Quantum Blue Calprotectin High Range

®

Quantum Blue Calprotectin High Range Kvantitativní laterální průtoková analýza

LF-CHR20 20 testů Poslední revize: 17.5. 2011

BÜHLMANN LABORATORIES AG Baselstrasse 55 CH - 4124 Schönenbuch, Switzerland Tel.: +41 61 487 1212 Fax: +41 61 487 1234 [email protected]

Zplnomocněný zástupce výrobce v České republice: BioVendor –Laboratorní medicína a.s. IČ: 63471507 Tůmova 2265/60, 616 00 Brno, tel: +420 549 124 111, fax: +420 549 211 465 Mail: [email protected], www.biovendor.cz

ZAMÝŠLENÉ POUŢITÍ ® BÜHLMANN Quantum Blue Calprotectin High Range je imunoanalýza vytvořená pro kvantitativní určení zvýšených koncentrací kalprotektinu ve vzorcích stolice lidí (1-5) a to v kombinaci s ® BÜHLMANN Quantum Blue readerem. Pouze pro laboratorní pouţití. PRINCIP ANALÝZY Test je vytvořen pro selektivní měření antigenu kalprotektinu pomocí sendvičové imunoanalýzy. Testovací membrána je potaţena monoklonálními capture protilátkami (mAb) vysoce specifickými pro kalprotektin. Sekundární monoklonální detekční protilátky konjugované na částice koloidního zlata jsou naneseny na podloţku uvolňující konjugát a uvolní se do reakčního systému po přidání extrahovaného a naředěného vzorku stolice. Zlatý konjugát kalprotektin/anti-kalprotektin se naváţe na anti-kalprotektinové protilátky navázané na testovací membráně (testovací linie; testovací prouţek) a zbývající volný anti-kalprotektinový zlatý konjugát se naváţe na kozí antimyší protilátky navázané na testovací membráně (kontrolní linie; kontrolní prouţek). Intenzita signálu testovací linie a kontrolní linie ® je kvantitativně změřená pomocí BÜHLMANN Quantum Blue readeru. DODÁVANÉ REAGENCIE A PŘÍPRAVA Reagencie Testovací kazeta Vakuově zabalená v hliníkové fólii Extrakční pufr Chase pufr

Mnoţství 20 ks

Kat.č. B-LFCHR-TC

Komentáře

1 láhev, 120 ml 1 láhev, 100 ml

B-CAL-EX B-CHR-CB

Připraven k pouţití Ředící pufr, Připraven k pouţití

RFID čipová karta

1 ks

B-CHR-RCC Tabulka 1

DODÁVANÉ REAGENCIE A MATERIÁL DOPLŇKOVÉ Zařízení pro extrakci stolice popsané níţe není dodáváno se soupravou a kterékoliv z nich musí být se soupravou objednáno. Smart Prep 50 zařízení B-CAL-RD TM Schebo® Quick-Prep 50 zkumavek B-CAL-SOFI Naplněno 1,3 ml extrakčního pufru Tabulka 2

Kontroly lze objednat zvlášť. Kontroly Low*/High*

2 lahvičky 0,5 ml * Koncentrace kalprotektinu specifická pro šarţi

B-CHR-CONSET

Připraveny k pouţití Tabulka 3

UCHOVÁVÁNÍ A SKLADOVATELNOST REAGENCIÍ Všechny součásti soupravy jsou stabilní při 2-8°C do data exspirace vytištěného na štítcích. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Materiál humánního původu: Ţádná z reagencií obsaţená v soupravě není humánního původu. Se vzorky pacientů je třeba manipulovat jako s potenciálně biologicky nebezpečnými; řiďte se příslušnými bezpečnostními opatřeními. POTŘEBNÝ ALE NEDODÁVANÝ MATERIÁL Vortexovací zařízení pro extrakci stolice Přesné pipety s jednorázovými špičkami: 10-100 μl a 3 ml Centrifuga 5 ml polypropylenové nebo polystyrenové zkumavky na ředění extraktů Stopky (volitelné) ® Quantum Blue reader od firmy BÜHLMANN (kat.č. BI-POCTR-ABS) Rukavice a laboratorní plášť Měkké papírové utěrky nebo blotovací papír

