Salmonella bij varkens: contaminatiecycli in het slachthuis en de differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van de mntH genexpressie Botteldoorn Nadine 18 januari 2006
varkensbedrijf varkenstransport varkensslachthuis varkensvleesverwerking en distributie
virulentie
interactie met het varken
consument
Data omtrent de Salmonella besmetting van varkens Bedrijfs-en slachthuisniveau Contaminatiecycli in het slachthuis
Verdere differentiatie van Salmonella enterica stammen met het oog op een gerichtere bestrijding van een subpopulatie van meer varkens-geadapteerde stammen
Inleiding
Salmonella
Enterobacteriaceae Gram – staafje Beweeglijk Facultatief anaëroob H2 S Lysine en ornithine gedecarboxyleerd Lactose – Zoönotische pathogeen
Taxonomie Salmonella 3 species enterica
6 subspecies
enterica
2400 serotypes
salamae
bongori
arizonae diarizonae houtenae
subterranea
indica
Nomenclatuur : Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Afgekort : Salmonella Typhimurium en niet S. Typhimurium
Typering van Salmonella Differentiatie van types, stammen of klonen in een bacterieel species Doel het achterhalen van de oorsprong van een infectie of een contaminatie
Fenotypisch Serotypering : volgens Kauffmann-White schema Somatische O-antigenen Flagellaire H-antigenen Kapsel Vi-antigenen Typhimurium, Enteritidis, Derby,…..
Faagtypering : voor de belangrijkste serotypes
DT104, DT193, PT4, PT21…
Antibiotica resistentie profiel (ARP)
Typering van Salmonella Genotypisch Bacteriële suspensie
Niet-PCR gebaseerd
Agarose plug Lyse en wassen
PFGE
stamniveau
Restrictie van DNA Elektroforese
PCR gebaseerd Rep-typering REP, BOX, ERIC, GTG5 ⇒ serotype AFLP stamniveau RAPD stamniveau
Analyse
Salmonellose Virulentie van Salmonella en de gevoeligheid aan externe factoren Fysiologische en immunologische toestand van de gastheer Misselijkheid, diarree, koorts, braken, buikkrampen, hoofdpijn 5% complicaties septicemie
200 doden EU/jaar Infectiedosis: 25-100 KVE’s YOPI (young, old, pregnant, immunodeficiënt)
Salmonellose in België 15774 gerapporteerde gevallen (1999) 9543 in 2004 10% van de Europese gevallen
60-65% Salmonella Enteritidis en 25% Salmonella Typhimurium
Belangrijkste besmettingsbronnen Eieren en ei-bereidingen: 55-65% Gevogelte: 15-20% Varkensvlees: 15-25% Rundsvlees: 2% melkpoeder
Vis en schelpdieren
Salmonella bij varkens Sub-klinisch Lichte diarree Asymptomatisch
Uitscheiden Drager
⇒
volksgezondheid
Prevalentie van Salmonella bij varkens op hoeveniveau België Nederland
27% (CODA, 1998) 14.4% (FAVV, 2004) 23%
Denemarken
11.4%
Ierland
50.8%
Prevalentie van Salmonella in het varkensslachthuis op karkasniveau België Nederland
12.6% (FAVV, 2004) 27% (Korsak et al. 1998) 1.4%
Duitsland
4.7%
Denemarken
9.6%
UK
5.3%
Probleemstelling Voedselveiligheid van belang voor de consument Vrij van chemische contaminanten Vrij van pathogene kiemen
Europese richtlijnen “safe food” van riek tot vork Integrale ketenbewaking voor zoönose Vanaf 2008: afwezigheid van Salmonella bij varkens (Europese Verordening 2160/2003/EG) Microbiologische criteria voor levensmiddelen (Europese Verordening 2073/2005/EG): afwezigheid van Salmonella op varkenskarkassen
Doelstellingen Aanwezigheid van Salmonella bepalen op slachthuisniveau Contaminatiecycli in het slachthuis Detectiemethode voor Salmonella op dierniveau
Differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van verschillen in de mntH genexpressie
Experimenteel deel
Doelstellingen Aanwezigheid van Salmonella bepalen op slachthuisniveau Contaminatiecycli in het slachthuis Detectiemethode van Salmonella op dierniveau
Differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van verschillen in de mntH genexpressie
