Stanovení aktivity alkalické fosfatázy v séru (ALP) ÚVOD Alkalická fosfatáza (ALP, alkalická fosfohydroláza monoesterů kyseliny fosforečné) je označení pro skupinu relativně nespecifických membránově vázaných enzymů, které při alkalickém pH hydrolyticky štěpí řadu esterů kyseliny fosforečné. pH optimum ALP je asi 10,5. 2-
R-O-PO3 + akceptor → R – OH + akceptor – PO3
2-
ALP se vyskytuje v játrech, kostech, střevě, ledvinách a placentě. Z tohoto jsou rozlišovány 3 hlavní izoenzymy: placentární, střevní a tkánově nespecifický (zahrnující tzv. kostní, jaterní a ledvinnou izoformu, tj. enzymy lišící se pouze posttranslační modifikací, na rozdíl od izoenzymů jsou kódovány stejným genem). V séru zdravých jedinců je celková aktivita ALP podmíněna především aktivitou jaterního (vysokou aktivitu má ALP ve žluči resp. její jaterní izoenzym) a kostního izoenzymu. Pomocí těchto izoenzymů specifikujeme diagnózu, protože oba se nachází v krvi. ALP jaterního původu pochází z cytoplasmatické membrány hepatocytů přivrácené do žlučových cest. ALP se nevyskytuje v erytrocytech a v trombocytech. Funkce ALP ● v játrech v transportních procesech 2+ ● v kostech → v kostní architektuře se podílí na zabudovávání Ca (je součástí membrány osteoblastů) 2+ ● ve střevě se podílí na přenosu mastných kyselin a absorpci Ca Aktivita enzymu Aktivita ALP se mění během života. Kostní izoenzym má vyšší aktivitu u dětí do 1 roku věku, pak postupně klesá, v pubertě při růstu kostí je aktivita vyšší, po ukončení růstu kostí opět klesá a zůstává na nízké úrovni - viz. tab. 1. Zvýšená aktivita kostního izoenzymu je způsobena zvýšenou činností osteoblastů. Při stanovení ALP musíme proto znát věk pacienta. Poločas rozpadu je 3 – 5 dní, který se liší u jednotlivých izoenzymů. Tab. 1: Přehled aktivit celkové ALP v séru v závislosti na věku člověka. věk do 6 týdnů do 1 roku do 10 let do 15 let nad 15 let
aktivita v séru (µkat/l) 1,20 – 6,30 1,40 – 8,00 1,12 – 6,20 1,35 – 7,50 0,66 – 2,20
Aktivita kostního izoenzymu ALP v séru ve věkové kategorii nad 15 let je 0,1 – 1,6 µkat/l. POZN. Hodnoty aktivit celkové ALP a kostního izoenzymu byly převzaty z Národního číselníku laboratorních položek - NČLP na CD-ROM MZČR. Rozlišení forem izoenzymů Každý izoenzym má svou charakteristickou pohyblivost při elektroforéze. Nejčastěji se používá elektroforéza na acetátcelulózových gelech, jejímž výsledkem je separace jaterního, kostního a střevního izoenzymu. U těhotných žen počínaje 16. týdnem se zvyšuje izoenzym placentární, který je termostabilní. Proto k rozdělení izoenzymů lze o použít i tepelnou inaktivaci. Zahřátím na 56 C po dobu 15 min se zcela inaktivuje kostní izoenzym. Ale je možno i použít imunochemické metody pro stanovení izoenzymů ALP. Klinický význam ALP Stanovení aktivity v séru se využívá hlavně k posouzení kostních a hepatobiliárních onemocnění. Zvýšená aktivita ALP je pozorována při: ● hepatitidách (virová, chronická, toxická alkoholová) ● obecně při chorobách jater (alkoholici), obstrukce žlučových cest např. nádorem, cirhóza jater, nádory jater (hepatom), mononukleóza ● kostních nádorech (resp. metastázy primárního nádoru z kostních buněk), osteosarkom ● při frakturách kostí Stanovení aktivity ALP je součástí tzv. obecného biochemického souboru jater a žlučových cest (screeningový test), jehož součástí je stanovení aktivit dalších enzymů: ALT, AST, GMT a bilirubinu. ALP se stanovuje také při onkologickém souboru vyšetření, dále také pro zjištění kostního metabolismu - stanovení kostního izoenzymu ALP.
