Seminar Nasional Biodiversitas VI September 3, 2016, UNAIR, Surabaya 1
OPTIMASI PCR FRAGMEN 16SDNA DARI ISOLAT RHIZOBACTERIA INDIGENOUS MERAPI YANG BERPOTENSI SEBAGAI PUPUK HAYATI PADA TANAMAN PADI YANG MENGALAMI CEKAMAN KEKERINGAN 1,2,3
AGUNG_ASTUTI1*, SARJIYAH2 DAN HARIYONO3 Prodi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta * No Tlp : 0811257673, Fax : 0274387656, Email :
[email protected]
ABSTRACT An indigenous osmotolerant rhizobacterial isolate has been obtained from Merapi volcano eruption ash, Central Java, Indonesia. The isolate also demonstrates phosphate solubilising, as well as a strong ammonification-nitrification capability. A study has been carried out to identify the isolate based on molecular characterisation using the 16S rDNA as the molecular character. In this work, PCR optimisation of the 16S rDNA was carried out, prior to the sequencing of the 16S rDNA, by varying the annealing time, using primer 27F and 1429R and DNA template of bacterial isolate otained from Merapi. PCR amplification was carried 0 0 out by the following programme: pre-denaturation at 95 C for 2 minutes, primer annealing at 55 C for 0,5 0 0 minutes, and followed by 30 cycles of polimerisation at 72 C for 1 minute, denaturation at 95 C for 2 0 minutes, and primer annealing at 55 C for 0,5 menit. At the end of cycles, an extra polimerisation was 0 0 carried out at 72 C for 5 minutes, and finally the temperature was cooled down to 8 C. The optimisation process resulted in strong band, with no visible mispriming, that can be used further for DNA sequencing. Keywords: Biofertiliser, Osmotolerant Rhizobacteria, PCR optimisation PENDAHULUAN Cekaman kekeringan dapat menyebabkan penurunan hasil padi sebanyak 48,87% (Sulistyono dkk, 2012). Penggunaan Rhizobacteria sebagai pupuk hayati, merupakan satu sumbangan bioteknologi dalam usaha peningkatan produktivitas tanaman padi dalam cekaman kekeringan. Penelitian Kusumaastuti dkk (2008) menunjukkan inokulasi campuran dua inokulum Rhizobakteri osmotoleran (Al-19+M-7b) pada tanaman padi IR-64 pada aras lengas 80% mampu menghasilkan anakan terbanyak. Inokulasi isolat Bacillus sp. pada bibit padi dapat meningkatkan pertumbuhan dan produksi padi hingga 43% (Ikhwan, 2008). AgungAstuti (2012) memperoleh isolat dari rhizosfer tanaman rumput di lahan pasir vulkanik pasca erupsi Merapi, yang berbersifat osmotoleran (>2,75 M NaCl), pelarut Phosphat dan kemampuan Nitrifikasi-Amonifikasinya kuat. Hasil pengujian selanjutnya menunjukkan bahwa isolat tersebut mampu berkembang di rhizosfer tanaman padi varietas IR64 dalam polibag dengan kondisi cekaman air (KL 40 %) nyata berpengaruh lebih baik terhadap semua parameter pertumbuhan tanaman padi (Agung_Astuti dkk, 2013). Sedang pada uji lapangan, menunjukkan adanya saling pengaruh yang nyata antara inokulasi
Rizhobakteri indegenous
Merapi dengan cekaman kekeringan, yaitu pada akar terpanjang (19 cm), perkembangan tajuk dan hasil tertinggi (1,4 ton/Ha) (Agung_Astuti dkk, 2014a; Agung_Astuti dkk, 2014b). Beberapa Rhizobacteria yang bermanfaat sebagai pupuk hayati, dari berbagai isolat dari Pseudomonas sp., Azospirillum sp., Azotobacter sp., Enterobacter sp., Bacillus sp. dan Serratia sp. (Nakkeeran et al., 2005; Radha et al, 2011). Untuk mengetahui jenis dari isolat Rhizobacteri indigenous Merapi maka perlu diidentifikasi berdasar analisis molekuler menggunakan squensing 16sDNA. Untuk itu perlu diperlukan produk amplifikasi fragmen 16sDNA
menggunakan teknik PCR. Polymerase Chain
Reaction (PCR) merupakan teknik yang digunakan untuk mengamplifikasi sequen genom spesifik (Yuwono, 2007).Tujuan penelitian adalah optimasi PCR untuk amplifikasi fragmen 16sDNA isolat
Rhizobacteri