1

ODBĚR A UCHOVÁVÁNÍ VZORKŮ S pouţitím zařízení pro extrakci, které je dodáváno na poţádání, je nutné méně neţ 1 g nativní stolice. Odeberte vzorek stolice do čistých zkumavek a uchovávejte v lednici při 2-8 °C max. po dobu 6 dní. Zamrazení vzorku můţe vést k slabému zvýšení hodnot kalprotektinu díky jeho uvolnění z neutrofilů přítomných ve vzorku. Proto je pro delší skladování výhodné extrakty uchovávat při –20 °C. Extrakty jsou stabilní nejméně 4 měsíce. Důleţité: Vzorek je třeba odebírat bez jakýchkoliv chemických nebo biologických přídavků do sběrného zařízení. POSTUP ANALÝZY Postup analýzy se skládá ze tří kroků: 1. Extrakce vzorků stolice: Extrakce je popsána v návodu k pouţití pro příslušné extrakční zařízení. 2. Zpracování vzorků: Před pouţitím pro analýzu extrakty vzorků stolice nařeďte 1:150 pomocí Chase pufru (např. 20 μl vzorku a 3000 μl pufru). Vortexujte. Centrifugujte naředěné extrakty po dobu 5 minut při 3’000 x g* a pokračujte v laterální průtokové analýze. * Jinou moţností je nechat extrakt stolice ustát po dobu 10 minut. Pro laterální průtokovou analýzu se pouţije supernatant (podívejte se na stranu 6). 3. Postup laterální průtokové analýzy Postup analýzy je detailně popsaný a nafocený na konci návodu, strana 6. POZNÁMKY K POSTUPU Všechny reagencie a testované vzorky se musí nechat před začátkem analýzy vytemperovat na ® pokojovou teplotu (18-28 °C). Quantum Blue reader se před začátkem analýzy musí spustit a naprogramovat na analýzu kalprotektinu High Range (CHR_0 a CHR_900 resp.) (viz manuál ® Quantum Blue reader). Abyste dostali spolehlivé a kvantitativní výsledky je důleţité vzorky stolice kompletně homogenizovat pomocí extrakčního zařízení. Vyvarujte se kontaminace stolicí v horní části zkumavky. Naředěné vzorky (uchovávané při 2-8 ° C) je třeba pouţít během 24 hodin a nelze je uchovávat po delší dobu. Neředěné extrakty lze uchovávat při –20 °C nejméně po dobu 4 měsíců. Je důleţité extrakty před uchováváním zcentrifugovat (5 min při 3.000 x g). Po centrifugaci se musí supernatant přenést do čisté zásobní zkumavky. KONTROLA KVALITY Pro správné pouţívání produktu je nezbytné úplné pochopení tohoto návodu k pouţití. Nesprávně zpracovávané vzorky pacientů mohou mít nepřesné výsledky. Pokud shodnost analýzy nekoreluje s ustanovenými limity a opakování vyloučí technické chyby, zkontrolujte následující záleţitosti: i) pomůcky pro pipetování, kontrolu teploty a měření času, ii) datum exspirace reagencií a iii) podmínky skladování a inkubace. VALIDACE VÝSLEDKŮ U platného výsledku musí být v jakémkoliv případě viditelná kontrolní linie (C). (viz obrázky 1A a 1B). Pouţívá se pouze jako kontrola funkčnosti testu a nelze ji pouţívat pro interpretaci testovací linie (T). Pokud testovací linie (T) není detekovatelná ani po 15 minutách inkubace (obrázek 1A), je koncentrace kalprotektinu přítomného ve vzorku stolice pod detekčním limitem. Pokud je testovací linie (T) detekovatelná po 15 minutách inkubace (obrázek 1B), je koncentrace kalprotektinu ® přítomného ve vzorku stolice vypočítaná Quantum Blue readerem. Pokud je po 15 minutách inkubace detekovatelná pouze testovací linie (T) (obrázek 1C), výsledek testu je neplatný a analýzu kalprotektinu High Range je třeba opakovat s pouţitím jiné testovací kazety. Pokud po 15 minutách inkubace není detekovatelná ani kontrolní linie (C) ani testovací linie (T) (obrázek 1D), výsledek testu je neplatný a analýzu kalprotektinu High Range je třeba opakovat s pouţitím jiné testovací kazety.