Salmonella t.h.v. het slachthuis 5 verschillende slachthuizen (A, B, C, D, E) A, C en D twee bemonsteringen (vb A1, A2) A2 en D1 : bemonstering gedurende de volledige slachtdag (28 en 38 bedrijven) andere bemonsteringen: beslag afkomstig van één bedrijf Salmonella-status van de hoeve gekend
“Onreine zone”
* Rectaal pistool
Evisceratie
Wachthokken *
“Reine zone”
Doden
*
Dikke darm en MLN
Polijsten Broeibak
* Splitten * Diafragma Branden
*
Veterinaire inspectie SKG-II klassificatie op basis van de karkaskwaliteit Verdere handelingen op karkassen
Ontharen
* Karkasswabs
* * Staalnames
* kar. swabs Snelle koeling (- 25°C)
Frigo(4°C)
*
Bacteriologisch onderzoek Omgevingsstalen Overschoenen Slachtgereedschap
Individuele dieren Dikke darm Darmlymfeknopen Karkasswabs
Serologisch onderzoek
Bacteriologisch onderzoek
Serologisch onderzoek
Omgevingsstalen Overschoenen Slachtgereedschap
Individuele dieren Dikke darm Darmlymfeknopen Karkasswabs
Individuele dieren Diafragma
Isolatie en identificatie van Salmonella Niet-selectieve aanrijking (BPW) 37°C 24h
omgevingsswabs overschoenen 5 g feces 10 g mesenteriale lymfeknopen
Rappaport Vassidialis (10 ml) 42°C 24h en 48h
XLD 37°C 24h
Rappaport Vassidialis (2 ml) 42°C 24h en 48h
XLD 37°C 24h
Semi-solid medium Diassalm 42°C 24h
XLD 37°C 24h
⇒ Identificatie via Salmonella specifieke PCR
Staal Totaal
medium
Nr. stalen
Diassalm+RV10 ml + RV2 ml
100
Diassalm
1337
95.3
RV 10 ml
1337
84.3
Diassalm+RV10 ml
Feces
Gevoeligheid %
100
RV 2 ml
240
68.8
Diassalm
345
89.2
RV 10 ml
345
73.8
RV 2 ml
57
45.8
De prevalentie van Salmonella in de omgeving (5) Staal type Wachthokken Onreine zone Broeibakwater Rectaal pistool Messen Karkassplitter Overschoen voor Overschoen tijdens Overschoen frigo
+/geanalyseerde stalen % positief 11/11 100 34/37 92 0/3 0 1/5 20 11/41 27 3/11 27 2/8 25 55/64 86 4/10 40
De prevalentie van Salmonella bij de varkens (5) Staal type
Karkas
+/geanalyseerde stalen % positief
138/370
37
Karkas frigo
12/75
16
Feces
65/345
19
M-lymfeknopen
73/346
21
Feces en/of MLK
98/346
28
Contamination frequencies
De Salmonella contaminatie in de verschillende slachthuizen 100 90 80 70 60
■ karkas
50 40
■ dikke darm
30
░ MLK
20 10 0 A1
A2
B
C1
Slachthuis
C2
D1
E
Salmonella serotypes REP-PCR Omgeving
Karkas Infantis
8%
Brandenburg Livingstone Typhimurium
25%
Derby 39.6%
Feces
London Ohio
38.8%
M-Lymfeknopen
Anatum Andere
8%
68%
11%
25%
Karkascontaminatie (5) slachthuizen Karkas (138 +)
Omgeving
70 %
30 %
Feces (65+)
M-Lymfeknopen (73 +)
Salmonella contaminatie in twee commerciële slachthuizen gedurende een volledige slachtdag A2
40
D1 X 10% Positief positive
Positief e % positive
35 30 25 20 15 10 5 0 ■Feces /MLK ■Karkas
0
1000
2000
geslachte varkens
25 % van de karkassen besmet
3000
8 7 6 5 4 3 2 1 0 0
1000
2000
3000
geslachte varkens
70 % van de karkassen besmet
4000
Verdere differentiatie van de Salmonella isolaten Pulsed field gelelektroforese (PFGE)
Salmonella Typhimurium
Antibiotica resistentie profiel (ARP)
Salmonella Derby
ampicilline, tetracycline, streptomycine,
Salmonella Ohio
nalidixine zuur, chloramfenicol en sulfadiazine PFGE-XbaI
PFGE-BlnI
XbaI+ BlnI
100
90
80
70
% homology
T11/T11a T11/T11 T8/T12 T2/T2a T2/T2 T8/T8 T9 T10 T4/T4 T4/T4a T5 T6 T1 T3
yp hi m S. ur iu Ty m ph T1 im S. ur iu Ty m ph T3 im S. ur iu Ty m ph T4 im S. ur iu Ty m ph T5 im S. ur iu Ty m ph T6 im S. ur iu Ty m ph T8 im S. ur Ty iu m ph T9 im ur i um S. B T1 ra 1 nd en bu S. rg D er by D S. 1 D er by D S. 2 D er by D S. 3 D er by D 4 S. In fa nt is S. V irc ho S. w Li vi ng st on e S. O hi o S. Lo nd on S. R is se S. n G ol dc oa st
S. T
Aantal isolaten
nr. of isolates
Slachthuis A2
16
14
12
10
8
6
4
2
0
■Omgeving
25% het corresponderend dier
47% eerder geslachte varkens
28% slachtomgeving ■Karkas
■Dier
yp hi m S. ur Ty iu ph m S. im T2 Ty ur iu ph m im S. T8 u Ty ri u ph m im T1 ur 0 iu m (N S. D D ) er S. by D D er 2 by D 1/ S. D D 5 er by N S. D In fa nt is S. A na tu m S. A go na S. P an S. am Li vi ng a s S. 4 7 tone :Z 4Z 13 :-