1
Literatura: Masopust, J.: Klinická biochemie: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření I a II. díl, Univerzita Karlova, Karolinum, Praha, 1998 ISBN 80-7184-649-3
POUŽITÁ ANALYTICKÁ METODA Spektrofotometrie je analytická metoda založená na interakci elektromagnetického záření s analyzovaným roztokem. Část záření je pohlcena (absorbována) analyzovanou látkou, zbývající záření, které analyzovaným roztokem projde, je detekováno detektorem. Intenzita záření po průchodu vzorkem (I) je menší než původní intenzita záření (I0) do vzorku vstupující: I < I0. Množství pohlceného záření závisí na množství analyzované látky ve vzorku: čím vyšší je koncentrace dané látky, tím více záření je pohlceno. Mnoho látek přítomných v biologických tekutinách (hlavně krvi a moči) je v klinických laboratořích analyzováno spektrofotometricky, používané přístroje se nazývají spektrofotometry. Schéma spektrofotometru:
I
I0
zdroj
čočka štěrbina monochromátor
vzorek v kyvetě
detektor
Pro spektrofotometrickou analýzu barevných roztoků se používá elektomagnetické záření v oblasti viditelného světla (VIS, λ = 400 - 800 nm), zdrojem světla je žárovka. Dále je časté použití ultrafialového záření (UV, λ = 190 - 400 nm), kterým můžeme analyzovat i roztoky bezbarvé, zdrojem světla bývá nejčastěji deuteriová výbojka. Každá látka absorbuje záření určité vlnové délky (obsahuje tzv. chromofory schopné toto záření pohltit). Záření určité vlnové délky se označuje jako monochromatické. Získá se rozkladem polychromatického záření (u VIS jde o rozklad bílého světla emitovaného žárovkou) pomocí optické mřížky nebo hranolu. Vhodným nastavením štěrbiny za monochromátorem vstupuje do kyvety jen záření o určité vlnové délce, ostatní vlnové délky se odrážejí pod jiným úhlem. Podle oblasti elektromagnetického záření se volí použité kyvety: skleněné pro VIS, křemenné pro UV oblast (UV záření je sklem pohlcováno); v současné době se používají i speciální plastové kyvety.
Doplňkové barvy viditelného světla (viz. také Obr.1): Pokud roztok absorbuje určitou vlnovou délku viditelného spektra (viz. prostřední sloupec tabulky), jeví se nám tento roztok jako barevný. Ostatní vlnové délky roztokem projdou, avšak pozorované zbarvení roztoku je dáno tzv. doplňkovou (komplementární) barvou k barvě pohlcené (viz. sloupec vpravo):
vlnová délka (nm)
absorbovaná část VIS spektra
komplementární - propuštěná barva (= určuje zbarvení roztoku )
350 - 430
fialová
žlutá
430 - 475
modrá
žlutooranžová
475 - 495
zelenomodrá
oranžová
495 - 505
modrozelená
červenooranžová
505 - 555
zelená
červená
2
555 - 575
žlutozelená
purpurová
575 - 600
žlutá
fialová
600 - 650
oranžová
modrá
650 - 700
červená
zelená
Příklady: •
pokud roztok absorbuje záření mezi 400 a 480 nm (modrofialová), bude propouštět všechny ostatní barvy, které budou okem vnímány jako barva žlutooranžová; znamená to, že žlutooranžová barva je komplementární k barvě modrofialové
•
pokud necháme procházet bílé světlo roztokem, který absorbuje záření mezi 505 a 555 nm (zelená), propuštěné záření a tudíž i zbarvení roztoku budou vnímány v barvě červené; původní bílé světlo obsahovalo všechny vlnové délky VIS v určitém poměru, tento poměr byl průchodem světla roztokem narušen a světlo tudíž změnilo barvu
•
pokud necháme procházet červeným roztokem červené světlo, bude toto záření propuštěno, neboť červený roztok červené záření neabsorbuje; naopak zelené záření (zelená je komplementární k červené) bude při průchodu červeným roztokem pohlcováno
Obr.1 Komplementární barvy se nacházejí v kolečku naproti sobě Z uvedeného vyplývá, že pro spektrofotometrické stanovení musíme vybrat takovou vlnovou délku, která bude analyzovanou látkou nejvíce pohlcována. Optimální je, pokud je tato vlnová délka současně co nejméně pohlcována ostatními látkami přítomnými v roztoku. Vhodná vlnová délka se zjišťuje před vlastní spektrofotometrickou analýzou: proměří se tzv. absorpční spektrum jako závislost schopnosti absorbovat záření různých, kontinuálně měněných vlnových délek (viz. Obr.2). Pro vlastní analýzu se vybírá vlnová délka, která je analyzovanou látkou nejvíce pohlcována.
