PROPOSAL METODOLOGI PENELITIAN (BM-3001) PENGARUH PERBEDAAN PANJANG GELOMBANG DAN INTENSITAS CAHAYA PADA PRODUKSI PIGMEN C-PHYCOCYANIN DARI Spirulina platensis
Penyusun: Aldina S. Suwanto
10407023
PROGRAM STUDI SARJANA MIKROBIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG BANDUNG 2009
DAFTAR ISI
Daftar Isi
1
BAB I Ringkasan Proposal
2
BAB II Pendahuluan
3
2.1 Latar Belakang
3
2.2 Tujuan Penelitian
4
BAB III Tinjauan Pustaka
5
3.1 Spirulina platensis
5
3.2 Kultur Spirulina platensis
6
3.3 Pigmen C-Phycocyanin
8
3.4 Manfaat Pigmen C-Phycocyanin
9
BAB IV Metodologi Penelitian
10
4.1 Metode Kerja
10
4.2 Jadwal Kerja
12
BAB V Daftar Pustaka
13
BAB VI Usulan Biaya Riset
15
1
BAB I RINGKASAN PROPOSAL
Pigmen c-phycocyanin merupakan pigmen berwarna biru yang dihasilkan oleh alga golongan Cyanobacteria dan kini digunakan secara luas dalam bidang diagnostik, bidang therapeutic, penelitian biomedis, sebagai pewarna alami dalam makanan serta pewarna kosmetik. Potensi pemanfaatan, nilai ekonomis serta kebutuhan akan pigmen ini sangat tinggi dan riset biomedis yang menggunakan pigmen ini sebagai marker fluorescence semakin banyak dilakukan. Sayangnya produksi pigmen c-phycocyanin masih terbatas dan penelitian tentang pigmen serta faktor-faktor yang mempengaruhi produksi pigmen ini belum banyak dilakukan. Pada penelitian kali ini akan dilakukan penelitian mengenai pengaruh perbedaan panjang gelombang dan intensitas cahaya terhadap produksi pigmen c-phycocyanin dari Spirulina platensis. Alga ini dipilih karena berdasarkan penelitian, Spirulina platensis memiliki kandungan c-phycocyanin yang paling tinggi dibandingkan alga-alga golongan Cyanobacteria lainnya.
Dengan penelitian ini
diharapkan produksi pigmen c-phycocyanin dari Spirulina platensis akan semakin terkontrol dan optimal sehingga pada akhirnya dapat memberikan manfaat ekonomi bagi bangsa Indonesia.
2
BAB II PENDAHULUAN
2.1
Latar Belakang
Spirulina platensis merupakan alga hijau biru (Cyanobacteria) yang memiliki kandungan protein, vitamin, nutrisi dan mineral yang sangat tinggi sehingga populer dimanfaatkan sebagai makanan suplemen. Disamping pemanfaatannya sebagai makanan suplemen sebenarnya Spirulina platensis masih memiliki berbagai manfaat lain misalnya sebagai pakan alami dalam akuakultur, sebagai obat, sebagai bahan baku kosmetik atau sebagai penghasil pigmen c-phycocyanin (Rahayu, 2007). Pemanfaatan Spirulina platensis sebagai penghasil pigmen c-phycocyanin ini merupakan pemanfaatan yang paling baru dan cukup menjanjikan karena Spirulina platensis telah terbukti memiliki kandungan cphycocyanin yang paling tinggi dibandingkan alga golongan Cyanobacteria lainnya. Pigmen c-phycocyanin sendiri merupakan pigmen dari cyanobacteria yang berperan menangkap cahaya dan meneruskannya ke klorofil a pada proses fotosintesis. Karena karakteristik pigmen c-phycocyanin yang unik, kemampuan berpendar (fluorescence) serta sifat antioksidannya, pigmen ini kini digunakan secara luas dalam bidang diagnostik, penelitian biomedis dan dalam bidang therapeutic (Roman et.al., 2002 ; Zhao et.al., 1995 ; Rassano et.al., 2003). Penggunaan yang utama adalah sebagai marker fluorescence untuk sel atau molekul dalam penelitian biomedis (Bermijo et.al., 2003). Penelitian terbaru juga menunjukkan bahwa c-phycocyanin dapat dimanfaatkan sebagai pewarna alami dalam makanan dan kosmetik untuk menggantikan pewarna sintetik yang memiliki aktivitas karsinogenik (Roman et.al., 2002). Saat ini, produksi pigmen c-phycocyanin masih terbatas dan penelitian tentang pigmen serta faktor-faktor yang mempengaruhi produksi pigmen ini belum banyak dilakukan padahal potensi pemanfaatan, nilai ekonomis serta kebutuhan akan pigmen ini sangat tinggi. Pada penelitian kali ini akan dilakukan penelitian mengenai pengaruh panjang gelombang dan intensitas cahaya terhadap produksi pigmen c-phycocyanin dari Spirulina
3
platensis. Penelitian-penelitian mengenai pengaruh perbedaan panjang gelombang dan intensitas cahaya terhadap produksi beberapa pigmen fotosintetik dari alga memang telah dilakukan sebelumnya tetapi belum ada penelitian spesifik untuk pigmen cphycocyanin dari Spirulina platensis. Dengan penelitian ini diharapkan produksi pigmen c-phycocyanin dari Spirulina platensis akan semakin terkontrol dan optimal sehingga pada akhirnya dapat memberikan manfaat ekonomi bagi bangsa Indonesia. 2.2
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui pengaruh perbedaan panjang gelombang dan intensitas cahaya terhadap produksi pigmen c-phycocyanin dari Spirulina platensis.
