Separační metody používané v proteomice Pavel Řehulka
[email protected]
Analýza proteomu – analýza komplexní směsi • proteom = soubor vyprodukovaných bílkovin v daném typu buněk nebo organismu v daném čase za definovaných podmínek • lidská buňka obsahuje přibližně 10 000 bílkovin • koncentrační rozdíl je v buňce okolo 6 řádů, v plazmě 10 až 11 řádů • cílená frakcionace a separace vzorku je klíčovým aspektem úspěšné proteomické analýzy • frakcionace/separace lze provádět na úrovni – proteinů • MS proteinů – top-down přístup (obtížné)
– peptidů – po aplikaci (enzymatického) štěpení • MS peptidů – bottom-up přístup (komplexní směsi)
Reference intervals for 70 protein analytes in plasma
Anderson N L , Anderson N G Mol Cell Proteomics 2003;2:50-50
http://www.mcponline.org/content/1/11/845 http://www.mcponline.org/content/2/1/50.full ©2003 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Štěpení proteinů • enzymaticky – specifické • trypsin – C-konec lysinu a argininu (nenásleduje-li prolin) • AspN – N-konec kyseliny asparagové
• GluC – C-konec kyseliny glutamové • ArgC – C-konec argininu • LysC – C-konec lysinu
– méně specifické • chymotrypsin – C-konec fenylalaninu, tyrosinu a tryptofanu (někdy i methioninu a leucinu) • pepsin - C-konec fenylalaninu, tyrosinu, tryptofanu, methioninu
– nespecifické (používá se někdy pro analýzu membránových proteinů a glykoproteinů) • subtilisin • proteináza K
Štěpení proteinů • chemicky – CNBr – C-konec methioninu s následnou modifikací methioninu na homoserin lakton (pozor: CNBr je vysoce toxický) – 2% kys. mravenčí – C-konec kys. asparagové – kyselina chlorovodíková – 6M roztok při 110 °C po dobu 24 hodin → aminokyselinová analýza
Vlastnosti proteinů a peptidů • jsou určeny složením a uspořádáním aminokyselin
(primární, sekundární, terciární struktura) – dále též posttranslačními modifikacemi
• molekulová hmotnost (MW) • isoelektrický bod (pI) – hodnota pH kdy má amfoterní molekula celkový neutrální náboj
• hydrofobicita – tzv. GRAVY index (grand average of hydropathicity) • nástroje pro teoretickou predikci některých vlastností – http://www.expasy.org/tools/protparam.html – http://biochemie.upol.cz/software/proteincutter/
Přehled aminokyselin vyskytujících se v přírodě
Glycine Gly; G
Alanine Ala; A
Proline Pro; P
Valine Val; V
Phenylalanine Phe; F
Leucine Leu; L
Tryptophan Trp; W
Lysine Lys; K
Histidine His; H
Aspartate Asp; D
Isoleucine Ile; I
Tyrosine Tyr; Y
Serine Ser; S
Arginine Arg; R
Glutamate Glu; E
Methionine Met; M
Asparagine Asn; N
Cysteine Cys; C
Threonine Thr; T
Glutamine Gln; Q
Fyzikálně-chemické vlastnosti aminokyselin Proline
Tiny
P
Small CSS
G A
CSH
V T
I
Aromatic
Hydrophobic
Q
D
L
M
N
S
Aliphatic
E Negative
W F
Y
H K
R
Polar Positive Charged
Livingstone, C. D. & Barton, G. J. (1993). Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation. Comput. Appl. Biosci. 9, 745-756.
Fyzikálně-chemické vlastnosti aminokyselin GASPVTCLINDQKEMHFRYW GA VTCLI K MHF YW S S NDQKE H RYW GASPVTC ND P GAS V LI HF YW K H R D E D KE H R
hydrophobic polar small proline tiny aliphatic aromatic positive negative charged
Livingstone, C. D. & Barton, G. J. (1993). Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation. Comput. Appl. Biosci. 9, 745-756.