Obr.2 Příklad absorpčního spektra analyzované látky: maximální absorbce byla nalezena kolem 500 nm
3
Princip spektrofotometrie: Při spektrofotometrii vycházíme z Lambert-Beerova zákona, který vyjadřuje vztah mezi koncentrací látky v roztoku a její absorbancí, tj. schopností molekul látky pohlcovat elektromagnetické záření o dané vlnové délce. Při průchodu světelného toku roztokem tak dochází k jeho zeslabení, protože částice látek přítomných v roztoku část elektromagnetického záření pohltí (absorbují). Záření, které projde kyvetou dopadá na detektor, který měří jeho intenzitu. Z tohoto důvodu je zavedena veličina zvaná transmitance (propustnost), která je definována vztahem: T = I / I0 kde I0 = intenzita záření vstupujícího do kyvety; I = intenzita záření po průchodu kyvetou; transmitance (T) nabývá hodnot 0 až 1:nulovou hodnotu má pokud je veškeré záření pohlceno, hodnotu 1 naopak tehdy, pokud kyvetou veškeré záření projde Někdy se transmitance vyjadřuje v procentech: T = (I / I0) x 100
tj. nabývá hodnot 0 až 100 %
Množství absorbovaného záření lze vypočítat z hodnoty transmitance: A = - log T
= log (1/T)
-A
T = 10
⇒
Veličina A se nazývá absorbace a je definována jako záporně vzatý dekadický logaritmus transmitance. Nabývá hodnot od nuly výše, většinou měříme v rozmezí 0 až 1,5 (nebo méně). Vyšší hodnoty absorbance již bývají málo přesné, měření vždy závisí na citlivosti detektoru (neboť např. A = 2 odpovídá T = 0,01, tj. pouze jedno procento z původní intenzity záření dopadlo na detektor; pro A = 3 je T = 0,001, tj. na detektor dopadá jen 0,1 % z původní intenzity záření).
Lambert-Beerův zákon:
A=c.l.e
-c.l.e
T = 10
nebo
A = absorbance; c = molární koncentrace; l = délka kyvety, resp. tloušťka vrstvy roztoku, kterou prochází záření; e = molární absorpční koeficient (tabelovaná hodnota); T = transmitance; Lambert-Beerův zákon platí pro -2 -1 monochromatické záření a obor nízkých koncentrací, řádově menších než 10 mol . l . Z Lambert-Beerova zákona vyplývá, že čím je koncentrace látky v roztoku vyšší, tím je vyšší hodnota naměřené absorbance (tj. absorbance je přímo úměrná koncentraci a naopak). Tato závislost je lineární, neboť LambertBeerův zákon připomíná rovnici přímky (A = c . l . e → y = kx + q, kde x odpovídá hodnotě c, hodnota l.e odpovídá k, tj. směrnici přímky; q = 0, tj. závislost absorbance na koncentraci prochází počátkem), viz. Obr.3 U barevných roztoků naměříme ve viditelném spektru tím větší absorbanci, čím větší je jejich intenzita zbarvení (= tmavší, koncentrovanější roztok).