4
BAB III TINJAUAN PUSTAKA
3.1 Spirulina platensis Spirulina platensis merupakan anggota ordo Oscilliatoriales yang merupakan salah satu ordo dalam divisi Cyanophyta dengan karakteristik trikom uniseluler dan berbentuk filamen. Ciri khas dari divisi Cyanophyta sendiri adalah mengandung pigmen biru atau cphycocyanin, glikogen cadangan dan memberi hasil negatif untuk tes iodium (Presscot, 1964).
Gambar 3.1 Spirulina platensis (Vonshak, 1997) Sel-sel Spirulina platensis merupakan sel silinder dengan diameter berukuran antara 1 hingga 12 μm. Bentuk trikom berupa heliks dan panjang serta dimensi heliks ini sangat bervariasi. Spirulina berbentuk spiral dengan lilitan teratur 3-8 lilitan, tidak bercabang serta tidak memiliki septa dan tidak mengandung kloroplas (Smith, 1950). Spirulina platensis tidak memiliki alat reproduksi seksual sehingga berkembang biak secara aseksual saja melalui pembelahan sel. Pembelahan sel dimulai dengan pembentukan membran transversal di dalam sel kemudian putus dan menghasilkan filamen yang memanjang sampai tahap dewasa (Rahayu, 2007). Spirulina platensis merupakan organisme yang ubiquitous dan dapat ditemui di berbagai lingkungan yang berbeda seperti tanah, rawa, perairan tawar, payau, laut serta sumber
5
air panas. Spirulina platensis juga dapat mendiami daerah dengan lingkungan yang ekstrim yang tidak cocok bagi kebanyakan organisme lain misalnya perairan yang mengandung kapur, belerang, sulfit dan perairan dengan konsentrasi garam yang terlalu tinggi (Borowitzka, 1988). Tingkatan taksonomi dari Spirulina platensis menurut Smith (1950) adalah sebagai berikut : Divisi
: Cyanophyta
Kelas
: Cyanopheceae
Famili : Oscilliatoriales Ordo
: Oscilliatoriaceae
Genus : Spirulina Spesies : Spirulina platensis 3.2 Kultur Spirulina platensis Spirulina platensis tumbuh pada permukaan air kolam yang memiliki pH tinggi dan salinitas tinggi (Carvajal et.al., 1982). Spesies ini juga tumbuh pada konsentrasi karbonat dan bikarbonat yang tinggi dan kondisi penyinaran yang cukup tinggi (Eyekelenburg, 1980). Faktor utama pada medium yang mempengaruhi pertumbuhan mikroalga adalah keberadaan makro dan mikronutrien, intensitas cahaya, pH, laju aerasi, jumlah padatan terlarut, jumlah inokulum, salinitas serta suhu. Parameter lingkungan yang paling optimum serta kisaran toleransinya spesifik bagi setiap spesies mikroalga. Tabel 3.1 menunjukkan parameter-parameter yang penting untuk kultur mikroalga secara umum (Lavens dan Sorgeloos, 1996). Konsentrasi sel mikroalga dalam kultur lebih tinggi daripada konsentrasi yang ditemukan di alam oleh karena itu diperlukan pengayaan nutrisi untuk mencegah adanya defisiensi (Lavens dan Sorgeloos, 1996). Nutrisi terpenting bagi pertumbuhan mikroalga adalah makronutrient nitrogen, fosfat dan silikat. Bagi Spirulina, nitrat merupakan sumber nitrogen utama yang diasimilasi namun penggunaan garam amonium juga dapat
6
digunakan. Medium pertumbuhan yang baik untuk kultivasi Spirulina adalah medium BG 11 (Waterbury dan Stanier, 1981). Komposisi medium BG 11 dapat dilihat pada tabel 3.2. Tabel 3.1 Kondisi Umum Parameter Lingkungan pada Kultur Mikroalga Parameter
Kisaran
Optimum
Suhu (˚C)
16-27
18-24
Salinitas (g/L)
12-40
20-24
Intensitas cahaya (lux)
1000-10 000
2500-5000
Fotoperiodisme
N/A
16:8 (minimum) 24:0 (maksimum)
pH
