Quantum Blue Calprotectin

®

Quantum Blue Calprotectin Kvantitativní laterální průtoková analýza

LF-CAL20 20 testů Poslední revize: 21.7. 2011

BÜHLMANN LABORATORIES AG Baselstrasse 55 CH - 4124 Schönenbuch, Switzerland Tel.: +41 61 487 1212 Fax: +41 61 487 1234 [email protected]

Zplnomocněný zástupce výrobce v České republice: BioVendor –Laboratorní medicína a.s. IČ: 63471507 Tůmova 2265/60, 616 00 Brno, tel: +420 549 124 111, fax: +420 549 211 465 Mail: [email protected], www.biovendor.cz

ZAMÝŠLENÉ POUŢITÍ ® BÜHLMANN Quantum Blue Calprotectin je imunoanalýza vytvořená pro kvantitativní určení ® kalprotektinu ve vzorcích stolice lidí (1-5) a to v kombinaci s BÜHLMANN Quantum Blue readerem. Pouze pro laboratorní pouţití. PRINCIP ANALÝZY Test je vytvořen pro selektivní měření antigenu kalprotektinu pomocí sendvičové imunoanalýzy. Testovací membrána je potaţena monoklonálními capture protilátkami (mAb) vysoce specifickými pro kalprotektin. Sekundární monoklonální detekční protilátky konjugované na částice koloidního zlata jsou naneseny na podloţku uvolňující konjugát a uvolní se do reakčního systému po přidání extrahovaného a naředěného vzorku stolice. Zlatý konjugát kalprotektin/anti-kalprotektin se naváţe na anti-kalprotektinové protilátky navázané na testovací membráně (testovací linie; testovací prouţek) a zbývající volný anti-kalprotektinový zlatý konjugát se naváţe na kozí antimyší protilátky navázané na testovací membráně (kontrolní linie; kontrolní prouţek). Intenzita signálu testovací linie a kontrolní linie ® je kvantitativně změřená pomocí BÜHLMANN Quantum Blue readeru. DODÁVANÉ REAGENCIE A PŘÍPRAVA Reagencie Testovací kazeta Vakuově zabalená v hliníkové fólii Extrakční pufr RFID čipová karta

Mnoţství 20 ks

Kat.č. B-LFCAL-TC

Komentáře

120 ml 1 ks

B-CAL-EX B-LFCAL-RCC

Připraven k pouţití

Tabulka 1

DODÁVANÉ REAGENCIE A MATERIÁL DOPLŇKOVÉ Zařízení pro extrakci stolice Smart Prep TM Schebo® Quick-Prep

50 zkumavek 50 zkumavek

B-CAL-RD

1,3 ml, připraveno k pouţití

B-CAL-SOFI Tabulka 2

®

Kontroly pro BÜHLMANN Quantum Blue LF-CAL20 lze objednat zvlášť. 2 lahvičky 0,5 ml * Koncentrace kalprotektinu specifická pro šarţi Kontroly Low*/High*

B-CAL-CON

Připraveny k pouţití

Tabulka 3

UCHOVÁVÁNÍ A SKLADOVATELNOST REAGENCIÍ Všechny součásti soupravy jsou stabilní při 2-8°C do data exspirace vytištěného na štítcích. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ TÝKAJÍCÍ SE REAGENCIÍ Materiál humánního původu: Ţádná z reagencií obsaţená v soupravě není humánního původu. Se vzorky pacientů je třeba manipulovat jako s potenciálně biologicky nebezpečnými; řiďte se příslušnými bezpečnostními opatřeními. POTŘEBNÝ ALE NEDODÁVANÝ MATERIÁL Vortexovací zařízení pro extrakci stolice Přesné pipety s jednorázovými špičkami: 10-200 μl a 1 ml Centrifuga na mikrozkumavky Zkumavky Eppendorf na ředění extraktů (1:16) Stopky (volitelné) ® Quantum Blue reader od firmy BÜHLMANN (kat.č. BI-POCTR-ABS) Rukavice a laboratorní plášť Měkké papírové utěrky nebo blotovací papír