Kalibrační křivka 0,9 0,8
a b so rb a n ce A
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
koncentrace c (mol/l)
Obr.3 Závislost absorbance na koncentraci Transmitance (propustnost) je nepřímo úměrná koncentraci: čím vyšší je koncentrace látky, tím méně záření vzorek propustí, tj. méně záření projde kyvetou ⇒ méně záření dopadne na detektor. Mezi koncentrací a -c.l.e transmitancí je exponenciální závislost (T = 10 ).
4
Aby bylo možno určit koncentraci stanovované látky je nejprve nutné proměřit a sestrojit kalibrační křivku. Kalibrační křivka (Obr.4) pro fotometrická stanovení je grafické znázornění závislosti absorbance roztoku na koncentraci v něm přítomné stanovované látky. Křivku lze zpracovat na počítači, nebo použít ruční zpracování pomocí milimetrového papíru. Pro sestrojení kalibrační křivky používáme tzv. standardní roztoky stanovované látky (tzv. kalibrační roztoky). Standardním roztokem se rozumí roztok látky o známém složení a koncentraci. V praxi se používají minimálně tři, raději však více, standardní roztoky o různé koncentraci. Lze je nejlépe připravit naředěním koncentrovaného, tzv. zásobního roztoku standardu na několik nižších koncentrací. Rozmezí koncentrací by mělo být tak široké, aby se výsledky analýzy vzorků o neznámé koncentraci vešly mezi nejnižší a nejvyšší hodnotu kalibrační křivky. Pokud je koncentrace analyzované látky vysoká, je nutno vzorek před analýzou naředit destilovanou vodou. Výsledek koncentrace odečtený z kalibrační křivky je potom nutné vynásobit faktorem ředění, abychom získali skutečnou koncentraci této látky v nenaředěném vzorku (např. při naředění vzorku 1:100 násobíme výsledek 100x) Vynesením naměřených hodnot absorbancí standardních roztoků (osa y) proti jejich koncentracím (osa x) získáme lineární závislost mezi absorbancí a koncentrací (viz. Lambert-Beerův zákon). Při sestrojování kalibrační křivky nepropojujeme jednotlivé body přímo, ale proložíme jimi přímku procházející co nejblíže všem bodům. Kalibrační přímka by měla procházet také nulou (průsečíkem os x a y). Standardní roztoky je vhodné zpracovávat současně se vzorky o neznámých koncentracích, aby byly zachovány stejné podmínky analýzy, včetně případných nepřesností, např. při pipetování. Po proměření absorbancí standardních roztoků i neznámých vzorků a sestrojení kalibrační křivky vyneseme do kalibrační křivky naměřenou hodnotu absorbance neznámých vzorků. Spuštěním kolmice od bodu, kde hodnota absorbance odpovídá bodu na kalibrační křivce odečteme na ose x hodnotu koncentrace látky v analyzovaném vzorku.
