ismerkedjen meg a rendszer tartalmával, mielıtt használni kezdené. A rendszerhez biztosított reagenseket és útmutatásokat az optimális teljesítmény eléréséhez igazítottuk. A készlet reagenseinek további hígítása, az inkubálási idı vagy a hımérséklet megváltoztatása hibás eredményekhez vezethet. Az immunfestés elıtt az AEC kromogén szubsztrát kivételével a rendszer valamennyi reagensét hagyni kell szobahımérsékletőre (20–25°C) melegedni. Az összes többi inkubálást ugy ancsak szobahımérsékleten kell végezni. Az AEC kromogén szubsztrát a hőtıszekrénybıl kivéve azonnal felhasználható, és nem kell elıbb szobahımérsékleten tartani. Használat után a tároláshoz tegye vissza a 2–8°C-os tárolóba. A 8°C feletti tárolási hımérséklet kedvezıtlenül hat az AEC kromogén szubsztrát stabilitására. Ne hagyja a metszeteket megszáradni a festési eljárás közben. A megszáradt metszeteken nagyobb mértékő lehet az aspecifikus festıdés. A huzatnak kitett metszeteket takarja le. Ha hosszabb ideig inkubál, helyezze a szöveteket párás környezetbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a kötı antitest inkubálása után (3. lépés) a metszetek szobahımérsékleten (20–25°C) legfeljebb egy óráig a pufferben tarthatók anélkül, hogy ez a festés eredményességét befolyásolná. Az LSAB2 System, HRP érzékenysége tovább növelhetı a 2., 3. és 4. lépésben megadott inkubálási idık 30 ±5 percre növelésével. Festési protokoll 1. LÉPÉS: PEROXIDÁZ-BLOKKOLÁS Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot. Szöszmentes törlıvel (például Kimwipe törlıvel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajta maradt folyadék eltávolítása érdekében, és hogy a reagensek a kijelölt területen maradjanak. Használjon a minta lefedéséhez elegendı peroxidáz blokkoló reagenst. Inkubálja 5 (±1) percig. A mosópalackból folyatva öblítse le óvatosan desztillált vízzel vagy mosópufferrel (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. 2. LÉPÉS: PRIMER ANTITEST VAGY NEGATÍV KONTROLL REAGENS Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és törölje le a metszeteket a fent leírt módon. Elegendı mennyiségő primer antitesttel vagy negatív kontroll reagenssel fedje be a mintát. Inkubálja 10 (±1) percig, illetve az elıírt ideig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan pufferoldattal (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. 3. LÉPÉS: BIOTINILÁLT KÖTİ ANTITEST Ütögetéssel azonnal távolítsa el a felesleges puffert, és törölje le a metszeteket a fent leírt módon. Alkalmazzon a kötı antitest SÁRGA oldatából a minta lefedéséhez elegendı mennyiségő cseppet. Inkubálja 10 (±1) percig. Öblítse le a lemezeket a 2. lépésben leírtak szerint. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a kötı antitest inkubálása után (3. lépés) a metszetek szobahımérsékleten (20-25°C) legfeljebb egy óráig a pufferben tartható k anélkül, hogy ez a festés eredményességét befolyásolná. 4. LÉPÉS: STREPTAVIDIN-HRP Törölje le a lemezeket a fentiek szerint. Alkalmazzon a Streptavidin PIROS oldatából a minta lefedéséhez elegendı mennyiségő cseppet. Inkubálja 10 (±1) percig. Öblítse le a metszeteket, ahogyan az elıbb.