7-9
8,2-8,7 (Lavens dan Sorgeloos, 1996)
Mikroalga melakukan fotosintesis seperti halnya tanaman. Intensitas cahaya memiliki peran yang penting dan tergantung pada kepadatan kultur. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, intensitas cahaya yang optimal bagi pertumbuhan kultur Spirulina berkisar antara 2500-4500 lux (Doke, 2005) namun pertumbuhan kultur yang optimum belum tentu menghasilkan jumlah pigmen per sel yang optimum juga. pH merupakan faktor yang penting bagi pertumbuhan mikroalga. Berbagai proses selular dapat terjadi sebagai akibat dari kegagalan mengatur pH yang sesuai karena pH secara tidak langsung menunjukkan kadar karbondioksida dan mineral terlarut yang dapat mempengaruhi metabolisme mikroalga. Spirulina platensis sendiri tumbuh baik dalam medium kultur yang memiliki pH dan alkalinitas yang tinggi. Pengadukan atau aerasi diperlukan untuk mencegah adanya sedimentasi mikroalga, memastikan semua sel terdedah pada nutrisi dan cahaya, serta menghindari stratifikasi suhu. Suhu air juga penting bagi pertumbuhan mikroalga karena mempengaruhi laju fotosintesis. Spirulina sendiri merupakan mikroalga mesofilik dan suhu optimum untuk pertumbuhan Spirulina berdasarkan percobaan adalah 28-33 ˚C (Rahayu, 2007).
7
Tabel 3.2 Komposisi Medium BG 11
(Waterbury dan Stanier, 1981) 3.3 Pigmen C-Phycocyanin C-Phycocyanin merupakan phycobilliprotein yang utama pada alga golongan Cyanobacteria. Phycobilliprotein sendiri merupakan pigmen fotosintetik yang terdapat pada Cyanobacteria, alga merah maupun Cryptomonads. Terdapat phycobilliprotein yakni phycoerythrin, phycocyanin dan allophycocyanin.
Gambar 3.2 Struktur Tiga Dimensi C-Phycocyanin (Adir, 2003)
8
3 jenis
Pigmen c-phycocyanin ini memiliki puncak absorbsi pada interval panjang gelombang 615-620 nm dan memiliki emisi fluorescence maksimum sekitar 650 nm. Pigmen ini sendiri terdiri dari protein dan kromofor dan berat molekulnya adalah 232 kilo dalton (Minkova et.al., 2003). Spektrum absorbsi c-phycocyanin dapat dilihat pada gambar 3.3. Pigmen ini sendiri bersifat hidrofilik dan beragregasi membentuk cluster-cluster yang menempel pada membran sel Cyanobacteria.
Gambar 3.3 Spektrum absorbsi sinar tampak dan fluorescence oleh c-phycocyanin (Minkova et.al., 2003) 3.4 Manfaat Pigmen C-Phycocyanin Pigmen c-phycocyanin memiliki karakteristik yang unik, fluorescence serta sifat antioksidannya sehingga dimanfaatkan secara luas dalam bidang diagnostik, penelitian biomedis dan dalam bidang therapeutic (Roman et.al., 2002 ; Zhao et.al., 1995 ; Rassano et.al., 2003). Pigmen ini mampu menghambat pertumbuhan sel carcinoma, mampu memberi efek anti-inflamatory sehingga meningkatkan sistem imun tubuh dan mencegah tumor (Rahayu, 2007) Penggunaan yang utama dari pigmen ini adalah sebagai marker fluorescence untuk sel atau molekul dalam penelitian biomedis (Bermijo et.al., 2003). Penelitian terbaru juga menunjukkan bahwa c-phycocyanin dapat dimanfaatkan sebagai pewarna alami dalam makanan dan kosmetik untuk menggantikan pewarna sintetik yang memiliki aktivitas karsinogenik (Roman et.al., 2002). Contoh aplikasi pigmen c-phycocyanin ini misalnya dalam fluorescence microscopy, fluorescence in situ hybridization (FISH), protein labelling, antibody labelling, isoelectric focusing atau gel exclusive chromatography.