Obr.4 Kalibrační křivka (x = neznámý vzorek, A = absorbance, c = koncentrace) Absorbanci měříme proti tzv. slepému vzorku (= slepý pokus, blank). Jedná se o roztok obsahující stejné množství všech přidaných činidel jako obsahuje analyzovaný vzorek (standard nebo vzorek o neznámé koncentraci), avšak s výjimkou vlastní stanovované látky. Pipetovaný objem stanovované látky (standardu nebo moči) nahradíme ve slepém pokusu stejným objemem destilované vody. Výraz „měříme proti slepému pokusu“ znamená, že fotometr před vlastním měřením absorbancí vynulujeme na slepý pokus: do kyvety nalijeme tento roztok a naměřenou absorbanci položíme rovnou nule. Při měření absorbancí standardních roztoků i vzorků o neznámé koncentraci tak bude automaticky odečtena případná „absorbance pozadí“, která není dána absorpcí záření analyzovanou látkou (v některých případech mohou totiž dané monochromatické záření absorbovat i přidaná činidla, což by bez použití slepého pokusu způsobilo naměření falešně vyšší absorbance a tím i falešně vyšší hodnotu zjištěné koncentrace). V praxi se většinou fotometr nejprve vynuluje na vodu (bezbarvá kapalina, samotné rozpouštědlo, s absorbancí = 0). Po té se do kyvety nalije slepý pokus, naměřená hodnota absorbance se zapíše (pro kontrolu, při příštím měření bychom při správné přípravě reakční směsi měli získat stejnou absorbanci) a fotometr se pak opět vynuluje. Pokud je fotometr vynulován pouze na vodu, je pak třeba od každé naměřené absorbance standardu či vzorku hodnotu absorbance slepého pokusu odečíst samostatně. Teprve tehdy je zajištěno, že při měření vzorků odpovídá absorbance pouze stanovované látce. Hodnota absorbance, a tudíž i výsledná koncentrace, nebude pak zkreslena jinou látkou, která je součástí roztoku. Výsledná hodnota kvantitativního stanovení (= zjišťujeme koncentraci, tj. kvantitu) závisí na přesnosti a pečlivosti při zpracování. Přidání pouze „přibližného“ množství činidla, nepřesné pipetování vzorků, nesprávná práce s fotometrem (nepřesné vynulování, špinavé kyvety, zbytky koncentrovanějšího roztoku v kyvetě při měření roztoků méně koncentrovaných, naředění vzorků vodou, která zůstala v kyvetě po proplachování) - to vše vede k získání nepřesných výsledků.
5
Spektrofotometrická metoda používaná v praktiku Alkalická fosfatáza (ALP) se stanovuje v séru nebo v heparinové plazmě. Substrátem je p-nitrofenylfosfát, který je v N-methyl-D-glukaminovém pufru štěpen na 4-nitrofenol a fosfát. Mírou aktivity enzymu je množství uvolněného 4nitrofenolu, který se stanovuje fotometricky (žluté zbarvení, Amax = 405 nm) po zastavení enzymové reakce inhibitorem (NaOH). Aktivita enzymu vztažená na 1 litr vzorku se označuje jako „katalytická koncentrace“ (µkat/L). ALP 4-nitrofenylfosfát (bezbarvý) + H2O → fosfát + 4-nitrofenol (žlutý) Kostní izoenzym ALP je termolabilní a jeho aktivitu lze získat z rozdílu aktivit před a po tepelné inaktivaci ALP ve vzorku séra.
POŽADOVANÉ ZNALOSTI Struktura, vlastnosti a funkce enzymů, základy enzymové kinetiky, aktivita enzymů - její ovlivnění a jednotky, izoenzymy, vztah mezi enzymy a jejich orgánovou lokalizací, využití stanovení aktivity enzymů v medicíně, princip spektrofotometrie
POSTUP ANALÝZY V praktickém cvičení se stanovuje aktivita celkové ALP a jejího kostního izoenzymu v séru Lyonorm (kontrolní sérum). Vybavení: vodní lázeň, plovoucí stojánek, Eppendorfky (umělohmotné zkumavky s víčkem), zkumavky + stojánek, pipeta, spektrofotometr, sáček na odpadky, buničina Chemikálie: • pufr o pH = 10,4 (= činidlo 2) • substrát pro enzym (= činidlo 1) • zastavovací roztok (70 mM NaOH) • sérum Lyonorm
Postup: A) Inaktivace kostního izoenzymu teplem Sérum Lyonorm obsahuje celkovou ALP tzn. všechny izoformy. Označte si Eppendorfku lihovou fixou a napipetujte do ní 0,2 ml séra Lyonorm. Zkumavku uzavřete víčkem a o umístěte jí do plovoucího stojánku ve vodní lázni. Sérum nechte inkubovat v lázni při 56 C po dobu 15 minut. Teplem se inaktivuje kostní izoenzym ALP a získáte tedy 0,2 ml inaktivovaného séra. B) Stanovení aktivity ALP 1. sérum inaktivované teplem a zbytek séra, které nebylo inaktivováno (= nativní sérum), zpracujte dle následujícího postupu: 1 2 3 4 5 zkumavka č. 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl pipetujte:
H2O (slepý pokus)
nativní sérum
nativní sérum
(celk. ALP)
(celk. ALP)
inaktiv. sérum (ALP bez kost. iz.)
inaktiv. sérum (ALP bez kost. iz.)