(113271-002)
302289HU_001 p. 5/8 oldal
5. LÉPÉS: KROMOGÉN SZUBSZTRÁT OLDAT Vegye ki az AEC illetve a DAB kromogén szubsztrát oldatot a 2–8°C-os tárolási helyr ıl. A DAB oldat elıkészítése vonatkozásában lásd „A reagensek elıkészítése” címő részt. Törölje le a lemezeket a fentiek szerint. Alkalmazzon a minta fedéséhez elegendı mennyiségő AEC illetve DAB kromogén szubsztrát oldatot. Tegye vissza az AEC illetve a DAB kromogén szubsztrát oldatot a hőtıbe. Inkubálja az AEC oldat esetében 10 (±1) percig, míg a DAB oldat esetében 5–10 percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan desztillált vízzel (ne öntse közvetlenül a szövetre). A visszamaradó AEC illetve DAB kromogén szubsztrát oldatot a megfelelı hulladékkezelésig győjtse veszélyes anyagok számára kialakított tartályban. 6. LÉPÉS: HEMATOXILINES KONTRASZTFESTÉS (OPCIONÁLIS) Merítse a metszeteket hematoxilin-fürdıbe. A használt hematoxilin erısségétıl függıen inkubálja kettı-öt (2–5) percig. Desztillált vizet tartalmazó fürdıben óvatosan öblítse le. Mártsa a metszeteket 10-szer 0,037 mol/l-es szalmiákszesz fürdıbe (opcionális). Desztillált vagy ionmentesített víz fürdıjében öblítse a metszeteket kettı-öt (2–5) percig. 7. LÉPÉS: RÖGZÍTÉS A minták vizes alapú rögzítıszerrel, például Faramount (kód: S3025) vagy Glycergel (kód: C0563) termékkel rögzíthetık, majd fedılemezzel lefedhetık. Megjegyzés: Az AEC reakcióterméke szerves oldószerekben oldódik, ezért nem használható együtt toluol vagy xilol alapú tartós rögzítıszerekkel. Megjegyzés: DAB oldat használata esetén bármilyen tartós rögzítıszer használható. Megjegyzés: A metszetek bármikor kiértékelhetıek. Némi fakulás azonban bekövetkezhet, ha a metszeteket egy hétnél hosszabb ideig erıs fény éri. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a metszeteket sötét helyen, szobahımérsékleten (20–25°C) tárolja. Minõség-ellenõrzés A felhasználó laboratóriumban végzett szövetfeldolgozásban és technikai eljárásokban rejlı eltérések jelentısen módosíthatják az eredményeket, ezért belsı kontrollok rendszeres alkalmazására van szükség. További információkat a College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry minıség-ellenırzési irányelveiben és az irodalomjegyzék 6–8. számú publikációiban olvashat. Az érzékenységgel és az immunreaktivitással kapcsolatban lásd az egyes primer antitestek terméktájékoztatóját. A pozitív és negatív kontrollokkal kapcsolatos további tudnivalókat lásd az „Általános utasítások az immunhisztokémiai festésekhez” címő kiadványban. A festés kiértékelése A kiértékeléssel kapcsolatos irányelveket lásd az „Általános utasítások az immunhisztokémiai festéshez” címő kiadványban. Általános korlátozások Az általános korlátozásokkal kapcsolatban lásd az „Általános utasítások az immunhisztokémiai festésekhez” címő kiadványt. Termékspecifikus korlátozások A Dako az LSAB2 rendszer reagenseit optimális hígításban biztosítja az IHC-ra vonatkozó, mellékelt útmutatásoknak megfelelıen, paraffinba ágyazott vagy fagyasztott metszeteken, illetve vérkeneteken történı használathoz. A javasolt vizsgálati eljárástól történı bármilyen eltérés esetében érvénytelenné válhatnak a megadott várt eredmények; ezért megfelelı kontrollokat kell alkalmazni, és az eredményeket dokumentálni kell. Azoknak a felhasználóknak, akik eltérnek a vizsgálati eljárás ajánlott menetétıl, vállalniuk kell a felelısséget a betegek eredményeinek eltérı körülmények között történı kiértékeléséért. Endogén avidin-kötı aktivitást (EABA) figyeltek meg fagyasztott máj- (teljes májdaganat) és vesemetszetekben (tubularis epithelium), valamint fagyasztott és formalinban fixált lymphoid szövetekben (paracorticalis histiocyták).9-12 Az EABA gátolható a festés elıtti egymást követı, 20 perces inkubálásokkal – elıször 0,1%-os avidinnel, majd 0,01%-os biotinnal 7,2–7,6-es pH-jú, 0,05 M-os Tris-HCl pufferben való inkubálással –, illetve a Biotin Blocking System (kódszám: X0590) alkalmazásával. Endogén peroxidáz vagy pszeudoperoxidáz aktivitás mutatható ki a hemoproteinekben, például a hemoglobinban, a mioglobinban, a citokrómban és a katalázban, valamint az eozinofil granulocitákban.13,14 Formalinban fixált szövetekben ez az aktivitás gátolható a primer antitest alkalmazása elıtt a minták ötperces, 3%-os hidrogén-peroxid oldatban történı inkubálásával. A vér- és csontvelı-kenetek illetve a fagyasztott szövetek szintén kezelhetık a Peroxidase Blocking Reagent (kódszám: S2001) termékkel. Ezzel az eljárással azonban a hemoproteinek vörösesbarna pigmentje nem tüntethetı el. Az eljáráshoz választható a metanol-hidrogén-peroxid oldat használata is. Ebben az esetben bizonyos antigének denaturálódhatnak az eljárás során. A reagensek elızıleg nem vizsgált szöveteken nem várt reakciókat mutathatnak. Az antigének neoplazmákban és más patológiás szövetekben való expressziójának biológiai változékonysága következtében a váratlan reakciókat még a tesztelt szövetcsoportokban sem lehet teljesen kizárni.8 A dokumentált váratlan reakciókkal forduljon a Dako Mőszaki Szolgálatához. Hepatitis B vírussal fertızött és a hepatitis B felületi antigént (HBsAg) hordozó személyektıl származó szövetek aspecifikus festıdést mutathatnak torma peroxidázzal.15
(113271-002)
302289HU_001 p. 6/8 oldal
Hibakeresés Probléma 1. Egyik lemez sem festıdik.
