TÖRÖK JÁNOS* egyetemi tanársegéd
DR. KÉKI SÁNDOR* egyetemi docens
DR. DEÁK GYÖRGY* egyetemi adjunktus
DR. ZSUGA MIKLÓS* tanszékvezetõ egyetemi tanár
A tömegspektrometria napjainkban egyre elterjedtebb a kémiai anyagszerkezet-vizsgáló laboratóriumokban. A tömegspektrométerek általános felépítése az 1. ábrán látható. 1. Polimerek molekulatömeg meghatározása fragmentáció nélküli, ún. lágy ionizációs technikákkal
mátrixból és az analitból gõzfázisban ionaddukt képzõdik. A felvett ion származhat a savas mátrixból (proton addíció) vagy a mátrixhoz kevert elektrolitból (általában Li+, Na+, K+, Ag+ vagy Cu+). A MALDI technikát eredetileg biopolimerek, fehérjék, oligonukleotidok analízisére dolgozták ki [5, 6], de remekül alkalmazható szintetikus polimerekre is [7–13]. 1.2. Elektroporlasztásos ionizáció (ESI)
1.1. Mátrix segített lézer deszorpció/ionizáció (MALDI)
Elektroporlasztásos ionizáció (Electrospray Ionization, ESI) esetén a mintát folyadékfázisban juttatjuk egy A mátrix segített lézer deszorpció/ionizáció (Matrix- kapillárison keresztül a tömegspektrométerbe [14]. A foAssisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) techni- lyadékáramból fûtött porlasztógáz és az alkalmazott kát HILLENKAMP [1] és TANAKA [2] kutatócsoportja a 80- elektromos tér segítségével apró cseppecskék keletkezas években egymástól függetlenül kutatta. Lágy ionizá- nek. Az ellenelektród és a kapilláris közötti feszültségciós technikaként a MALDI alkalmas makromolekulák különbség hatására a cseppek felülete töltött lesz, a porfragmentáció nélküli ionizálására [3, 4]. A nagy intenzi- lasztógáz hatására az oldószer elpárolog és a csepp zsutású lézerfényt a szilárd mátrix nyeli el és a felvett ener- gorodik. A cseppet összetartja a folyadék felületi feszültgiát gõzfázisban átadja az analizálandó molekulának. A sége, viszont a felszínen lévõ azonos töltések igyekeznek minél messzebb kerülni egymástól. A csepp zsugorodása a RayleighMintabevivõ rendszer Ionforrás pl. LC, GC, CE pl. MALDI, ESI, VI, APCI, féle instabilitási határig folytatódik, mikrofecskendõ EI, TS, FAB ennél a méretnél a felületi feszültség már nem kompenzálja a taszítóerõt és bekövetkezik az ún. Coulomb-robbaAnalizátor Vákuumrendszer nás. Ha ez a zsugorodás-robbanás elég pl. szektor, TOF, FT-ICR, rotációs, diffúziós, sokszor ismétlõdik, akkor a folyamat kvadrupol, ion trap turbómulekuláris szivattyúk végén a minta ionizált molekuláit (addukt ion) kapjuk meg [14–15]. Detektor pl. mikrocsatornás, hibrid detektor
Adatgyûjtés, feldolgozás A/D konverter, számítógép, szoftver
2. MS/MS mérés MALDI körülmények között Lágy ionizációs technikaként a MALDI ionforrásban elhanyagolhatóan csekély mértékû a fragmentáció. Elõfordulhat azonban olyan eset, amikor épp az a célunk, hogy a vizsgált
1. ábra. A tömegspektrométerek általános felépítése *Debreceni
Egyetem, Alkalmazott Kémiai Tanszék
2005. 42. évfolyam, 8. szám
MÛANYAG
ÉS
GUMI
285
Szerkezetvizsgálat
Polimerek molekulatömeg meghatározása tömegspektrometriával