1

ODBĚR A UCHOVÁVÁNÍ VZORKŮ S pouţitím zařízení pro extrakci je nutné méně neţ 100 mg nativní stolice. Odeberte vzorek stolice do čistých zkumavek a uchovávejte v lednici při 2-8 °C max. po dobu 6 dní. Zamrazení vzorku můţe vést k slabému zvýšení hodnot kalprotektinu díky jeho uvolnění z neutrofilů přítomných ve vzorku. Proto je pro delší skladování výhodné extrakty uchovávat při –20 °C. Extrakty jsou stabilní nejméně 4 měsíce. Důleţité: Vzorek je třeba odebírat bez jakýchkoliv chemických nebo biologických přídavků do sběrného zařízení. POSTUP ANALÝZY Postup analýzy se skládá ze tří kroků: 1. Extrakce vzorků stolice: Extrakce je popsána v návodu k pouţití pro příslušné extrakční zařízení. 2. Zpracování vzorků: Před pouţitím pro analýzu extrakty vzorků stolice nařeďte 1:16 pomocí Extrakčního pufru (např. 20 μl vzorku a 300 μl pufru). Vortexujte. Centrifugujte naředěné extrakty po dobu 5 minut při 3’000 x g* a pokračujte v laterální průtokové analýze. * Jinou moţností je nechat extrakt stolice ustát po dobu 10 minut. Pro laterální průtokovou analýzu se pouţije supernatant. 3. Postup laterální průtokové analýzy Postup analýzy je detailně popsaný a nafocený na konci návodu, strana 6. POZNÁMKY K POSTUPU Všechny reagencie a testované vzorky se musí nechat před začátkem analýzy vytemperovat na ® pokojovou teplotu (18-28 °C). Quantum Blue reader se před začátkem analýzy musí spustit a ® naprogramovat na analýzu kalprotektinu (viz manuál Quantum Blue reader). Abyste dostali spolehlivé a kvantitativní výsledky je důleţité vzorky stolice kompletně homogenizovat pomocí extrakčního zařízení. Naředěné vzorky je třeba pouţít během několika hodin a nelze je uchovávat po delší dobu. Neředěné extrakty lze uchovávat při –20 °C nejméně po dobu 4 měsíců. Je důleţité extrakty před uchováváním zcentrifugovat (5 min při 3.000 x g). Po centrifugaci se musí supernatant přenést do čisté zásobní zkumavky. KONTROLA KVALITY Pro správné pouţívání produktu je nezbytné úplné pochopení tohoto návodu k pouţití. Nesprávně zpracovávané vzorky pacientů mohou mít nepřesné výsledky. Pokud shodnost analýzy nekoreluje s ustanovenými limity a opakování vyloučí technické chyby, zkontrolujte následující záleţitosti: i) pomůcky pro pipetování, kontrolu teploty a měření času, ii) datum exspirace reagencií a iii) podmínky skladování a inkubace. VALIDACE VÝSLEDKŮ U platného výsledku musí být v jakémkoliv případě viditelná kontrolní linie (C). (viz obrázky 1A a 1B). Pouţívá se pouze jako kontrola funkčnosti testu a nelze ji pouţívat pro interpretaci testovací linie (T). Pokud testovací linie (T) není detekovatelná ani po 12 minutách inkubace (obrázek 1A), je koncentrace kalprotektinu přítomného ve vzorku stolice pod detekčním limitem. Pokud je testovací linie (T) detekovatelná po 12 minutách inkubace (obrázek 1B), je koncentrace kalprotektinu ® přítomného ve vzorku stolice vypočítaná Quantum Blue readerem. Pokud je po 12 minutách inkubace detekovatelná pouze testovací linie (T) (obrázek 1C), výsledek testu je neplatný a analýzu kalprotektinu je třeba opakovat s pouţitím jiné testovací kazety. Pokud po 12 minutách inkubace není detekovatelná ani kontrolní linie (C) ani testovací linie (T) (obrázek 1D), výsledek testu je neplatný a analýzu kalprotektinu je třeba opakovat s pouţitím jiné testovací kazety. ®

Jelikoţ Quantum Blue reader umoţňuje kvantitativní hodnocení testovací (T) a kontrolní (C) linie, je zaručena další kontrola validity kontrolní linie (C). Pokud je intenzita signálu kontrolní linie (C) po 12