S. T
Aantal isolaten nr. of isolates
Slachthuis D1
60
50
40
30
20
10
0
4% het corresponderend dier
Continue contaminatiebron
Aërosol vorming ■Omgeving
■Karkas
■Dier
De belangrijkste bronnen voor karkascontaminatie Aanvoer van Salmonella besmette dieren Het varken zelf dat drager is van Salmonella, in combinatie met de evisceratie Besmette dieren die eerder tijdens de dag werden geslacht
Besmette slachtomgeving
Serologisch Vleesnat Mixed-ELISA: Salmotype®-ELISA Antilichamen detectie (verschillende O antigenen: 1, 4, 5, 6, 7 en 12) 90% van de Salmonella serotypes worden gedetecteerd Lineair verband tussen antilichaamconcentratie en O.D.450nm
Cut-off waarden 1,5 OD 450nm
y = 0,0231x + 0,1374 1 0,5 0 0
*
20
40
60
antilichaamconc. %
In de kit voorstel om cut-off waarde O.D.% ≥ 40 te gebruiken In literatuur wordt ook O.D. % ≥ 10 en 20 gebruikt
Level Bacteriologisch Status (aantal varkens) varken
Totaal
Cut-off<10 Cut-off≥10 Cut-off<40 Cut-off≥40
- (226)
117
109
198
28
+ (97) (30%)
25
72
46
51
323
142
181 (56%)
244
79 (24.4%)
Bacteriologisch status van het individuele dier bepaald op de aanwezigheid van Salmonella in de darm of MLK
24.4% (cut-off ≥ 40) 56% (cut-off ≥ 10) 17.6% serologisch negatief maar bacteriologisch positief Beste correlatie met het bacteriologisch status wanneer cut-off ≥ 40
Besluiten Hoge karkascontaminatie (37%) 28% van de varkens bacteriologisch positief Complexe contaminatiecycli Dier Eerder geslachte dieren Omgeving
Tussen de slachthuizen grote variaties Serologisch 24.4% van de individuele dieren positief (cut-off ≥ 40) Serologische screening alleen laat niet toe om recent besmette varkens te detecteren (17.6%)
Besluiten Salmonella Typhimurium en Derby meest geïsoleerde serotypes Salmonella Typhimurium en Derby zijn genotypisch heel divers PFGE ARP
51% van de stammen resistent t.o.v. ten minste 1 antibioticum Salmonella Typhimurium DT104 13.3% (penta-resistent)
Karkascontaminatie reduceren Hygiëne en desinfectie in het slachthuis Uitscheiding van Salmonella doen dalen Bestrijding van de infectie t.h.v. het varkensbedrijf
Binnen serotype Salmonella Typhimurium bestaat er een sterke genetische diversiteit Een specifieke kloon geassocieerd met varkens kon niet worden geïdentificeerd Persisterende stammen : van varkensbedrijf tot in het slachthuis BELANG VOOR KARKASCONTAMINATIE
Niet-persisterende stammen (omgeving van het varkensbedrijf maar niet in het dier)
Doelstellingen Prevalentie van Salmonella op hoeve en slachthuisniveau Contaminatiecyli in het slachthuis
Differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van verschillen in de mntH genexpressie
Pathogenese van Salmonella Na opname verschillende barrières Zure pH Galzouten
Adhesie fimbriae
Invasie van het darmepitheel en kolonisatie van de darm (Intestinale fase, SPI-1) Overleving van Salmonella in de macrofaag en kolonisatie van de organen (Systemische fase)
Systemische fase Lumen
Epitheel
Lamina propria
Chemotactische factoren
Macrofaag Verspreiding naar de organen
Interactie van Salmonella met de macrofaag Salmonella containing vacuole (SCV)
Overleving en vermenigvuldiging van Salmonella in de macrofaag
Afdoding van Salmonella in de macrofaag
De genen van pathogeniciteitseiland 2 spelen hierbij een belangrijke rol
Gastheer “Respiratory Burst” Zuurstofradicalen Superoxide, waterstofperoxide
Fusie met lysosomen
Salmonella Verdedigingsmechanisme SPI-2 Andere genen zoals het mntH (H+-afhankelijk divalent transport eiwit) Enzymen (Mn-Superoxidedismutase)
De rol van mntH X2+
NRAMP1 2+
X
X2+
MntH SOD CAT
X2+ X2+
mntH = H+afhankelijke divalent transporter eiwit bacterieel homoloog van Nramp1 26-29% homologie met Nramp1
Cytoplasm
SCV
Rol in de virulentie bij muizen
Genexpressie van mntH DNA niveau gen aanwezig bij alle S. enterica stammen Transcriptie
mRNA niveau Translatie
Eiwit niveau
?