Rozložení četnosti aminokyselin (databáze UniProt rel. 2011_01; NCBInr rel. 20110105) 10%
UniProt_SwissProt_2011_01
524 420 sequences
9%
NCBInr_20110105
12 600 418 sequences
Relative frequency
8%
7%
6%
5%
4%
3%
2%
1%
0%
L
A
G
S
V
E
I
T
R
K
D
P
N
F
Q
Y
M
H
C
W
UniProt_SwissProt_2011_01 9.67 8.27 7.09 6.53 6.88 6.76 5.98 5.34 5.54 5.85 5.46 4.69 4.06 3.87 3.94 2.92 2.43 2.27 1.37 1.08 9.79 8.48 7.07 6.91 6.67 6.20 5.82 5.60 5.52 5.31 5.31 4.89 4.12 3.99 3.91 3.03 2.41 2.23 1.37 1.31 NCBInr_20110105
AA Residue
Rozložení četnosti proteinových sekvencí podle počtu aminokyselinových zbytků UniProt_Sprot_2011_01
NCBInr_20110105
0.60%
Relative frequency
0.50%
0.40%
0.30%
0.20%
0.10%
0.00% 0
200
400
600
800
1000
1200
# AA Residue
1400
1600
1800
2000
Separační metody • separace = rozdělení vzorku na více podílů o
rozdílném složení • charakteristiky separačních metod – selektivita metody • schopnost dělit látky na základě různých vlastností, např. fyzikálních (bod varu) nebo chemických (polarita molekuly)
– rozsah použitelnosti • pro jaké skupiny analytů lze separační metodu použít
– frakcionační kapacita • maximální počet složek, které lze oddělit v průběhu separace
Rozdělení separačních metod používaných v proteomice • metody na principu využití různých rovnovážných rozdělovacích konstant mezi dvěma fázemi – extrakce: solid → liquid, liquid → liquid, liquid → solid – chromatografické metody • varianty kapalinové chromatografie • jednodimenzionální – HPLC, GPC, SCX, TLC, afinitní LC ... • vícedimenzionální – 2D-LC (SCX-RP, RP-RP), chromatofokusace-RP, ...
• separace polem – elektromigrační metody • jednodimenzionální – IEF, SDS-PAGE, CE, FFE, ... • dvojdimenzionální – 2D-GE
– – – –
ultracentrifugace frakcionace tokem v silovém poli (FFF) průtoková cytometrie hmotnostní spektrometrie (MS)
• membránové separace – ultrafiltrace – dialýza
Extrakce na pevné fázi wetting 100% ACN
equlibrating 2% ACN / 0.1% TFA
sample loading
washing 2% ACN / 0.1% TFA
elution 60% ACN / 0.1% TFA
to waste
collect purified sample
C18 stationary phase
to waste
to waste
collect flow-through (optional) or to waste
Chromatografie • vzorek (směs analytů) • stacionární fáze • mobilní fáze • pro úspěšnost separace je důležitá rozdílná interakce analytů se stacionární fází (ovlivněná danou mobilní fází)
Signál detektoru
Chromatogram při eluční metodě n ... počet teoretických pater kolony 2
start
inert
tR n 16 Yt 2 tR n 5.54 Y1/ 2
pík h
výška píku
Y1/2
šířka píku v polovině výšky
pík základní linie
mrtvý retenční čas
složka A
tM
t‘R tR
Yt
h/2
výška píku
šířka píku v základně
Čas redukovaný retenční čas
retenční čas
Závislost účinnosti kolony na lineární rychlosti mobilní fáze podle van Deemterovy rovnice van Deemterova rovnice H = HA + HB + HC nebo H = A + B/u + Cu kde u = L/tM
H H
HC
HA – turbulentní difúze HB – molekulární difúze HC – odpor proti převodu hmoty
Hmin HB
HA Hopt
u
Druhy kapalinové chromatografie používané v proteomice • jednodimenzionální metody – vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) na reverzní fázi (RPLC) – gelová permeační chromatografie (GPC nebo SEC)
– iontově výměnná chromatografie (IEX – SCX, SAX) – afinitní chromatografie (AC) – chromatografie na tenké vrstvě (TLC, HPTLC)
• vícedimenzionální metody – SCX-RP, RP-RP...