2

minutách inkubace pod prahem specifickým pro danou šarţi, výsledek testu je také neplatný a analýzu kalprotektinu je třeba opakovat s pouţitím jiné testovací kazety. STANDARDIZACE A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Laterální průtoková analýza je kalibrována pomocí testu BÜHLMANN Calprotectin ELISA (kat.č.: EK-CAL). ® BÜHLMANN Quantum Blue reader pouţívá pro výpočet koncentrace kalprotektinu šarţespecifickou standardní křivku Šarţe-specifická standardní křivka je vytvářena pomocí mediánových hodnot (n≥10 měření kaţdá) z ≥ 10 bodů kalibrace získaných z různých vzorků stolice o známé koncentraci kalprotektinu. Rozmezí analýzy je mezi 30 a 300 μg/g. Neznámé vzorky s hodnotami nad 300 μg/g, je třeba pro kvantitativní změření znovu testovat ® pomocí BÜHLMANN Quantum Blue High Range Calprotectin (kat.č.: LF-CHR20). LIMITACE Reagencie dodávané se soupravou jsou optimalizovány pro měření humánního kalprotektinu v extrahovaných vzorcích stolice. Hodnoty fekálního kalprotektinu by měly být při stanovování diagnózy pouţívány jako doplňkové údaje. Před vyslovením jakéhokoliv klinického a/nebo terapeutického rozhodnutí by se měly výsledky testu ® na kalprotektin získané pomocí rychlé analýzy BÜHLMANN Quantum Blue High Range Calprotectin potvrdit měřením dalších biomarkerů (jako je C-reaktivní protein) nebo opakováním kalprotektinového testu (s ELISA, kat.č. EK-CAL, nebo s pouţitím druhé testovací kazety) a porovnat s CDAI skóre a klinickým stavem pacienta. OČEKÁVANÉ HODNOTY Odhad fekálního kalprotektinu je spolehlivou a snadnou cestou jak rozlišit mezi funkčními a organickými chorobami zaţívacího traktu. Následující data byla stanovena pomocí BÜHLMANN Calprotectin ELISA (kat.č.: EK-CAL). V klinické studii bylo vyšetřeno 401 symptomatických po sobě jdoucích pacientů, objednaných na kolonoskopii (tabulka 16). Endoskopické vyšetření ukázalo 273 pacientů s funkčním onemocněním, kdeţto 128 pacientů mělo různé organické choroby (kolitida, Crohnova nemoc, divertikulitida, polypy, adenomy, rakovina nebo infekční choroby). Klinický cut-off 50 μg/g byl stanoven pomocí analýzy ROC křivky (AUC: 0.935). Aplikací tohoto cut-off na rozlišení mezi organickým a funkčním onemocněním můţe být dosaţeno klinické citlivosti 84.4% a specifičnosti 94.5%. Navrhovaná hladina cut-off pro dospělé (<50 μg/g) můţe být pouţita pro děti ve věku 4 aţ 17 let bez ohledu na pohlaví (6). Ačkoliv hladiny fekálního kalprotektinu u dospělých a dětí jsou obecně uváděny jako srovnatelné, hladiny u novorozenců se podstatně zvýší (5). Doporučuje se znovu testovat vzorky v šedé zóně mezi 30 a 70 μg/g, které korespondují s 2.5 – 97.5 percentilem nepřesnosti kolem cut-off 50 μg/g. CHARAKTERISTIKA PROVEDENÍ Limit pro blank (LoB): <7 μg/g kalprotektinu. LoB byl stanoven v souladu s CLSI protokolem EP17A ve třech nezávislých běţících testech s pouţitím tří různých šarţí testovacích kazet celkem s 60 hodnotami blanku s pouţitím extrakčního pufru jako vzorku. Limit detekce (LoD): <15 μg/g kalprotektinu. LoD byl stanoven pomocí dvou extraktů stolice s koncentracemi 14.5 a 28.5 μg/g. Vzorky byly měřeny pomocí tří různých šarţí testovacích kazet ve třech nezávislých běţících testech s 10 kopiemi od kaţdého vzorku, připravených během 10 minut. Byly stanoveny průměrné hodnoty SD a LoD byl odtud vypočten v souladu s CLSI protokolem EP17-A. Limit kvantifikace (LoQ): Spodní LoQ: ≤30 μg/g kalprotektinu; Horní LoQ: ≥ 300μg/g kalprotektinu. LoQ byl stanoven pomocí sedmi extraktů stolice v koncentracích 14,5 aţ 622 μg/g. Vzorky byly měřeny třemi různými šarţemi testovacích kazet ve třech nezávislých běţících testech kaţdý v 10-20 kopiích, připravených během 10 minut a zprůměrovaných. Výsledná shodnost je ukázána na obrázku 2. Limit kvantifikace koresponduje s koncentrací kalprotektinu s nepřesností pod 25 % CV, coţ umoţňuje kvantitativní měření v rozmezí od 30 (spodní LoQ) do 300 μg/g (horní LoQ). ®

