Separační metody používané v proteomice

Separační metody používané v proteomice

Proteome = komplexní směsi proteinů ‡

Lidská buňka „

10,000 typů proteinů ‡

‡

Rozdíl v koncentraci – 106, plasma 109

Nutnost separace, frakcionace „

Na úrovni ‡

Proteinů ƒ Obtížně identifikovatelné, je nutné měřit velké molekulové hmotnosti, s velkým rozlišením ƒ lze pomocí FTICR

‡

Peptidů – štěpení

Proteinové štěpení „

Chemické ‡

CNBr ƒ M

„

Enzymatické ‡

Vysoce specifické ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ

‡

Trypsin – K, R AspN - D GluC – E ArgC – R LysC - K

Méně specifické ƒ Chymotrypsin - aromatické ƒ Pepsin – F,L,W,Y

‡

Nespecifické ƒ Proteináza K

Vlastnosti proteinů, peptidů pI ‡ mw ‡ Hydrofobicita ‡

Alanine Valine

Aspartic acid

Rozložení aminokyselin v proteinech podle četnosti

Separační metody ‡

Elektromigrační metody „ „

SDS PAGE 2DE ‡ ‡

„ „ „

‡

IEF SDS PAGE

Nativní elektroforéza Kapilární elektroforéza Free flow eletrophoresis

Chromatografické metody „

Jednorozměrná ‡ ‡ ‡ ‡ ‡

„

Na reverzní fázi Iontově výměnná Gelová chromatografie Hydrofilní Afinitní

Vícerozměrná ‡ ‡

2D – nejčastěji SCX+RP Chromatofokusace – Beckman-Coulter

Elektromigrační metody 1DE - SDS PAGE ‡ 2DE ‡

„ „

IEF SDS PAGE

Nativní elektroforéza ‡ Kapilární elektroforéza ‡ Free flow electrophoresis ‡

Elektromigrační metody ‡

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) „

Molekulová hmotnost

Elektromigrační metody ‡

isoelektrická fokusace „

‡ ‡

Separace proteinů v závislosti na isoelektrickém bodě

IPG proužky – imobilizovaný pH gradient Různý Gradient pH „

3-10, 4-7, 6-11, 4,5-5,5

Elektromigrační metody Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE

IEF +

SDS PAGE

MS analýza

Elektromigrační metody Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE

+ pI 3

_

První dimense ++

-+- - --

-

- - - --- -

- --

+

+

-

-

--

-

++ -

+ -

-

+

+ + + + +-

-

+ ++

+

+ -- +

++++ + - ++ --

+

++

Druhá dimense

--

Polyakrylamidový gel ++

+

+

-

-

-

+

pI 10

Elektromigrační metody 2-DE ‡

Vizualizace proteinů: „ „ „

‡ ‡ ‡

Citlivost Kompatibilita s identifikací Dynamický rozsah

Stříbření Modření koloidní coomasie modří Fluorescenční barvení „

Sypro Ruby

Elektromigrační metody 2-DE

Elektromigrační metody DIGE - Differential gel electrophoresis ‡

Modifikace 2DE „

vzorky označené různou flourescenční barvou ‡ CY-2, CY-3, CY-5 – různé maximum excitační energie

Elektromigrační metody Nativní elektroforéza ‡

Elektroforéza bez denaturačních činidel a detergentů „ Zachovává aktivní konformaci proteinů ‡ ‡

‡

Lze testovat aktivitu Lze purifikovat velké komplexy

Modrá nativní elektroforéza – BN „ Coomasie modř, udává proteinům negativní náboj „ V kombinaci s SDS PAGE ‡

2D BN/SDS PAGE

2-D BN/SDS-PAGE membránových proteinových komplexů E. coli

J.-P. Lasserre et al. Electrophoresis 2006, 27, 3306–3321

Elektromigrační metody Kapilární elektroforéza „ „ „

Vysoké rozlišení spojení s MALDI Nekompatibilní s ESI, příliš solí v pufrech

Elektromigrační metody Free Flow electrophoresis ‡

‡

Metoda založená na principu isoelektrické fokusace v roztoku „ Vysoké rozlišení „ Odpadá problém s precipitací proteinů v gelu

Obdobný princip „ „

ROTOFOR ZOOM

Chromatografické metody „

HPLC – vysokotlaká kapalinová chromatografie Jednorozměrná ƒ Na reverzní fázi ƒ Iontově výměnná ƒ Gelová chromatografie ƒ Hydrofilní ƒ Afinitní ‡ Vícerozměrná ƒ 2D – nejčastěji SCX+RP Nízkotlaká chrom. - FPLC Extrakce na tuhé fázi - SPE ‡

„ „

video

Chromatografické metody HPLC - Reverzní fáze (RP) ‡

Sorbent - stacionární fáze - je hydorfóbní náplň „

Hydrofobicita

Uhlovodíkový řetězec navázaný na: ‡ ‡

‡

silikagelu polymeru Různý počet uhlíků ƒ C4, C8, C18

„

Mobilní fáze ‡ ‡

Vodný roztok s přídavkem TFA nebo kys. mravenčí Gradient tvořený organickým rozpouštědlem ƒ ACN

