PRODUKSI, KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN XILANASE DARI Staphylococcus aureus MBXi-K4
INDAH WIJAYANTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul produksi, karakterisasi dan pemurnian xilanase dari Staphylococcus aureus MBXi-K4 adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Indah Wijayanti P055050021
ABSTRACT
INDAH WIJAYANTI. P055050021. Production, Characterization and Purification of Xylanase from Staphylococcus aureus MBXi-K4. Under the direction of MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO, KHASWAR SYAMSU and YULIN LESTARI. Wheat by-products are feedstuffs that vary in nutritional value, partly because of arabinoxylans that limit nutrient digestibility. Pollard is a by-product from dry milling wheat into flour and contains 16,49% of crude fiber. In order to increase nutritional value of pollard a xylanolitic enzyme is added to catalyze hydrolysis of xylan components into small oligomers and xylose residues. The addition of xylanase in wheat-pollard diet is necessary to reduce viscosity of digesta by hydrolysis arabinoxylan into arabinose and xylose. Thus could be easily absorbed in intestinal gut. Because traditional enzyme cannot survive feedpelleting temperatures, xylanase use incurs an additional expense due to the need to apply it in liquid form after pelleting. The more economical approach would be the addition of a thermally stable xylanase to feed mixtures followed by a simultaneous pelleting of enzyme and feed. The objectives of this research are to produce xylanase in batch system bioreactor, to characterize and purify xylanase from Staphylococcus aureus MBXi-K4, and to explore its possibility as feed additive in pelleting poultry feed. Production of xylanase used 0,7% xylan-pollard substrate in a 2L batch bioreactor with aeration rate of 1 vvm, agitation speed of 160 rpm, growth temperature 37oC and pH 7 for 96 hours. Maximum enzyme production was reached after 72 hours of cultivation with specific enzyme activity of 10,5 U/mg protein. One unit of xylanase activity (U) is the amount of enzyme which liberates 1 µmol of reducing sugars (as xylose equivalents) per min in certain condition. Biomass specific growth rate (µ) was 0,107 per hour, yield of product of 2,255 (g product/g substrate) and yield of biomass of 0,004 (g biomass/g substrate). The optimum temperature and pH of crude extract xylanase activity was o 70 C and 6 respectively. The xylanase maintained its stability for 30 minutes at 70oC and over pH range 4 – 8. The Km and Vmax value at 70oC on oatspelt xylan was 1,086 (mg/ml) and 3,195 (µmol xilose/min.ml) respectively. Xylanase was purified from the culture supernatant of S.aureus MBXi-K4 by ammonium sulphate precipitation, dialysis using a 12kDa molecular weight cut-off cellophane membrane and gel filtration Sephadex G-100 column chromatography. The purity of xylanase increased 11,69 fold than those of the crude enzyme. The specific activity after purification was 383,9 U/mg. Three kinds of xylanase activities was visualized by zymogram (activity stain) technique in nondenaturing protein gels with estimated molecular weights of 45,6 kDa, 28,1 kDa and 21,6 kDa. The purified xylanase had one band protein with molecular weight of 47,9 kDa as shown on SDS-PAGE stained with silver nitrate. Keywords : xylanase, S.aureus, production, characterization, purification
RINGKASAN INDAH WIJAYANTI. P055050021. Produksi, Karakterisasi dan Pemurnian Xilanase dari Staphylococcus aureus MBXi-K4. Dibimbing oleh MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO, KHASWAR SYAMSU dan YULIN LESTARI. Penggunaan dedak gandum (pollard) sebagai salah satu bahan baku pakan terutama ternak monogastrik terkendala oleh kandungan serat kasarnya yang tinggi. Untuk meningkatkan nilai nutrisi bahan pakan berkadar serat tinggi, salah satu upayanya adalah dengan memanfaatkan enzim sebagai imbuhan pakan (feed additive) yang berfungsi untuk memecah komponen serat kasar menjadi produk yang lebih sederhana, yang dapat diserap langsung oleh ternak. Penambahan enzim xilanase pada pakan berbasis dedak gandum (pollard) dapat menurunkan viskositas digesta pada unggas. Xilanase dapat menurunkan viskositas digesta dengan cara menghidrolisis arabinoxilan menjadi arabinosa dan xilosa, sehingga dapat dengan mudah dimanfaatkan oleh unggas. Studi mengenai karakter xilanase diperlukan untuk mengetahui aplikasinya pada industri yang tepat. Sebagai contoh, tuntutan utama pada industri pakan yang memanfaatkan enzim adalah kestabilan enzim terhadap perlakuan panas pada proses pelleting dan kisaran pH asam sampai netral. Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian terdahulu oleh Setyawati (2006), yang melakukan produksi dan karakterisasi xilanase mikroba yang diisolasi dari tongkol jagung. Staphylococcus aureus MBXi-K4 tumbuh optimum pada suhu 37oC dan pH 7 (bakteri mesophilik). Xilanase yang dihasilkan memiliki suhu optimum 70oC dan cukup stabil pada rentang pH yang luas (4 – 10) dengan pH optimum 6. Berdasarkan data tersebut dirasa perlu untuk melakukan kajian awal produksi pada bioreaktor volume 2 liter dengan sistem curah (batch),karakterisasi dan pemurnian enzim xilanase tersebut. Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan kajian awal terhadap produksi xilanase dari isolat MBXi-K4 (S.aureus) pada sistem curah (batch) menggunakan bioreaktor volume 2 liter, mendapatkan data mengenai karakternya serta memurnikan enzim xilanase dari S.aureus. Produksi enzim xilanase dari S.aureus dilakukan pada bioreaktor volume 2 liter. Substrat yang digunakan adalah xilan dedak gandum dengan konsentrasi 0,7% dengan komposisi media: ekstrak khamir 0.2%, K2HPO4 1.5%, Mg.SO4.7H 2O 0.025%, NaCl 0.25%, NH4Cl 0.5% Na2HPO4 0.5%. Kultivasi dilakukan selama 96 jam pada suhu 37oC, laju aerasi 1 vvm dan laju agitasi 160 rpm dan pH awal 7. Kultur hasil kultivasi disentrifugasi pada 4550 x g selama 10 menit pada suhu 4oC untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim. Larutan ekstrak kasar enzim memiliki aktifitas paling tinggi pada jam ke 72 sebesar 2,26 U/ml dan aktifitas spesifiknya sebesar 10,5 U/mg. Satu unit aktifitas enzim (U) adalah banyaknya enzim yang dapat memproduksi 1 μmol xilosa /menit/ml pada kondisi tertentu. Laju pertumbuhan spesifik (µ) sebesar 0,107/jam, rendemen biomassa (Yx/s) = 0,004 (g biomassa/g substrat) dan rendemen produk (Yp/s) = 2,255 (g produk/g substrat).
Karakteristik xilanase yang diamati adalah ketahanan enzim terhadap suhu dan pH. Xilanase dari S.aureus ini tergolong moderat termostabil karena aktifitasnya pada suhu 70oC masih dapat dipertahankan lebih dari 70% sampai menit ke 30. Enzim tersebut dapat bekerja pada kisaran pH 4 – 8 dengan nilai pH optimum 6. Pengamatan kinetika enzimatis dilakukan melalui pengukuran nilai Km dan Vmaks. Perhitungan kinetika reaksi enzimatis dilakukan dengan mengukur konsentrasi xilosa sebagai hasil hidrolisis substrat oatspelt xilan pada berbagai konsentrasi. Nilai Vmaks dari reaksi enzimatis xilanase sebesar 3,195 (µmol xilosa/menit.ml) dan nilai Km = 1,086 (mg/ml). Teknik pemurnian enzim yang dilakukan dalam penelitian ini adalah melalui pengendapan menggunakan amonium sulfat, dialisis untuk menghilangkan garam amonium dan teknik kromatografi filtrasi gel. Pengendapan enzim xilanase dengan menggunakan amonium sulfat dalam penelitian ini, dilakukan pada konsentrasi 40% dan diperoleh nilai aktifitas enzim sebesar 1,8 U/ml dan aktifitas spesifik sebesar 37,4 U/mg. Larutan protein setelah melalui proses pengendapan menggunakan amonium sulfat kemudian disentrifugasi pada putaran 4550 x g selama 15 menit, endapan yang diperoleh didialisis selama semalam (over night) menggunakan membran dialisis dengan ukuran Molecular Weight Cut-Off sebesar 12kDa dalam 0,05 M buffer Tris-HCl pH 7,5 dengan volume 100 kali volume enzim yang dipekatkan. Aktifitas enzim xilanase hasil dialisis sebesar 1,76 U/ml. Profil elusi filtrasi gel menggunakan matrik Sephadex G-100 memperlihatkan adanya beberapa puncak protein, dimana puncak utama adalah yang terelusi pada fraksi 4 – 6. Puncak lain yang lebih kecil terelusi pada fraksi 54-55, dan fraksi 68-69. Aktifitas xilanase tertinggi diperoleh dari fraksi 6 sebesar 1,56 U/ml dengan aktifitas spesifik sebesar 383,9 U/mg. Teknik kromatografi filtrasi gel telah meningkatkan kemurnian xilanase sebesar 11,69 kali dibandingkan dengan enzim ekstrak kasarnya. Hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya pita tunggal pada tahap pemurnian dengan teknik kromatografi filtrasi gel, yaitu fraksi 4 – 6, dengan perkiran bobot molekul 47,9 kDa. Profil zimogram memperlihatkan pada ekstrak kasar xilanase, pengendapan dengan amonium sulfat dan hasil dialisis, masing – masing menunjukkan tiga zona bening, dengan perkiraan bobot molekul 45,6 kDa, 28,1 kDa dan 21,6 kDa. Hasil pemurnian dengan kromatografi gel filtrasi diperoleh satu zona bening dengan bobot molekul sebesar 21,6 kDa. Kata kunci : xilanase, S.aureus, produksi, karakterisasi, pemurnian.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2009 Hak cipta dilindungi UU 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