2

®

Jelikoţ Quantum Blue reader umoţňuje kvantitativní hodnocení testovací (T) a kontrolní (C) linie, je zaručena další kontrola validity kontrolní linie (C). Pokud je intenzita signálu kontrolní linie (C) po 15 minutách inkubace pod prahem specifickým pro danou šarţi, výsledek testu je také neplatný a analýzu kalprotektinu High Range je třeba opakovat s pouţitím jiné testovací kazety. STANDARDIZACE A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Laterální průtoková analýza je kalibrována pomocí testu BÜHLMANN Calprotectin ELISA (kat.č.: EK-CAL). ® BÜHLMANN Quantum Blue reader pouţívá pro výpočet koncentrace kalprotektinu šarţespecifickou standardní křivku Šarţe-specifická standardní křivka je vytvářena pomocí mediánových hodnot (n≥10 měření kaţdá) z ≥ 10 bodů kalibrace získaných z různých vzorků stolice o známé koncentraci kalprotektinu. Rozmezí analýzy je mezi 100 a 1800 μg/g. Neznámé vzorky s hodnotami nad 1800 μg/g, je třeba pro kvantitativní změření naředit (např. 1:5) Chase pufrem a znovu analyzovat dle postupu. Abyste obdrţeli konečný výsledek, je třeba výsledný faktor ředění vynásobit naměřenou koncentrací. Neznámé vzorky s hodnotami pod 100 μg/g, je třeba pro kvantitativní změření znovu testovat ® pomocí BÜHLMANN Quantum Blue Calprotectin (kat.č.: LF-CAL20). LIMITACE Reagencie dodávané se soupravou jsou optimalizovány pro měření humánního kalprotektinu v extrahovaných vzorcích stolice. Hodnoty fekálního kalprotektinu by měly být při stanovování diagnózy pouţívány jako doplňkové údaje. Před vyslovením jakéhokoliv klinického a/nebo terapeutického rozhodnutí by se měly výsledky testu ® na kalprotektin získané pomocí rychlé analýzy BÜHLMANN Quantum Blue High Range Calprotectin potvrdit měřením dalších biomarkerů (jako je C-reaktivní protein) nebo opakováním kalprotektinového testu (s ELISA, kat.č. EK-CAL, nebo s pouţitím druhé testovací kazety) a porovnat s CDAI skóre a klinickým stavem pacienta. Během navazující léčby by výsledky testu kalprotektinu získané pomocí rychlé analýzy BÜHLMANN ® Quantum Blue Calprotectin High Range měly být interpretovány v porovnání s předchozími výsledky a v kontextu s celkovým klinickým obrazem pacienta. CHARAKTERISTIKA PROVEDENÍ Limit pro blank (LoB): <60 μg/g kalprotektinu. LoB byl stanoven ve dvou nezávislých běţících testech s pouţitím dvou různých šarţí testovacích kazet celkem s 60 hodnotami blanku s pouţitím Chase pufru jako vzorku.LoB byl vypočítán jako průměr dvou běţících testů v souladu s CLSI protokolem EP17-A. Limit detekce (LoD): 95 μg/g kalprotektinu. LoD byl stanoven pomocí dvou extraktů stolice s koncentracemi 62 a 128 μg/g. Vzorky byly měřeny pomocí tří různých šarţí testovacích kazet ve dvou nezávislých běţících testech za den po dobu 10-20 dní. Byly stanoveny průměrné hodnoty SD a LoD byl odtud vypočten v souladu s CLSI protokolem EP17-A. Předloţené údaje jsou průměrem tří různých šarţí testovací kazety. Limit kvantifikace (LoQ): Spodní LoQ: <100 μg/g kalprotektinu; Horní LoQ: > 1800μg/g kalprotektinu. LoQ byl stanoven pomocí 11 extraktů stolice v koncentracích 24 aţ 2682 μg/g. Vzorky byly měřeny třemi různými šarţemi testovacích kazet ve dvou nezávislých běţících testech za den po dobu 10-20 dní. Byl určen celkový CV shodnosti, zprůměrován pro kaţdý vzorek a byl pouţit limit 30% CV. Linearita: Sériové ředění čtyř nezávislých vzorků mělo linearitu mezi naměřenou hodnotou a ředícím faktorem v rámci indikovaného rozsahu měření 100-1800 μg/g (R2=0.985-0.996) Jako příklad jsou na obrázku 2 ukázány mediány 4 kopií kaţdého ředění vzorku 1. Průměrný rozdíl mezi naměřenými a očekávanými koncentracemi byl 3 %, (zpětné výtěţnosti 103 %). Zpětná výtěţnost: 84-125%. Čtyři extrakty stolice obsahující nízké koncentrace kalprotektinu byly kontaminovány různým mnoţstvím zásobního roztoku s vysokou koncentrací kalprotektinu. Kaţdý vzorek byl měřen před a po umělé kontaminaci na třech testovacích kazetách dle pracovního postupu. Tři opakování byly zprůměrovány a průměrné hodnoty jsou ukázány v tabulce 16.