Hydrofóbní řetězec

rozměry kolony

velikost částic

Příklad označení kolony: C18, 75 um x 15 cm, 3um, 300Å

porozita

-9,50 2

-10,68 0,0

2,5 5,0 7,5 10,0

-9,00

12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5

30 - 33,538 35,0

32 - 36,430

31 - 34,917

29 - 32,998

28 - 30,150

22 - 26,181

4 - 19,487

9 - 28,752

-9,60 1

26 - 29,106 27 - 29,322

24 - 27,633 25 - 28,124

20 - 23,677

-7,00

21 - 25,794

-8,00

19 - 23,500

mV

23 - 26,726

-7,50

13 - 20,557 14 - 21,169

-9,40

18 - 22,895

8 - 17,563 9 - 17,684 10 - 18,104

-9,20

15 - 21,734 16 - 22,201 17 - 22,639

11 - 18,833 12 - 19,264

6 - 16,7575 - 16,595

10 - 29,423

6 - 22,845

5 - 20,907

3 - 14,090

-9,00

7 - 17,039

-8,50

3 - 13,141

8 - 28,053

7 - 26,681

2 - 12,987

-8,40

4 - 14,115

-8,80

1 - 10,974

-8,60

2 - 12,370

1 - 11,701

Chromatografické metody – HPLC -RP mV

Rozdělení směsi 9-ti peptidů – UV detekce

-9,80

-10,00

-10,20

Rozdělení tryptického digestu hemoglobinu – UV detekce

-10,00

37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 min

56,0

Chromatografické metody Iontově výměnná chromatografie „

„

Separace probíhá na základě afinity nabitých proteinových/peptidových částic ke stacionární fázi Eluce probíhá vyplavením pufru o větší iontové síle ‡ ‡

„ „

krokově gradientově

Kationtově výměnná Aniontově výměnná

Chromatografické metody Gelová chromatografie (size exclusion chrom.) „

Větší částice se pohybují rychleji než malé, které jsou brzděny interakcí s póry gelu ‡

Spíše jako hrubá frakcionace

Chromatografické metody Afinitní chromatografie „

Vazba proteinu přes specifickou vazebnou schopnost ‡ ‡

„

Substrát Protilátka

Využíváno např. pro ‡

odstranění proteinů o veliké koncentraci ze séra ƒ Až 20 nejkoncentrovanějších (albumin, immunoglobuliny)

‡

purifikaci proteinových komplexů

Ukázka specificity separačních technik

Chromatografické metody Multidimenzionální kapalinová chromatografie ‡

Iontově výměnná + na reverzní fázi „

‡

Gelová permeační + na reverzní fázi „

‡

SEC-RPLC

Afinitní + na reverzní fázi „

‡

SCX-RPLC, WAX-RPLC

AC-RPLC

Na reverzní fázi + kapilární elektroforéza „

RPLC-CE

Chromatografické metody 2D-LC SCX kolona

odpad trap RP pumpa

1. dimenze nástřik

RP kolona pumpa

peptidová směs štěpení

2. dimenze

proteinová směs (celý lysát, frakce)

MS (ESI)

Chromatografické metody Separace komplexních peptidových směsí

Benefit: Sensitive Drawback: Not Robust

Yates J.R. (1999) Nature Biotechnol. 17, 676-682. Yates J.R. (2001) Nature Biotechnol. 19, 242-247.

Chromatografické metody

2DLC MS - příklady ‡

SCX-RPLC „ Kvasinky– 1484 proteinů (Washburn et al, Nat. Biotech, 19, 2001, 242-247) „

Nano 2D-LC ‡ 100 fmol BSA ‡ 100-300 proteinů E.coli / analýzu (celkem 500) (Nagele et al, J.Chromatogr. A, 1009, 2003, 197-205)

Chromatografické metody Analýza HMEC (human mammary epithelial cells) Lyzát celých buněk Gelová permeační chromatografie

6 frakcí Digesce (trypsin)

1574 proteinů (NET evaluace)

SCX separace

114 frakcí

5836 jedinečných peptidů

RP separace 700000 MSMS spekter (LCQ Thermo Finnigan)

16836 peptidů Jacobs et al., J. Proteome Res, 2004, Vol 3, No.1

Separace organel - frakcionace ‡

Analýza subproteomu „ „

Cytoplasma Membrány ‡

G- Bakterie ƒ Vnější ƒ Vnitřní

„ „ „

Mitochondrie, chloroplasty Fagozómy, jiné buněčné váčky Jádro

Frakcionace ‡

Diferenciální centifugace „

‡

různé sedimentační schopnosti organel

Zónální centrifugace „

gradient ‡

Sacharóza, ClCs