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High Performance Liquid Chromatography (HPLC) zásobníky mobilní fáze A a B A
B typická lineární rychlost: 3-6 mm/sec
řízení gradientu směšovač
vzorek
kolona vysokotlaké čerpadlo
detektor eluát
dávkovací zařízení
termostat
HPLC na reverzní fázi (RP) • sorbent - stacionární fáze - je hydorfobní náplň
Hydrofobicita
– uhlovodíkový řetězec navázaný na: • silikagelu • polymeru • různý počet uhlíků – C4, C8, C18 (proteiny – peptidy)
– mobilní fáze • vodný roztok s přídavkem TFA nebo kys. mravenčí • gradient tvořený organickým rozpouštědlem – ACN Hydrofobní řetězec
rozměry kolony
velikost částic
Příklad označení kolony: C18, 75 um x 15 cm, 3um, 300Å
porozita
Typy částic v chromatografii na reverzní fázi •
silikagelové částice – klasické i hybridní, např. Ethylene Bridged Hybrid (BEH) particle (pro UPLC) 4
•
polymerní částice – např. kopolymer styrenu a divinylbenzenu
•
monolitické kolony – sol-gel, methacrylate based
•
core-shell částice – separační efektivita sub 2 um částic při 40-50% tlaku (nebo 100% 3 um) • Ascentis Express – Sigma
• Kinetex – Phenomenex • Poroshell – Agilent Technologies
0.5 um 3 um
1.7 um 0.5 um
Organická rozpouštědla pro mobilní fázi • parametry – vizkozita – souvisí s protitlakem při separaci – UV-cutoff – omezuje rozsah UV detekce
– index polarity – nízká polarita → rychlejší eluce (vhodné pro čištění kolon) – cena
• používaná rozpouštědla – acetonitril – nejčastěji používaný, nízký UV-cutoff i protitlak – methanol – nízká cena, vyšší protitlak – ethanol – nepoužívá se (kvůli protitlaku)
– isopropanol – čištění kolon při nízkém průtoku (vysoký protitlak) – aceton – vysoká absorbance v UV oblasti (někdy se používá pro zjištění mrtvého retenčního objemu) – tetrahydrofuran – vysoká cena
Chromatografické metody – HPLC-RP Rozdělení směsi 9-ti peptidů – UV detekce 7 - 26,681
-9,40
9 - 28,752
4 - 19,487
-9,20
10 - 29,423
-9,00
5 - 20,907
-8,80
3 - 14,090
1 - 10,974
-8,60
6 - 22,845
-8,40
UV_VIS_1
8 - 28,053
smes 9peptidu
2 - 12,987
-8,20 1 - December06 #38 [modified by OBSLUHA] mV
-9,60 1
-9,80
-10,00
-10,20 hemoglobin digest
UV_VIS_1
20 - 23,677
-6,54 2 - December06 #39 [modified by OBSLUHA] mV
31 - 34,917
32 - 36,430
29 - 32,998
28 - 30,150
26 - 29,106 27 - 29,322
24 - 27,633 25 - 28,124
30 - 33,538
22 - 26,181 21 - 25,794
23 - 26,726
15 - 21,734 16 - 22,201 17 - 22,639
11 - 18,833 12 - 19,264
2 -9,50
8 - 17,563 9 - 17,684 10 - 18,104
6 - 16,7575 - 16,595
-9,00
7 - 17,039
1 - 11,701 2 - 12,370
-8,50
4 - 14,115
3 - 13,141
-8,00
18 - 22,895
13 - 20,557 14 - 21,169
-7,50
19 - 23,500
Rozdělení tryptického digestu hemoglobinu – UV detekce
-7,00
-10,00
-10,68 0,0
min 2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,5
35,0
37,5
40,0
42,5
45,0
47,5
50,0
52,5
56,0
Iontově výměnná chromatografie • separace probíhá na základě afinity nabitých proteinových/peptidových částic ke stacionární fázi • eluce probíhá vyplavením pufru o větší iontové síle – krokově – gradientově
• kationtově výměnná (SCX, WCX) • aniontově výměnná (SAX, WAX)
Gelová chromatografie – Gel Permeation Chromatography (GPC) také Size Exclusion Chromatography (SEC) • větší částice se pohybují rychleji než malé, které jsou brzděny interakcí s póry gelu – spíše jako hrubá frakcionace
Afinitní chromatografie – Affinity Chromatography (AC) – vazba proteinu přes specifickou vazebnou schopnost • substrát • protilátka
– využíváno např. pro • odstranění proteinů o veliké koncentraci ze séra – Až 20 nejkoncentrovanějších (albumin, immunoglobuliny)
• purifikaci proteinových komplexů • prekoncentraci glykoproteinů (lektiny)
