PROTEOMIKA AZ ÉLELMISZER ELŐÁLLÍTÁSBAN. Czeglédi Levente Gulyás Gabriella Csősz Éva

PROTEOMIKA AZ ÉLELMISZER ELŐÁLLÍTÁSBAN Czeglédi Levente – Gulyás Gabriella – Csősz Éva

A PROTEOMIKA VIZSGÁLATI MÓDSZEREI I.

Az előadás vázlata • Molekuláris biológiai alapfogalmak • Proteomika, mint tudományterület • Gél alapú proteomika - a munka lépései - eszköztára

Biológiai alapismeretek DNS: - dezoxiribonukleinsav - örökítőanyag - szerkezete lehetővé teszi a genetikai információ tárolását, megkettőződését és átadását Forrás:http://www.astrochem.org

RNS: - ribonukleinsav - a gének kifejeződésében játszanak szerepet - hírvivő RNS (messenger, mRNS): a DNS információtartalmának szállítása a fehérjeszintézis helyére - szállító RNS (transfer, tRNS): aminosavak szállítása a fehérjeszintézis helyére - riboszomális RNS (rRNS): riboszómák felépítésében vesznek részt

Fehérje: - aminosavakból felépülő szerves makromolekulák - az aminosav sorrendet a DNS nukleotid szekvenciája kódolja a kódszótárnak megfelelően - elsődleges szerkezet: aminosav sorrend - másodlagos szerkezet: polipeptidlánc konformációja - harmadlagos szerkezet: a fehérje háromdimenziós szerkezete - negyedleges szerkezet: több polipeptidlánc aggregációja, összetett fehérjék szerkezete

• Transzkripció: a DNS-ben tárolt információ átíródása hírvivő (mRNS) molekulákra • Transzláció: az átíródott mRNS nukleotid sorrendjének megfelelő aminosav sorrendű polipeptid képződése • Poszt-transzláció: megváltozhatnak a fehérjék egyes kémiai tulajdonságai (pl.: foszforiláció, glikolizáció) ill. a fehérjék irreverzibilis hasítását jelentheti (proteázok)

Transzkripció Fázisai: INICIÁCIÓ: RNS polimeráz kötődése, transzkripciós kezdőpont (promoter), DNS szál széttekeredik ELONGÁCIÓ: lánchosszabbítás 5’-3’ irányban, hibrid hélix képződése TERMINÁCIÓ: terminációs szignálhoz ér, befejeződik az RNS szintézison Exon, intron szekvenciák

DNS kettős hélix RNS-polimeráz

Stop-szekvencia RNS

RNS

Transzláció Fázisai: INICIÁCIÓ: riboszóma kis és nagy alegysége + mRNS ELONGÁCIÓ: - riboszómán A(aminosav) és P(peptid) kötőhely - mRNS kodon és t-RNS antikodon párosodás - Met t-RNS-sel kezdődik a P helyen - újabb t-RNS az A helyen - peptidkötés kialakul - transzlokáció TERMINÁCIÓ: stop kodonig tart az elongáció, leáll a fehérje növekedés

fehérjelánc

aminosav

t-RNS

mRNS

riboszóma

Poszt-transzláció • 1. csoport: enzim által katalizált kovalens módosítás; aminosav oldalláncok kémiai tulajdonságai megváltoznak pl.: glikoziláció, aciláció, metiláció, foszforiláció, • 2. csoport: proteolízis; fehérjék peptidkötéseinek irreverzibilis hidrolitikus hasítása

„Omikák” DNS

Genomika

transzkripció

mRNS Transzkriptomika transzláció

Fehérje Proteomika poszt-transzláció

Funkció

Ugyanaz a genom!

Proteomika: adott időpillanatban egy sejtben vagy szövetben expresszálódó fehérjék összességével foglalkozó tudományterület

Proteomika történet 1975. O’Farrell nagy felbontású elválsztástechnika: két dimenziós gélelektroforézis, néhány ezer fehérje 1994. Wilkins proteom kifejezést először használta 1997. James proteomika kifejezés

Élelmiszer proteomika Élelmiszer minőség és biztonság Milyen hatással van az élelmiszer a fogyasztók egészségére/életfolyamataira

A feldolgozási folyamatok során hogyan változik a fehérje összetétel

Gél-alapú proteomikai vizsgálatok főbb lépései • Minta előkészítés: homogenizálás, fehérjék szolubizálása, frakcionálás • Elválasztás: - pH szerint (izoelektromos fókuszálás) - molekulasúly szerint (SDS-PAGE) • Festés: coomassie, ezüst, fluoreszcens • Gélelemzés: expressziós különbségek keresése

Intens. [a.u.]

? x10 4

1475.7

3

1307.6

1993.9

1638.8

1107.5

2211.1

2

1851.9 1

2329.1 2383.9

1082.5

2717.1 2510.1

0 1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2872.3 3052.6

2750

3000

3264.5

3250

m/z

Minta előkészítés • A proteomikai vizsgálatok sikerességét nagy mértékben befolyásolja a minta előkészítés • Figyelembe kell venni a fehérjék oldhatóságát, méretét, töltését, izoelektromos pontját • Hatékony minta előkészítés: - megakadályozza a fehérjék aggregációját - megakadályozza a fehérjék módosítását (enzimatikus, kémiai) - eltávolítja az interferáló anyagokat

Homogenizálás • Cél: szövetek, sejtek roncsolása, feltárása • Mechanikai: Potter-féle homogenizátor (kézi) Folyékony nitrogén - mozsár+mozsártörő Polytron - rotor+állórész Gyöngyök: koptató, nyíró hatás • Ultraszonikálás: ultrahangos roncsolás –kavitáció • Magas nyomás: French press • Fagyasztás-olvasztás

• A sejtek feltárását követően különböző vegyszerek segítségével végezzük a fehérjék kivonását a mintákból • A kivonásnál használt detergensek, amfolitok, redukáló ágensek és kaotrópikus sók koncentrációjának módosításával jelentős különbségeket érhetünk el a későbbi elválasztási lépések során.

Kaotrópikus ágensek • • • • • • •

Urea, thiourea Makromolekulák denaturálása Hidrogén kötéseket bont Fehérje aggregációk kialakulásának megakadályozása Thiourea gyengén oldódik vízben 37˚C fölött Karbamiláció Ajánlott: 2M thiourea, 8M urea

Detergensek • Amfipatikus molekulák (hidrofil+hidrofób) • Nem ionos detergensek: NP-40, Triton X-100 • Ikerionos detergensek: CHAPS 3-[(3-kolamidopropil)dimetilammónium]-1-propánszulfonát , CHAPSO, szulfobetainok (ASB-14) • Hidrofób kölcsönhatások megakadályozása (aggregációt, precipitációt okoznak) • Fehérjék oldhatósága nő • Ajánlott: max. 4% CHAPS

Redukáló ágensek • Intra- és intermolekuláris diszulfid kötéseket bontják • Dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), tributylphosphine (TBP) • Magas cisztein tartalmú fehérjéket a DTT nem tudja teljesen redukálni • TBP sokkal hatékonyabb, de toxikus! • Ajánlott: DTT max. 100mM TBP 2mM

Amfolitok • Stabilizálják a pH-t • Megakadályozzák az amino csoportok karbamilációját • A nem megfelelő só koncentrációt ellensúlyozzák • Túl magas amfolit koncentráció lelassítja az izoelektromos fókuszálást • Az első dimenzió pH tartományának megfelelő amfolit használata növeli a hatékonyságot

Proteáz inhibitorok • Proteáz: peptidkötések hidrolízise • A mintavétel során a szövetek kikerülnek természetes közegükből, a fehérjék nagyon gyorsan elkezdenek degradálódni (kisebb peptidek jönnek létre), nem az intakt állapotnak megfelelő képet kapjuk a fehérje összetételről • Ez megakadályozható: - azonnal folyékony nitrogénbe helyezzük a mintát - proteáz inhibitorok hozzáadásával - a kettő kombinációjával

• PMSF: leggyakrabban használt, szerinproteázok és néhány cisztein proteáz ellen hatásos, vízben hamar degradálódik • AEBSF: szerin-proteázok ellen • EDTA: metalloproteázok gátlása • Benzamidine: szerin-proteázok ellen • Aprotinin: szerin-proteázok ellen • Bestatin: aminopeptidázok ellen • Pepstatin: aszpartát-proteázok

Frakcionálás • Nagy gyakoriságú fehérjék depletálása:

ELŐTTE

UTÁNA

• Frakcionálás méret szerint: centrifugálással

• Szubcelluláris frakcionálás

• Frakcionálás oldhatóság szerint

• Ezekkel a frakcionálási módszerekkel növelhető a marker fehérjék megtalálásának valószínűsége

Kromatográfiás elválasztás • Frakcionálás egyik lehetséges módja • Lényege: álló fázis + mozgó fázis a minta komponensei az állófázissal és a mozgófázissal különböző típusú kölcsönhatásba lépnek, eltérő ideig tartózkodnak az álló-fázisban • Típusai a mozgófázis halmazállapota szerint: - gázkromatográfia, - folyadékkromatográfia - szuperkritikus folyadékkromatográfia

Szennyező anyagok • • • •

DNS/RNS Sók Lipidek Poliszacharidok

Zavarják a további elválasztási lépéseket!!!

Fehérje koncentráció meghatározása • Abszorbancia mérés 280nmen • Bradford reagens: Coomassie Brillant Blue 470nm-595nm, kék szín

• BCA módszer: bicinchoninic sav, 562nm, a peptidkötés redukálja a réz(II) iont réz(I) ionná, lila szín

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Mi a transzkripciós és a transzláció? • Mi indokolja a fehérjék frakcionálását?

• Melyek a mintaelőkészítés vegyszerei és szerepük?

Felhasznált és ajánlott irodalom • 2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation,Volume 1,2 Szerkesztő: Anton Posch • Thierry Rabillouda, Cécile Lelong (2011): Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial. Journal of proteomics, 1829 – 1841. • Wayne F. Patton (2002): Detection technologies in proteome analysis. Journal of chromatography B, 771, 3-31. • Jian-Zhong Han and Yan-Bo Wang (2008): Proteomics: present and future in food science and technology. Trends in Food Science & Technology 19, 26-30.

A PROTEOMIKA VIZSGÁLATI MÓDSZEREI II.

Az előadás vázlata • Kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis

-Első dimenzió -Második dimenzió

• Blue Native PAGE • Western-blot

Első dimenzió - Izoelektromos fókuszálás (IEF) • fehérjék elválasztása izoelektromos pontjuk(pI) alapján • pI: az a pH érték, amelynél a pozitív és a negatív töltések kiegyenlítik egymást, ilyenkor a molekula neutrális viselkedést mutat elektromos térben • Legtöbb fehérje izoelektromos pontja pH 3-12 tartományba esik • áram hatására a fehérjék vándorolnak a gélben elérik az izoelektromos pontjukat

pH3 IPG strip 4,5

pH10 5,9

4,5 6,9

5,9

4,8 4,5

4,5

5,9

4,5 6,9

8,2 6,9

4,5 4,8

4,5

5,9

IEF

pH3 IPG strip

pH10 4,5

4,8

5,9

6,9

8,2

Rögzített pH gradiens - stripek • Vékony gél csík egy műanyag fóliához polimerizálva, meghatározott pH tartománnyal • Könnyen kezelhető, jól ismételhető • Lineáris vs. nem-lineáris • Különböző pH tartományok: 3-10, 4-7, 5-8, 3-6, 7-10 • Különböző hosszúság: 7cm, 11cm, 17cm, 18cm, 24cm • Különböző rehidratálási térfogat: 7cm-125ul, 11cm-200ul, 17cm-300ul

Rehidratálás • fehérjék abszorbeálódnak a gélben (strip) • 11-16 óra • aktív: alacsony feszültség, a fókuszáló gépben passzív: csak abszorbció cup-loading: sok DNS/RNS/nagy molekulák Cup-loading sok glikoprotein bázikus IPG stripeknél szérum mintáknál, melyek még albumint tartalmaznak

Izoelektromos fókuszáló

Futtatási paraméterek • • • • •

Függ: minta típustól, pH gradinestől, strip hosszúságtól Áramerősség max: 50uA/strip Hőmérséklet konstans 20˚C 1 lépésben vagy 3 lépésben Kezdetben alacsony a feszültség, így elkerülhető az aggregáció és precipitáció • Volt-óra: pl: 9000Vhr= 9000V 1óra alatt vagy 4500V 2óra alatt 7cm – 8-10,000 V-hr 11cm – 20-35,000 V-hr 17cm – 40-60,000 V-hr

Problémák az IEF során Vízszintes csíkozottság: • Túl hosszú fókuszálási idő • Túl rövid fókuszálási idő • Túl sok fehérje a gélen • Sók, lipidek, nukleinsavak, poliszacharidok • Nem megfelelő rehidratáló oldat

IEF nincs optimalizálva

DNS szennyeződés, rövid fókuszálási idő

Equilibrálás • IEF után • Két különböző összetételű equilibráló puffert használnak egymást követően • Összetevők: urea, SDS, Tris puffer pH 8,8, glicerol, DTT/iodoacetamide • Urea, glicerol: electroendozmózis csökkentése • Tris puffer: megfelelő pH fenntartása • SDS: denaturálás, egységes negatív töltés

• Szulfhidril csoportok redukálása 1. equilibráló puffer 2%DTT • Szulfhidril csoportok alkilálása 2. equilibráló puffer 2,5% iodoacetamid • 10-15 perc / equilibráló puffer

Elégtelen equilibrálás

Második dimenzió – SDS PAGE • SDS PAGE: Szodium dodecil szulfát poliakrilamid gélelektroforézis • A fehérjék molekulasúly alapján történő elválasztása • SDS: negatív töltést ad, így már csak a molekulasúly különböző • A kisebb fehérjék gyorsabban mozognak -

-

+

- -

-

+

-

-

-

+ +

+

--

SDS

-

-

-

-

- -

-

pH3 IPG strip

pH10 5,9

4,5

6,9

8,2

4,8 4,8

Molekulasúly (kDa)

SDS-PAGE

8,2 4,5 5,9

4,8 6,9

Poliakrilamid gél • • • • •

Monomer: akrilamid Keresztkötő: N-N’-metilén-biszakrilamid T%:monomer mennyisége C%:keresztkötő mennyisége A polimerizáció katalizátorai: Ammonium perszulfat TEMED (N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine) • Különböző méretű gélek – különböző felbontás

Grádiens gél elektroforézis • Koncentráció grádiens: gél tetejétől az alja felé nő a pórusméret csökken • Lassabb migráció • Kis molekulasúlyú fehérjék tovább maradnak a gélben ugyanabban a gélben lehetséges a kis és nagy molekulasúlyú molekulák elválasztása • Komplex minták szeparálása • Általános: 8-16 T%

SDS-PAGE • Csak molekulasúly szerinti elválasztás • Elektroforézis előtt SDS-sel forralás • Gyűjtő (stacking) és elválasztó (resolving) gél

FELSŐ PUFFERTARTÁLY

ZSEBEK

GYŰJTŐ GÉL

ELVÁLASZTÓ GÉL

ALSÓ PUFFERTARTÁL Y

BlueNative-PAGE • A fehérjék szolubilizálása nem-denaturáló reagenssel + Coomassie brilliant blue (negatív töltést ad) • 1.dimenzió: natív gélelektroforézis (nem-denaturáló), a molekulák alakja és mérete is befolyásolja a futtatást • Gélsáv kivágása, SDS-es oldattal denaturálás • 2.dimenzió: 90°-kal elforgatás és egy grádiens SDS-es gél tetejére • Mitokondriális fehérjék vizsgálata

Molekulasúly csökken

SDSPAGE

BN-PAGE

elforgatás

1. dimenzió

2. dimenzió

16-BAC • Hidrofób membrán fehérjék vizsgálata • 1. dimenzió: kationos detergens 16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride) stacking gél pH 4,1; resolving gél pH 2,1 • Gélsáv kivágása, 90˚-kal elforgatás • 2. dimenzió: SDS-PAGE (molekulasúly szerinti elválasztás)

elforgatás

16-BAC

Molekulasúly csökken

SDSPAGE

2. dimenzió 1. dimenzió

DIGE (Differential in-gel electrophoresis) • Ugyanazon a gélen 2 minta + belső standard (kísérletben szereplő összes mintából képzett elegy) • Fluoreszcens festékkel jelölve: Cy2, Cy3, Cy5 a futtatás előtt • A festéknek megfelelő hullámhosszon scan • Előnyök: kevesebb gél, futtatásból adódó különbségek csökkennek (jobb az ismételhetőség), gélelemzés egyszerűbb, nagyon érzékeny módszer

Cy2

Cy3

Cy5

Cy2 Gélek elemzése

Cy3 2D-PAGE

MIX

Cy5

Cy3 kb. 575 nm

Gél festési eljárások • Három leggyakrabban használt: • Coomassie festés: érzékenység 10ng R-250: regresszív festés G-250: progresszív festés • Ezüst festés: érzékenysége 1ng nem végpontos festés, nem alkalmas mennyiségi összehasonlításra • Fluoreszcens festés: érzékenysége 1ng kvantitatív, pl.: Sypro Ruby

Gélelemző szoftverek • Ugyanaz a spot ugyanolyan futtatási paraméterek mellett sem mindig ugyanott helyezkedik el a gélen! • Okok: inhomogén poliakrilamid különbségek a hőmérsékletben különbségek az áramerősségben • A szoftverek segítségével: festésből adódó háttérzaj csökkentése spotok párosítása (matching) gélek egymásra illesztése (warping) fúziós gélek létrehozása spotok detektálása és kvantifikálása statisztikai próbák alkalmazása

Decodon, Germany • Delta2D Bio-Rad, USA • PDQuest, • ProteomWeaver Nonlinear Dynamics, UK • SameSpots • Progenesis

GE Healthcare • Decyder 2D Syngene, UK • Dymension

Western blot • Fehérjék kimutatásához antitesteket használnak SDS-PAGE • Lépései: - gélelektroforézis - transzfer nitrocellulóz vagy PVDF membránra - nem specifikus fehérjék blokkolása - fehérjék jelölése antitesttel - detektálás

Western blot

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Miért érdemes több dimenzióban elválasztani a fehérjéket? • Gélfestési eljárások összehasonlítása

• Mi a Western blot elve? Alkalmazhatósága?

Felhasznált és ajánlott irodalom • 2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation,Volume 1,2 Szerkesztő: Anton Posch • Thierry Rabillouda, Cécile Lelong (2011): Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial. Journal of proteomics, 1829 – 1841. • Kathryn S Lilley, David B Friedman (2006): Difference gel electrophoresis DIGE. Drug Discovery Today: Technologies 3,3. • Leo G.J. Nijtmans,Nadine S. Henderson,Ian J. Holtc (2002): Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods 26, 327– 334.