molekula fragmentácóját idézzük elõ, így a bomlástermékek tömege alapján tudunk következtetni a szerkezetre. A bomlás körülményeitõl függõen megkülönböztetjük az ionforrásban és az ionforrás utáni (azaz a repülési csõben történõ) bomlást (In-Source Decay (ISD), illetve Post-Source Decay (PSD)) [3–6]. A PSD esetében az ion a gyorsító szakasz után, a szabad repülési csõben bomlik egy töltött és egy semleges fragmensre. A különbözõ tömegû és töltésû fragmensek sebessége megegyezik, ezért a különbözõ tömegû fragmensekhez ugyanakkora repülési idõ tartozik. Reflektron módban a fragmensionok az iontükörrõl visszaverõdnek és repülési idejük eltérõ lesz (a nagyobb tömegû fragmens nagyobb kinetikai energiája miatt hosszabb utat tesz meg a reflektronban). A repülési idõk alapján és kalibráció után a fragmens ionok tömege meghatározható. Az így kapott PSD spektrumból a bomlásra hajlamos (kisebb kötési energiájú, fõleg a C és a heteroatom közötti) kötések helyzete meghatározható, a szerkezet felderíthetõ. Ez a technika alkalmas kis moltömegû vegyületek szerkezetének megállapítására [7–10, 16] és rutinszerûen alkalmazzák fehérjék elsõdleges szerkezetvizsgálatára [17–18]. Az általunk használt készülékben a tömeganalizátor repülési idõ (Time of Flight, TOF) [19] alapján különíti el az eltérõ tömegû ionokat. A TOF analizátor nagy elõnye, a többi analizátorral szemben, hogy széles molekulatömeg tartományt vizsgálhatunk. Néhány technikai probléma megoldásával (késleltetett ion extrakció [20], iontükör [21]) a mai TOF készülékek nagypontosságú és nagy felbontású tömegspektrumot szolgáltatnak, így az abszolút molekulatömeg és molekulatömeg-eloszlás meghatározható. Az m/z és a repülési idõ közötti öszszefüggést az (1) egyenlet adja meg. m 2 = A′·t TOF z
3. Molekulatömeg meghatározás tömegspektrometriával Oligomerek és polimerek esetében, a (2) egyenlet szerint meghatározható az ismétlõdõ egység és a végcsoportok tömege [11]: z
M végcsoport + n·M monomer + M mért =
∑M i =1
i ,kation
(2)
z
ahol Mmért a mért tömeg (Th, Thomson), Mvégcsoport, monoa végcsoport, a monomeregység tömege, z a keletkezõ ion töltése, Mi, kation pedig az i-edik addicionálódott kation tömege (1-tõl z-ig). Míg MALDI körülmények között leggyakrabban csak egyszeres töltésû, addig az ESI ionforrásban többszörös töltésû ionok keletkeznek. E két ionizációs technikát hasonlíthatjuk össze a 2. és 3. ábrán. A képzõdött adduktion töltését (megfelelõ felbontás esetén) az izotópcsúcsok tömegkülönbségébõl számíthatjuk. Könnyen belátható, hogy ez a különbség 1/z Th lesz (4. ábra). A tömegkülönbség a két polimermolekula között Mmonomer/z, azaz 44/2, 22 Th, az izotópcsúcsok között pedig 0,5 Th, azaz z=2. A végcsoportok tömegösszege 18 Th lesz, ami megfelel a láncvégen két hidroxilcsoportnak. A polimerlánc szerkezete: mer
HO–(–CH2–CH2–O–)–nH
(1)
ahol m, z a tTOF repülési idejû részecske tömege és töltése, az A' az ún. mûszerállandó. A kalibráció során ismert tömegû ionok repülési idejét mérve határozzuk meg az A'-t. 2. ábra. A PEG-1540 MALDI-TOF tömegspektruma (Bruker BiFlex III), Mn=1366, Mw=1404, Mw/Mn=1,03
286
MÛANYAG
ÉS
GUMI
2005. 42. évfolyam, 8. szám
∑ M ·N = ∑N 2 i
Mw
i
i
(4)
i
i
ahol Mi az i-dik polimerizációfokú molekula moláris tömege, Ni pedig a száma. A MALDI és ESI mérés során, szûk eloszlás esetén (az ionizáció mértéke független a polimerizációfoktól), a mért jel intenzitása arányos a molekulák számával, így a számítás a következõképp módosul:
∑ M ·I = ∑I i
Mn
i
i
(5)
i
i
∑ M ·I = ∑I 2 i