9
BAB IV METODOLOGI PENELITIAN
4.1
Metode Kerja
Metode kerja dalam penelitian ini dijelaskan secara sistematis dalam gambar 4.1.
Gambar 4.1 Metode Kerja 4.1.1 Pembuatan Medium untuk Pertumbuhan Spirulina platensis Medium yang digunakan dalam penelitian ini merupakan medium BG 11 (Waterbury dan Stanier, 1981). Dalam pembuatan medium ini, ada tiga tahap yang harus dilakukan yakni persiapan peralatan, pencampuran bahan-bahan dan sterilisasi medium.
10
4.1.2 Kultur Spirulina platensis dengan perlakuan perbedaan panjang gelombang dan intensitas cahaya Kultur awal Spirulina platensis didapat dari Laboratorium Analisis Ekosistem Akuatik, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung. Spirulina platensis kemudian dikultur secara batch selama 5 hari. Sebanyak 70 mL (10% (v/v)) inokulum Spirulina platensis dengan kepadatan sel 106 ditambahkan secara aseptik ke dalam 630 mL air tawar steril 28 ppt dalam botol 1 L. Selanjutnya ditambahkan 0,7 mL medium BG 11 kemudian botol disegel menggunakan tutup berupa karet yang dilengkapi saluran aerasi. Laju aerasi yang digunakan adalah 80 L/jam. Kultur Spirulina platensis ditumbuhkan pada kondisi pH 9, suhu 30 ˚C dan fotoperiodisme 24:0 sesuai dengan kondisi yang optimum bagi Spirulina platensis menurut Raoof et. al. (2007). Perlakuan yang diberikan adalah variasi panjang gelombang dan intensitas cahaya. Variasi panjang gelombang yang digunakan pada penelitian ini adalah 450 nm (biru), 500 nm (hijau), 580 nm (kuning), dan 700 nm (merah). Variasi panjang gelombang ini didapatkan dari lampu khusus yang panjang gelombangnya dapat diatur. Sementara itu, variasi intensitas cahaya yang digunakan adalah 1500, 2500, 3500 serta 4500 lux. Intensitas cahaya diatur melalui pengaturan jarak dan diukur menggunakan lux meter EXTECH Heavy Light Duty Meter. Pengukuran intensitas cahaya dilakukan pada permukaan kultur. 4.1.3 Ekstraksi Sel Spirulina platensis Ekstraksi sel Spirulina platensis dilakukan dengan cara filtrasi kemudian dikeringkan. Filtrasi dilakukan menggunakan kertas saring Whatman. Sel Spirulina platensis akan tertahan pada permukaan kertas saring dan selanjutnya dijemur sampai kering sehingga didapatkan crude cell extract Spirulina platensis. 4.1.4 Ekstraksi dan Purifikasi C-Phycocyanin dari crude cell extract Spirulina platensis Ekstraksi dan purifikasi c-phycocyanin dari crude cell extract Spirulina platensis dilakukan dengan metode Minkova et.al. (2006). Ekstraksi dilakukan dengan buffer ekstraksi KH2PO4/K2HPO4
pH 6.7 dan rivanol (6,9-diamino-2-ethoxyacridine lactate). Purifikasi
dilakukan dengan gel filtration menggunakan kolom Sephadex G-25. Eluat biru yang
11
dihasilkan dijenuhkan dengan 70% (v/v) amonium sulfat dan disentrifugasi. Supernatan yang dihasilkan merupakan larutan yang kaya pigmen c-phycocyanin. 4.1.5 Penentuan Konsentrasi C-Phycocyanin Konsentrasi c-phycocyanin ditentukan dengan metode Moraes dan Kalil (2009). Absorbansi dari larutan hasil ekstraksi dan purifikasi c-phycocyanin diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm dan 652 nm. Konsentrasi cphycocyanin (mg/mL larutan) kemudian dihitung dengan persamaan Moraes dan Kalil (2009) menggunakan data A620 dan A652. 4.1.6 Analisis Data Data konsentrasi c-phycocyanin yang didapat pada masing-masing kombinasi variasi panjang gelombang dan intensitas cahaya dianalisis secara statistik menggunakan analisis variansi satu arah (one-way ANOVA) (P < 0,05) dengan perangkat lunak SPSS 16.0 untuk membandingkan ada atau tidaknya perbedaan yang signifikan antara datadata tersebut.