HÚS és HÚSTERMÉKEK PROTEOMIKÁJA I.

Az előadás vázlata • Izomszövet, mint hús és fehérjéi

• A hús minősége és azt befolyásoló proteinek: - porhanyósság

- márványozottság - szín - víztartóképesség - PSE/DFD

Húsfogyasztás • Világátlag: 42,5 kg/fő/év (2012) • Magyarország: 63,2 kg/fő/év (2005-2009) • Százalékos megoszlás Magyarországon: - Marha és borjúhús: 4,4% - Sertéshús: 44,6% - Baromfihús: 43,4% - Egyéb hús: 2,8% - Belsőség: 4,8%

Hús összetevők • • • •

56-72% víz 15-22% fehérje 5-34% intramuszkuláris zsír 3,5% szénhidrátok, sók, ásványi anyagok, vitaminok • Az összetevők arányát több tényező befolyásolja: faj, fajta, nem, életkor, tartási körülmények

Izomfehérjék • miofibrilláris fehérjék: - magasabb só koncentrációjú oldatokban oldhatóak - aktin, miozin, tropomiozin, troponin és a-, baktinin - melyeknek elsősorban az izommozgásában van szerepük

wikipedia.org alapján

• szarkoplazma fehérjék: - vízben és gyengébb sóoldatokban oldhatók albuminok, mioglobin, globuláris fehérjék, miogén, mitokondriális fehérjék, lizoszómák, liposzómák, szarkoplazmás retikulum hálózat • kötöszöveti fehérjék: - kollagén, elasztin, retikulin - vízben és sóoldatokban oldhatatlan frakciót képeznek

Élettani hatások • • • • •

A kiegyensúlyozott táplálkozás fontos része Teljes értékű fehérjeforrás, esszenciális aminosavak B1-, B2-, B6-, B12-, A- és D-vitamin Fontos ásványi anyagok: vas, cink, mangán, szelén Húsban lévő vas nagyobb mértékben hasznosul a felszívódás során, mint a növényi forrásból származó vas • Mértéktelen húsfogyasztás káros következményei: köszvény, reuma, érelmeszesedés

Proteomikai vizsgálatok célja • Húsminőség hátterében álló jelenségek feltérképezése • Húsminőség javítása, biomarker fehérjék azonosításával • Izomnövekedés és fejlődés vizsgálata • Feldolgozási folyamatok hatása a proteom összetételére • Hamisítások kiszűrése • Élelmiszerbiztonsági vizsgálatok

Húsminőség • A húsminőségben mutatkozó variancia gyakran jelent problémát a húsiparban • Proteomikai módszerek segítséget nyújthatnak e komplex tulajdonság tanulmányozásában • Post-mortem folyamatok is befolyásolják • Húsminőségi paraméterek: porhanyósság,víztartó képesség, márványozottság, lédússág, szín

Fehérje módosítások • - Kovalens módosítások: oxidáció, foszforiláció, acetiláció, glikoziláció, aciláció - Fehérje molekulák hasítása • Hatással vannak az élelmiszer különböző tulajdonságaira: emészthetőség, tápérték, szavatosság

• A módosítások megváltoztathatják a fehérjék molekulasúlyát és/vagy izoelektromos pontját 1D v. 2D PAGE használható kimutatáshoz vagy LC-MS/MS • Oxidáció minőségromlást okoz: csökkenti a hús víztartóképességét, a porhanyósságát és lédússágát valamint az emészthetőséget és tápértéket is

Porhanyósság • Az izomfehérjék postmortem degradációja fontos faktora a hús puhaságának • Nem sokkal vágás után elkezdődik • Miofbrilláris fehérjék degradációja okozza • Ezek a fehérjék biztosítják a miofibrillumok szerkezeti integritását, proteolitikus degradációjuk a miofibrillumok gyengüléséhez, végső soron a hús puhaságához vezet

Porhanyósság marker fehérjéi • troponin T, nebulin, titin, vinculin, desmin, dystrophin SDS-PAGE és immunoblot segítségével is bizonyították ezek post-mortem degradálódását • Titin és nebulin gyorsabban degradálódik a porhanyósabb húsban (lehetséges biomarkerek)

• Glikolitikus útvonal enzimjeinek expressziós szintje növekszik a porhanyós húsokban: triózfoszfát izomeráz, enolase 3, gliceraldehid 3-foszfát, piruvát-kináz Triózfoszfát izomeráz

Enoláz 3

• Oxidatív energia metabolizmus enzimjei a mitokondriumban, megnövekedett expressziós szintjük a hús porhanyósságát jelzi: 3-hydroxyisobutirát dehidrogenáz citokróm-c hydroxyacyl CoA-dehydrogenase izocitrát dehidrogenáz szukcinát dehidrogenáz szukcinil KoA dehidrogenáz

• Hősokk fehérjék: - védik a fehérjéket a denaturálástól és a funkcióvesztéstől - HSP60, HSP70, HSP40, HSP27 – marker fehérjék - megnövekedett expressziójuk a porhanyósággal ellentétes irányba hat (keményebb lesz a hús)

Elektromos stimuláció • Porhanyósság javítása post-mortem • Hidegrövidülés (izomban lévő ATP és a nem megfelelő Ca pumpa váltja ki) ellen hatásos • Izom összehúzódást indukál, mely az izomban lévő maradék ATP-t felhasználja • 2D-PAGE segítségével összehasonlítás: nem kezelt vs. elektromosan stimulált hús

• Eredmények: Elektromos stimuláció hatására: - metabolikus enzimek degradációja - ATP kiürülést segíti - kreatin kináz degradáció – nagyobb energia felhasználás - troponin-T, dezmin, aktin mennyisége csökken – proteolízis sebessége nő - csökken a miofibrilláris fehérjék stabilitása

Márványozottság • Intramuszkuláris zsírtartalom mennyisége és eloszlása • A hús ízének kialakításában nagyon fontos • Biomarker fehérjék Negatív korreláció a márványozottsággal: triózfoszfát izomeráz, szukcinát dehidrogenáz

Szín • Mioglobin és származékai határozzák meg a telítettséget és az árnyalatot • Mioglobin oxidáltságától függően: Dezoximioglobin (bíborvörös), oximioglobin (cseresznyepiros) metmioglobin (szürkés barna) tárolás során • L*: világossági tényező, a hús fényvisszaverési képességével függ össze

• Sertésnél L* biomarkerek: sötétebb húsban overexpresszió: - mitokondriális fehérjék, magyarázza az erősebb oxidatív metabolizmust - hemoglobin, jobban erezett a sötét hús - chaperonok (Hsp 27 és αB-christallin) világosabb húsban overexpresszió: - glikolízis néhány enzimje (enolázok) - proteolízis indikátorai

• a*: vörösség - Marhahús esetén pozitív korrleáció a* értékkel: aldóz reduktáz, reductase, keratin kináz, ß- enoláz, piruvát dehidrogenáz - Marhahús esetén negatív korrleáció a* értékkel: mitokondriális akonitáz • Szín stabilitása: pozitív korreláció Hsp27, piruvát dehidrogenáz, peroxiredoxin-2, stresszindukált foszfoprotein-1

Víztartó képesség • Vágás, hő vagy nyomás hatására is képes a hús megtartani a vizet • A post-mortem a pH csökkenés és a fehérje denaturáció csökkenti a vízkötő képességet • Csepegési veszteség formájában lehet mérni • Nagy csepegési veszteség súly csökkenést okoz a nyers és a feldolgozott húsokban • A víztartó képesség a lédússág fontos tényezője

• Marker fehérjék: Nagyobb csepegési veszteség - kreatin kináz enzim (marker fehérje) expressziós szintje magas - keratin foszfát gyorsabb degradációját okozza - gyorsabb pH csökkenés és gyorsabb izom összehúzódás - nagyobb csepegési veszteség Jó víztartó képesség: Hsp70 overexpresszió

Juh hús pH5-8

Szarvasmarha hús pH5-8

Sertés hús pH 3-10

Szarvasmarha – hosszú hátizom pH 5-8 DIGE

Cy5 Cy2

Cy3

PSE/DFD húsminőség • PSE: Pale Soft Exudative – halvány, puha, vizenyős gyors glikogén lebomlás sok tejsav pH 5,7 alatt ok: stressz (genetikai v. környezeti) • PSE markerek: proteolízis mértéke csökken a PSE húsokban troponin T, MLC1, α-krisztallin mennyisége magasabb a csökkent intenzitású proteolízis miatt

• DFD: dark, firm, dry – sötét, tömött, száraz ha tartós stressz után vágják az állatokat, a glikogén már korábban lebomlik, nincs tejsav pH 6,4 feletti könnyen romlik, kevés sót vesz fel • DFD markerek: lehetséges marker HSP70, az alacsony csepegési veszteségű húsokban szintén marker

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Melyek a legfontosabb izomfehérjék: • A porhanyósságnak vannak protein biomarkerei?

• Mi a áll a PSE/DFD húshiba hátterében?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Proteomics in foods. 2013. Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. • Thierry Sayd és mtsai. (Proteome Analysis of the Sarcoplasmic Fraction of Pig Semimembranosus Muscle (2006):  Implications on Meat Color Development J. Agric. Food Chem., 54 (7), 2732–2737. • Gianluca Paredia és mtsai. (2012): “Muscle to meat” molecular events and technological transformations: The proteomics insight. Journal of proteomics 75, 4275- 4289

HÚS és HÚSTERMÉKEK PROTEOMIKÁJA II.

Az előadás vázlata • Szárazon pácolt sonka és proteomikai kutatások

• Hő hatása a húsfehérjékre • Fajspecifikus proteinek

• Baktériumok hústermékekben • Hamisítások

Hústermékek • Proteomikai vizsgálatok többsége: szárazon pácolt sonka („dry-cured”) • Proteolízis tanulmányozása • Füstölés, sózás, pH változás, hő, szárítás hatása • Virslik, szalámik, kolbászok

Szárazon pácolt sonka Magas minőség, tipikus íz és állag Hosszú érlelési idő Pl.: Prosciutto, Bayonne Több biokémiai reakció (proteolízis, lipolízis, glikolízis) is lejátszódik, míg kialakul a végleges íz Fehérjék degradációja: proteolízis (a leginkább tanulmányozott folyamat a sonkák érlelése során)

Sózás

1-3 ˚C, páratartalom>90%, 1,1 nap/kg

Pihentetés

2-4 ˚C, páratartalom 75-85%, 40-60nap

Érlelés 14-20˚C, páratartalom 70-80%, 6-24 hónap

Proteolízis az érlelés során • Enzimatikus autolízis során a nagyméretű miofibrilláris fehérjék (miozin, aktin, titin) a proteázok enzimatikus aktivitásának hatására kis méretű peptidekre hasadnak • Ez a folyamat nagymértékben meghatározza a sonka ízét, textúráját és illatát • Proteolitikus enzimek 2 csoportba sorolhatók: - endopeptidázok - exopeptidázok

• Endopeptidázok: - pl.: kalpainok, katepszinek, - közvetlenül felelősek a post-mortem változásokért - intakt fehérjéket hasítják nagyobb polipeptidekre - kalpainok az érlelés első 2 hetében aktívak - katepszinek akár a 15. hónapig is

• Exopeptidázok: - az endopeptidázok által létrehozott nagyobb polipeptideket hasítják kis peptidekre ill. aminosavakra - dipeptidil-peptidáz, sózás alatt csökken az aktivitás, mert a pH kedvezőtlen - aminopeptidázok: N-terminális végen lévő aminosavak lehasítása, a fehérje degradáció késői fázisában fontosak -karboxipeptidáz: C-terminálison hasít

Proteomikai vizsgálatok • SDS-PAGE: Miofibrilláris fehérjék vizsgálata: - aktin, miozin könnyű és nehéz lánc, tropomiozin, troponin T fehérjék proteolízise az érlelés során érlelés 12. hónapját követően teljesen hidrolizálódnak - troponin T degradációja és a marha hús íze között pozitív korreláció - lipofil aminosavak, dipeptidek kellemetlen keserű íz markerei

• SDS-PAGE: Szarkoplazmatikus fehérjék vizsgálata - Mioglobin az érlelés 17,5. hónapjáig kimutatható az ibériai sonkában - Mioglobin sávja SDS-PAGE-en a bayonne-i sonkában is folyamatosan csökken az érlelés alatt

• 2D-PAGE: - foszfoglicerát kináz, kreatin kináz, glikogén foszforiláz, mioglobin mennyisége csökken az érlelés során - enoláz, foszfoglicerát mutáz végig kimuatatható az érlelés során, de csökken - piruvát kináz, az érlelés 11. hónapja után is konstans mennyiség

• 2D-PAGE: - érlelés során használt só mennyiség hatása a fehérje összetételre - különböző genotípusú állatok sonkájának proteom vizsgálata (PRKAG3 és CAST gének) - pH hatása a proteolízisre a sonka érlelése során - a sonka textúrájában lévő különbségek proteomikai háttere

• MS alapú módszerek - gél alapú módszerekhez hasonlóan, miofibrilláris és szarkoplazmatikus fehérjék proteolízisének vizsgálata - bayonne-i sonkában a különböző érlelési szakaszok megkülönböztethetőek - „mass fingerprint” - legmodernebb módszerek esetén előzetes frakcionálások: SEC (size exclusion chromatography), RP-HPLC (reversed phase HPLC)

• Nyers hús fehérje markereiből meg lehet jósolni a sonka minőségét - segítséget nyújthat az élelmiszeriparban a megfelelő sonka alapanyag kiválasztásához - módszer: SELDI-TOF- MS (surface-enhanced laser desorption/ionisation time-of-flight MS) - főleg a nyers hús színe és állaga között találtak korrelációt a sonka minőségi paraméterivel

• Serrano sonka: - proteolízis tanulmányozása az érés során - miozin könnyű lánc 1 - peptid fragmensek elvesztik az N-terminális végen lévő dipeptidet - dipeptidil peptidázok végzik ezt a hasítást - a dipeptidek felelősek lehetnek a Serrano sonka karakteres ízéért

Hő hatása a húsfehérjékre • A húsfeldolgozási folyamatok közül a hő károsítja leginkább a fehérjéket • A leromlás a nagy molekulasúlyú fehérjéket jobban érinti • Az izoelektromos pont és a molekulasúly nem változik, ezért a 2D képeken a pozíció nem változik • A festés intenzitását csökkenti a hő hatás, főleg a nagy molekulasúlyú fehérjék esetén (pl.:miozin nehéz lánc)

Faj-specifikus fehérjék változása a feldolgozási folyamatok során • Kolbászok, virslik, szalámik különböző fajokból (sertés, marha, csirke, pulyka, stb.) • Különböző feldolgozási folyamatok: sós pácolás, füstölés, sütés, főzés, szárítás • A feltételezésekkel ellentétben a legtöbb fajspecifikus fehérje rezisztens a feldolgozási folyamatokkal szemben • A denaturálás ellenére nem degradálódtak szignifikánsan

• Húsiparban a hőkezelés hatására (a termék belsejében legalább 72˚C) a legtöbb proteáz inaktiválódik, a felvágottaknál ezt ritkán használják • A só (nátrium-klorid, nátrium-nitrát) és a pH változás is csökkenti a proteázok aktivitását • A sók is csökkentik a festés intenzitását • A termékek magas zsírtartalma nem befolyásolta a 2D mintázatot

Fermentáció • Tejsav baktériumok a legfontosabbak • Higiénia és minőség javítás • A romlását okozó és a patogén flóra kialakulását gátolja a savanyítással • Bakteriocin termelés: fehérje, közeli rokon mikroorganizmusok elpusztítása • Stabilizálja a hús színét és textúráját javítja • Proteolitikus aktivitás: kis peptidek és aminosavak (nem ezek a baktériumok a fő résztvevői a postmortem proteolízisnek, de részt vehetnek benne)

• SDS-PAGE analízis: - szarkoplazmatikus fehérjék - bizonyos fehérjék eltűnnek a gélképről, ok: proteolízis vagy elsavasodott közeg - L. curvatus CRL705 vákuum csomagolt húsok szavatossági idejét növeli, a kis peptidek és szabad aminosavak felszabadításával

Bakteriális leromlás • Az a folyamat, mely során különböző biokémiai változások történek mikrobiális aktivitás hatására • Gazdasági veszteséget és súlyos élelmiszereredetű megbetegedéseket okozhatnak • Aminok keletkeznek, melyek kellemetlen ízűek, vagy ízetlenné teszik a húst • MALDI-TOF-MS alkalmas a baktériumok detektálására és kvantifikálására a húsmintákból

Hamisítások kiszűrése • Olcsóbb hússal helyettesítés - vallási megfontolások (hinduk nem esznek marhát, iszlám vallásúak és a zsidók sertést) • Friss vs. felolvasztott hús • Nem hús eredetű anyagok kiszűrése, pl: színezékek, egyéb vegyszerek – frissebbnek tűnik a hús • Füst aromák füstölés helyett • Víz hozzáadása tömegnövelés céljából

Kimutatás célja: faj-specifikus biomarker fehérjék azonosítása kromatográfiás és elektroforetikus elválasztás, immunoassay

Gyakorlatban: Csirkehús kimutatása húskeverékekből - miozin könnyű lánc-3 a markerfehérje - OFF-GEL elektroforézis + SDS-PAGE + MALDI-TOF MS - 0,5% w/v csirkehús belekeverés még kimutatható

• SDS-PAGE mintázat alapján elkülöníthető: marha, gímszarvas, kecske, juh, nyúl • Kézzel csontozott hús (drágább) és csontozás utáni maradék hús (olcsóbb), melyet géppel szednek le - szükségessé vált egy analitikai módszer, mely segítségével elkülöníthető a két hústípus - OFF-GEL elektroforézis + SDS-PAGE + nanoLC-MS - „maradék hús” biomarkerei: hemoglobin alegység, myosin-binding protein C

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Milyen proteolízis játszódik le a húsban? • A hús/hústemrék hőkezelése miként befolyásolja a 2D PAGE eljárást?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Proteomics in foods. 2013. Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. • Leticia Mora és mtsai. (2012): Proteolysis follow-up in dry-cured meat products through proteomic approaches. Food research international • Silvina Fadda és mtsai. (2010): Role of lactic acid bacteria during meat conditioning and fermentation: Peptides generated as sensorial and hygienic biomarkers. Meat science 86, 66-79. • Aldo Di Luccia és mtsai. (2005): Proteomic analysis of water soluble and myofibrillar protein changes occurring in dry-cured hams. Meat Science 69. 479–491

A TOJÁS PROTEOMIKÁJA

Az előadás vázlata • Fehérjék és kötelező élelmiszerjelölés

• Tojás fehérje • Tojás sárgája

• Tojáshéj • Tárolás során bekövetkező változások

Élelmiszerek jelölése 19/2004. (II. 26.) FVM-ESzCsM-GKM együttes rendelet az élelmiszerek jelöléséről