Ukázka specificity separačních technik
Vícedimenzionální chromatografie – možné kombinace • Iontově výměnná + na reverzní fázi – SCX-RPLC, WAX-RPLC
• Gelová permeační + na reverzní fázi – SEC-RPLC
• Afinitní + na reverzní fázi – AC-RPLC
• Na reverzní fázi + kapilární elektroforéza – RPLC-CE
Vícedimenzionální chromatografie – princip kombinace SCX-RP SCX kolona
odpad
trap RP pumpa
1. dimenze nástřik RP kolona pumpa
peptidová směs štěpení
2. dimenze
proteinová směs (celý lysát, frakce)
MS (ESI)
Vícedimenzionální chromatografie – kombinace SCX-RP
Benefit: Sensitive Drawback: Not Robust
Aplikace vícedimenzionální chromatografie • SCX-RPLC – Kvasinky – 1484 proteinů (Washburn et al, Nat. Biotech, 19, 2001, 242-247)
– Nano 2D-LC • 100 fmol BSA • 100-300 proteinů E.coli / analýzu (celkem 500) (Nagele et al, J.Chromatogr. A, 1009, 2003, 197-205)
Aplikace vícedimenzionální chromatografie Analýza HMEC (human mammary epithelial cells) Lyzát celých buněk
Gelová permeační chromatografie
6 frakcí
1574 proteinů
Digesce (trypsin) SCX separace
(NET evaluace)
114 frakcí
5836 jedinečných peptidů
RP separace 700000 MSMS spekter (LCQ Thermo Finnigan)
16836 peptidů Jacobs et al., J. Proteome Res, 2004, Vol 3, No.1
Gelová elektoforéza Gel electrophoresis (GE) • jako matrice pro separaci se používá – polyakrylamid – pro separaci proteinů – agaróza – pro separaci nukleových kyselin
• lze ji provádět jak za nativních, tak i denaturujících podmínek (dithiothreitol – DTT, dodecylsulfát sodný – SDS) • dvě základní varianty – jednodimenzionální (1D-GE) – často používaná ve formě SDS-PAGE – dvojdimenzionální (2D-GE) – zde se jako první separační krok používá
isoelektrická fokusace
• je to metoda schopná rozdělit velmi složité směsi bílkovin
Polyakrylamidová gelová elektroforéza se dodecylsulfátem sodným Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Cathode (-)
-O
3S-
-SO3-SO3-
-O
3S-
protein molecule
-SO3-O
3S-
-SO3-O
3S-
-SO3-O
3S-
-O
3S-
-SO3-SO3-
-O
3S-
SDS
-SO3-O
3S-
Anode (+)
SDS-PAGE
Isoelektrická fokusace – Isoelectric Focusing (IEF) Anode (+)
Cathode (-) COOH
(a) NH3+
COO-
(b) NH2
COO-
(c) NH3+
3
4
5
6 7 pH gradient pI
8
9
10
IEF – praktické provedení
• isoelektrická fokusace – separace proteinů v závislosti na isoelektrickém bodě
• IPG proužky – imobilizovaný pH gradient • různý gradient pH – 3-10, 4-7, 6-11, 4,5-5,5
Dvojdimenzionální gelová elektroforéza (2DE) schéma postupu
IEF +
SDS PAGE
MS analýza
2DE – princip metody
+ pI 3
_
První dimense ++
-+- - --
-
- - - --- -
- --
+
+
-
-
--
-
++ -
+ -
-
+
+ + + + +-
-
+ ++
+
+ -- +
++++ + - ++ --
+
++
Druhá dimense
--
Polyakrylamidový gel ++
+
+
-
-
-
+
pI 10
2DE – vizualizace proteinů • Vizualizace proteinů: – Citlivost – Kompatibilita s identifikací – Dynamický rozsah – Stříbření • Modření koloidní coomasie modří (Coomassie Brilliant Blue) • Fluorescenční barvení – Sypro Ruby
2DE – relativní kvantifikace
DIGE - Differential gel electrophoresis • Modifikace 2DE – vzorky označené různou flourescenční barvou • CY-2, CY-3, CY-5 – různé maximum excitační energie
Nativní elektroforéza • Elektroforéza bez denaturačních činidel a detergentů – Zachovává aktivní konformaci proteinů • Lze testovat aktivitu • Lze purifikovat velké komplexy
• Modrá nativní elektroforéza – Blue native (BN) – Coomasie modř, udává proteinům negativní náboj – V kombinaci s SDS-PAGE • 2D BN/SDS PAGE
2-D BN/SDS-PAGE membránových proteinových komplexů E. coli
J.-P. Lasserre et al. Electrophoresis 2006, 27, 3306–3321