PRODUKSI, KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN XILANASE DARI Staphylococcus aureus MBXi-K4
INDAH WIJAYANTI
Tesis Sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Anja Meryandini MS
HALAMAN PENGESAHAN Judul Nama Mahasiswa
: Produksi, Karakterisasi dan Pemurnian Xilanase dari Staphylococcus aureus MBXi-K4 : Indah Wijayanti
NIM
: P055050021
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono Ketua
Dr. Ir. Khaswar Syamsu, MSc Anggota
Dr. Ir. Yulin Lestari Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Bioteknologi
Dekan Sekolah Pasca Sarjana
Dr. Ir. Muhamad Jusuf, DEA
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodipuro, MS
Tanggal Ujian : 24 Juni 2009
Tanggal Lulus :
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pemalang, Jawa Tengah pada hari Senin tanggal 7 September 1970. Penulis merupakan anak kedua dari delapan bersaudara dari ayah Sugito, BA dan ibu Sri Maryati. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar dan menengah di kota kelahiran. Pada tahun 1988 penulis melanjutkan studi Strata 1 (Sarjana) dan diterima melalui program Penelusuran Minat dan Kemampuan (PMDK) pada jurusan Matematika Universitas Negeri Sebelas Maret Surakarta.
Penulis kemudian pindah ke
program Diploma 2 Institut Pertanian Bogor pada jurusan Informatika Pertanian pada tahun 1989.
Pada tahun 1990 penulis diterima melalui Ujian Masuk
Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) pada jurusan Teknologi Industri Pertanian (TIN), Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan menyelesaikan studi Strata 1 (Sarjana) pada bulan Januari 1995. Sejak tahun 2005 penulis bekerja sebagai staf pengajar pada departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan (INTP), Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penulis ditempatkan di laboratorium Industri dan Manajemen Pakan, bidang Ilmu dan Teknologi Pengolahan Pakan. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi Strata 2 (Magister) pada Program Studi Bioteknologi, IPB. Pada bulan Mei 2007 – Juni 2008 penulis mengikuti
“Training on Modern
Industrial Biotechnology“ di lembaga Helmholtz Infection Research Center (HZI), Braunschweigh, Jerman.
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat, karunia dan kekuatan pada penulis sehingga penelitian dan penulisan tesis ini dapat diselesaikan. Tesis dengan judul Produksi, Karakterisasi dan Pemurnian Xilanase dari Staphylococcus aureus MBXi-K4 ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Penulis mengucapkan terimakasih yang setulusnya kepada berbagai pihak yang telah membantu penulis baik selama penelitian maupun penulisan tesis ini kepada: 1. Prof Dr.Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono, selaku ketua komisi pembimbing yang telah berkenan memberikan bimbingan, pengarahan selama penelitian dan penulisan tesis serta memberikan ijin menggunakan seluruh fasilitas dan bahan kimia di Laboratorium Biokimia dan Mikrobiologi Pangan, PPSHB, IPB. 2. Dr.Ir. Khaswar Syamsu, MSc, selaku anggota komisi pembimbing yang banyak memberi masukan terutama dalam hal proses produksi enzim. 3. Dr.Ir. Yulin Lestari, selaku anggota komisi pembimbing yang telah meminjamkan beberapa koleksi isolat untuk kepentingan penelitian penulis. 4. Dr.Ir.Anja Meryandini MS, selaku dosen penguji luar komisi yang telah memberikan koreksi dan masukan untuk perbaikan tesis ini. 5. Dirjen Pendidikan Tinggi melalui pemberian beasiswa BPPS untuk menempuh studi Strata 2 di Institut Pertanian Bogor. 6. Dr.Ir Idat G Permana, MagrSc, selaku Ketua Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, atas kesempatan yang diberikan untuk studi lanjut dan dana penelitian melalui program Due-Like batch 3. 7. Teknisi dan laboran di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, PPSHB, IPB, Lab Rekayasa Bioproses, PPSHB, IPB atas bantuan selama penelitian berlangsung.