2.
3.
A metszetek festıdése halvány.
Nagymértékő háttérfestıdés mindegyik metszeten, a negatív kontroll metszeteken is.
Valószínő ok 1a. A reagenseket nem a megfelelı sorrendben alkalmazta. 1b. Nátrium-azid van a pufferfürdıben. 1c. A kromogén szubsztrátot nem jól keverte össze. 2a. A metszeteken túl sok oldat marad a mosófürdı után. 2b. Nem inkubálta elég ideig a metszeteket a reagensekkel. 2c. Inkompatíbilis kontrasztfesték vagy rögzítıszer használata, ami feloldja reakcióterméket. 3a. A mintákban nagy az endogén peroxidáz aktivitás.
3b. A paraffin nincs teljesen eltávolítva. 3c. A metszetek nem lettek alaposan leöblítve. 3d. A normálisnál gyorsabb szubsztrátreakció a helyiség túl magas hımérséklete miatt. 3e. A metszetek megszáradtak a festési eljárás alatt. 3f. A reagensek aspecifikus kötıdése a szövetmetszethez.
4.
A szövet leválik a tárgylemezrıl.
3g. A primer antitest túl koncentrált. 4a. Nem megfelelı tárgylemezt használ.
5.
Túlságosan erıs specifikus festés.
5a. A primer antitest túl koncentrált. 5b. Túl hosszas inkubálás a primer antitesttel, a biotinilált kötı antitesttel vagy a streptavidin-HRP-vel.
Javasolt teendı 1a. Ellenırizze a reagensek használatát.
1b. Használjon friss, azidmentes puffert. 1c. Készítsen új kromogén szubsztrát oldatot a készlethez mellékelt protokoll szerint. 2a. Finom ütögetéssel távolítsa el a felesleges oldatot, mielıtt a metszetet körbetörli. 2b. Ellenırizze az ajánlott inkubálási idıket. 2c. Az AEC oldat alkalmazásával készített immunfestett metszetekhez csak vizes alapú kontrasztfestéket és rögzítıszert használjon.
3a. Inkubálja a metszeteket friss hidrogénperoxiddal.
3b. Használjon friss xilol- vagy toluolfürdıt. 3c. Használjon friss oldatokat a pufferfürdıkben és a mosófürdıkben. 3d. A kromogén szubsztrát oldatnál alkalmazzon rövidebb inkubációs idıt.
3e. Használjon párakamrát. A reagens alkalmazása elıtt egyszerre csak három-négy metszetet töröljön le. 3f. Használjon Dako antitest hígítószert, vagy adjon 1% BSA oldatot az antitest hígítószerhez. A másik lehetıség 0,3 mol/l NaCl-ot tartalmazó 0,05 mol/l Tris és 0,1% Tween 20, 7,2-7,6 pH-jú oldat (kódszám: S3306) használata mosópufferként. Külön proteinblokkoló reagenssel (kódszám: X0909) történı inkubálásra is szükség lehet a primer antitest alkalmazása elıtt. 3g. Hígítsa jobban a primer antitestet. 4a. A legtöbb festési eljáráshoz használjon poli-L-lizin tárgylemezeket. Olyan primer antitesteknél, amelyeknél antigén-feltárás szükséges, használja a Silanized Slides tárgylemezeket. 5a. Készítsen a primer antitestbıl hígítási sort az optimális hígítási arány meghatározásához. 5b. Határozza meg az antitesthez a megfelelı festési protokollt, vagyis a primer antitesttel, a biotinilált kötı antitesttel, illetve a streptavidin-HRPvel történı inkubálás hosszát.
Megjegyzés: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Mőszaki Szolgálatát. A festési technikákkal és a minta elıkészítésével kapcsolatban további tudnivalók olvashatók a következı kiadványokban: Handbook -Immunochemical Staining Methods10 (kapható a DakoCytomationnél), Atlas of Immunohistology16 és ImmunoperoxidaseTechniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.17
(113271-002)
302289HU_001 p. 7/8 oldal
Irodalomjegyzék 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979;27(8):1131-9 2. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984;2(3):161-6 3. Center for Disease Control Manual Guide – Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, 1976 4. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 5. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, 1992 6. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe S, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Amer J Clin Pathol 1989;92(6):836-43 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991;66(4):194-9 9. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981:81 10. Key M (ed). Immunohistochemical Staining Methods. 4th Edition. Dako 2006 11. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981;29(10):1196-204 12. Banerjee D, Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37(2):223-5 13. Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2):213-20 14. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1990; 46 15. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73(5):626-32 16. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press 1986 17. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCP Press 1986
Kiadás: 05/07
(113271-002)
302289HU_001 p. 8/8 oldal