Mn
i
i
(6)
i
i
3. ábra. A PEG-1540 ESI-TOF tömegspektruma (Bruker BioTOF II)
1. táblázat. Különbözõ módszerrel kapott molekulatömegek és a számított érték összehasonlítása Összetétel
MALDI 1361,78
M, Th
[C60H122O31+Na]+ ESI 1361,79
[C60H122O31+2Na]2+ ESI Számított 692,39 692,39
Számított 1361,79
A 30-as polimerizációfokú polimerre (összetétel C60H122O31) a számított és a mért értékeket az 1. táblázat tartalmazza. Az 1. táblázatban jól látható, hogy az eltérés a mért és a számított érték között maximum 0,01 Th. A szám- (Mn) és tömegátlag-molekulatömeg (Mw) az alábbi összefüggések szerint számíthatók:
∑ M ·N = ∑N i
Mn
i
i
i
i
2005. 42. évfolyam, 8. szám
(3)
ahol Mi az i-dik polimerizációfokú molekula tömegspektrumban mért moláris tömege és Ii az Mi tömeghez tartozó jel intenzitása. Széles eloszlású polimerek esetén (Mw/Mn>1,2) a (5) és (6) egyenletek nem alkalmazhatók, ezért elõnyösebb frakcionálással (pl. gél permeációs kromatográfiával vagy frakcionált kicsapással) szûkíteni a molekulatömeg eloszlást [22].
4. Folyadékkromatográfia/ tömegspektrometria Több komponensû minta, ismeretlen szerkezet, esetleg izobár tömegek esetén ahhoz, hogy megfelelõen értékelhetõ tömegspektrumot kapjunk, elengedhetetlenül szükséges a komponensek elõzetes elválasztása (liquid chromatography, LC) és idõben elkülönülõ detektálása (pl. tömegspektrometriásan). Az elválasztás leggyakrabban valamilyen kromatográfiás lépést jelent, polimereknél folyadék vagy gélpermeációs kromatográfiát. Mivel az elválasztás során a minta folyadékfázisban van, ezért a folyadékkromatográfiás módszerekkel kitûnõen kombinálhatók az egyes porlasztásos ionizációs technikák [23].
MÛANYAG
ÉS
GUMI
287
A kromatografálás és detektálás idõbeli lefutása alapján megkülönböztetünk off-line és on-line LC/MS módszereket. Off-line mérésekre a MALDI és az ESI alkalmas technika, on-line mérésekre az ESI alkalmazha-
2. táblázat. A molekulatömegek és a hozzátartozó szerkezet az EO-CL kopolimer esetén MT–EO–CL=150 + n·58 + m·114 + 23 t-Bu-Ph-(EO)n–(CL)m–OH MH–EO–CL=18 + n·58 + m·114 + 23 H–(EO)n–(CL)m–OH MR–EO–CL=0 + n·58 + m·114 + 23 (EO)n–(CL)m
tó, bár az utóbbi idõben biztató jelek vannak az on-line MALDI megvalósítására [24]. Biner random kopolimereket on-line HPLC-UV-MS módszerrel vizsgáltunk. A kopolimerizáció során monomerként etilén-karbonátot, propilén-karbonátot és εkaprolaktont használtunk [25]. A kopolimerizáció lejátszódását jól mutatja az 5. ábra. Az EO-CL kopolimer esetén a molekulatömeg: MEO–CL=Mvég + n·44 + m·114 + Mkation
4. ábra. A PEG-1540 nagyított ESI-TOF tömegspektruma (Bruker BioTOF II)
5. ábra. Az EO-CL kopolimer ESI-TOF tömegspektruma p-terc-butil-fenol)
288
MÛANYAG
ÉS
GUMI
(K+-mal
(7)
ahol Mvég, kation a végcsoportok és a kation tömege, n, m pedig a PO és CL egységek száma. Ugyanahhoz a molekulához képest 58 és 114 Th tömegnövekedés is megfigyelhetõ. A gyûrûs karbonátok gyûrûfelnyílásos homopolimerizációja során szerzett tapasztalataink [7, 8] és a (7) egyenlet alapján az 5. ábrán a feltüntetett 461 Th-os tömegnél a végcsoport tömege 150 Th, ami megfelel a p-terc-butil-fenol moláris tömegének. A további csúcsok végcsoportok tömegére 18 és 0 Th értéket kaptunk. A molekulatömegeket és a lehetséges szerkezeteket a 2. táblázatban tüntettük fel. A T-sorozat a telekelikus sorozat, azaz a kopolimer lánc a monomeregységek mellett az iniciátor maradékot is tartalmazza. A következõ a H-sorozat, a hidroxiltelekelikus sorozat, vagyis az iniciátor maradék helyett hidroxil végcsoportot tartalmaz a kopolimer. A harmadik, R-sorozat gyûrûs szerkezetû. A tömegspektrum és a lehetséges szerkezetek összevetése során izobár tömegeket (azaz eltérõ összetételhez ugyanakkora nominális tömeg tartozik) találtunk.