3

®

Opakovatelnost: 21% CV. Opakovatelnost analýzy Quantum Blue Calprotectin High Range byla spočítána ze čtyř extrahovaných vzorků stolice obsahujících 128 a 917 μg/g kalprotektinu. Kaţdý vzorek byl testován dle postupu analýzy v jedno běţícím testu s 20 kopiemi připravených během 10 minut. Průměrné hodnoty čtyř různých šarţí testovacích kazet jsou představeny v tabulce 17. ®

Shodnost mezi dny: <10% CV. Shodnost mezi dny pro analýzu Quantum Blue Calprotectin High Range byla spočítána dle CLSI protokolu EP5-A2 z šesti extraktů stolice s koncentrací kalprotektinu 128 aţ 1324 μg/g ve dvou kopiích za den po dobu 10-20 dní. Průměrné hodnoty tří různých šarţí testovacích kazet jsou představeny v tabulce 17. ®

Celková shodnost: 25% CV. Celková shodnost analýzy Quantum Blue Calprotectin High Range byla spočítána dle CLSI protokolu EP5-A2 ze šesti extraktů stolice s koncentrací kalprotektinu 128 aţ 1324 μg/g testovaných ve dvou běţících testech denně (1 ráno, 1 odpoledne) po dobu 10-20 dní. Průměrné hodnoty tří různých šarţí testovacích kazet jsou představeny v tabulce 17. ®

Shodnost mezi šarţemi: 21,1% CV. Shodnost mezi šarţemi Quantum Blue Calprotectin High Range byl spočítána ze 4 extrahovaných vzorků stolice obsahujících mezi 128 a 917 μg/g kalprotektinu. Kaţdý vzorek byl testován dle pracovního postupu ve třech nezávislých běţících testech s 20 kopiemi od kaţdého, připravených během 10 minut s pouţitím tří různých šarţí testovacích kazet (n=60 opakování od kaţdé). Údaje mezi šarţemi u 4 vzorků se pohybovaly mezi 17.0 a 22.9 % CV. Porovnání metod: R2 = 0.86-0,93. 54 extraktů stolice od osob s podezřením na IBD vykazující ® koncentrace kalprotektinu v rámci indikovaného lineárního rozmezí pro Quantum Blue Calprotectin High Range analýzu bylo analyzováno dle pracovního postupu s pouţitím dvou různých šarţí testovacích kazet (šarţe A a šarţe B) ve dvou běţících testech kaţdá a porovnáno s hodnotami získanými pomocí BÜHLMANN Calprotectin ELISA, s rozšířeným rozmezím (kat.č.: EK-CAL). Korelační data jsou prezentována v tabulce 18 a jeden příklad je zobrazený na obrázku 3.

4

Uvedení readeru do pohotovostního stavu: (viz Příloha I nebo nahlédněte do manuálu přístroje). - Stiskněte tlačítko ENTER na dobu 1 sekundy a tím reader zapněte. - Počkejte na autotest a kalibrační kontrolu, které se provádějí automaticky. - Vyberte <SCAN> a stiskněte ENTER. - Vyberte * a stiskněte ENTER. - Vyberte <User ID> a stiskněte ENTER. - Vyberte <SAMPLE ID> a stiskněte ENTER. - Vyberte a stiskněte ENTER. - Potvrďte ID a ID> výběrem a stiskněte ENTER. ID musí být .