Seminar Nasional Biodiversitas VI September 3, 2016, UNAIR, Surabaya 2 indigenous Merapi dengan penambahan jumlah templat DNA pada formula PCR, variasi suhu annealing, penambahan waktu annealing dan waktu ekstensi. METODE PENELITIAN Bahan Rhizobacteri indigenous Merapi isolat MA, MB dan MB, khemikalia untuk isolasi DNA (Tris-HCl, EDTA, Triton, Etanol, Aseton), komponen untuk Amplifikasi PCR (primer oligonukleotida, GoTaq® Green Master Mix, khemikalia untuk Elektroforesis (gel agarosa 0,8 % dan 2%, TBE, Etidium Bromida). Prosedur Penelitian 1. Isolasi DNA dari isolat Rhizobacteri indigenous Merapi dengan menggunakan metode miniprep (Sambrook et al., 1989). 2. Amplifikasi fragmen 16sDNA. Sepasang primer 27F dan 1429R digunakan dalam proses PCR. Formulasi dilakukan dengan mencampur dH2O 9,5 µl, GoTag Green 12,5 µl, Primer 27F 1 µl dan Primer 1429R 1 µl, template DNA genom isolat MA 1 µl, total volume 25 µl. Amplifikasi PCR dilakukan dengan thermocycler: 0
0
denaturasi awal pada suhu 95 C selama 2 menit, diikuti primer annealing pada suhu 55 C selama 0,5 0
menit, dilanjutkan dengan 30 kali siklus yang terdiri atas : polimerisasi pada suhu 72 C selama 1 menit, 0
0
denaturasi pada suhu 95 C selama 2 menit, dan primer annealing pada suhu 55 C selama 0,5 menit, divariasi suhu dan waktu yang diperlukan. Pada akhir siklus dilanjutkan dengan polimerisasi tambahan pada 0
0
suhu 72 C selama 5 menit dan akhirnya suhu diturunkan menjadi 8 C. 3. Deteksi Produk PCR. Hasil PCR ditambah Etidium Bromida, dituang 3 ul ke dalam sumur gel agarosa 0,8% atau 2% yang sudah terendam TBE pada chamber elektroforesis, kemudian di running pada tegangan 65 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi pada UV Transilluminator. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil kondisi optimasi PCR untuk amplifikasi fragmen 16sDNA dari Rhizobacteri indigenous Merapi isolat MA, MB dan MB, setelah dilakukan deteksi menggunakan elektroforesis gel gel agarosa 0,8 %, sebagai berikut : Tabel 1. Hasil optimasi PCR DNA Rhizobacteri indigenous Merapi Program thermocycler Hasil Keterangan 0 Denaturasi awal 95 C 3 mnt Tidak terlihat pita DNA Tidak Siklus 30x : menghasilkan 0 Denaturasi 94 C 1 mnt produk 0 Annealing 56 C 1,5 mnt amplifikasi 0 Ekstension 72 C 10 mnt 0 Ekstension 72 C 10 mnt 0 Denaturasi awal 95 C 3 mnt Tidak terlihat pita DNA Tidak Siklus 30x : menghasilkan 0 Denaturasi 94 C 1 mnt produk 0 Annealing 50-55 C 1,5 mnt amplifikasi 0 Ekstension 72 C 10 mnt 0 Ekstension 72 C 10 mnt 0 Denaturasi awal 95 C 2 mnt Terlihat pita DNA Menghasilkan Siklus 30x : produk 0 Denaturasi 95 C 0,5 mnt amplifikasi 0 Annealing 55 C 0,5 mnt 0 Ekstension 72 C 1 mnt
Seminar Nasional Biodiversitas VI September 3, 2016, UNAIR, Surabaya 3 0
Ekstension 72 C 5 mnt 0
0
Optimasi pertama dengan suhu Denaturasi 94 C selama 1 menit dan suhu Annealing 56 C selama 1,5 menit, ternyata belum mampu menghasilkan produk PCR. Berdasarkan optimasi tersebut maka 0
selanjutnya dilakukan dengan suhu Denaturasi 94 C selama 1 menit, namun dilakukan gradien suhu 0
0
0
0
annealing pada suhu 50 C. 52 C, 54 Cdan 55 C selama 1,5 menit. Hasil optimasi ternyata juga belum mampu menghasilkan produk PCR. Untuk meningkatkan produk amplifikasi maka suhu Denaturasi 0
0
dinaikkan menjadi 95 C selama 0,5 menit dengan suhu annealing 55 C selama 0,5 menit, dan ternyata menghasilkan produk PCR yang tebal, seperti tersaji pada gambar 1. 1kb MA MB MD
Gambar 1. Hasil Analisis Elektroforesis Produk PCR dari DNA Rhizobacteri indigenous Merapi isolat MA, MB dan MB Hasil penelitian ini memberikan gambaran bahwa proses optimasi amplifikasi memerlukan pengaturan suhu yang tepat, khususnya suhu annealing. Ketidaktepatan suhu akan menyebabkan primer tidak dapat menempel dengan stabil pada DNA cetakan (template DNA) sehingga tidak terjadi proses polimerisasi DNA oleh enzim DNA polimerase. Dalam penelitian ini diketahui bahwa suhu annealing yang o