kationizált, iniciátor
150+n·44+m·114+39= 18+(n+3)·44+m·114+39
(8)
2005. 42. évfolyam, 8. szám
A (8) egyenlet alapján az n=2, m=1 esetben a Tsorozat összetétele C20H32O5, a hozzá tartozó káliumcsúcs tömege 391,188 Th. A H-sorozatban az n=5, m=1 esetben az összetétel C16H32O8, a káliumcsúcs tömege 391,173 Th. A két monoizotóp tömegkülönbsége 0,015 Th, ami a tömegspektrométerünk pontosságán belül van. Az, hogy a tömegspektrumban mégis melyik sorozat fordul elõ, csak elválasztás-technikával kombinálva dönthetõ el. Folyadékkromatográfiát kettõs detektálással alkalmazva egyértelmûvé válik, hogy melyik sorozat melyik tagjáról van szó. Az UV és MS jeleket összehasonlítva megállapítható, hogy az adott részecske tartalmazott-e aromás iniciátor maradékot 6. ábra. vagy sem (6. ábra). A 6. ábrán az EO-CL kopolimer extrahált ion [7] kromatogramját láthatjuk. Az ábrán 489 Th tömeghez 3 kromatográfiás csúcs tartozik. A (8) egyenletbõl követ[8] kezik, hogy a két szerkezetben kromatográfiás szempontból a legjelentõsebb eltérés az aromás iniciátor[9] maradék megléte, illetve nemléte. Az alkalmazott fordí[10] tott fázisú rendszerben mindenképpen kisebb visszatartást (rövidebb retenciós idõt) várunk az aromás egységet [11 nem tartalmazó részecskéktõl. Az UV csúcsot csak a hosszabb retenciós idejû komponens ad, tehát ez tartal[12] mazza az aromás iniciátormaradékot. A kopolimerizá[13] ciónál a homopolimerizációhoz képest egy új eloszlásforma, az ún. szekvenális eloszlás is megjelenik. Ebben [14] az esetben azonos az összetétel, azonos a végcsoport, csak a komonomeregységek kapcsolódási sorrendjében [15] van különbség. Ezt megfigyelhetjük a 6. ábrán, az extrahált ion kromatogramon a 14,5– 16,0 perc retenciós idõ [16] között két csúcsot kaptunk, mindkét esetben van UV jel, tehát csak a kapcsolódási sorrend különbözik. A molekulatömeg-eloszlás és a végcsoport-eloszlás egyszerû tö[17] megspektrometriával is vizsgálható, azonban izobár öszszetételek és szekvenális eloszlás esetén a rendszer csak elválasztás-technikával kombinálva tanulmányozható. [18] Irodalomjegyzék [1] Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F.: Anal. Chem., 57, 293 (1985). [2] Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T.: Rapid Comm. Mass Spectrom., 2, 151 (1988). [3] Hanton, S. D.: Chem. Rev., 101, 527 (2001). [4] Nielen, M. W. F.: Mass Spectrom. Rev., 18, 309 (1999). [5] Beavis R. C.; Chait B. T.: Methods in Enzymol., 270, 519 (1996). [6] Coligan, J. E.; Dunn, B. M.; Ploegh, H. L.: ‘Matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass analysis of peptides’. Speicher, D. W. and Wingfield, P. T. Eds. (Contributed by Henzel, William, J. and Stults, John, T.), Current Protocols in Protein Science, 1, John Wiley & Sons, New York, Unit 16.2. (1995).