Elérhetőség: http://net.jogtar.hu/jr/gen/hjegy_doc.cgi?docid=A0400019.FVM

Élelmiszerek jelölése Allergén anyagok, melyek jelölése kötelező: -Glutént tartalmazó gabona (búza, rozs, árpa, zab, tönköly, kamut-búza vagy ezek hibrid változatai) és azokból készült termékek -Rákfélék és azokból készült termékek -Tojás és abból készült termékek -Halak és azokból készült termékek -Földimogyoró és abból készült termékek -Szójabab és abból készült termékek -Tej és abból készült termékek (beleértve a laktózt is)

Élelmiszerek jelölése Allergén anyagok, melyek jelölése kötelező: -Diófélék, azaz mandula, mogyoró, dió, kesudió, pekándió, brazil dió, pisztácia, makadámia és queenslandi dió és azokból készült termékek -Zeller és abból készült termékek -Mustár és abból készült termékek -Szezámmag és abból készült termékek -Kén-dioxid és SO2-ben kifejezett szulfitok 10 mg/kg, illetve 10 mg/liter koncentrációt meghaladó mennyiségben -Csillagfürt és abból készült termékek -Puhatestűek és abból készült termékek

Élelmiszerek jelölése Enzimek felhasználásának jelölése: „Összetevőnek minősül mindazon anyag, az adalékanyagokat és enzimeket is beleértve, amelyet az élelmiszer előállításához használnak fel, akkor is ha az megváltoztatott formában van jelen a végtermékben.” Nem minősül összetevőnek: „…enzim, amely az adott élelmiszer egy vagy több összetevőjében jelen volt, de a fogyasztásra kész élelmiszerben technológiai funkcióval nem rendelkezik” Nem kötelező az összetevők felsorolása : „sajt, vaj, savanyú tej- és tejszínkészítmények, amennyiben az előállításukhoz a tej eredetű alapanyagon, enzimeken, mikrobatenyészeten, továbbá a friss és ömlesztett sajttól eltérő sajtok esetében az előállításhoz szükséges étkezési són kívül más anyagot nem használtak fel”

TOJÁS • Magyarországi éves tojás fogyasztás: 247db/fő • Vitaminforrás: A, B2, D, E, K • Fehérjék, zsírsavak (telített, telítetlen), karotinoidok, ásványi anyagok • Táplálkozás-élettani jelentősége kiemelkedő

Tojásfehérje • Feladata: embrió táplálása, mikróbák védekezés, embrió stabilizálás • Olcsó, jó minőségű fehérje forrás • Tojásfehérje kb. 11%-a fehérje • Nagy gyakoriságú fehérjék: 54% ovalbumin 12% ovotranszferrin 11% ovomucoid

elleni

• Kis gyakoriságú fehérjék: 4% ovoglobulin G2, 4% ovoglobulin G3, 3,5% ovomucin, 3,4% lizozim, 1,5% ovoinhibitor, 1% ovoglikoprotein, 0,8% flavoprotein, 0,5% ovomacroglobulin, 0,5% avidin, 0,05% cystatin

• Fehérjéi széles molekulasúly és pI tartományban mozognak • 7kDa - 8000 kDa • pH3,9 - pH10,7

1D-PAGE • KMITL Sci. Tech. J. Vol. 7 No. S2 Nov. 2007

2D-PAGE

KMITL Sci. Tech. J. Vol. 7 No. S2 Nov. 2007

Tojássárgája • Embrió táplálása • Immunológiai funkció: anyai antitesteket is tartalmaz • Az élelmiszer- és kozmetikai iparban elterjedt a használata (kötő ágensként, antioxidánsként, emulgeálószerként) • Fehérje tartalma kb. 13-17% • Vitellogenin: foszfo- és lipoproteinek prekurzora a sárgájában • Víz 48%, lipidek 33%

• Fehérjék: 68% low-density lipoprotein (LDL) 16% high-low density lipoprotein (HDL) 4% phosvitin Vízoldékony frakció 10% livetin

Globuláris frakció

Kombinatorikus peptid ligand könyvtár • Tojásminták esetén legnagyobb kihívás a nagy gyakoriságú fehérjék (ovalbumin, ovotranszferin) csökkentése, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítása • gyöngy technológia (2005) • Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

• 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal • Tojásfehérje: ezzel a módszerrel megduplázták az azonosított fehérjék számát (148) • Tojássárgája: 70%-kal növekedett a fehérje találatok száma (316)

Tojáshéj • Védi az embriót a mikrobiális és a fizikai környezeti hatásokkal szemben • Kalciumot biztosít a növekvő embrió számára • Szabályozza a víz és gázcserét • Rétegei: - kutikula: legkülső vékony filmréteg, mely lezárja a pórusokat, véd a mikróbák ellen - mészhéj: kalcit - héjhártya: dupla membrán

• Kutikula: kb. 85%-a fehérje 47 különböző fehérjét azonosítottak, melyek közül több antibakteriális és antifungális aktivitással is rendelkezik • Mészhéj: - sok tojásfehérje protein megtalálható benne - de vannak csak mészhéj specifikus fehérjék is, melyek az elmeszesedést szabályozzák • Héjhártya: megakadályozza, hogy az elmeszesedés befelé is terjedjen - kollagének, proteoglikánok, lizozim, ovotranszferin

Tárolás • Hosszabb tárolás során a tojás fehérje viszkozitása csökken (elvékonyodik) • Kevésbé ellenálló a mikrobiális fertőzésekkel szemben • 2D PAGE segítségével megállapították , mely fehérjék expressziója változik tárolás során: ovalbumin, ovotranszferrin, clusterin, ovoinhibitor

• pH növekedés a tárolás során: - a fehérjék feltekeredését akadályozza - clusterin expressziója nő, hozzákapcsolódik a nem teljesen feltekeredett fehérjékhez, így stabilizálja azokat • Tárolás során az ovalbumin és a clusterin proteolízisen megy keresztül, ez a folyamat vagy a proteolitikus enzimeknek vagy a pH savasodásának köszönhető

Allergia • Magyarországon a lakosság kb. 1% • Nagyon sok élelmiszerben megtalálható valamilyen tojás-származék • Szigorú jelölés szabályozás szükséges az élelmiszereken • MS-alapú módszerekkel nagyon alacsony koncentrációban is kimutathatóak a tojás fehérjéi különböző élelmiszerekből

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • A jogszabályoknak megfelelő élelmiszerjelölés betartását miként Segíthetik a fehérjevizsgálatok?

• Mi jellemző a tojásfehérje fehérjéire? • Mi jellemző a tojássárgája fehérjéire?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Alessia Farinazzo és mtsai. (2009): Chicken egg yolk cytoplasmic proteome, mined via combinatorial peptide ligand libraries. Journal of Chromatography A, 1216, 1241–1252. • Ning Qiu és mtsai. (2012): Proteomic analysis of egg white proteins during the early phase of embryonic development. Journal of proteomics 75, 1895-1905. • Egisto Boschettia és mtsai. (2008): The ProteoMiner in the proteomic arena: A nondepleting tool for discovering low-abundance species. Journal of proteomics 71, 255-264.

TEJ ÉS TEJTERMÉKEK PROTEOMIKÁJA

Az előadás vázlata • Tej összetevői és fehérjéi

• Tej zsírcsepp membrán fehérjéi • Tejsavó jellemzése

• Kazeinek • PTM-ek a tejben • Sajt • Baktériumok szerepe

Tej • Természetes táplálék minden újszülöttnek • Felnőttek számára is kiváló, tápanyagokban gazdag, könnyen emészthető • Kedvező élettani hatások: immunerősítő, betegségmegelőző (csontritkulás, fogszuvasodás, magas vérnyomás) • Sokoldalúan használható: - tej, író - vaj - joghurt, tejföl, kefir - sajt

Tejfogyasztás • • • • •

Magyarország: 67 liter/év Európai Uniós átlag: 60,7 liter/év Világátlag: 32,7 liter/év Dietetikusok által javasolt: 180 liter/év Magyarország éves tej és tejtermék fogyasztása: 156 kg

Tej összetevői • Tejcukor (laktóz): ásványi anyagok felszívódását segíti • Tejzsír: könnyen emészthető lipid, n-6 és n-3 zsírsav arány optimális • Ásványi anyagok: kálium, kalcium, nátrium, foszfor, szelén • Vitaminok: B2, B6, B12 • Tejfehérjék

Tejfehérjék • αs1-kazein αs2-kazein β-kazein k-kazein • β –Laktalbumin ß-Laktoglobulin Immunoglobulinok • A sokféle poszttranszlációs módosítás teszi a tejproteomot különösen összetetté

Frakciók centrifugálás

Tejzsír (MFG-milk fat globule), kis gyakoriságú fehérjék

Fölözött tej ultracentrifugálás

Oldott frakció: savó fehérjék és peptidek Oldhatatlan frakció: kazeinek

MFGM • Milk fat globule membrane – tejzsírcsepp membrán • Tőgyepithel sejt membrán + citoplazma proteinek • Kis gyakoriságú fehérjék, prefrakcionáció szükséges ezek feldúsításához • A tőgy patofiziológiás állapotáról kaphatunk információt a laktáció ideje alatt

• Fehérjéi nehezen vihetők oldatba, a sok lipid és a fehérjék hidrofobitása miatt • Centrifugálást követően a legfelső zsírrétegből izolálható • Zsírtalanítás: metanol+kloroform • Fontosabb fehérjék: butyrophilin, lactadherin, adipophilin, xanthine, annexin, acyl-CoA szintáz, lanosterol szintáz • Szerepük: lipid transzport, szintézis és szekréció

Kombinatorikus peptid ligand könyvtár • Kihívás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentése, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítása • Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció) • 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal

MFG frakció pH 3-10

MFG - vizes fázis pH 3-10

MFG frakció pH 3-6 ProteoMiner

MFGM fehérjék - betegség megelőzés • Rákmegelőző hatás: különösen mellrák fatty acid binding (FAB) fehérje gátolja a ráksejtek növekedését BRCA1 és BRCA2 fehérjék a DNS javító folyamatokban játszanak szerepet • Koleszterinszint csökkentő hatás

• Helicobacter pylori fertőzés gátlása: gyomorfertőzések csökkentése • Szív koszorúér megbetegedés esélyének csökkentése • Baktericid hatás • Szklerózis multiplex tünetek enyhítése • Butyrophilin fehérje – autoimmun enkefalomielitisz gátlása

Tejsavó • 2 nagy gyakoriságú fehérje: α-lactalbumin, βlactoglobulin, a fajok között nagy változatosság • Immunglobulinok: antimikrobiális fehérjék IgA, IgM, IgG • Laktoferrin, laktoperoxidáz • Szerum albumin

Kazeinek • Foszfoproteinek • Tehéntejben a fehérjék 80%-a • Sokféle poszt-transzlációs módosulás, nagyon különböző foszforilációs mintázatok • αs1-kazein és αs1-kazein kalcium jelenlétében jobban oldódik • Kappa kazein • Sajtkészítésben fontos szerepük van – kazein+kalcium-foszfát - kazeinmicellák

Poszttranszlációs módosulatok vizsgálata • A PTM-ek miatt olyan komplex a tej proteom • Aminosav oldalláncok kémiai tulajdonságai megváltoznak • Foszforiláció: protein kinázok aktivizálják, foszfátcsoport kapcsolódik a fehérjék szerin, treonin és tirozin oldalláncaihoz kazeineknél vizsgálták leginkább 2D-PAGE mintázat

Glikoziláció • szacharid láncok kapcsolódnak az aszparagin, szerin, treonin és triptofán aminosavakhoz • 2D-PAGE+MALDI 10 különböző kappa-kazein glikoforma detektálása • Laktoziláció: speciális esete a glikolizációnak, hő hatására alakul ki

Proteolízis • proteázok végzik, peptidkötés hasítása • Legfontosabb proteázok: plasmin és cathepsin aktivitásuk nő a szomatikus sejtszám növekedéssel, így kapcsolatba hozhatók a masztitisszel • Ez a folyamat fontos meghatározója a tej termékek textúrájának és ízének. • Különböző keménységű és érlelési idejű sajtok különböző 2D mintázatot mutatnak.

Tej és tejtermékek hamisítás • Pl: bivalytejbe tehéntejet kevernek és bivaly tejként/sajtként árusítják • A DNS alapú eredetvizsgálat elterjedtebb • DE! Proteomikai vizsgálatok is alkalmasak, főleg MS alapú • HPLC/ESI-MS – tehén tejet mutattak ki kecske tejben, beta-laktoglobulin marker, 5%-os határ • A tejpor hozzáadást is ki lehet mutatni kromatográfiás módszerekkel • MALDI-TOF-MS – bivaly mozzarellában tehén vagy juh tej jelenléte, alfa-laktalbumin és beta-laktoglobulin marker

Sajtok Proteomikai módszerek segítségével vizsgálhatjuk: • a proteolízis mértékét (proteolitikus enzimek expressziója) és fajtáját • a sajtok eredetét (hamisítások) • a tejfehérje polimorfizmusok és a sajtok minősége közti összefüggéseket

• A víz-oldékony frakció a proteolízis következtében: fehérjék (kivéve kazeinek), peptidek, aminosavak és kis nitrogén tartalmú komponensek A sajtok ízéért ez a frakció felelős, és az érlelési szintet is ebből lehet megállapítani.

Oltóanyag (rennet) • • • •

A tej alvadásért felelős Fiatal állatok (borjú, bárány) gyomrából Két enzim: kimozin, pepszin Kimozin (aszpartil proteáz) 88-94%-os tej alvadási aktivitás • Pepszin (szerin proteáz) 6-12%-os tej alvadási aktivitás

Kimozin • • • •

Kappa-kazeint bont 105 Fenilalanin és 106 methionin között vág Para-kappa-kazein + makropeptidek Para-kappa-kazein nem képes stabilizálni a micellákat és kicsapódik • Helyettesíthető: mikroorganizmusokban termeltetett kimozinnal vagy gombákban lévő proteinázokkal

Baktériumok • A fermentált élelmiszerekben lévő baktérium törzsek enzimaktivitása felelős az élelmiszer végső textúrájáért és ízéért • Proteomikai módszerekkel lehetőség nyílik metabolizmusuk in situ tanulmányozására a tejtermékekben

• Megvizsgálhatjuk a tárolás ill. a különböző feldolgozási folyamatok (hűtés, melegítés, extrém pH, magas nyomás) során hogyan változik a baktérium törzsek proteom összetétele • Starter baktériumok: laktózból tejsavat állítanak elő, így a közeg savasodoik, patogének ellen hatásos

• Sajtok: Lactococci ( L. lactis , L. cremoris , L. diacetylactis ), Lactobacilli ( L. helveticus , L. acidophilus , L. casei ), Streptococcus salivarius • Joghurtok: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus • Sajtok érést segítő baktériumok: Propionibacterium freudenreichii, Brevibacterium linens

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Mi az MFGM? • A sajtgyártásban milyen céllal használhatunk proteomikai

megközelítést?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Timothy A. Reinhardt, John D. Lippolis (2006): Bovine Milk Fat Globule Membrane Proteome. Journal of Dairy Research, 73, 406–416. • Caroline Vanderghem és mtsai. (2008): Proteome analysis of the bovine milk fat globule: Enhancement of membrane purification. International Dairy Journal, 18, 885–893. • Proteomics in foods. 2013. Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. • R. O’Donnella és mtsai. (2004): Milk proteomics. International Dairy Journal 14, 1013– 1023.

A SÖR PROTEOMIKÁJA

Az előadás vázlata • • • • •

A sör élettani hatása A sör fehérjéi Allergének A habzás markerei Gyömbérsör

Sörfogyasztás • A sör a legrégebbi és legszélesebb körben fogyasztott alkoholos ital • Csehek a legnagyobb sörfogyasztók: 144 liter/fő • Magyarországon átlagosan 70 liter/fő • Az Európai Unióban ̴ 40000 különböző sör létezik és ̴ 130 sörtipus

Élettani hatások • Kedvező élettani hatásai csak mérsékelt fogyasztás esetén érvényesülnek :

- vízhajtó - vesekő képződés megelőzése - nyugtató, altató hatású - magas vitamintartalom (B1, B2, B3, B6, B9) - magas antioxidáns tartalom - csökkenti az LDL koleszterin szintet - stimulálja az immunrendszert - ásványi anyag tartalom (Cu, Fe, Zn, Mg)

Sör fehérjék • ̴ 500mg/liter fehérjetartalom • Méretük: 5-100kDa • A legtöbb fehérje a sörfőzés során használt gabonából származik • Hordein – nagy gyakoriságú fehérje (árpából származik) • Egyéb fehérjék: globulinok, albuminok, amiláz inhibítorok, chaperonok, lipid kötő fehérjék

• Sörgyártás folyamán a fehérjék különböző módosításokon eshetnek át (különösen a malátázás és a cefrézés során) • Hidrolízis, glikoziláció, glikáció • A forralás és a hűtés során a fehérje tartalom nagy része kiválik a cefréből • A fehérjék módosítása hatással van a későbbi minőségi tulajdonságokra: szín, íz, zavarosság, hab képződés és stabilitás

Lipid transzfer protein (LTP) • LTP1: egyik nagy gyakoriságú fehérje a sörben • Árpa aleuron rétegéből származik • Az LTP1-nek nincs habképző potenciálja, de hő hatására irreverzibilisen denaturálódik és így már kitűnő habképző • A sör LTP1 tartalma nincs szignifikáns összefüggésben a hab stabilitással

• 2D gélen a bázikus régióból a savasba vándorol a hő hatására • LTP1 hatással van a túlzott habzásra, ami az üveg kinyitásakor figyelhető meg, ez súlyos minőségi probléma, az árpa gombás fertőzése okozza az LTP1 overexpresszióját

Z Protein: • Nagy gyakoriságú fehérje, magas felületi feszültség és rugalmasság jellemzi • Hab stabilitásban fontos szerep • 3 izoforma: Z4, Z7, Zx Kloroform-/metanolban oldódó fehérjék • Alfa-amiláz/tripszin inhibitor család • Zavarosságot okoznak

Maláta

Cefre

Sör

*1: serpin Z4 *2: LTP

Forrás: Tanner GJ, Colgrave ML, Blundell MJ, Goswami HP, Howitt CA (2013) Measuring Hordein (Gluten) in Beer – A Comparison of ELISA and Mass Spectrometry. PLoS ONE 8(2): e56452. doi:10.1371/journal.pon e.0056452

Árpa alfa-amiláz inhibitor-1 dimer: • Számos amiláz inhibitor azonosítható a sörből • Hab képződést pozitívan befolyásolja, de zavarosságot is okoz • Kelt tészták esetén is ez a fehérje felelős a gázbuborékok stabilizálásáért