4.2 Jadwal Kerja Bulan ke-
No
Perihal
1 2 3 4 5 6 7 8
Studi Literatur Pembuatan Medium Pertumbuhan Kultur Spirulina platensis Ekstraksi Sel Spirulina platensis Ekstraksi dan Purifikasi C-phycocyanin Penentuan Konsentrasi C-Phycocyanin Analisis Data Pembuatan Laporan
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
12
BAB V DAFTAR PUSTAKA
Adir N, Lerner N. 2003. The crystal structure of a novel unmethylated form of cphycocyanin, a possible connector between cores and rods in phycobilisomes. J Biol Chem 278 : 25926 – 25932. Bermijo R, Allen FG, Ibanez MI, Fernandez JM, Molina E, Alvarezpez JM. 2003. Preparative purification of B-PE from the microalgae Phormidiumcruentum by expended bed adsorption chromatography. J Chromatogr 790 : 317–325. Borowitzka M, Borowitzka L. 1988. Micro-algal : Biotechnology. New York : Cambridge Universit y Press. Carjaval NM, Fernandez PB, Rodriguez, Donzo M. 1982. Urease of Spirulina maxima. Phytochem 21 (12) : 2821-2823. Eyekelenburg CV. 1980. Spirulina platensis : Morphology and Ultrastructure. Rotterdam : Delftse Universitaire Pers. Lavens P, Sorgeloos P. 1996. Manual on the Production and Use of Live Food for Aquaculture. Roma : FAO Fisheries Technical. Minkova K, Tchorbadjieva M, Tchernov A, Stojanova M, Gigova L, Busheva M. 2007. Improved procedure for separation and purification of Arthronema africanum phycobilliprotein. Biotechnol Lett 29 : 647-651. Moraes CC, Kalil SJ. 2009. Strategy for a protein purification design using C-phycocyanin extract. Biores Technol 100 : 5312-5317. Presscott GW. 1964. How to Know the Fresh Water Algae. Iowa : WMC Brown Company Publisher. Rahayu W. 2007. Isolasi dan optimasi parameter lingkungan kultur Spirulina sp. dalam kondisi laboratorium. [Thesis]. Bandung : Institut Teknologi Bandung. Raoof B, Kaushik BD, Prasanna R. 2007. Formulation of a low cost medium for mass production of Spirulina. Biomass Biotech 30 (6) : 537-542.
13
Rassano R, Ungaro N, Ambariso AD, Liuzzi GM, Riccio P. 2003. Extracting and purifying RPE from Mediterranean red algae Corallina elongata Ellis and Solander. J Biotechnol 101 : 289–293. Roman RB, Alvarezpez JM, Fernandez FGA, Grima EM. 2002. Recovery of pure B-PE from the microalgae Porphyrium cruenlum. J Biotechnol 93 : 73–85. Smith GM. 1950. The Freshwater Algae of United States. London : Mc Graw Hill. Vonshak
A.
1997.
Spirulina
platensis:
Physiology,
Cell-biology
and
Biotechnology. London: Taylor and Francis. Waterbury JB, Stanier RY. 1981. Isolation and growth of cyanobacteria from marine and hypersaline environments. In: Starr MP, Stolp H, Trüper HG, Balows A, Schlegel HG (ed), The Prokaryotes. Berlin : Springer-Verlag. p 221–223. Zhao J, Zhu J, Jiang L. 1995. Study on the energy transfer process in phycobilisome from blue-green algae by the use of stochastic simulation approach. Biochem Biophys Acta 1229 : 39–48.
14
BAB VI USULAN BIAYA RISET
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Bahan Medium BG 11 Botol 1 L Karet dengan saluran aerasi Kertas saring Whatman Buffer fosfat Rivanol Kolom Sephadex G-25 Amonium sulfat Standar BSA Natrium bikarbonat NaOH Natrium kalium tartarat CuSO4 Reagen Folin-Ciocalteu Gelas ukur 10mL Tabung reaksi Rak Tabung reaksi Alumunium foil Bunsen Tips Baki plastik Spatula
Jumlah 100 mL 50 buah 50 buah 1 lusin 2L 1L 50 buah 1L 1L 1L 1L 1L 1L 1L 3 buah 50 buah 1 buah 1 gulung 1 buah 3 lusin 1 buah 1 buah TOTAL
15
Harga (Rp) 200.000 250.000 100.000 150.000 70.000 100.000 500.000 50.000 100.000 30.000 30.000 30.000 30.000 100.000 60.000 250.000 8.000 20.000 15.000 100.000 12.000 5.000 2.210.000