Změna šarţe-specifických parametrů testu s pouţitím RFID čipové karty: (povinné pokud ID zobrazené na readeru není shodné s ID vytištěným na štítku testovací kazety nebo na šarţespecifickém QC listu dodávaném s testovací soupravou). Změňte ID a ID> pomocí výběru a stiskněte ENTER.

Umístěte RFID čipovou kartu na Tag pozici RFID readeru. Nové šarţe-specifické parametry testu se automaticky přenesou do firmwaru readeru. Reader je nyní připraven pro pouţití s novou šarţí testovací soupravy.

Připravení kazety kalprotektinu: Otevřete ochrannou fólii testovací kazety buď utrţením nebo odstřiţením nůţkami. Označte testovací kazetu pacientovým ID. Otevřete drţák readeru a umístěte do něj kazetu. Upozornění: - Aby nedošlo k mechanickému opotřebení, netlačte na svorky na zadní straně (šrafovaná šipka), kdyţ upevňujete testovací kazetu do drţáku. - Ujistěte se, ţe port pro načtení vzorku je umístěn na pravé straně tak, jak naznačuje šipka na obrázku.

5

1.

Pomocí přesné pipety naneste 80 μl naředěného a zcentrifugovaného extraktu stolice na port pro načtení vzorku testovací kazety.

Ihned po nanesení vzorku spusťte stopky zmáčknutím tlačítka ENTER na readeru. Upozornění: Abyste se vyhnuli kontaminaci optického zařízení readeru, zavřete drţák aţ po asi 30 sekundách. 2.

Po 15 minutách je testovací kazeta automaticky odečtena a spočítán výsledek testu. *) 4. Stiskněte tlačítko ENTER a tím se vraťte do hlavního menu. Poznámka: Výsledky posledních 100 testů budou uloţeny v rámci MEMORY MENU a mohou být opakovaně vyvolány (viz manuál přístroje). 3.

Alternativně můţe být test spuštěn v reţimu REMOTE s dodatečně dodaným softwarem (LF Control). Návod naleznete v manuálu softwaru. *) Alternativně

můţe být testovací kazeta měřena (skenována) bez pevné doby testu 15 minut. Pro tuto moţnost prosím vyberte a proveďte „ruční“ načasování 15 minutového inkubačního kroku.

6

PŘÍLOHA I ® STRUČNÝ POPIS QUANTUM BLUE READERU, RFID READERU A RFID ČIPOVÉ KARTY Vkládací zásobník pro testovací kazetu

Tlačítko ENTER (ve středu)

Obrazovka (displej)

Navigační tlačítka (nahoru, dolů, vlevo, vpravo)

Tag pozice RFID Readeru (zde umístěte RFID čipovou kartu)

RFID čipová karta

Přípojka k I/O portu(ům) Quantum ® Blue Readeru

7

PŘÍLOHA II-TABULKY A OBRÁZKY Obrázek 1

Obr. 1A

Obrázek 2

Výsledky testu

Obr. 1B

Obr. 1C

Tabulka 17

Obr. 1D

Shodnost

nd* = nestanoveno

Linearita Tabulka 18

Korelace

** graf na obrázku 3

Tabulka 16

Zpětná výtěţnost Obrázek 3

8

Porovnání metod

LITERATURA 1. Tibble JA et al.: Use of surrogate markers of inflammation and Rome criteria to distinguish organic from nonorganic intestinal disease. Gastroenterol 123, 450-460 (2002) 2. Fagerhol MK: Calprotectin, a faecal marker of organic gastrointestinal abnormality. Lancet 356, 1783-4 (2000) 3. Hessian PA and Fisher L: The heterodimeric complex of MRP-8 (S100A8) and MRP-14 (S100A9). Antibody recognition, epitope definition and the implications for structure. Eur J Biochem 268, 353-63 (2001). 4. Tibble JA et al.: A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn’s disease. Gut 47, 506-513 (2000). 5. Konikoff MR and Denson LA: Role of fecal calprotectin as a biomarker of intestinal inflammation in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 12(6), 524-34 (2006) SYMBOLY Pouţitelné do Katalogové číslo Šarţe Pro in vitro pouţití Obsah dostačuje pro testů Viz návod k pouţití Rozmezí teplot Testovací kazeta Extrakční pufr Chase pufr RFID čipová karta

Datum revize: 17.5. 2011

9