Hordeinek: • B-, C-, D-, γ- csoport • Malátázás és a cefrézés során a maláta proteázok aminosavakra és kis polipeptidekre bontják a hordeineket • Habképzők, a hab frakcióban koncentráltan jelen vannak

• Élesztőből származó fehérjék: 2D + MS: 40 féle élesztő eredetű fehérjét azonosítottak a sörből - élesztő thioredoxin: habzásra negatívan hat - élesztő proteináz A: habzásra negatívan hat, lipid transzfer protein 1-et (LTP-1)bontja - enoláz és triózfoszfát izomeráz: élesztő citoplazmából származnak, melyek a sejtek károsodását követően kerülnek a sörbe

• sörfőzés során használt élesztők számos környezeti stressznek vannak kitéve: alacsony pH, magas etanol koncentráció, magas ozmotikus nyomás, kevés tápanyag, hőmérsékleti szélsőségek - ezek mind hatással vannak a habképződésre és az ízre - a proteomikai módszerek segítségével ezek a fehérjék markerként használhatók az élesztősejtek kondíciójának monitorozására

Allergének • Serpin-Z4 + Lipid transzfer protein 1 a leginkább allergén fehérjék a sörben • Csalánkiütést és anafilaxiát okozhatnak • Glutén érzékenység: búza – glutenin és gliadin fehérjék árpa – hordeinek rozs – secalinek zab - aveninek

Habzás • Egyik legfontosabb minőségi tulajdonság a fogyasztók számára • Stabilitás, fehérség, intenzitás, krémesség • Fehérjék a fő meghatározói • Habképződés szempontjából vannak pozitív és negatív fehérjék pozitív pl.: árpa alfa-amiláz inhibitor-1 dimer negatív pl.: élesztő thioredoxin

Gyömbérsör • A gyömbér széles körben használt fűszernövény és a természetgyógyászatban is elterjedt • Emésztőrendszeri betegségek és petefészek rák megelőzésében • 1851. körül Írországban készítettek először gyömbérsört

Kombinatorikus peptid ligand könyvtár • A különböző italok esetén leggyakrabban használt eljárás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentésére, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítására • gyöngy technológia (2005) • Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

• 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal • ProteoMiner segítségével vizsgálták egy kereskedelmi forgalomban kapható gyömbér ital fehérje összetételét

• 5 szőlő és 1 alma fehérjét sikerült azonosítani • DE!!! Gyömbérfehérjét egyet sem sikerült azonosítani • A szőlő és alma fehérje jelenléte nem meglepő, mert az italon feltüntették, hogy szőlő és alma levet is tartalmaz • De nem lenne szabad rajta feltüntetni, hogy gyömbér kivonatot tartalmaz, habár a gyömbér íz érezhető

Megfelelő és pontos címkézés!! A kis és nagy mennyiségben előforduló összetevőket is fel kell tüntetni, ill. csak a ténylegesen előforduló komponenseket.

• Kombinatorikus peptid ligand könyvtár használata üdítőitalok esetén: - kóla - mandulatej - mandulatej szirup • Kombinatorikus peptid ligand könyvtár használata más alkoholos italok esetén: - aperitifek (olasz cynar és braulio) - borok, pezsgők

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Mi jellemző a sör fehérjetartalmára? • Mi az LTP és mi a jelentősége?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Takashi Iimure, Kazuhiro Sato (2012): Beer proteomics analysis for beer quality control and malting barley breeding. Food Research International • Michelle L. Colgrave (2012): Proteomics as a tool to understand the complexity of beer. Food Research International • Elisa Fasoli és mtsai. (2012): Ginger Rogers? No, Ginger Ale and its invisible proteome. Journal of proteomics 75, 1960-1965. • Elisa Fasoli és mtsai. (2012): In-depth proteomic analysis of non-alcoholic beverages with peptide ligand libraries. I: Almond milk and orgeat syrup. Journal of proteomics 74, 1080-1090.

A bor proteomikája

Az előadás vázlata • a bor élettani hatása

• szőlőfehérjék • minőség és proteinek

• mikroorganizmusok fehérjéi • más eredetű fehérjék

Borfogyasztás • • • •

Magyarországon: 23liter/év Franciaországban: 54 liter/év Olaszországban: 49 liter/év Világátlag: 3,6 liter/év

Élettani hatások • Kedvező élettani hatásai csak mérsékelt fogyasztás esetén érvényesülnek • Magnézium: izomműködés • Mangán: idegrendszer, pajzsmirigy, vérképzés • Kalcium: csontritkulás ellen • Kálium: szívritmuszavar ellen • Vas: vérképzés • Borkő, citromsav, borostyánkősav: emésztést segíti

• C- és B- vitamin • Antioxidánsok: koleszterinszint csökkentés • Fenolok: vérrögök kialakulását gátolják, nitrogén-oxid termelés fokozása (értágító) • Napi 1-2dl vörösbor fogyasztás 50%-kal csökkentheti a szív- és érrendszeri megbetegedések kialakulásának esélyét

Borfehérjék A bor fehérjéi származhatnak:

Szőlőből (nagyobb rész) Mikroorganizmusokból

Szerepük a borban Borminőség Íz és testesség Habzás a pezsgőborok esetén Hátrányok: zavarosság okozói, allergének

A szőlő fehérjéi • Kis mennyiség: 15-230 mg/liter • Heterogének • Az érés kezdetét követően nő a fehérjemennyiség • Fő komponensek: 34% Energiaháztartás 19% Patogenezishez köthető fehérjék (védekezés, stressz, betegségek) 13% Metabolizmus

• Szőlőszemek érése során bekövetkező változások: - fotoszintézis, szénhidrát metabolizmus, stressz válasz fehérjéinek expressziója nő a szemek színváltozásának kezdetén - a színváltozás végén az antocián szintézis fehérjéi overexpresszálódnak a termés héjban - a szüretet követően a patogenezishez köthető fehérjék a legdominánsabbak

Patogenezis fehérjéi • Kitináz • Osmothin • β-1,3-glukanáz • Thaumatin-szerű fehérjék Szerepük: gombák elleni védekezés Egészséges növényekben alacsony a szintjük

Kitináz • 32kDa, több izoforma • Levelekben, gyökérben, szárban, de legnagyobb mennyiségben a bogyóban • Érés során nő a mennyisége • Borban is aktív, képes kötődni a kitinhez

Thaumatin-szerű fehérjék • 24kDa • Főleg a szőlőszemben • Thaumatin édes ízű, de ezek a fehérjék nem • Antifungális hatás: permeabilizálják a sejtmembránt

A proteolízissel és a bor alacsony pH-jával szemben ellenállóak, így túlélik a borkészítést. Üledékképződést és/vagy a bor zavarosodását okozhatják.

• Borkészítés során a szőlő fehérjéi (kivéve patogenezishez köthető fehérjék): - denaturálódnak (savas pH miatt) - degradálódnak (proteázok) - precipitálódnak • Nehéz izolálni a bor fehérjéit, a sok polifenol és más interferáló anyag miatt (fehérborból könnyebb, mert abban nincsenek antociánok)

Opálosság • Tárolás során fellépő szélsőséges hőmérséklet okozza • Fehérjék aggregálódnak, zavarosságot okoznak, üledéket képeznek • Csökkenti a bor piaci értékét • Bentonittal megelőzhető • Nem mindegyik típusú borfehérje okoz zavarosságot, csak amelyek nem hőstabilak

• Az opálosság okozójaként: patogenezishez kapcsolódó fehérjéket azonosítottak • Ezek proteázokkal és savas pH-val szemben ellenállóak, de hővel nem • Kitináz, thaumatin-szerű fehérje, β-1,3glukanáz • Bentonit abszorbeálja ezeket a fehérjéket • Élesztő fehérjék (pl.: mannoproteinek) okolhatók a zavarosság fennmaradásáért

Habképződés • Pezsgő borok esetén • Pozitív korreláció a fehérje koncentráció és a habképződés között • Fehérje degradáció csökkenti a habképződést • Patogén gombák (Botrytis cinerea) negatív hatás a hab stabilitására (gomba proteázok hidrolizálják a bor fehérjéit)

• Bentonit szintén csökkenti a hab képződést és stabilitást, mivel a megköti a fehérjéket • Mannoproteinek (élesztőből): elősegítik a habképződést (sörben is)

Nyomon-követhetőség • Jó minőségű borok eredetigazolása fontos • Milyen típusú szőlő és földrajzilag honnan származik • Többféle komponens alapján lehetséges az azonosítás, fehérjék alapján is • Módszerek: natív-gélelektroforézis, kapilláris gélelektroforézis, SDS-PAGE, MALDI

Nem bor eredetű fehérjék • • • • •

Fehérje-alapú derítőanyagok használata Segítségükkel eltávolíthatóak az üledékek P.: glutén, tej kazein, tojás ovalbumin Gyakori allergének ELISA és Western blot használata elterjedt, de a detektálási limit túl magas (100ug/liter) • MS-alapú módszerek kezdenek elterjedni, sokkal érzékenyebbek

• Kombinatorikus peptid ligand könyvtárakkal 1ug/liter kazein mennyiség kimutatható • Fehér borban inkább kazeint használnak, vörös boroknál albumint (tojásból) • Olasz vörösboroknál egy kísérlet során csak kazeint találtak derítőanyagként (nincs feltüntetve az üvegen)

Botrytis cinerea • patogén penészgomba, nagyon elterjedt • szürkerothadást okoz, kedvező feltételek mellett nemesrothadást • szőlő és a bor esetén is minőségi és mennyiségi veszteség egyaránt • Pezsgő borok esetén csökkenti a hab stabilitását • A 2D és 1D géleken számos fehérje eltűnik a fertőzött mintákból, ok: proteolízis, megváltozott expresszió a gombafertőzés miatt

Fermentáció • • • •

Alkoholos erjedés Komplex folyamatok: mikrobiológiai és biokémiai Saccharomyces cerevisiae központi szerepet játszik Fermentáció során változnak a környezeti feltételek Az élesztő proteom összetétele is megváltozik az alkalmazkodás során

• Fermentációs stressz hatása: - represszált fehérjék: folding és stressz fehérjék, fehérjeszintézis fehérjéi, szénhidrát metabolizmus fehérjéi - indukált fehérjék: fehérje szintézis és degradáció, szénhidrát metabolizmus - proteolízis

Kombinatorikus peptid ligand könyvtár • A különböző italok esetén leggyakrabban használt eljárás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentésére, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítására • gyöngy technológia (2005) • Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

• 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal • Borok esetén a derítőanyag komponenseinek kimutatására használják

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Mi okozza a bor opálosságát? • A habképződés és a proteom között mi a kapcsolat? • A Botrytis milyen módon hat a szőlő fehérje expresszióhára?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Proteomics in foods. 2013. Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. • Zoel Salvado és mtsai. (2008): Proteomic evolution ofawineyeast during the first hours of fermentation. FEMS Yeast Res 8, 1137–1146. • Clara Cilindre és mtsai. (2007): Influence of Botrytis cinerea infection on Champagne wine proteins (characterized by two-dimensional electrophoresis/immunodetection) and wine foaming properties. Food Chemistry 103, 139–149 • S. VINCENZI és mtsai. (2011): Protein evolution during the early stages of white winemaking and its relations with wine stability. Australian Journal of Grape and Wine Research 17, 20–27,

A gabonafélék és proteomjuk

Az előadás vázlata • • • • • •

A gabonafélék szerepe A búza endospermium fehérjéi Elektroforézis és MS spektrum értelmezése Liszt, csíra, korpa Környzetre reagáló gabonafehérjék Allergének

Gabona • Az emberiség fő táplálkozási alapanyaga kezdetektől fogva - kenyérgabonák • Szemtermésük magas energia, vitamin és ásványi anyag tartalommal jellemzhető • E1-, B1-, B2-, B6-vitamin, niacin, magnézium, kalcium, cink • Magas rosttartalom, mely a bélműködést, emésztést felszívást segíti • A teljes magokból készült termékek jelentősen több vitamint és ásványi anyagot tartalmaznak

Fontosabb gabonafélék • Sikérképző fehérjéket tartalmaznak – Búza, rozs, árpa, zab • Sikérképző fehérjéket nem tartalmaznak – Rizs, köles, cirok, kukorica • Alternatív gabonafélék – Hajdina, amaránt

Búza • Búzafehérjék: albumin (leukozin), globulin (edesztin), prolamin (gliadin), glutelin (glutenin), nukleoproteidek • Sikér: gliadin + glutenin • Búzaszem felépítése: - külső réteg: maghéj - csíra - endospermium

Búzaszem pH 3-10 Forrás:Guo H, Zhang H, Li Y, Ren J, Wang X, et al. (2011) Identification of Changes in Wheat (Triticum aestivum L.) Seeds Proteome in Response to Anti–trx s Gene. PLoS ONE 6(7): e22255. doi:10.1371/journal.po ne.0022255

Endospermium • Belső táplálószövet • Emberi táplálkozás szempontjából ez a legfontosabb része a búzaszemnek • Endospermiumból készül a liszt • Leginkább tanulmányozott magrész • Endospermium fehérjéi határozzák meg a lisztből készült tészta rugalmasságát, nyújthatóságát, levegő tartási képesség

• Tároló fehérjék: Gliadin: nagyon polimorf fehérje csoport Globulinok és triticinek: kisebb gyakoriság • Rovarok és gombák elleni védekezés: amiláz és proteáz inhibítorok • Amfipatikus fehérjék: pl. membrán fehérjék - néhány amfipatikus fehérje az endospermium fehérje mátrixa és a keményítő szemcse között helyezkedik el, befolyásolja a mag keménységét és végső soron a tészta tulajdonságait

Gliadinok különböző búzafajtákban

Forrás: Lagrain B, Brunnbauer M, Rombouts I, Koehler P (2013) Identification of Intact High Molecular Weight Glutenin Subunits from the Wheat Proteome Using Combined Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. PLoS ONE 8(3): e58682. doi:10.1371/journal.pone.0058682

Gliadinok azonosítása RP-HPLC-ESIMS-sel Forrás: Lagrain B, Brunnbauer M, Rombouts I, Koehler P (2013) Identification of Intact High Molecular Weight Glutenin Subunits from the Wheat Proteome Using Combined Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. PLoS ONE 8(3): e58682. doi:10.1371/journal.pone.0058682

Liszt • A liszt fehérjék befolyásolják a keverési és sütési tulajdonságokat • Fő vízoldékony fehérje frakció: - glutenin polimerek (nagy molekulasúlyú és kis molekulasúlyú alegység) és gliadin monomerek - a legtöbb vizsgálat ezekre irányult (2D PAGE, MS) - azonosításuk MS-sel nehézkes, mert a homológ fehérjék a hexaploid búza 3 genomjából származhatnak - legtöbb glutén fehérje csak a búzára jellemző, így pl. rizs szekvencia adatbázisok nem használhatók az azonosításnál

• Amiláz és proteáz inhibítorok: szintén nagy gyakoriságú fehérjék, fontos esszenciális aminosav források • Manapság a kisebb gyakoriságú fehérjék azonosításával foglalkoznak inkább: albuminok, globulinok • A lisztfehérjék vizsgálata a lisztérzékenység és egyéb allergiás betegségek kapcsán is fontos

Csíra • • • •

A búzamag embrionikus szövete Növekvő érdeklődés a fogyasztók részéről 2D-PAGE képe már elkészült (Mak et al.,2006) Az azonosított fehérjék kétharmada az embrió növekedésével és fejlődésével volt összefüggésben • Stresszhez köthető fehérjék nagy mennyiségben, ellentétben az endospermiummal

• Csírázás: csökkenő expressziós szintet mutat: - energiatermelő folyamatokhoz - fehérje szintézishez - jelátviteli mechanizmusokhoz - stressz-hez köthető folyamatokhoz - metabolizmushoz kapcsolódó fehérjék megemelkedett expressziós szintet mutat: - energia és fehérje degradációhoz kapcsolódó fehérjék

Búzakorpa • Nagyrészt: terméshéj + aleuron (fehérje tartalmú szemcse) • Proteomikai analízis eredménye: - külső réteg: baktériumok és gombák elleni védekezésben szereplő fehérjék - belső réteg: 7S globulin tároló fehérje, oxalát szekretáló bacik ellen • Aleuron réteg: lizinben gazdag fehéjék, magas vitamin és ásványianyag tartalom

Tészta, kenyér • „Hab-képző” oldható fehérjék: - a kelt tésztában kialakuló gázbuborékok stabilizálása és a kenyér belső szerkezetének kialakítása - béta-amiláz, tritin, szerpin - ezek a fehérjék egy elasztikus „bélést” alkotnak a gázbuborékok körül, a tészta integritását biztosítják - prolamint (tároló fehérje) és puroindolint (felület-aktív fehérje) nem azonosítottak

Proteomikai vizsgálatok gyakorlati jelentősége • Proteomikai módszerekkel betekintést nyerhetünk: - gabonaszemek fejlődésének, táplálkozási jellemzőinek szabályozásába - biotikus és abiotikus stressz hatások okozta változásokba • Aboitikus stressz vizsgálata kiemelt fontosságú a globális klímaváltozás szignifikánsan befolyásolja a mezőgazdaságot és az élelmiszeripart

• A fehérje vizsgálatok segíthetik a klimatikus faktorok által okozott változások megértését: - fotoszintetikus stressz - légszennyezés - hő és hideg stressz - ozmotikus stressz (aszály, árvíz) - fém stressz • Megszüntethető vagy csökkenthető ezen faktorok negatív hatása az élelmiszer előállításra

Abiotikus stressz • Búzaszemeken vizsgálták a hőstressz, a hideg, a szárazság, és a só hatását • 2D PAGE gélen több mint 140 fehérjét azonosítottak • 124 fehérje expressziójában történt változás valamilyen stressz hatására • Segíti a stressz tolerancia és adaptálódás megértését • Markerek azonosítása, későbbi szelekcióban hasznos

Kukorica szárazságtűrése • A szárazságra adott válasz megértése az első lépés a toleráns fajták termesztésében • Dehidratációra való érzékenység szempontjából két fajtát vizsgáltak • Védekező és stresszhez kapcsolódód fehérjék expressziója nő mindkét fajtánál, de a védekező fehérjék szintje a szenzitívnél kevésbé nőtt meg, mint a toleránsnál • Fehérjeszintézis szintje alacsonyabb a szenzitívnél

Kontroll

Szenzitív genotípus Szárazság - stressz

Forrás: Benešová M, Holá D, Fischer L, Jedelský PL, Hnilička F, et al. (2012) The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi:10.1371/journal.po ne.0038017

Kontroll

Toleráns genotípus Szárazság - stressz

Forrás: Benešová M, Holá D, Fischer L, Jedelský PL, Hnilička F, et al. (2012) The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi:10.1371/journal.po ne.0038017