2. do každé zkumavky přidejte 200 µl pufru (= činidlo 2) a 200 µl H2O, promíchejte o 3. inkubujte zkumavky 3 minuty ve vodní lázni při 30 C 4. do každé zkumavky přidejte 50 µl substrátu. Z lázně vždy vyjměte jen jednu zkumavku, přidejte do ní substrát, ihned promíchejte a umístěte zpět do lázně. Je třeba dodržet přibližně stejný inkubační čas všech vzorků. o 5. po přidání substrátu nechte inkubovat při 30 C přesně 15 minut (= čas pro proběhnutí enzymové reakce).
6
6. inkubaci ukončete přidáním 2 ml 70 mM NaOH, který zastaví probíhající reakci. Reakční směs promíchejte. 7. při 405 nm změřte absorbance všech vzorků proti slepému pokusu 8. zbytky roztoků ze zkumavek vylijte do láhve s biologickým odpadem (vedle fotometru) a zkumavky dejte do nádoby s dezinfekčním roztokem (označený kbelík)
Úkoly: Vypočítejte celkovou aktivitu ALP a aktivitu kostního izoenzymu ALP v séru. K výpočtu použijte následující podklady: V oblasti platnosti Lambertova-Beerova zákona byla naměřena absorbance séra o známé aktivitě ALP. Stanovení bylo provedeno za stejných podmínek jako ve výše uvedené metodě. Toto sérum o celkové aktivitě ALP 3,96 µkat/l mělo absorbanci 0,970. Využijte znalosti, že poměr absorbance ke koncentraci je v oblasti platnosti Lambertova-Beerova zákona konstantní (A/c = l.e). Popište výpočet, tj. jak jste dospěli k hodnotám aktivit ALP ve vzorcích. Do tabulky zaznamenejte získané hodnoty: nativ. sérum
nativ. sérum
průměr
absorbance
inaktiv. sérum
inaktiv. sérum
X
průměr
X
aktivita ALP (µkat/l)
Výsledky: celková aktivita ALP: .......... µkat/l aktivita kostního izoenzymu ALP: ............µkat/l
Diskuze: získané výsledky porovnejte s fyziologickým rozmezím ● aktivita celkové ALP v séru ve věkové kategorii nad 15 let
0,66 – 2,20 µkat/l
● aktivita kostního izoenzymu ALP v séru ve věkové kategorii nad 15 let
0,1 – 1,6 µkat/l
OKRUHY ZKUŠEBNÍCH OTÁZEK Praktikum navazuje na přednášky a semináře na téma: • • • •
Enzymy a koenzymy, inhibice enzymů (kurz EB) Regulace metabolických drah na úrovni buňky (kurz SBT) Složky krevní plazmy a jejich funkce (kurz SFST) Laboratorní metody používané k analýze krevní plazmy (kurz SFST)
Předpokládané znalosti: • struktura, vlastnosti a funkce enzymů • názvosloví enzymů • znalost termínů: apoenzym, kofaktor, koenzym, prostetická skupina, alosterické místo, podjednotky, proenzymy (zymogeny), izoenzymy, specifita enzymu • základy enzymové kinetiky (rovnice Michaelis-Mentenové, Michaelisova konstanta, aktivita enzymu + její jednotky, katalytická koncentrace, modulace aktivity enzymu, inhibice enzymu • kompartmentace buněčných dějů (enzymy metabolických drah v jednotlivých oddílech buňky) a tkáňová distribuce enzymů, např. enzymy močovinového cyklu jsou jen v játrech atd. • princip spektrofotometrie
Poslední aktualizace: 25.4.2012
7