Kapilární elektroforéza Capillary electrophoresis (CE) • vhodné pro polární látky • relativně vysoké rozlišení • obvykle detekce UV nebo vodivostním detektorem • off-line spojení s MALDI (např. dávkovací zařízení Probot) – užší výběr kompatibilních pufrů • on-line spojení s ESI není obvyklé a bývá komplikovanější • omezení v množství nanášeného vzorku
• některé látky silně interagují se stěnou kapiláry (proteiny)
Schéma kapilární elektroforézy vyhodnocení signálu
separační kapilára detektor
vzorek dávkování
elektrolyt (pufr)
elektrolyt (pufr) ~ 30 000 V zdroj napětí
Free Flow Electrophoresis • Metoda založená na principu isoelektrické fokusace v roztoku
– Vysoké rozlišení – Odpadá problém s precipitací proteinů v gelu • Obdobný princip – ROTOFOR – ZOOM
Separace organel - frakcionace • Analýza subproteomu – Cytoplasma – Membrány • G- Bakterie – Vnější – Vnitřní
– Mitochondrie, chloroplasty – Fagozómy, jiné buněčné váčky
– Jádro
Frakcionace – Ultracentrifugace • Diferenciální centrifugace – různé sedimentační schopnosti organel
• Zónální centrifugace – gradient • Sacharóza, ClCs
Průtoková cytometrie Flow cytometry • měření více charakteristik jednoduchých částic, často buněk (0,2-150 um) – relativní velikost (FSC) – relativní granularita (SSC) – relativní intenzita fluorescence
• skládá se z: – fluidní systém – transport částic do místa osvětlení laserem – optický systém – lasery, filtry, doprava signálu do detektoru – elektronický systém – konverze detekovaného světla a zpracování signálu (někdy i separace jednotlivých částic)
Schéma zařízení pro průtokovou cytometrii sample
sheath
hydrodynamic focusing
nozzle stained cells
fluorescence
scattered light light source droplet generation +
-
-
+ -
sorted cells
-
-
+ + +
+ +
waste
deflected droplets
sorted cells
Mass Spectrometer Ion Source
+ + + + + +
Mass Analyzer
+
+
Detector
+ --
+
% Recorded Spectrum m/z
Membránová separace – dialýza přívod čistého rozpouštědla
semipermeabilní membrána
vzorek
odvod difuzátu
Inhibition of plant amine oxidases by a novel series of diamine derivatives • polyamines (i.e. putrescine, spermidine and spermine) are involved in cell growth and differentiation • their levels are controlled by biosynthesis (ornithine decarboxylase, spermidine synthase, spermine synthase) and biodegradation (quinoprotein copper containing amine oxidases – CAOs; flavoprotein polyamine oxidases – PAOs) • CAOs act on primary amino groups of diamines (diamine oxidases), PAOs act on secondary amino groups • both CAOs and PAOs show up their own spectrum of inhibitors • isolation of oat polyamine oxidase (OPAO) and its partial de-novo sequencing using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry • characterization of newly synthesized diamine derivatives and measurement of their dual inhibition toward CAOs and PAOs
Improved isolation of polyamine oxidase from oat seedlings (OPAO) Purification step
Volume (mL)
Total activity (nkat)
Total protein (mg)
Specific activity (nkat/mg)
Enrichment factor (-fold)
Yield (%)
Crude extract Protamine precipitation (NH4)2SO4 60% sat., dialysis DEAE-celullose chromatography SP-Sepharose FF chromatography Hydroxyapatite chromatography Mono S column Chromatography
2200
72000
4930
14.6
1
100
2180
69850
1930
36.2
2.5
97
142
43 890
489
89.8
6.2
60
320
41470
311
133.3
9.1
58
45
35280
57
618.9
42.4
49
15
29800
19
1568.4
107.4
41
3
11520
6.1
1888.5
129.3
16
Improved isolation resulted in: • higher enzyme activity, higher enrichment factor, lower yield • avoiding acetone precipitation (= risk of enzyme denaturation)
1D SDS PAGE of isolated OPAO kDa 97.4 66.2
OPAO @ ~ 56 kDa 45
31
21.5 14.4