2005. 42. évfolyam, 8. szám
[19] [20] [21] [22] [23]
[24]
[25]
Az EO-CL kopolimer UV (274 nm) és extrahált ion kromatogramjai (489 Th tömegnél, Na-mal kationizált) Kéki, S.; Török, J.; Deák, Gy.; Zsuga M.: Macromolecules, 34, 6850 (2001). Kéki, S.; Török, J.; Deák, Gy.; Zsuga, M.: Macromolecular Symposia, 215, 141 (2004). Kéki, S.; Bodnár, I.; Borda, J.; Deák, G.; Zsuga, M.: J. Phys Chem. B, 105, 2833 (2001). Kéki, S.; Bodnár, I.; Borda, J.; Deák, G.; Batta, G.; Zsuga, M.: Macromolecules, 34, 7288 (2001). Montaudo, G.; Montaudo, M. S.; Puglisi, C.; Samperi, F.: Rapid Commun. Mass Spectrom., 9, 453 (1995). Rashidzadeh, H.; Guo, B.: Anal Chem., 70, 131 (1998). Kéki, S.; Deák, Gy.; Mayer-Posner, F. J.; Zsuga, M.: Macromol. Rapid Commun., 21, 770 (2000). Karas, M.; Bachman, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F.: Int. J. Mass Spectrum. Ion Processes, 78, 53 (1987). Cole, R. B.: Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation and Applications, ISBN 0-471-14564-5 (1997). Eisenberg, P.; Erra-Balsells, R.; Ishikawa, Y.; Lucas, J. C.; Nonami, H.; Williams, R. J. J.: Macromolecules, 35, 1160 (2002). Breen, E. J.; Holstein, W. L.; Hopwood, F. G.; Smith, P. E.; Thomas, M. L.; Wilkins, M. R.: Spectroscopy (Amsterdam, Netherlands), 17, 579 (2003). Belghazi, M.; Bathany, K.; Hountondji, C.; GrandierVazeille, X.; Manon, S.; Schmitter, J.-M.: Europ. J. of Mass Spec., 7, 101(2001). Stephens, W. I.: Phys. Rev., 69, 691 (1946). Wiely, W. C.; McLaren, I. H.: Rev. Sci. Instrum, 26, 1150 (1955). Mamyrin, B. A.; Schmikk, D. V.; Zagulin, V. A.: Soviet Phys. JEPT., 37, 45 (1973). Luftmann, H.; Tabani, G.; Kraft, A.: Macromolecules, 36, 6316 (2003). Yergey, A. L.; Edmonds, C. G.; Lewis, I. A. S.; Vestal, M. L.: Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Techniques and Applications, Plenum Publ. Co., New York, 1989. Musyimi, H. K.; Narcisse, D. A.; Zhang, X.; Stryjewski, W.; Soper, S. A.; Murray, K. K.: Anal. Chem., 76, 5968 (2004). Kéki, S.; Török, J.; Deák, Gy.; Zsuga, M.: European Polymer Journal, 7, 41 (2005).
MÛANYAG
ÉS
GUMI
289