8. Teman-teman seperjuangan di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PPSHB, Bu Sri, Mbak Rika, Bu Emma yang telah menjadi teman diskusi dan Pak Hadi di Wageningen University and Research yang telah memberi masukan untuk kinetika modeling serta memberi dukungan berupa jurnal-jurnal terbaru. Niken, Ulfah, Mbak Okti dan teman-teman lain yang tidak dapat dituliskan satu per satu. 9. Seluruh keluarga besar penulis terutama suami tercinta Dr Sri Wilarso dan ananda Shabrina Firdaus , juga adik – adik: Intan, Yuniga, Zaenal serta keponakan yang selalu menghibur saat lelah dan penat melanda, Bebe dan Baby, yang tiada putus-putusnya atas dukungan baik material, moral maupun spiritual. Penulis menyadari sepenuhnya hasil penelitian ini jauh dari sempurna, untuk itu saran dari semua pihak sangat diperlukan demi perbaikan karya ilmiah ini. Akhir kata penulis berharap semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi yang berkepentingan.
Bogor, Juli 2009
Penulis
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI...................................................................................................
xii
DAFTAR TABEL ..........................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xvi
1 PENDAHULUAN ……………………………………………………......
1
1.1 Latar Belakang ……………………………………………………...
1
1.2 Tujuan Penelitian …………………………………………………....
3
1.3 Manfaat Penelitian…………………………………………………...
3
2 TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………………….
4
2.1 Xilan ..................................................................................................
4
2.2 Enzim Xilanase ..................................................................................
5
2.3 Mekanisme Pemecahan Xilan ...........................................................
7
2.4 Dedak Gandum (Pollard) ..................................................................
9
2.5 Pemurnian Protein…. ........................................................................
10
2.5.1 Kromatografi Filtrasi Gel…………………………………….
12
2.5.2 Kromatografi Pertukaran Ion ..................................................
12
2.5.3 Kromatografi Afinitas .............................................................
13
2.6 Kinetika Pertumbuhan Mikroba... .....................................................
14
2.7 Staphylococcus aureus ……………………………………………...
16
3 BAHAN DAN METODA ..........................................................................
19
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ..........................................................
19
3.2 Alat dan Bahan ……………………………………………………..
19
3.3 Metoda Penelitian ………………………………………………….
20
3.3.1 Ekstraksi Xilan Dedak Gandum ……………………………..
20
3.3.2 Produksi Xilanase ...................................................................
21
3.3.3 Pengujian Aktifitas Enzim Xilanase .......................................
21
3.3.4 Pengukuran Kadar Protein .....................................................
22
3.3.5 Stabilitas Xilanase terhadap pH dan Suhu .............................
22
3.3.6 Parameter Kinetika Reaksi Enzimatik ...................................
23
3.3.7 Pengendapan Xilanase Menggunakan Amonium sulfat .........
23
3.3.8
Pemurnian Xilanase Menggunakan Kromatografi Filtrasi Gel..........................................................................................