Forrás: Benešová M, Holá D, Fischer L, Jedelský PL, Hnilička F, et al. (2012) The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi:10.1371/journal.po ne.0038017

Árpa • A sörkészítés legfontosabb alapanyaga • A legnagyobb gyakoriságú fehérjék a sörben: hordeinek, melyek az árpából származnak • Hordeinek az allergén fehérjék az árpában • Árpán vizsgálták az aluminium-mérgezést, mely a savanyú talajok esetén fontos limitáló faktor

Árpa 2DPAGE kép Forrás: Dai H, Cao F, Chen X, Zhang M, Ahmed IM, et al. (2013) Comparative Proteomic Analysis of Aluminum Tolerance in Tibetan Wild and Cultivated Barleys. PLoS ONE 8(5): e63428. doi:10.1371/journal.p one.0063428

Allergének • Glutén tartalmú ételek fogyasztása egyre több embernél okoz egészségügyi problémát • Búza/glutén érzékenység/intolerancia, lisztérzékenyég, glutén allergia: csalánkiütés, emésztőrendszeri problémák, depresszió, ekcéma, alacsony vas mennyiség a vérben, autoimmun (lisztérzékenység), anafilaxiás hiperszenzitivitás

• Az allergén fehérjék azonosításával foglalkozó tudományterület: „allergenomics” • Az allergén forrás fehérjéit szolubilizálják erős anionos detergenssel és ureával • Fehérjék elválasztása: 2D PAGE • IgE-reaktív fehérjék detektálása allergiás páciensek szérumával (immunoblottal) • Kandidáns allergének azonosítása MS-sel

• LC-MS/MS: késztermékekből az allergén búza fehérjék ill. a nem-búza eredetű összetevők szintjének meghatározása

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Mi az amfipatikus proteinek szerepe? • Az abiotikus stressz hatást gyakorol a gabona proteomjára? •Milyen módon játszik szerepet a proteomika a gluténmentes étkezésben?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Guo H. és mtsai. (2011): Identification of Changes in Wheat (Triticum aestivum L.) Seeds Proteome in Response to Anti–trx s Gene. PLoS ONE 6(7): e22255. • Dai H. és mtsai. (2013): Comparative Proteomic Analysis of Aluminum Tolerance in Tibetan Wild and Cultivated Barleys. PLoS ONE 8(5): e63428. • Proteomics in foods. 2013. Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. • Benešová M. és mtsai. (2012): The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi:10.1371/journal.pone.0038017

Gyümölcsök és expresszált fehérjéik

Az előadás vázlata • • • • •

Gyümölcsfogyasztás Érés során bekövetkező változások vizsgálata Tárolás során történő változások Különböző tárolási körülmények hatása Allergének

Gyümölcsfogyasztás Magyarországon: 73kg/fő/év (2013) csökkenő tendenciát mutat Átlag európai: napi 220g Ajánlott mennyiség: 500-700g/nap

• • • •

Karotinoidok, B- és C-vitamin Kálium, kalcium, vas, foszfor Magas rost és víztartalom Élettani hatások: szív és érrendszeri betegségek, daganatos megbetegedések, hiánybetegségek megelőzése • A kiegyensúlyozott táplálkozás része a napi gyümölcsfogyasztás

Kémiai összetétel Száraztermésű, héjas gyümölcsök – Víztartalom: alacsony (6-9%) – Fehérjetartalom: 18-27% – Szénhidráttartalom: 4-24% – Zsírtartalom: 50-60%

Lédús gyümölcsök – Víztartalom: 75-90% – Fehérjetartalom: nagyon alacsony 0,1-1,3%, nem teljes értékű fehérjék – Szénhidráttartalom: 4-24% – Zsírtartalom: nem jelentős

Proteomikai vizsgálatok Érés során bekövetkező változások monitorozása Tárolás során hogyan változik a fehérje összetétel Hő, hideg, anaerob körülmények hatása

Érés során bekövetkező változások • Az érés a gyümölcsök fejlődésének utolsó fázisa • Biokémiai, fiziológiai és gén expressziós változások történnek • Klorofillok degradálódnak • Karotinoidok és antociánok szintetizálódnak • Etilén receptorok degradálódnak • Sejtfalak meglágyulnak • A keményítő egyszerű cukrokká alakul • Illóanyagok keletkeznek

Citrusfélék • Legfontosabb örökzöld gyümölcsök a világpiacon • Évi 105 millió tonna • Felhasználásuk széleskörű • Fontos C-vitamin forrás • Bogyótermés: egyedülálló anatómiai struktúra • Héjrész (exocarpium + mesocarpium) • Endocarpium: lédús mirigyszőrök

Narancs - változások az érés során • Módszer: LC MS/MS • Metabolikus enzimek: - invertáz szint nem változik, viszont egy invertáz inhibítor expressziós szintje megnő az érés végső fázisában - szacharóz foszfát szintáz és szacharóz 6-foszfát foszfatáz szint növekszik magas szacharóz szint a gyümölcsben - citromsav: aminosav és cukor szintézisben hasznosul

Eper • Egyik legnépszerűbb gyümölcs, magas antioxidáns tartalom • Módszerek: 1D, 2D, DIGE, nLC-MS • Fehérje referencia térkép már elkészült • 3 fázisát különböztették meg az érésnek • Az érés fázisai során változik a fehérje expresszió: - energia és szénhidrát metabolizmus - stressz válasz - sejtalkotók szintézise - transzkripció

Szőlő Szőlő fehérjék: - Kis mennyiség: 15-230 mg/liter - Heterogének - Az érés kezdetét követően nő a fehérje-mennyiség - Fő komponensek: 34% Energiaháztartás 19% Patogenezishez köthető fehérjék (védekezés, stressz, betegségek) 13% Metabolizmus

• Nem csak táplálkozási szempontból, hanem a borkészítés kapcsán is végeznek vizsgálatokat • Borkészítés során a szőlő fehérjéi (kivéve patogenezishez köthető fehérjék): - denaturálódnak (savas pH miatt) - degradálódnak (proteázok) - precipitálódnak • Patogenezishez köthető fehérjék: kitináz, osmothin, β-1,3-glukanáz, thaumatin-szerű fehérjék Szerepük: gombák ellenei védekezés

• Szőlőszemek érése során bekövetkező változások vizsgálata: - fotoszintézis, szénhidrát metabolizmus, stressz válasz fehérjéinek expressziója nő a szemek színváltozásának kezdetén - a színváltozás végén az antocián szintézis fehérjéi overexpresszálódnak a termés héjban - a szüretet követően a patogenezishez köthető fehérjék a legdominánsabbak

O2 Tárolás során alkalmazott kezelések, melyek célja a szavatossági idő meghosszabbítása

Őszibarack - hőkezelés hatása -

• Rövid szavatossági idő • Több eljárás létezik, amivel meghosszabbítható a szavatosság pl.: - hűtve tárolás - módosított nyomásviszonyok - ehető bevonat - hőkezelés • Hőkezelés: 48˚C-os vízbe merítés 10 percig, további tárolás szobahőmérsékleten

• Hogyan változik hő hatására az őszibarack fehérje összetétele?

- reaktív oxigén gyökök metabolizmusa csökken - növekszik a kis molekulasúlyú stressz fehérjék mennyisége - néhány allergén fehérje mennyisége csökken - negatív hatás a glikolitikus útvonalra (csökkent energiatermelés) - a sejtfal integritásának fenntartásában részt vevő fehérjék expressziója nő

Pomelo - hűtve tárolás hatása • Alacsony hőmérsékletnek számos pozitív hatása van a gyümölcsök tárolása során: - organikus savak és vitaminok mennyisége magasabb - a gyümölcsök húsa keményebb • Overexpresszió: - stressz válasz fehérjéi - metabolizmust gátló fehérjék - metabolitok transzportját gátló fehérjék • Az alacsony hőmérséklet okozta stressz jelátviteli folyamatában a kalcineurin B-szerű fehérje és a protein kinázok komplexe fontos szerephez jut

Mandarin • • • • • • •

- hűtve tárolás hatása 4°C-on 85-90%-os páratartalom 2D-PAGE + MALDI-TOF-TOF MS 74 fehérje expressziója változott meg a tárolás során C-komponensek és szénhidrát metabolizmus Aminosav metabolizmus Dehidrin – dehidrációért felelős, a tárolás késői szakaszában halmozódik fel Betegség rezisztenciával kapcsolatos fehárjék overexpressziója, nagyon fontos a tárolás során

Anaerob stressz hatása • Citrusféléken vizsgálták • Tárolás során gyakran ki vannak téve anaerob viszonyoknak pl: olyan bevonat, ami nem engedi át a gázokat, elégtelen ventillációjú tárolási helyiség, műanyag zsákok • 10% O2 alatti és 5%CO2 feletti mennyiséget a citrusfélék nem tudnak tolerálni, anaerob respiráció nő, etanol és acetaldehid akkumulálódik, ízetlen lesz a gyümölcs

Intens. [a.u.]

• Mandarin különösen érzékeny, mert a héja kevésbé permeábilis a gázokra • Módszer: 2D-PAGE + HPLC/MS/MS x10 4

1475.7

3

1307.6

1993.9

1638.8

1107.5

2211.1

2

1851.9 1

2329.1 2383.9

1082.5

2717.1 2510.1

0 1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

• Mandarin és grapefruit • Külső héj (flavedo) és gyümölcshús • Kezelés: 24 h, N2 atmoszféra/ levegő

2872.3 3052.6

2750

3000

3264.5

3250

m/z

• Héj proteom változása az anaerob stresszre : - mandarin és grapefruit esetén is a stresszhez köthető fehérjék - pl.: dehidrinek, szuperoxid-dismutase, lipoxigenáz - oxidoreduktáz (reaktív oxigén gyökök detoxifikálása) szint a N2-es grapefruitban magasabb, mint a mandarinban, ezzel magyarázható, hogy a grapefruit jobban ellenáll az anaerob stressznek

• Gyümölcshús proteom változása az anaerob stresszre: - fehérje expressziós változás az energia termelésben, sejt ciklusban, sejt károsodás elleni folyamatokban - mandarinban nagyobb változások

• - 10-szeres expressziós különbséget azonosítottak az alkohol dehidrogenáz fehérje esetén a kezelések között a mandarin mintáknál, ez is bizonyítja a mandarin anaerob stressz érzékenységét - a kis hőstressz fehérjék (HSP) mennyisége is a mandarin esetén mutatott magasabb értéket

Alma - etilén hatása • Növényi hormon, etilén gyorsítja a gyümölcsök érését • Az alma érése során is termelődik etilén • Etilén kezelés indukálja a gyümölcs etilén termelését • Vizsgálati módszer: 2D-PAGE + LC/MS/MS • Etilén hatására növekszik azon fehérjék expressziója, melyek normál érés során nem jelennek meg • Néhány fehérje expressziója csökken, pl.: glikolitikus útvonal utolsó néhány lépésének enzimje

Kivi - ózon -

• Az ózon sejthalált és sejtkárosodást indukáló sejteket aktivál • Ózon kezelés megakadályozza a bakteriális leromlást és néhány betegség kialakulását • Segíti az etilén oxidációját a tároláskor, szacharóz degradációt stimulálja, antioxidánsok termelését serkenti

• Vizsgálati módszerek: SDS-PAGE + LC/MS • Az ózon blokkolta a gyümölcsök etilén termelését, késleltette az érést, stimulálta az antioxidáns és szabadgyök képződést • Az érés indukálja a fehérjék karbonilációját, de az ózon gátolja ezt a folyamatot • A kivi kandidáns fehérjéinek nagy része érzékeny a karbonilácóra, ezért képes az ózon késleltetni az érést

Banán • Éretlen vs. érett • Vizsgálati módszer: 2D-DIGE + MS • Kitinázok: - legnagyobb gyakoriság az éretlen gyümölcsben - többféle izoforma - patogének elleni védekezés + növekedési és fejlődési folyamatok - non-catalytic class III acidic kitináz mennyisége csökken az érés során (aminosav forrás a fehérje szintézisben)

•

• • •

- másik két izoforma expressziója azonban növekszik, patogének elleni védekezésben fontosak Pectát-liáz: pectint bont, ami a sejtfal fő komponense, csak mérsékelt szerep a gyümölcs puhaságában Érett banánban a keményítőt bontó enzim overexpresszálódik, édes íz kialakításban van szerepe Érett banánban a hősokk fehérjék mennyisége is nagyobb Ezek a fehérjék mind nagy mértékben befolyásolják az érett banán minőségét

Vérnarancs vs. narancs • Vérnarancs: likopin és antocián akkumuláció • 11 fehérje csoportban találtak expressziós különbséget: pl.: - cukor metabolizmus (vérnarancs) - stressz válasz (narancs) - aminosav metabolizmus (narancs) - oxidatív folyamatok (vérnarancs) - transzport (vérnarancs) - védekezés(vérnarancs) - sejtalkotók biogenezise (narancs)

• Fehérje csoportok 2/3-a a vérnarancsban mutat overexpressziót - Valószínű ok: magas antocianin szint - Antocianin bioszintézis és a hozzá kapcsolódó útvonalak változtatják meg a fehérje expressziót • A stressz válasz fehérjéi a másik csoportban mutattak magasabb expressziós szintet - Valószínű ok: a vérnarancs az antocianin szint növelésével reagál a rossz környezeti feltételekre, míg a normál narancs a stressz fehérjék szintézisével

Allergének • Allergiás reakciók elkerülésének érdekében, meg kell határozni mely növény okozza a tüneteket • Egy növény számos allergént tartalmazhat • Kb. 350 ismert allergén létezik • Leggyakrabban tároláshoz kapcsolódó fehérjék, enzimatikus és szerkezeti fehérjék okoznak allergiás reakciót

Allergének kimutatása: Western blot ELISA 2D PAGE + MS Protein microarray LC-MS/MS

• Gyakori fehérje allergének: - patogenezishez kapcsolódó fehérjék (PR-10): alma, eper, cseresznye, répa, körte, mogyoró - profilin, aktin kötő fehérje: körte, ananász, banán, alma, eper, répa, cseresznye, mangó - nem-specifikus lipid transzfer fehérjék: barack, kivi, alma, mogyoró, kukorica, cseresznye

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • A hőkezelés miként befolyásolja az őszibarack proteomját? • A környezet befolyásolja a gyümölcshéj fehérjéit?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Tatiana Torres Toledoa és mtsai. (2012): Proteomic analysis of banana fruit reveals proteins that are differentially accumulated during ripening. Postharvest Biology and Technology 70, 51–58. • Vera Muccillia és mtsai. (2009): Proteome analysis of Citrus sinensis L. (Osbeck) flesh at ripening time. Journal of proteomics 73, 134-152. • Jian Xin Shi és mtsai. (2008): Effects of anaerobic stress on the proteome of citrus fruit. Plant Science 175, 478–486. • Ioannis S. Minas és mtsai (2012): Physiological and proteomic approaches to address the active role of ozone in kiwifruit post-harvest ripening. Journal of Experimental Botany, Vol. 63, No. 7, pp. 2449– 2464

Zöldségek fehérjéi élelmiszeripari szempontból

Az előadás vázlata • • • • •

Zöldségfogyasztás élettani hatásai Változások az érés során Tárolás hatása a fehérje összetételre Hagyományos vs. biotermelés Kombinatorikus peptid ligand könyvtárak

Zöldségfogyasztás • Magyarország átlagfogyasztása: - 90kg/fő/év - Európában átlagosnak tekinthető - szegényes az összetétele: nagyrészt paradicsom, paprika, káposzta, vöröshagyma • Világátlag: 1970 és 2000 között 60kg-ról 105kg/fő/évre nőtt • Ajánlott napi bevitel: 40-50 dkg

Élettani hatásuk • Nem csak biológiai energiaforrás, hanem értékes tápanyag • Általában fehérjékben szegények (kivéve: borsó, bab) • Ásványi anyagok közül a kálium a legjelentősebb, ezenkívül: foszfor, kalcium, magnézium, nátrium, vas • Vitaminok: D- és B12-vitamin kivételével az összes vitamin

Zöldségek termésének érése • Biokémiai, fiziológiai és gén expressziós változások történnek • Klorofillok degradálódnak • Karotinoidok és antociánok szintetizálódnak • Etilén receptorok degradálódnak • Sejtfalak meglágyulnak • A keményítő egyszerű cukrokká alakul • Illóanyagok keletkeznek • Ízanyagok akkumulálódnak

Paradicsom • Világszerte elterjedt zöldségféle • Régóta használják modell szervezetként: - genetikai - fiziológiai - fejlődéstani - termés érési vizsgálatokban

• Éretlen, közepesen érett, érett: - pektinészteráz és GTP-kötő fehérje, ezek a sejtfalak puhulásában és ezáltal a paradicsom keménységében vesznek részt - specifikus marker fehérjék, mennyiségük nő az érés során

• Koktélparadicsom: - fejlődés és érés vizsgálatok - a poliakrilamid gélen lévő fehérje spotok 8%-a mutatott expressziós különbséget az érés során - az érés kezdeti szakaszában: aminosav metabolizmus és fehérje szintézis - szénhidrát metabolizmushoz és oxidatív folyamatokhoz kapcsolódó fehérjék overexpressziója az érett gyümölcsben éri el a maximumot

Bab és borsó • A két legfontosabb hüvelyes zöldségféle a humán táplálkozásban • Mindkettőnek elkészült a 2D-PAGE térképe • Borsó esetében több tanulmány a kórokozók (pl. lisztharmat) hatását vizsgálja a proteom összetételre • Babszemben leggyakoribb fehérjék: phaseolin, fitohemagglutinin és a lektinhez kapcsolódó alfa-amiláz inhibitor

Oliva • Gazdaságilag fontos növény, az olivaolaj alapanyaga • Az olivaolaj zsírsavösszetétele (telítetlen zsírsavak aránya magas) miatt kedvelt tápanyagforrás, rákmegelőző hatása közismert • Az olaj minősége a bogyóban lejátszódó felépítő és lebontó folyamatok függvénye

• Olivabogyó különböző fejlődési szintjeinek összehasonlítása: - vizsgálati módszer: 2D PAGE + MALDI TOF - változások a fehérje expresszióban: +aminosav metabolizmus +sejtciklus +energia és szén metabolizmus +lipid szintézis +fotoszintézis +fehérje szintézis +stresszválasz +allergének +almasav enzim akkumulációja az olajképződéssel pozitív korrelációban van

45 nappal a virágzás után

110 nappal a virágzás után

150 nappal a virágzás után

Forrás: Bianco L, Alagna F, Baldoni L, Finnie C, Svensson B, et al. (2013) Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e53563. doi:10.1371/journal.pone.0053563