Kwantificatie van de genexpressie Staal
set -up
RNA
RNA isolatie
Staalname Stabiliteit RNA
Totaal RNA
Lyse van de bacteriën
Bewaring DNase behandeling
cDNA
RT-reverse transcriptase Twee staps reactie Random hexameren
PCR Real time PCR amplificatie Primer design cDNA mRNA aanwezig
Optimalisatie en standaardisatie van de verschillende stappen noodzakelijk
Real-time PCR Meten van de hoeveelheid amplificatieproduct in iedere cyclus van de PCR reactie Standaardcurve 1/2 verdunning van een bepaald cDNA Lineair verband tussen Ct waarde en – [log10concentratie] y=ax+b a: een maat voor de reactie-efficiëntie (- 3.2) Ongekend staal: [conc] ↓ → Ct waarde ↑
Normalisatie De expressie van het gen van interesse wordt uitgedrukt t.o.v. een endogene controle controlegen of huishoudgen Compenseert voor de verschillende hoeveelheden RNA gebruikt in de reactie Constitutief tot expressie tijdens experimentele condities 16S rRNA , rpoD en het gmk
Via geNorm wordt de genstabiliteit en de normalisatiefactor berekend
Keuze van de Salmonella stammen Fenotypisch als genotypisch divers Oorsprong Serotype PFGE type Persisterende vs. niet-persisterende stammen
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 555 585 615 645 675 705 735 765 795 min. min. min. min. min. min. min. min. min. Time (min)
cfu /m l
n g (rescaled )
De mntH genexpressie is groeiafhankelijk
▬
groei
■mntH ■rpoD ■16S rRNA
Invloed van fagosoom vergelijkbare condities op de mntH genexpressie Inducer
BHI n=18
Sauton (5µM Fe2+) n=14a
Monocytes n= 11
NIT=0 min
0.053 (±0.021)c
0.157 (±0.069) α
0.086 (± 0.016)b
H2O2
0.532 (±0.323)*
5.950 (±4.794)*,δ
0.160 (± 0.053)*,c
NIT=45 min
0.062 (±0.027)
ND
EDTA
0.323 (±0.202)*
ND
Inductie van de mntH genexpressie H2O2 en EDTA Minimale groeicondities Intracellulair
α M B 1 M 170 B 1 M 689 B 2 M 108 B 2 M 109 B 2 M 115 B 2 M 126 B 2 M 136 B 2 M 150 B 2 M 156 B 2 M 208 B 2 M 216 B 2 M 223 B 2 M 233 B 2 M 484 B 2 M 486 B 2 M 491 B 2 M 495 B 24 97
Genormaliseerde mntH expressie
* α *
waterstofperoxide M B 1 M 170 B 1 M 689 B 2 M 108 B 2 M 109 B 2 M 115 B 2 M 126 B 2 M 136 B 2 M 150 B 2 M 156 B 2 M 208 B 2 M 216 B 2 M 223 B 2 M 233 B 2 M 484 B 2 M 486 B 2 M 491 B 2 M 495 B 24 97
De mntH genexpressie bij verschillende Salmonella enterica stammen
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
EDTA ■zonder inductie
■na inductie
Variatie tussen de stammen Geen verband met fenotypische of genotypische eigenschappen van de onderzochte stammen
Besluiten mntH genexpressie is groeiafhankelijk Condities die de fagosoom nabootsen induceren de mntH genexpressie Er kon geen sub-populatie van Salmonella persisterende stammen worden geïdentificeerd aan de hand van verschillen in de mntH genexpressie
Algemeen besluit Karkassen sterk besmet met Salmonella Voornamelijk afkomstig van het dier Na verdere differentiatie van de stammen complexere contaminatiecycli Slachthuis identiteit van belang Geen sub-populatie van Salmonella persisterende stammen kon worden geïdentificeerd aan de hand van verschillen in de mntH genexpressie
Bedankt voor uw aandacht