Opakovatelnost: 19% CV. Opakovatelnost analýzy Quantum Blue Calprotectin byla spočítána ze dvou extrahovaných vzorků stolice obsahujících 49 a 138 μg/g kalprotektinu. Kaţdý vzorek byl testován dle postupu analýzy v jedno běţícím testu s 20 kopiemi připravených během 10 minut. Průměrné hodnoty tří různých šarţí testovacích kazet jsou představeny v (tabulka 17).

3

®

Shodnost mezi šarţemi: 22% CV. Shodnost mezi šarţemi Quantum Blue Calprotectin byl spočítána ze 4 extrahovaných vzorků stolice obsahujících mezi 30 a 244 μg/g kalprotektinu. Kaţdý vzorek byl testován dle pracovního postupu ve třech nezávislých běţících testech s 10-20 kopiemi od kaţdého, připravených během 10 minut s pouţitím tří různých šarţí testovacích kazet. Údaje mezi šarţemi u 4 vzorků se pohybovaly mezi 20.2 a 24.5% CV. Linearita: Čtyři vzorky stolice se zvýšenými koncentracemi kalprotektinu byly extrahovány dle pracovního postupu. Extrakty byly naředěny extrakčním pufrem a kaţdé ředění následně analyzováno na dvou testovacích kazetách dle pracovního postupu a zprůměrováno pro kaţdý testovací bod. Výsledky ukázaly linearitu v rámci indikovaného rozsahu měření od 30 do 300 μg/g pro Quantum ® Blue Calprotectin analýzu pro všechny 4 vzorky (R2 = 0.986 - 0.995). Jeden příklad je ukázán na (Obrázek 3). Průměrný rozdíl mezi naměřenými a očekávanými koncentracemi byl 2 %, coţ odpovídá zpětné výtěţnosti 98 %. Zpětná výtěţnost: 92%. Čtyři extrakty stolice obsahující nízké koncentrace kalprotektinu byly kontaminovány různým mnoţstvím zásobního roztoku s vysokou koncentrací kalprotektinu. Kaţdý vzorek byl měřen před a po umělé kontaminaci na třech testovacích kazetách dle pracovního postupu. Tři opakování byly zprůměrovány a průměrné hodnoty jsou ukázány v tabulce 18. Porovnání metod: R2 = 0.806. 101 extraktů stolice od osob podstupujících IBD versus IBS screening ® vykazující koncentrace kalprotektinu v rámci indikovaného rozsahu měření pro Quantum Blue Calprotectin analýzu bylo analyzováno dle pracovního postupu s pouţitím souboru dat pocházejících z testovacích kazet šesti různých šarţí a porovnáno s hodnotami získanými pomocí BÜHLMANN Calprotectin ELISA (kat.č.: EK-CAL). Korelační data jsou zobrazeny na obrázku 4.

4

Uvedení readeru do pohotovostního stavu: (viz Příloha I nebo nahlédněte do manuálu přístroje). - Stiskněte tlačítko ENTER na dobu 1 sekundy a tím reader zapněte. - Počkejte na autotest a kalibrační kontrolu, které se provádějí automaticky. - Vyberte <SCAN> a stiskněte ENTER. - Vyberte * a stiskněte ENTER. - Vyberte <User ID> a stiskněte ENTER. - Vyberte <SAMPLE ID> a stiskněte ENTER. - Vyberte a stiskněte ENTER. - Potvrďte ID a ID> výběrem a stiskněte ENTER. ID musí být .

Změna šarţe-specifických parametrů testu s pouţitím RFID čipové karty: (povinné pokud ID zobrazené na readeru není shodné s ID vytištěným na štítku testovací kazety nebo na šarţespecifickém QC listu dodávaném s testovací soupravou). Změňte ID a ID> pomocí výběru a stiskněte ENTER.

Umístěte RFID čipovou kartu na Tag pozici RFID readeru. Nové šarţe-specifické parametry testu se automaticky přenesou do firmwaru readeru. Reader je nyní připraven pro pouţití s novou šarţí testovací soupravy.