Forrás: Bianco L, Alagna F, Baldoni L, Finnie C, Svensson B, et al. (2013) Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e53563. doi:10.1371/journal.pone.0053 563

A gélképen a különböző expressziós szintet mutató fehérjék vannak jelölve

Expressziós különbséget mutató fehérjék csoportosítás Forrás: Bianco L, Alagna F, Baldoni L, Finnie C, Svensson B, et al. (2013) Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e53563. doi:10.1371/journal.pone.0053563

Paprika - hűtve tárolás • Leszedést követően amint lehet le kell hűteni (kb. 7,5˚C-ra) • A paprika érzékeny a hideg tárolásra • Ha 7˚C-nál alacsonyabb hőmérsékleten tartjuk: - lyukak jelennek meg a felszínén - magok megbarnulnak - elszíntelenedik - nedvességtartalma csökken - másodlagos hatás: reaktív oxigéngyökök szabadulnak fel

• 10˚C-on tárolt vs. 1˚Con tárolt • Vizsgálati módszer: 2D DIGE + MALDI-TOF MS • Szemmel látható változások az 1˚C-on tárolt esetében + fokozott etilén termelés

• Peroxiszómák száma csökken ezáltal az egyik antioxidáns enzimfehérje szintje is, mely a peroxiszómában lokalizálódik • Fő különbségek: - redox homeosztázisban - szénhidrát metabolizmusban • Glikolízis, Calvin-ciklus, Krebs-ciklus enzimjei gátlódnak a hűtve tárolás során

• Enoláz és gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz fehérjék a fő okozói a hűtés során kialakuló károsodásokért • Citoszolban lévő malát-dehidrogenáz (MDH) is részt vesz az abiotikus stressz kialakításában – ebben a vizsgálatban bizonyították először, korábban csak a plasztiszokban lévő MDH-t tudták ehhez a stressz típushoz kapcsolni

• Paradicsom esetén is megfigyelhető a hűtve tárolás káros hatása (pl.:gumiszerűvé válik) • A hűtve tárolás hatása: - éréshez kapcsolódó fehérjék exp. csökken (pl. savas invertáz) - fagy toleranciáért felelős fehérjék exp. nő - kis hősokk fehérjék exp. Nő - sejtfal fehérjék exp. változik: β-galaktozidáz szint nő, poligalakturonáz szint csökken

Cukorrépa - só stressz -

• Hajtás és a gyökér setében vizsgálták a só stressz hatását • Módszer: 2D-PAGE • A legtöbb fehérje nem mutatott változást a só stressz hatására, expressziójuk stabil maradt • Hajtás: 6 fehérje expressziója változott • Gyökér: 3 fehérje expressziója változott • De ezek nem kapcsolhatók a sóhoz való alkalmazkodáshoz

Burgonya - változások a tárolás során • A tárolás befolyásolja a rügyezést, mely a későbbi hozamra van hatással • Vizsgálati módszer: 2D-DIGE + MS/MS • Változások a tárolás során: - keményítő metabolizmusban - fehérje konformáció szabályozása - fehérjék újrahasznosításában - stressz válaszban

• Radikális szabadgyök semlegesítés, így az oxidatív károsodások nem halmozódnak fel a tárolás során

Hagyományos vs. bio termelés • Bio termelés esetén: - magasabb szárazanyag tartalom - magasabb citromsav, fenol és cukor tartalom - kisebb nedvesség tartalom - kisebb nitrát és fehérje tartalom • A bio termelés nagyon komplex hatással van a növények fiziológiás és minőségi tulajdonságaira, ezért nehéz vizsgálni

• Burgonya esetén az szerves- és a műtrágya volt szignifikáns hatással a fehérje expresszióra: 160 fehérje esetén találtak expressziós különbséget: - 17 fehérje a műtrágyás csoportban mutatott overexpressziót - 143 fehérje expressziója növekedett meg a szerves trágyázás esetén

Különbségek: - fehérje szintézisben és turnover-ben - szén és energia metabolizmusban - védekezési válaszok, mely jelzi hogy a szerves trágyázás növeli a stressz választ

• Káposzta minták esetén: - 58 fehérje esetében találtak expressziós különbséget a hagyományos és a bio termesztés összehasonlítása során - ez kb 5%-a az összes detektált fehérjének - ezek főleg a glikolízisben vesznek részt vagy ahhoz kapcsolódnak - a bio termelés esetén overexpresszálódtak - hagyományos termelés során a detoxikáláshoz kapcsolódó fehérjék expressziója nő

• Répa: - 68 fehérje esetében találtak expressziós különbséget a hagyományos és a bio termesztés összehasonlítása során - szénhidrát és polipeptid metabolizmusra + a másodlagos metabolitok termelésére volt hatással a - bio termelés negatívan befolyásolja a chaperonok mennyiségét és a fehérjeszintézishez szükséges fehérjéket

Kombinatorikus peptid ligand könyvtár • Zöldségekből származó minták esetében is komoly kihívás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentése, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítása • A kombinatorikus peptid ligand könyvtárak alkalmasak erre a feladatra: Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

• 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal • Spenót minták esetén sikeresen alkalmazták a kis gyakoriságú fehérjék esetén • Olivabogyók esetén is sikerült feldúsítani a kisebb gyakoriságú fehérjéket ezzel a módszerrel

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • A paradicsom érettségét miként befolyásolják a fehérjék?

• A hűtve tárolás milyen változásokat okoz a zöldségek fehérje expressziójában? • A biotermesztés befolyásolhatja a protemprofilt?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Paloma Sánchez-Bel és mtsai. (2012): Understanding the mechanisms of chilling injury in bell pepper fruits using the proteomic approach. Journal of proteomics 75, 5463 - 5478. • Linda Bianco és mtsai. (2013): Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e53563. doi:10.1371/journal.pone.0053563 • Arkadiusz Nawrocki és mtsai. (2011): Quantitative proteomics by 2DE and MALDI MS/MS uncover the effects of organic and conventional cropping methods on vegetable products. Journal of proteomics 74, 2810-2825.

A hal, mint élelmiszer proteomikája

Az előadás vázlata • Halfogyasztás • Hamisítások kiszűrése • Allergének vizsgálata • Tenyésztett és vadvízi állományok összehasonlítása • Post-mortem vizsgálatok • Mikrobiális leromlás, patogének

Halfogyasztás • Magyarországon évente átlagosan 4,5 kg/fő (élősúlyban) • Európai Unióban évente átlagosan 22 kg/fő (élősúlyban) • Világátlag: 13,5 kg/fő (élősúlyban)

Halfogyasztás pozitív élettani hatásai • Magas az omega-3 zsírsavak aránya • Magas fehérjetartalom • Alacsony energiatartalom, mely az alacsony zsírtartalomnak köszönhető • Vitaminok: A, D, E, B1, B2 • Ásványi anyagok: jód, foszfor, nátrium, kálium, vas • Szív- és érrendszeri megbetegedések megelőzésében fontos

Proteomikai módszerek felhasználásának lehetőségei • Hamisítások kiszűrése • Allergének vizsgálata • Tenyésztett és vadvízi állományok összehasonlítása • Post-mortem változások vizsgálata • Mikrobiális leromlás, veszteség

Hamisítások kiszűrése • Helyettesítés más fajjal • Okok: olcsóbb, adók elkerülése • Veszély!!! A különböző halfajták a leggyakoribb étel allergének! • EU-ban szigorúan szabályozott jelölés a csomagoláson: - pontos fajmegnevezés - tenyésztett vagy vad vízi - származási hely

• Néha még a szakértőknek is nehézséget okoz az azonos élőhelyen megtalálható nagyon közeli halfajok elkülönítése • A feldolgozási eljárások során a külső anatómiai ismérvek alapján történő megkülönböztetés lehetetlenné válik

Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a halfajok azonosítására

Fehérje alapú módszerek • SDS-PAGE: - 1985. Keenan és Saklee 164 különböző halfaj elkülönítése gyakori enzimfehérjék alapján - izomfehérjék alapján történő elkülönítés is lehetséges nyers és feldolgozott húsból egyaránt • IEF: parvalbumin (Ca kötő fehérje az izmokban) nagyfokú variabilitást mutat a halfajok között

Aktin és miozin

Tokhal

Harcsa

Pisztráng

Cápa

Standard

Lazac

Miozin nehéz lánc (210kD) Aktin (42kD) Tropomiozin (35kD) Miozin könnyű lánc 1 (21kD) Miozin könnyű lánc 2 (19kD)

Audrey Dell Hammerich 10/2009

• 2D-PAGE: fehérje mintázatok összehasonlítása biomarkerek keresése - 3 tonhal faj elkülönítése, marker: triózfoszfát izomeráz - 4 sügér faj elkülönítése, marker: szarkoplazmatikus fehérjék - 9 laposhal faj elkülönítése, marker: szarkoplazmatikus fehérjék

Intens. [a.u.]

• MS alapú módszerekkel: MALDI-TOF, ESI-MS/MS - 25 kereskedelmi forgalomban kapható halfaj elkülönítése, marker: szarkoplazmatikus fehérjék - Merlucciidae család fajainak elkülönítése, marker: parvalbumin, nukleozid difoszfát kináz x10 4

1475.7

3

1307.6

1993.9

1638.8

1107.5

2211.1

2

1851.9 1

2329.1 2383.9

1082.5

2717.1 2510.1

0 1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2872.3 3052.6

2750

3000

3264.5

3250

m/z

Allergének • A különböző halfajták nagyon gyakori étel allergének • Immunoglobulin E által közvetített allergiás reakciók • Életveszélyes is lehet (anafilaxiás sokk) • EU-s szabvány: 14 leggyakoribb allergént fel kell tüntetni a csomagoláson • Az élelmiszer feldolgozási folyamatok során kontamináció lehetséges

• Feltétlenül szükséges a gyors, pontos, érzékeny és jó ismételhető allergén azonosítási módszerek kidolgozása • A parvalbuminok (Ca kötő albumin) a legfontosabb allergének a halhúsban • Biomarkerként használhatóak

• MS-alapú módszerekkel parvalbumin szekvenciák monitorozása az élelmiszerekben Leggyorsabb és legmodernebb eljárás: High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) + Selected MS/MS Ion Monitoring (SMIM) + Linear ion trap (LIT) kevesebb mint 2 óra alatt elvégezhető

Tenyésztett vs. vadvízi • Halak esetén is leggyakrabban az izomszövetet használják proteomikai vizsgálatokhoz: - könnyen begyűjthető - kereskedelmi szempontból is ez a szövet a legjelentősebb

• A tenyésztett és vadvízi állományok izom proteomjának összehasonlítása során vizsgálhatjuk: - a tenyésztési módszerek - környezeti különbségek (víz minőség, hőmérséklet) - étrendek hatását • Atlanti tőkehal: post-mortem degradáció a tenyésztettben gyorsabb, mivel genetikai távolság nincs köztük, ezért ez a különbség a környezeti különbségből adódik

• Farkassügér: - Európa haltenyésztésének egyik fő terméke - kilenc fehérje expressziójában találtak különbséget - szénhidrát metabolizmus enzimjei a tenyésztett halaknál overexpresszálódtak - kreatin kináz, nukleozid difoszfát kináz B és a parvalbumin expressziója csökkent a tenyésztett állománynál tartási körülmények befolyásolják a tenyésztett állatok izom fejlődését

A vizsgálatok célja: termékek minőségének javítása

• Tőkehal: - gyorsabb post-mortem degredáció a tenyésztett tőkehalban a húsa kevésbé kemény, magas a víztartalma, izomrostok szerkezete is különböző - lehetséges ok: tenyésztés során stressz - óriás laposhalban is ugyanezt figyelték meg - tenyésztett állatoknál különbségek a mitokondrium szerkezetében, megváltozott fehérje expresszió az metabolikus enzimek esetén, elégtelen zsírsav oxidáció, abnormális zsírsav lerakódás az izomban

• Szivárványos pisztráng: dezmin fehérje (sejtváz fehérje) mennyisége kevesebb a tenyésztett állatokban, rosszabb húsminőség • Tengeri sügér: glikolitikus enzimek és parvalbumin frakció között különbség, a tenyésztés hatással van az izom összetételre

• Az izomszöveten kívül májból és vérből is lehetséges a fehérje vizsgálatok elvégzése. • Szivárványos pisztráng: - az emelt szója tartalmú táp hatása a máj fehérje összetételére - rövid ideig tartó éhezés hatása a máj proteomra

• Aranydurbincs: hideg hatására hogyan változik a máj proteomja hideg hatására a hepatocitákban oxidatív károsodások alakulnak ki • Aranydurbincs: tenyésztés során fellépő stresszhatások következményeinek vizsgálata a máj proteom szintjén számos fehérje összefüggésbe hozható a stresszel

• A vérplazma mintákat leggyakrabban az immunrendszer feltérképezésére használják a halak esetén.

Post-mortem változások • Enzimatikus autolízis során a nagyméretű miofibrilláris fehérjék (miozin, aktin, titin) a proteázok enzimatikus aktivitásának hatására kis méretű peptidekre hasadnak • Ez a folyamat nagymértékben meghatározza a hús ízét, textúráját és illatát • A vágás előtti események (fizikai aktivitás, sűrűség, stressz) is hatással vannak az izom post-mortem tulajdonságaira (glikogén tartalom, pH csökkenés)

• Nem enzimatikus módosítás: oxidáció - karboniláció, thiol-oxidáció, aromás hidroxiláció stb. - hatással vannak a halhús minőségére, mert megváltozhat a fehérjék oldahtósága, aggregációs képessége, hidrofobitása - 2D-PAGE segítségével detektálható a tárolás során növekedő oxidációs szint

• Tárolási hőmérséklet: hatással van a proteolízis mértékére, alacsonyabb hőmérsékleten kevésbé aktívak a proteolitikus enzimek • Tárolási idő: - Tőkehal: Mennyire friss a halhús? 16 kDa nagyságú fehérje, mely a tárolási idő előrehaladtával degradálódik, eltűnik a gélképről - Durbincs: alfa-actin, tropomiozin 6. napig stabilak - Parvalbumin: allergén, mennyisége a tárolás során csökken

Különböző vizsgálatokból kiderült, hogy a tárolás időtartama nagyobb hatással van a halhús fehérje összetételére, mint a tárolási hőmérséklet

• Különböző vágási technikák hatása az izomfehérjékre: - Asphyxia levegőn - Asphyxia jégben - Gerincvelő átvágása 2D-DIGE módszerrel vizsgálták Eredmény: gerincvelő átvágás biztosítja leginkább, hogy a fehérjék megőrizzék integritásukat (kevesebb stressz)

Mikrobiális leromlás, veszteség • Az a folyamat, mely során különböző biokémiai változások történek mikrobiális aktivitás hatására • Gazdasági veszteséget és súlyos élelmiszereredetű megbetegedéseket okozhatnak • Aminok keletkeznek, melyek kellemetlen ízűek, vagy ízetlenné teszik a húst • MS-alapú módszerekkel sokféle patogént lehet azonosítani nyers, füstölt, vákuum csomagolt halfélékből

• Pl.: Listeria monocytogenes - liszteriózis kórokozója – halálos kimenetel is lehetséges - egyik leggyakoribb élelmiszer útján terjedő baktérium - folyékony füst változást okoz a proteom összetételükben, csökkenti a növekedésüket és túlélésüket füsttel tartósított halfélék esetén ritka a liszteriózis

• Egyéb, élelmiszer leromlást és emberi megbetegedést okozó baktériumok: • Gram-negatív: Pseudomonas spp., Aeromonas hydrophila, Acinetobacter baumanii, Enterobacter spp., Campilobacter spp. • Gram-pozitív: Carnobacterium spp., Clostridium spp., Staphylococcus spp.

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Mely területeken van indokoltsága a hal proteom vizsgálatának? • A halfeldolgozás után (során) milyen fehérjeváltozások következnek

be a halhúsban?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Proteomics in foods. 2013. Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. • Mónica Carrera és mtsai. (2012): Proteomics for the assessment of quality and safety of fishery products. Food research international • Tune Wulffa és mtsai. (2012): Time-dependent changes in protein expression in rainbow trout muscle following hypoxia. Journal of proteomics 75, 2342-2351. • Maria Filippa Addisa és mtsai. (2012): 2D DIGE/MS to investigate the impact of slaughtering techniques on postmortem integrity of fish filet proteins. Journal of proteomics 75, 3654 - 3664.

Tömegspektrometriás alapok

Az előadás vázlata • a tömegspektrometria helye a proteomikában

• tömegspektrometriás alapfogalmak • a tömegspektrométer felépítése

A tömegspektrometria helye a proteomikában Gél alapú módszerek

Egy- vagy kétdimenziós gélelektroforézis

Tömegspektrometriás módszerek

Fehérjék emésztése Peptidek elválasztása (kromatográfiás lépés)

Fehérjék emésztése

Fehérje mintázat vizsgálata

Tömegspektrometriás analízis

Tömegspektrometria A tömegspektrométer felépítése

Minta

Ionforrás

Elektronika

Tömeg analizátor

Detektor

Adatfeldolgozó rendszer

Vákuum rendszer Tömegspektrum

Tömegspektrometriás alapfogalmak a) Tömegspektrometriában használt tömegek Molekula tömegeket Da-ban vagy atomtömeg egységben mérik (amu) amu: 12C atom 1/12-ed része Da: 16O atom 1/16-od része. Relatív molekula tömeg (Mr) mértékegység nélküli, egy arány Th (Thomson): tömeg/töltés arány (m/z) • tömeg – tömeg/töltés probléma

pl.1000 Da +1-es töltés esetén: 1000+1 = 1001 m/z +2-es töltés esetén: (1000+2):2 = 501 m/z Ionok m/z értéke: (Mw+n):n (n a töltések száma)

Tömegspektrometriás alapfogalmak b) Tömegpontosság • a mért tömeg eltérése az igazi tömegtől • Abszolút tömegpontosság: kísérleti - elméleti = ± X Da pl.: ± 0.2 Da • Relatív tömegpontosság : relatív eltérés pl.: ± 200 ppm

(± X Da / M elméleti) x 106 ppm pl. 100 Da tömegnél a ± 0.2 Da eltérés 20 ppm relatív eltérést eredményez: 0.2 Da / 100 Da x 106 = ± 20 ppm de 1000 Da esetében a ± 0.2 Da eltérés 200 ppm relatív eltérést eredményez: 0.2 Da / 1000 Da x 106 = ± 200 ppm

Tömegspektrometriás alapfogalmak c) Felbontás (R) m/z

R=

Δm/z

A tömegspektrométerek felbontó képessége azt jelenti, hogy milyen tömegkülönbségű ionokat, egymástól milyen távolságra levő csúcsokat tud egymástól megkülönböztetni. Csúcs definíció: Peak width at half-height/

Int (intenzitás)

FWHM

Intmax

Full width at half maximum (FWHM) – csúcsszélesség az

Intmax/2

intenzitás 50%-nál.

x1

x2

x (m/z)

Tömegspektrometriás alapfogalmak Nagyobb felbontás jobb tömegpontosságot eredményez

Intenzitás

FWHM = 0,633 Th R = 4500

FWHM = 0,2 Th R = 14200

m/z

Tömegspektrometriás alapfogalmak d) Izotópok

A legtöbb elemnek több mint egy stabil izotópja van

pl. a C atomok 98,9%-nak tömege 12 Da és 1,1%-nak 13 Da.