24
3.3.9 Elektroforesis/SDS PAGE ......................................................
24
3.3.9.1 Running ....................................................................
24
3.3.9.2 Staining dan Destaining Gel ....................................
25
3.3.10 Zimogram ..............................................................................
25
4 HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................
26
4.1 Ekstraksi Xilan Dedak Gandum ……………………………………
26
4.2 Produksi Enzim Xilanase ...................................................................
27
4.2.1 Pertumbuhan Biomassa ……………………………………...
28
4.2.2 Perubahan Nilai pH .................................................................
30
4.2.3 Pembentukan Produk ………………………………………..
31
4.2.4 Kinetika Kultivasi Staphylococcus aureus MBXi-K4 ………
33
4.3 Karakteristik Enzim Xilanase ...........................................................
35
4.3.1 Pengaruh Suhu ………………………………………………
35
4.3.2 Pengaruh pH …………………………………………………
39
4.3.3 Parameter Kinetika Reaksi Enzimatik ………………………
42
4.4 Pemurnian Enzim Xilanase ...............................................................
45
4.4.1 Pengendapan Xilanase Menggunakan Amonium Sulfat ……
45
4.4.2. Dialisis ……………………………………………………...
45
4.4.3 Pemurnian Xilanase dengan Kromatografi Gel ……………
47
4.5 Hasil SDS PAGE dan Zimogram ......................................................
49
5 SIMPULAN DAN SARAN ........................................................................
54
5.1 Simpulan ...........................................................................................
54
5.2 Saran .................................................................................................
54
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
62
LAMPIRAN ...................................................................................................
63
DAFTAR TABEL Halaman 1. Hemiselulase dan jenis substrat yang dihidrolisis............................
6
2. Kadar xilan berbagai limbah industri pertanian...............................
10
3. Teknik pemurnian xilanase dari beberapa jenis mikroba………….
14
4. Komposisi media pertumbuhan S.aureus MBXi-K4 penghasil xilanase.............................................................................................
21
5. Hasil ekstraksi xilan dari dedak gandum………………………….
26
6. Nilai 1/[S] dan 1/[V] dari berbagai konsentrasi substrat………….
44
7. Ringkasan hasil pemurnian xilanase...............................................
48
8. Karakteristik beberapa xilanase yang dihasilkan oleh berbagai jenis bakteri......................................................................................
52
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1.
Konfigurasi dinding sel tanaman..................................................
2.
Struktur xilan dengan residu pengganti dan letak ikatan yang
4
dipecah oleh enzim xilanolitik.....................................................
8
3.
Struktur tiga dimensi xilanase tampak atas..................................
9
4.
Pemurnian enzim dengan berbagai teknik kromatografi kolom ..
13
5.
Koloni Staphylococcus aureus.....................................................
17
6.
Skema ekstraksi xilan dari dedak gandum...................................
20
7.
Proses ekstraksi xilan dedak gandum...........................................
27
8.
Grafik laju pertumbuhan biomassa dan aktifitas xilanase............
29
9.
Grafik perubahan nilai pH dan laju pertumbuhan biomassa........
30
10.
Grafik perubahan kadar protein dan aktifitas spesifik enzim.......
31
11.
Grafik laju konsumsi substrat, laju pertumbuhan biomassa dan pembentukan produk (xilanase)...................................................
32
12.
Penentuan laju pertumbuhan biomassa spesifik (µ).....................
33
13.
Perhitungan nilai rendemen produk (Yp/s) ................................
34
14
Perhitungan niali rendemen biomassa (Yx/s)..............................
35
15.
Kurva ketahanan xilanase terhadap suhu ....................................
36
16.
Keaktifan relatif enzim terhadap suhu.........................................
38
17.
Ketahanan enzim xilanase terhadap pH.......................................
40
18.
Persentase keaktifan relatif xilanase terhadap pH.......................
40
19.
Kurva hidrolisis xilan pada berbagai konsentrasi substrat ..........
43
20.
Kurva double-reciprocal Lineweaver-Burk................................
44
21.
Aktifitas xilanase yang diendapkan dengan amonium sulfat pada konsentrasi 40% – 60%........................................................
22.
46
Profil elusi filtrasi gel dengan matrik Sephadex G-100 dari enzim xilanase.............................................................................
47
23.
Hasil SDS PAGE xilanase pada beberapa tahap pemurnian........
50
24.
Profil zimogram hasil pemurnian xilanase……………………...
50
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1.
Uji biokimia isolat MBXi-K4…………………………………
63
2.
Isolat MBXi-K4………………………………….....................
64
3.
Komponen reagen asam dinitrosalisilat (DNS) (Miller, 1959)..
65
4.
Penentuan aktifitas xilanase......................................................
65
5.
Kurva standar xilosa..................................................................
66
6.
Komposisi reagen Bradford (Bradford, 1976)...........................
66
7.
Kurva standar protein................................................................
67
8.
Komposisi gel dan pereaksi untuk elektroforesis.....................
67
9.
Pereaksi dan prosedur pewarnaan perak...................................
68
10
Kurva standar penanda elektroforesis (Pharmacia) dan perhitungan berat molekul sampel (SDS PAGE)…………......
11.
69
Kurva standar penanda (LMW Fermentas) dan kurva standar zimogram..................................................................................
70