paling tepat adalah 55 C selama 30 detik. Perbedaan sekuen DNA cetakan juga akan berimplikasi pada perbedaan suhu annealing sehingga untuk proses amplifikasi harus dilakukan optimasi terlebih dahulu. Hasil optimasi PCR menunjukkan pita yang tebal baik untuk Rhizobacteri indigenous Merapi isolat MA, MB dan MD dan tidak terjadi mispriming, sehingga dapat digunakan sebagai templat untuk proses sekuensing. Hasil deteksi dengan elektroforesis gel agarosa 0,8 %, dengan volume sampel loading 1 ul maka diperoleh pita DNA ukuran sekitar 4000 bp dan konsentrasi 12 ng/0,2 ug. KESIMPULAN Berdasarkan hasil optimasi PCR untuk amplifikasi fragmen 16sDNA isolat Rizhobakteri indegenous Merapi menunjukkan pita yang tebal dan tidak terjadi mispriming, yang dapat digunakan sebagai templat untuk proses sekuensing. Amplifikasi PCR dilakukan dengan thermocycler : denaturasi awal pada suhu 95
0
Seminar Nasional Biodiversitas VI September 3, 2016, UNAIR, Surabaya 4 0
C selama 2 menit, diikuti dengan primer annealing pada suhu 55 C selama 0,5 menit, dilanjutkan 30 siklus 0
0
yang terdiri dari: polimerisasi pada suhu 72 C selama 1 menit, denaturasi pada suhu 95 C selama 2 menit, 0
dan primer annealing pada suhu 55 C selama 0,5 menit. Pada akhir siklus dilanjutkan dengan polimerisasi 0
0
tambahan pada suhu 72 C selama 5 menit dan akhirnya suhu diturunkan menjadi 8 C. UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada DIRJEN DIKTI yang telah membiayai penelitian ini melalu skema Hibah Bersaing tahun 2013-2014. DAFTAR PUSTAKA Agung_Astuti. 2013. Uji Potensi Rhizobacteria Indigenous Lahan Pasir Vulkanik Merapi Untuk Dikembangkan Sebagai Pupuk Hayati Di Lahan Marginal. Dalam Prosiding Seminar Nasional Pemanfaatan Lahan Marginal Sumberdaya Lokal untuk Mendukung Ketahanan Pangan Lokal, HITI & UNSOED Purwokerto. Agung_Astuti, Sarjiyah dan Hariyono. 2014a. Study Of The Population Dynamic And Growth Of Rhizobacteria Indigenous Merapi To Be Developed As Biofertilizer On Drought Tolerant Rice Plant. nd 2 International Conference Sustainable Innovations. Universitas Muhammadiyah Yogyakarta-TU/e Netherland-Springer-Verlag Netherland, Yogyakarta 3-5 June 2014. Agung_Astuti, Sarjiyah, Hariyono. 2014b. Uji Kompatibilitas Isolat Rhizobakteri Indigenous Merapi Pada Berbagai Varietas Padi Yang Mengalami Cekaman Kekeringan . International Seminar on th Biothecnology and The 6 Conggress of Indonesia Biothecnology Consortium An International Forum. Universitas Sriwijaya-RisTek, LIPI. Palembang. 1-4 September 2014. Ikhwan, A. 2008. Pengaruh Inokulum Rhizobacteria Tahan kekeringan dan kemasaman dan Penambahan Pupuk kandang Sapi Terhadap Pertumbuhan dan hasil Kacang tanah. Laporan Penelitian JIPTUMM. Kusumastuti, A., T. Yuwono dan J. Soedarsono. 2003. Peran Bahan Organik dalam Interaksi Rhizobakteria osmotoleran dan padi IR-64 pada dua aras lengas tanah di Udipsament. Tesis Program Studi Ilmu Tanah UGM. Nakkeeran, S, W.G. Dilantha Fernando and Zaki A. Siddiqui. 2005. Plant Growth Promoting Rhizobacteriaa Formulations and Its Scope In Commercialization for the Management of Pests and Disease. Springer, Dordrecht, The Netherlands. Radha P., L. Nain, A.K. Pandey and A.K. Saxena. 2011. Microbial Diversity and Multidimentional Interactions in The Rice Ecosystem. Archives of Agronomy and Soil Science 2011 : 1-22 Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Manual.
Second
Sulistyono E., Suwarno, Ikandar .L, dan Deni. S. 2012. Pengaruh Frekuensi Irigasi Terhadap Pertumbuhan Dan Produksi Lima Galur Padi Sawah. Agrovigor V (I) : 1-7. Yuwono, T. 2007. Teori dan Aplikasi Polymerase Change Reaction. Andi Publisher. Yogyakarta.
Seminar Nasional Biodiversitas VI September 3, 2016, UNAIR, Surabaya 5