Miért fontos ez? Ha a tömegspektrométer felbontása elég jó, akkor ezeket az izotópokat is detektálja.

Ha elég jó a felbontás, akkor az izotópok segítségével jobb tömegpontosság is meghatározható.

Tömegspektrometriás alapfogalmak Néhány elem izotópjainak előfordulása

Elem

Tömeg

H D

1,0078 2,0141

Előfordulási arány (%) 99,985 0,015

C

12,000 13,0034 14,0031 15,001 15,9949 16,9991 17,9992

98,89 1,11 99,64 0,34 99,73 0,04 0,20

N O

Tömegspektrometriás alapfogalmak Izotóp klaszter C1 elméleti spektruma

C10 elméleti spektruma

C100 elméleti spektruma

120.00 1200.00

12.00

1201.00

Természetes előfordulás: 12C: 98.9 % 13C: 1.1 %

90

Intentzitás

80 70 1202.00

60 50 40 30

1203.01 20 121.00 10

1204.01

13.00 122.00

m/z

Az atomok számának növekedésével nő annak a valószínűsége, hogy izotóp atomok legyenek jelen a molekulában.

Tömegspektrometriás alapfogalmak Az izotóp mintázat változik a tömeg változásával

Intentzitás

3660

2095

1295

2465

5730

m/z Ahogy a C-atomszám növekszik, úgy nő a nagyobb izotóp tömegű csúcsok relatív intenzitása is.

Tömegspektrometriás alapfogalmak Az izotópeloszlás segítségével meghatározható a töltés

0,5

Intentzitás

1

1

+2

0,5 0,5

1

m/z

m/z 0,3 0,4

Intentzitás

Intentzitás

+1

0,3 0,3

m/z

+3

Tömegspektrometriás alapfogalmak Monoizotópos tömeg

Monoizotópos tömeg A legkönnyebb izotóp tömegével számolt tömeg A legpontosabb Intentzitás

tömeg

( 1H= 1.007825,

12C=12.000000,

16O=15.994915).

Ez a legpontosabb tömeg és ha a készüléknek elég jó a felbontása, akkor ezt használják. m/z

Tömegspektrometriás alapfogalmak Átlagos tömeg Átlagos tömeg

Intentzitás

A molekulát felépítő atomok átlagos Az így számolt tömeg nem lehet olyan pontos, mint a

monoizotópos tömeg

tömegéből számolható. Az így kapott

érték a természetes izotóp eloszlást tükrözi, a H =1.0080, C = 12.011, O=15.994 stb. tömegeket használja.

m/z

Tömegspektrometriás alapfogalmak 2 x C13

Az inzulin spektruma

Intentzitás

C13

C12 : 5730,61

m/z

Inzulin 257 C-atomos. Ezen tömeg felett a monoizotópos csúcsok intenzitása már túl kicsi ahhoz, hogy elég információval szolgáljanak, ezért már az átlagos molekulatömeget használják

Tömegspektrometriás alapfogalmak e) A tömegspektrometriás spektrum Átlagos tömeg

Báziscsúcs 100

Intenzitás (%)

Báziscsúcs: a legintenzívebb csúcs • ha az intenzitás %-

Monoizotópos tömeg

ban van megadva, akkor a báziscsúcs

50

intenzitása 100%

m/z

Tömegspektrometriás alapfogalmak A tömegspektrometriás analízis paraméterei - összefoglalás •

tömegpontosság: a mért tömeg eltérése az igazi tömegtől

•

felbontás: két hasonló tömegű ion (csúcs) megkülönböztethetősége

•

érzékenység: a mérendő anyag legalacsonyabb még detektálható mennyisége

•

tömeg tartomány: a mérhető tömeg alsó és felső határa

•

dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben az analit ion intenzitása lineárisan változik a koncentrációval

•

mérési sebesség: adott idő alatt lemérhető minták száma

•

izotóp klaszter: az elemek állandóan jelenlevő izotópjaiból származó eltérő tömeg sorozat

•

monoizotópos és átlagos tömeg

A tömegspektrométer felépítése

1.Minta

2.Ionforrás

Elektronika

3.Tömeg analizátor

4.Detektor

5.Adatfeldolgozó rendszer

Vákuum rendszer Tömegspektrum

A tömegspektrométer felépítése 1. A minta

Minta típusa gáz

Minta bejuttatási formája gáz

Minta folyadék

folyadék

szilárd

szilárd

Bejuttatás módja Elválasztást követően Elválasztást követően

GC-MS

LC-MS

Közvetlenül (infúziós pumpa) Közvetlenül (mintatartó lemez)

Proteomikában használatos mintabeviteli módok

MALDI-MS

A tömegspektrométer felépítése 2. Az ionforrás • a mintát alakítja át gáz fázisú ionokká • többféle ionizációs technika létezik – mindig a szükséges információ és a minta jellege határozza meg az alkalmazott módszert • Elektron ütközéses ionizáció (EI)

• Kémiai ionizáció (CI) • Gyors atom bombázásos ionizáció (FAB) • Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (APCI) • Termospray ionizáció (TS) • Elektrospray ionizáció (ESI) • Mátrix segített lézer deszorpciós ionizáció (MALDI) • Deszorpciós elektrospay ionizáció (DESI)

A tömegspektrométer felépítése

*

Elektrospray ionizáció (ESI) szárító gáz (N2) légköri nyomás

MS analizátor

elektrospray kapilláris

nagy feszültség (+)

nagy vákuum

nyomás, feszültség és hőmérséklet gradiens

+ ++++++++ +++++ + + + ++++ + +++ + ++ +++oldószer cseppek +

+

minta oldat

orifice (mintabemenet)

párolgás

szétrobbanása

[M + nH]n+ +

további robbanások és deszolvatált ionok keletkezése

• a minta folyékony halmazállapotú • többszörösen töltött ionokat eredményez • nagy térfogattartományban (nl-ml) használható • szükség van szárító gázra (nitrogén) • lágy ionizációs technika

A tömegspektrométer felépítése Mintatartó lemez

*

Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) - MALDI

Minta

Lézer

+ MH+

+ +

+

+

Analizátor Mátrix

+20-30 kV

Detektor

• mintát mátrixal együtt kristályosítják – szilárd halmazállapotú • a minta ionizációját a mátrix ionok segítik • egyszeres vagy kétszeres töltésű ionok keletkeznek • ún. lágy ionizációs technika

A tömegspektrométer felépítése 3. Az analizátor •

Tömeg analízist tesznek lehetővé, az ionokat m/z szerint elválasztják egymástól

•

Többféle típus ismeretes pl. :

– Mágneses és elektrosztatikus

Kiválasztásuk függ a(z): – Repülési idő analizátor (TOF)

•

alkalmazástól

•

költségtől

•

kívánt teljesítménytől

– Quadrupole – Ion csapda (3D, hibrid és lineáris) – Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia

A tömegspektrométer felépítése Az ionok útja a repülési idő (Time-Of-Flight) TOF analizátorban • A TOF analizátorban az ionok a kinetikus energiájuk és nagyságuk alapján vándorolnak • A kisebb m/z-vel rendelkező ionok gyorsabban, a nagyobb m/z-vel rendelkező ionok lassabban mozognak az analizátorban • Minél hosszabb az ionok útja, annál szebb elválást eredményez • A TOF analizátor felbontása jó TOF analizátor Ionforrás

Detektor

A tömegspektrométer felépítése A kvadrupól analizátor

• A kvadrupól négy elektródából áll, amelyekre feszültség kapcsolható • A VRF és VDC feszültségek megfelelő kombinációja révén megadható, hogy a kvadrupól milyen ionokat enged át

• A kvadrupól felbontása nem olyan jó mint pl. a repülési idő analizátoré

*

A tömegspektrométer felépítése Az ionok útja a kvadrupólban A kvadrupól elektródáira kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat enged át a kvadrupól

Kvadrupól

A kvadrupól szelektíven stabilizál

Detektor

A tömegspektrométer felépítése Az ionok útja az ioncsapdában Az ioncsapda stabilizálja minden bejutott ion mozgását és az elektródákra kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat destabilizál és enged ki

Detektor Az ioncsapda szelektíven destabilizál

A tömegspektrométer felépítése Az ionok útja az Orbitrap analizátorban • Az ionok többé-kevésbé körpályán mozognak

• Az ionok mozgása által keltett áramokat a külső elektród érzékeli (detektor) • A regisztrált frekvenciákat Fourier transzformáció segítségével alakítják át spektrummá • Nagyon jó felbontást lehet elérni

en.wikipedia.org

A tömegspektrométer felépítése Egyszerű vs. tandem tömegspektrométer

Egyszerű tömegspektrométer

Ionforrás

Tömeg analizátor

Detektor

A tömegspektrométer felépítése Egyszerű vs. tandem tömegspektrométer

Tandem tömegspektrométer

Ionforrás

Tömeg analizátor

Ütközési cella

Tömeg analizátor

Detektor

A tömegspektrométer felépítése Tömegspektrométerek fajtái • a készülékben alkalmazott ionforrás és tömeg analizátor típusa szerint lehet: • MALDI-TOF • MALDI-TOF-TOF

• MALDI/ESI-QTOF • ESI-tripleQuad • MALDI/ESI-Trap (3D, hibrid v. lineáris) •ESI-Orbitrap • ESI-FTICR ……..

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • A tömegspektrométer felépítése • Az egyszerű és tandem tömegspektrométerek közötti különbség

• A tömegspektrometriás analízis paraméterei

Felhasznált és ajánlott irodalom • Michael Kinter, Nicholas E. Sherman: Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, New York, 2000. • Chabil Dass: Principles and Practice of Biological Mass Spectrometry, WileyInterscience, 2001

A tömegspektrometria adta lehetőségek a fehérjék vizsgálatában, különös tekintettel az élelmiszerek ellenőrzésére

Az előadás vázlata • fehérjék azonosítása tömegspektrométer segítségével

• fehérjék kvantitálása tömegspektrométer segítségével • tömegspektrometriás technikák alkalmazása az élelmiszerek

vizsgálata során • baktériumok gyors azonosítása tömegspektrométer segítségével

Az élelmiszerek minőségének ellenőrzése rendszeres laboratóriumi vizsgálatokat igényel Élelmiszerbiztonság

Élelmiszer előállítása

Megfelelő biztonsági előírások betartása (HACCP)

A jelzett összetétel biztosítása Megfelelő tájékoztatás, eredetiségvizsgálat

Rendszeres laboratóriumi vizsgálat

Élelmiszerbiztonság Az a tudományág, amely az ételmérgezések

elkerülése érdekében az élelmiszerek biztonságos tárolásával, előállításával és kezelésével foglalkozik

en.wikipedia.org

Ételmérgezés: élelmiszer eredetű megbetegedés, amely az élelmiszerek rendeltetésszerű használata esetén következik be. • Okozhatják fizikai, kémiai és biológiai ágensek.

Tömegspektrometriás vizsgálatok az élelmiszerek ellenőrzése során

Fehérje azonosítás:

• fajmeghatározás (pl. húskészítmények esetén) • allergének meghatározása • patogének meghatározása

• toxinok meghatározása

Tömegspektrometriás vizsgálatok az élelmiszerek ellenőrzése során

Fehérje módosulások vizsgálata:

• élelmiszerek érésének nyomon követése (pl. sonka, kolbász, sajtok stb. érése során) • különböző feldolgozási és tárolási folyamatok során bekövetkező esetleges minőségromlás

vizsgálata

Fehérjék azonosítása Intakt fehérje MW alapján intenzitás

Túl sok variációs lehetőség – ritkán használható m/z

Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek m/z alapján – PMF: peptide mass fingerprint

intenzitás

Több variációs lehetőség – ha van előzetes információ, használható. Közléshez nem elfogadott. m/z

Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek fragmentációja segítségével megállapított szekvencia alapján. Pontos

intenzitás

Fehérje azonosítás

információ, közléshez is elfogadott.

m/z

Fehérje azonosítás tömegspektrometriával •

A fehérjéket tripszinnel emésztik

•

Peptideket ionizálják és pontos tömegüket meghatározzák, hogy így azonosítsák a peptideket és fehérjéket (PMF), vagy ionokat választanak ki (anya ion/prekurzor ion) és fragmentálják őket (MS/MS spektrum)

•

A keletkezett egyszeres töltésű ionokat (leány ionok) analizálják hogy a szekvenciát meghatározzák és azonosítják a peptidet, majd a peptidek segítségével a fehérjéket

Peptidek fragmentációja •

Az ütközési cellában történik, általában ütközés hatására

•

Több típusa létezik, leggyakrabban a CID – collision induced dissotiation – ütközés indukálta disszociációt alkalmazzák

•

Amikor a peptidek belépnek az ütközési cellába, akkor főként a peptid kötés mentén fragmentálódnak

•

Minden egyes peptidre optimalizálni kell az ütközési energiát

•

Ütközéses fragmentációkor főleg “b” és “y” típusú leány ionok keletkeznek

A „b” és „y” fragmens ionok y2

y3

H2N

Aminosav1

Aminosav2

b1

Aminosav3

b2 +

H2N

Aminosav1

y1

Aminosav2

Aminosav4

b3 + Aminosav3

Aminosav4

y ion

b ion y4 y3 y2 y1

MINTAPEPTID b1 b2 b3 b4

COOH

COOH

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Komplex minta

Ionforrás

Analizátor1

Ütközési cella

MS/MS spektrum

fragmentáció

intenzitás

intenzitás

MS spektrum

Analizátor2

m/z

m/z

„b” és „y” sorozatok azonosítása Peptid szekvencia megállapítása

Fehérje azonosítása

Detektor

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 1. Tömegspektrum (MS) felvétele

Komplex minta

Ionforrás

Analizátor1

Ütközési cella

Analizátor2

MS spektrum

Prekurzor ion kiválasztása

Detektor

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Komplex minta

Ionforrás

2. Töltöttségi fok meghatározása

Analizátor1

Ütközési cella

Analizátor2

Detektor

+2 - Töltöttségi fok megállapítása - Megfelelő ütközési energia kiszámolása

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 3. MS/MS spektrum felvétele

Komplex minta

Ionforrás

Analizátor1

Ütközési cella

Analizátor2

Detektor

MS/MS spektrum

Peptid fragmens ionok analízise

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Információ függő adatgyűjtés: IDA – information dependent aquisition/DDA – data dependent aquisition MS (EMS)

Kizárási listák

Töltöttségi fok Megállapítása (ER)

MS/MS (EPI)

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével A szekvencia meghatározása a spektrumban látható csúcsok különbségéből Aminosavak monoizotópos tömege

Intenzitás

EPTID PEPTID PEPTI y6 b1 b2 y2

y4 3 y3 b101

y5

97 Pro(P) b5

113 Ile/Leu Thr(T) b4 129 97 101 113 Glu(E) Pro(P) Thr(T) Ile/Leu (I/L)

m/z

129 Glu(E)

y7

b6 115 Asp(D) 97 Pro(P)

Glicin Alanin Szerin Prolin Valin Treonin Cisztein Izoleucin Leucin Aszparagin Aszpartát Glutamin Lizin Glutamát Metionin Hisztidin Fenilalanin Arginin Tirozin Triptopfán

57.02147 71.03712 87.03203 97.05277 99.06842 101.04768 103.00919 113.08407 113.08407 114.04293 115.02695 128.05858 128.09497 129.04264 131.04049 137.05891 147.06842 156.10112 163.06333 186.07932

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálás és adatbázisok segítségével intenzitás

MS/MS spektrum

Adatbázis (pl. NCBInr, UniProt)

m/z

Keresőprogram (pl. MASCOT)

De novo szekvenálás

Peptid szekvenciák

Fehérjék

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálással - áttekintés

Fehérje

intenzitás

Tripszines emésztés

Triptikus fragmensek (peptidek) m/z

m/z

m/z

MS/MS spektrum

intenzitás

intenzitás intenzitás

m/z

intenzitás

Fehérje

Peptid szekvencia Peptid szekvencia Peptid szekvencia Peptid szekvencia

LC-MS

m/z

MS spektrum

Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Sertéshús állása során bekövetkező folyamatok nyomon követése DIGE és MS/MS fehérjeazonosítás segítségével Fehérje azonosítás

LC-MS/MS

2D-DIGE Di Luca A, Elia G, Mullen AM, Hamill RM.: Monitoring post mortem changes in porcine muscle through 2-D DIGE proteome analysis of Longissimus muscle exudate. Proteome Sci. 2013 Mar 20;11(1):9. doi: 10.1186/1477-5956-11-9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3639075/#!po=61.7647

Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis MRM – Multiple Reaction Monitoring/SRM – Selected Reaction Monitoring • Nagyon érzékeny és szelektív módszer

• Csak tripla kvadrupólokon lehet alkalmazni • A Q1 és a Q3 m/z adatok megadásával detektálni lehet meghatározott anyagokat • Kis mennyiségű ismert fehérje kimutatására alkalmas • Jól használható mennyiség meghatározására, a görbe alatti terület arányos a bejuttatott anyag mennyiségével

• Fehérjék poszt-transzlációs módosulásainak kimutatására használható (foszforiláció, ubikvitináció, metiláció stb.)

Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis MRM/SRM működési elve Specifikus fragmensek/formák célzott azonosítására alkalmas, elengedhetetlen a megfelelő Q1 és Q3 értékek (MRM átmenetek) beállítása

555

653

m/z ESI ionforrás

Q1

m/z

Ütközési cella

Q3

Detektor

Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis MRM/SRM működési elve

m/z

Komplex fehérje elegy

Ütközési cella

Q1

Meghatározott m/z-jű ionok kiválasztása és fragmentációja

Q3

min

Detektor

Meghatározott m/z-jű ionok kiválasztása és detektálása

Görbe alatti területből (AUC) koncentráció számítás

Intentzitás

ESI ionforrás

m/z

Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis Mikrocisztin kimutatása MRM módszerrel (Waters) Mikrocisztin – algák által termelt erősen toxikus (hepatotoxikus) anyag

MRM átmenet

Analit

Q1

Mw

Q3

MCYST-RR

498

135

1037,6

MCYST-LW

1025,8

891,7

1024,5

MCYST-LF

986,8

852,5

985,5

Fehérjék relatív kvantitálása Izobár kémiai jelölés A fehérjék meghatározott funkciós csoportjaihoz kémiai jelölő ágenseket kapcsolnak A jelölés során a különböző mintákból származó jelölt fehérjék tömege azonos, de az

MS/MS során olyan ionok keletkeznek, amelyek csak az illető jelölő anyagra jellemzők Izobár jelölést alkalmazó módszerek: iTRAQ – izobár jelölés abszolút és relatív kvantitáláshoz (isobaric tag for relative and absolute quantitation) TMT – tandem tömeg jelölés (tandem mass tag) Multiplex (4-6-8) mérésre alkalmasak

Fehérjék relatív kvantitálása iTRAQ – izobár jelölés abszolút és relatív kvantitáláshoz (isobaric tag for relative and absolute quantitation) Jelölő csoport (114, 115, 116, 117)

Kiegyenlítő csoport

Fehérjéhez való kötődésért felelős csoport

Izobár csoport • A fehérjék Lys oldalláncaihoz és az N-terminális amin csoporthoz kapcsolódik • Bármilyen biológiai mintát lehet jelölni Hátrány

•iTRAQ 4plex

• A kapcsolódás hatékonysága sosem 100%

•iTRAQ 8plex

• Drága

Fehérjék relatív kvantitálása iTRAQ – izobár jelölés abszolút és relatív kvantitáláshoz

(isobaric tag for relative and absolute quantitation)

Minta 1

116

Minta 2

117

Minta 3

Minták feldolgozása, összekeverése

intenzitás

115

Kontroll

MS

m/z

fragmentáció

115

Fehérje mennyiségi adat a görbe alatti területből számolva

intenzitás

114

116

114

117 m/z

Fehérjék relatív kvantitálása Jelölés TMT - tandem mass tag segítségével A TMT szerkezete: M–F–N–R Jelölő csoport

Fehérjéhez kötődő csoport

Kiegyenlítő/normalizáló csoport Linker régió

• A fehérjék Lys oldalláncaihoz és az N-terminális amin csoporthoz kapcsolódik • Bármilyen biológiai mintát lehet jelölni Hátrány

• A kapcsolódás hatékonysága sosem 100% • Drága

•TMT zéró •TMT duplex

•TMT hatplex

Fehérjék relatív kvantitálása Enzimatikus O-18 jelölés

Kontroll (H216O)

Kezelt (H218O)

Az enzimes emésztés során a beépült OH csoportok 16O ill. 18O izotópokat

tartalmaznak Tripszines emésztés

Szükséges a proteáz gyors inaktiválása Hátrány • Csak két proteóm hasonlítható össze

1:1 arányú keverés

• A kis tömegkülömbség a természetben előforduló izotópokkal interferálhat

MS/MS analízis

Fehérjék relatív kvantitálása Jelölés nélküli kvantitálás – Label-free quantitation

• Teljes mértékben tömegspektrometriás módszer • Nem alkalmaz jelölő anyagot • A vizsgálat során bekövetkező MS/MS események számát használja a kvantitáláshoz. Minél több MS/MS készül egy fehérjéről, annál nagyobb koncentrációban van jelen. • Megfelelő optimalizálással jól használható

Hátrány • Csak a nagyon érzékeny készülékek esetében alkalmazható (Orbitrap, FTICR-MS)

Fehérjék relatív kvantitálása Különböző szója variációk fehérjéinek vizsgálata iTRAQ jelölés segítségével

Hobbit szója

iTRAQ jelölés

Zao5241 szója

keresztezés

LC-MS/MS

Jidou17 szója Eltérő mennyiségben jelen levő fehérjék vizsgálata J Qin. et. al. 2013 Proteome Sci. http://www.proteomesci.com/content/11/1/12

Fehérjék relatív kvantitálása Különböző csillagfürt fajták bioaktív fehérjéinek vizsgálata jelölés nélküli kvantitálás segítségével A táplálkozás szempontjából fontos csillagfürt (Lupinus albus) fehérjék vizsgálata, a különböző fajták fehérjéinek kvantitatív analízise

Adam Arés

Jelölés nélküli kvantitálás

Lucky

HPLC-Chip - ITMS

Multitalia

A fehérjék kvantitatív analízise

fajták

Brambilla F, Resta D, Isak I, Zanotti M, Arnoldi A. A label-free internal standard method for the differential analysis of bioactive lupin proteins using nano HPLC-Chip coupled with Ion Trap mass spectrometry. Proteomics. 2009 Jan;9(2):272-86. doi: 10.1002/pmic.200800317.

Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása • Bakteriológia – kenet levétele – baktériumok tenyésztése – baktériumok azonosítása • Egy/több nap Minden baktériumnak van egy csak rá jellemző, ún. spektrum-lábnyoma BioTyper (Bruker Daltonix) – baktériumok és bizonyos gombák gyors analízise

Minta

Azonosított baktérium

Szoftver MALDI-TOF

Adatbázis – baktérium spektrumok www.bruker.com

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • Hogyan azonosíthatók a fehérjék MS/MS spektrumok segítségével? • Milyen módszereket használnak a fehérjék kvantitálására? • Mire használhatók a tömegspektrometriás elemzések az élelmiszerek vizsgálata során?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Salvatore Sechi: Quantitative Proteomics by Mass Spectometry, Humana press, 2007 • Pedro R. Cutillas, John F. Timms: LC-MS/MS in Proteomics, Humana press, 2010

Kromatográfia, immunológiai módszerek és aminosav analízis alkalmazása az élelmiszerek vizsgálata során

Az előadás vázlata • Kromatográfia

• Immunológiai módszereken alapuló technikák • Aminosav analízis

Kromatográfia • kroma – szín és grafein – írás görög szavakból származik

• Általános jellemző, hogy az oldószerben (mozgó fázis) feloldott elválasztandó anyagok áthaladnak az ún. álló fázison (papír, oszloptöltet stb.) és eközben elválnak egymástól

• Típusai:

• preparatív – vegyületek tisztítására, dúsítására • analitikai – vegyületek kimutatására

Kromatográfia • Osztályozása:

• Állófázis alapján: • Oszlopkromatográfia • Síkkromatográfia • Papírkromatográfia • Vékonyréteg kromatográfia • Mozgófázis alapján: • Gázkromatográfia • Folyadékkromatográfia

• Elválasztás alapján: • Ioncserés kromatográfia • Affinitáskromatográfia • Méretkizárásos kromatográfia

Kromatográfia HPLC – nagy teljesítményű folyadékkromatográfia – high performance liquid chromatography

Vegyületek elválasztására, azonosítására és mennyiségi meghatározására gyakran használt kromatográfiás eljárás

HPLC részei: • oszlop vagy kolonna – a kromatográfiás töltetet (állófázist) tartalmazza • pumpa és kapillárisok – a mozgó fázist, eluenst juttatja át az oszlopon • detektor – a kromatogrammot generálja – a molekulák retenciós idejét jelzi

Kromatográfia HPLC – nagy teljesítményű folyadékkromatográfia – high performance liquid chromatography

Kromatogramm

intenzitás

A retenciós idő az adott anyagnak adott körülmények között a rendszeren való áthaladásához szükséges időtartam

• az álló fázis, a vizsgált molekula és a mozgó fázis közötti kölcsönhatásoktól függ retenciós idő (min)

Kromatográfia HPLC – nagy teljesítményű folyadékkromatográfia – high performance liquid chromatography • A hatvanas években Prof. Horváth Csaba (Yale Medical School) fejlesztette ki • Molnár Imre és Wayne Melander segítségével kifejlesztették a reverz fázisú HPLC-t • Waters – 1967 – első kereskedelmi HPLC

Prof. Horváth Csaba

Molnár Imre

Kromatográfia Reverz fázisú HPLC • Az egyes komponensek a hidrofobicitásuk alapján elválaszthatók egymástól • Állófázis: C4-18 töltet, mozgófázis: víz/acetonitril vagy metanol gradiens • A hidrofób részecskék jobban kötődnek az oszlophoz és csak magasabb szerves oldószer koncentráció mellett távolíthatók el

Komplex minta

Inetnzitás

Szerves oldószer %

C18-szilika szemcse

min

Kromatográfia A bivalytej fehérje tartalmának vizsgálata reverz fázisú HPLC segítségével Az egyes kazein típusok mennyisége hogyan befolyásolja az alvadási paramétereket? • αS1-kazein • β-kazein

621 bivalytej minta

RP-HPLC

• κ-kazein mennyiségének meghatározása

Kazein tartalom függvényében változnak az alvadási paraméterek

Bonfatti et. al. (2013) Protein composition affects variation in coagulation properties of buffalo milk. J. Diary Sci. 96:4182-4190.

Kromatográfia Méretkizárásos kromatográfia • Az egyes komponensek a méretük alapján elválaszthatók egymástól • A pórusméretnél kisebb méretű részecskék a porózus anyag szemcséibe jutnak, ott vándorolnak és ezáltal hosszabb utat tesznek meg, később eluálódnak az oszlopról, míg a pórusméretnél nagyobb méretű részecskék a szemcsék között, rövidebb utat megtéve,

hamarabb hagyják el az oszlopot. Fehérje oldat

Fehérje oldat

Inetnzitás

Fehérje oldat

min

Fehérje oldat

Kromatográfia Affinitáskromatográfia • Az egyes komponensek specifikus kötődési tulajdonságaik alapján elválaszthatók egymástól

Immobilizált ligand

A megfelelő fehérje hozzákötődése az oszlopon immobilizált ligandhoz

A nem kötődött fehérjék lemosása

Inetnzitás

A specifikusan kötődött fehérjék specifikus elúciója

min

Kromatográfia Különböző, kereskedelmi forgalomban lévő lizozim preparátumok tisztaságának vizsgálata HPLC segítségével Lizozim – antibakteriális tulajdonságokkal rendelkező fehérje Felhasználás: • a tejsavas erjedés leállítása (bortermelés) • a vajsavas erjedés gátlása (sajtgyártás)

Preparátum 1. Preparátum 2. Standard

Brasca M, et.al. 2013 Molecules;18:6008-20. doi: 10.3390/molecules18056008.

Immunológiai alapfogalmak Az antitestek szerkezete • Fab régió – elsődleges szerep az antigén felismerése és megkötése • Fc régió – szerep: opszonizáció, effektor funkciók Szupervariábilis régió

Fab régió

variábilis régió • Könnyű lánc

konstans régió variábilis régió Hinge régió Fc régió

Diszulfid hidak

konstans régió

• Nehéz lánc

Immunológiai alapfogalmak Antigén – antitest kölcsönhatás • Az antitest és az antigén között specifikus kapcsolat alakul ki, az antitest felismeri és hozzákötődik az antigén megfelelő epitópjához • Epitóp – antigén determináns, az antigén egy része, amelyet az immun rendszer felismer • Antigén – olyan molekula, amely az immunválasz aktiválását eredményezi

Epitóp Antigén Antitest

Immunológiai alapfogalmak Monoklonális és poliklonális antitestek Poliklonális antitest –immunoglobulinok

Monoklonális antitest – egyetlen fajta

kombinációja („antigén koktél”), amelyek az

immunoglobulin, amely az antigén egy

antigén több epitópját ismerik fel

epitópját ismeri fel

Y Antitest

Antigén Antigén

Y

Epitóp

Epitóp

Immunológiai módszereken alapuló technikák 1. ELISA – enzyme linked immunosorbent assay • Meghatározott fehérjék/antigén kimutatására és mennyiségének meghatározására szolgál

Lépései: Abszorbancia leolvasása Kromogén szubsztrát Mosás Másodlagos antitest Mosás

Elsődleges antitest

• A reakció oldatban megy végbe • Specifikus antitestek szükségesek

Blokkolás Antigén felvitele

Mikrotiter lemez

Immunológiai módszereken alapuló technikák 1. ELISA – enzyme linked immunosorbent assay Elsődleges antitest – specifikusan felismeri és hozzákötődik az antigénhez • Lehet enzimmel vagy fluorofór csoporttal konjugált

• Lehet monoklonális vagy poliklonális Másodlagos antitest – specifikusan felismeri az elsődleges antitest Fc régióját • Általában enzimmel vagy fluorofór csoporttal konjugált • Lehet monoklonális vagy poliklonális Leggyakrabban használt enzimek • ALP – alkalikus foszfatáz • HRP - tormaperoxidáz

Immunológiai módszereken alapuló technikák 1. ELISA – enzyme linked immunosorbent assay

Direkt ELISA

Indirekt ELISA

Szendvics ELISA

YY YY Y Y YY

Immunológiai módszereken alapuló technikák GMO termékek kimutatása és kvantitálása A Bacillus thuringiensis Cry1Ab fehérje ellenes antitest és ELISA alkalmazásával kimutatható A Bt-Cry1Ab jelenléte GMO-ra utal Dupla antitest szendvics ELISA (DAS)

YY YY Y Y YY

Immunológiai módszereken alapuló technikák Allergének, mikotoxinok kimutatása és kvantitálása ELISA alapú módszerrel

http://www.neogeneurope.com/

Gyors, érzékeny módszer allergének (tojás, mogyoró, mustár, tej, gliadin stb.), mikotoxinok azonosítására és tengeri ételek hisztamin tartalmának vizsgálatára

Immunológiai módszereken alapuló technikák 2. Western blot • Meghatározott fehérjék/antigén kimutatására szolgál

Lépései: Előhívás (filmre)

• A reakció szilárd felületen

Kemilumineszcens szubsztrát

Film

(membránon) megy végbe

Mosás

• Specifikus antitestek

Másodlagos antitest

szükségesek

Mosás Elsődleges antitest Blokkolás Blottolás

Membrán (nitrocellulóz, PVDF) Gél

Immunológiai módszereken alapuló technikák 3. Immunkromatográfia • Antigén-antitest kölcsönhatás és a kromatográfia ötvözése • Egyszerű kivitelezni, laboratóriumi háttér nélkül is használható – napjainkban kiszorította a Western blot-ot

QuickStix AP Kit (Nuscana)

• GMO • Allergén tesztek www.nuscana.pl

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis • A fehérjék összetételének és biológiai értékének megállapítása céljából szükséges • Az egyes fehérjék eltérő arányban tartalmazzák az aminosavakat, az eszenciális és szemieszenciális aminosav tartalmuk nagyon változó lehet – táplálkozási szempontból nagy jelentőség Biológiai érték: BV = ( Nr / Na ) * 100 Na = a teszt alatt diétából felvett nitrogén; Nr = a teszt alatt szervezetbe beépült nitrogén Egy fehérje számunkra annál magasabb biológiai értékű, minél kevesebb kell belőle a N egyensúly fenntartásához, abban az esetben, ha csak az adott fehérjével táplálkoznánk.

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis Esszenciális aminosavak: aminosav, amit a szervezetünk nem tud szintetizálni, ezért a táplálékkal kell bevinni: fenilalanin, valin, treonin, triptofán, izoleucin, metionin, leucin és lizin Szemieszenciális aminsoavak: szintézis lehetséges, de bizonyos esetekben a táplálékból kell

pótolni Hisztidin: Biokémiai szintézise nem lehetséges, de bélbaktériumok szintetizálják számunkra. Arginin: Szintézise lehetséges, de nem elégséges fokozott fehérjebeépítéssel járó életszakaszokban.

Tirozin, cisztein: Szintetizálódnak, de szintézisük egy másik esszenciális aminosav jelenlétéhez kötött

Minél közelebb áll az adott fehérje esszenciális aminosav összetétele az emberi szükséglethez, és minél jobban emészthető, annál magasabb a biológiai értéke.

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis 1. Hidrolízis A fehérjéket aminosavakra kell bontani (gyakran savas hidrolízis)

2. Derivatizáció Az aminosavak nem detektálhatók HPLC segítségével – derivatizálni kell, megfelelő kémiai reagensekhez kell kötni a detektálás érdekében 3. HPLC elválasztás

Megfelelő oszloptöltetet alkalmazva folyadékkromatográfia segítségével az aminosavak elválasztása 4. Detektálás A derivatizáláshoz használt csoport függvényében a megfelelő hullámhosszon az

egyes aminosavak detektálása, kromatogramm felvétele 5. Koncentráció számítás Kromatogram alapján, standardok felhasználásával

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis P

Hidrolízis

Derivatizálás

P

P P

P

P

P

P

Fenil-izotiocianát (PITC) HCl D D

D D

D

Dabszil-klorid (DABS-Cl)

D

D D

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis Derivatizált aminosavak elválasztása és detektálása HPLC segítségével

www.waters.com

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis Előny: Elérhető

Viszonylag egyszerűen kivitelezhető

Fontos a megfelelő standardok használata!

Többféle módszer/szolgáltató Kvantitatív adatok Hátrány: Nem ad információt a szekvenciáról, korlátozottan használható fehérje azonosításra

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Különböző takarmányok aminosav összetételének meghatározása ACQUITY UPLC és AccQ Tag Ultra reagens segítségével (Waters)

Csirke takarmány Sertés takarmány

Szójabab (teljes)

Szója takarmány

www.waters.com

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosavak mennyiségének változása a sörkészítés során

A kiindulási alapanyagként használt különböző maláták aminosav összetétele

www.waters.com

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosavak mennyiségének változása a sörkészítés során

Az aminosav összetétel változása a fermentáció hatására

www.waters.com

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis ún. intelligens reagensek segítségével Jelölő csoport 121

Kiegyenlítő csoport

Reaktív csoport

+ Biológiai minta (fehérje hidrolizátum) Jelölés (aTRAQ reagens)

Jelölő csoport 121

Kiegyenlítő csoport

Reaktív csoport

Aminosavak a biológiai mintából

Keverék LC/MS/MS (MRM analízise)

+ Jelölő csoport 113

Kiegyenlítő csoport

Reaktív csoport

Aminosav standardok

aTRAQTM (ABSciex) www.absciex.com

A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis ún. intelligens reagensek segítségével

Koncentráció számítás

intenzitás

Keverék MRM analízise

AUC121 AUC113

idő (min)

Előny: Gyors, a mérés kevesebb mint egy óra alatt kivitelezhető Pontos kvantitatív adatok Hátrány: Drága

aTRAQTM (ABSciex) www.absciex.com

x koncentráció113

Témakörhöz kapcsolódó kérdések • A kromatográfia általános jellemzői, típusai, osztályozása és a reverz fázisú HPLC működési elve. • Hogyan történik az analitok vizsgálata ELISA technika segítségével? • Melyek az aminosav analízis lépései?

Felhasznált és ajánlott irodalom • Leo M.L. Nollet, Fidel Toldra: Food Analysis by HPLC, CRC Press, 2012 • S. Suzanne Nielsen: Food Analysis, Fourth Edition, Springer, 2010 • Navam S. Hettiarachchy, Kenji Sato, Maurice R. Marshall, Arvind Kannan: Food Proteins and Peptides: Chemistry, Functionality, Interactions, and Commercialization, CRC Press, 2012