Připravení kazety kalprotektinu: Otevřete ochrannou fólii testovací kazety buď utrţením nebo odstřiţením nůţkami. Označte testovací kazetu pacientovým ID. Otevřete drţák readeru a umístěte do něj kazetu. Upozornění: - Aby nedošlo k mechanickému opotřebení, netlačte na svorky na zadní straně (šrafovaná šipka), kdyţ upevňujete testovací kazetu do drţáku. - Ujistěte se, ţe port pro načtení vzorku je umístěn na pravé straně tak, jak naznačuje šipka na obrázku.

5

1.

Pomocí přesné pipety naneste 60 μl naředěného a zcentrifugovaného extraktu stolice na port pro načtení vzorku testovací kazety.

Ihned po nanesení vzorku spusťte stopky zmáčknutím tlačítka ENTER na readeru. Upozornění: Abyste se vyhnuli kontaminaci optického zařízení readeru, zavřete drţák aţ po asi 30 sekundách. 2.

Po 12 minutách je testovací kazeta automaticky odečtena a spočítán výsledek testu. *) 4. Stiskněte tlačítko ENTER a tím se vraťte do hlavního menu. Poznámka: Výsledky posledních 100 testů budou uloţeny v rámci MEMORY MENU a mohou být opakovaně vyvolány (viz manuál přístroje). 3.

Alternativně můţe být test spuštěn v reţimu REMOTE s dodatečně dodaným softwarem (LF Control). Návod naleznete v manuálu softwaru. *) Alternativně

můţe být testovací kazeta měřena (skenována) bez pevné doby testu 12 minut. Pro tuto moţnost prosím vyberte a proveďte „ruční“ načasování 12 minutového inkubačního kroku. Testovací kazeta musí být testována po 12 ± 1 minutě.

6

PŘÍLOHA I ® STRUČNÝ POPIS QUANTUM BLUE READERU, RFID READERU A RFID ČIPOVÉ KARTY Vkládací zásobník pro testovací kazetu

Tlačítko ENTER (ve středu)

Obrazovka (displej)

Navigační tlačítka (nahoru, dolů, vlevo, vpravo)

Tag pozice RFID Readeru (zde umístěte RFID čipovou kartu)

RFID čipová karta

Přípojka k I/O portu(ům) Quantum ® Blue Readeru

7

PŘÍLOHA II-TABULKY A OBRÁZKY Obrázek 1

Obr. 1A

Tabulka 16

Výsledky testu

Obr. 1B

Obr. 1C

Obrázek 2

Profil shodnosti

Obr. 1D

Klinická studie Obrázek 3

Tabulka 17

Shodnost (Opakovatelnost)

Tabulka 18

Zpětná výtěţnost kontaminanty Obrázek 4

Popis tabulek: porovnej. “Standardizace a interpretace výsledků”, “Očekávané hodnoty” a “Charakteristika provedení” (str. 4).

8

Diagram linearity

Porovnání metod

LITERATURA 1. Tibble JA et al.: Use of surrogate markers of inflammation and Rome criteria to distinguish organic from nonorganic intestinal disease. Gastroenterol 123, 450-460 (2002) 2. Fagerhol MK: Calprotectin, a faecal marker of organic gastrointestinal abnormality. Lancet 356, 1783-4 (2000) 3. Hessian PA and Fisher L: The heterodimeric complexof MRP-8 (S100A8) and MRP-14 (S100A9). Antibody recognition, epitope definition and the implications for structure. Eur J Biochem 268, 353-63 (2001). 4. Tibble JA et al.: A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn’s disease. Gut 47, 506-513 (2000). 5. Konikoff MR and Denson LA: Role of fecal calprotectin as a biomarker of intestinal inflammation in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 12(6), 524-34 (2006) 6. Fagerberg UL et al. : Colorectal inflammation is well predicted by fecal calprotectin in children with gastrointestinal symptoms. J Pediatr Gastroenterol Nutr 40, 450-5 (2005) SYMBOLY Pouţitelné do Katalogové číslo Šarţe Pro in vitro pouţití Obsah dostačuje pro testů Viz návod k pouţití Rozmezí teplot Testovací kazeta Extrakční pufr RFID čipová karta

Datum revize: 21.7. 2011

9