Příprava biologického materiálu, fixace, zalévání do epoxidových médií
Glutaraldehyd
fixace - rychlé usmrcení buněk při optimálním zachování jejich tvaru, struktury a obsahu
OCH(CH2)3 CHO
volíme „EM grade“ nebo „biological grade“; uchovávat v lednici nebo mrazáku 2% roztok v fosforečnanovém (stabilizačním) pufru (pH 6,7-7,2)
buňky je možno dlouhodobě uchovávat nedodává biologickým vzorkům vhodný kontrast pozměňuje, ale neruší permeabilitu plasmatických membrán reaguje s bílkovinami – vznikají průhledné stabilní gely, enzymy si zachovávají svou aktivitu, nereaguje s lipidy a většinou polysacharidů
Oxid osmičelý OsO4
'Volatile substance' The resulting vapours corrode skin and eyes and fumes damage the lungs when inhaled. In the laboratory it is only safely handled inside a fume cupboard. dodává biologigkým vzorkům kontrast v přítomnosti organických látek a na světle se redukuje na nižší oxidy a postupně až na osmium (černá)
okamžitá fixace jednobuněčných protist proniká pomalu do objektu, nutnost fixovat drobné objekty, ztráta enzymatické aktivity, nevratné změny v PM – stává se prostupnou pro makromolekuly , buňkám nevadí změny osmotického tlaku
Uranyl acetát
jedovatý, radioaktivní
Commercial preparations of uranyl acetate are made from depleted uranium and have a typical radioactivity of 0.37 - 0.51 µCi/g. This mild radioactivity level is not sufficient to be harmful while the material remains external to the body. However it is very toxic by ingestion and if inhaled as dust or by skin contact if skin is cut or abraded and there is a danger of cumulative effects from long term exposure. rozkládá se působením světla, fixace a stabilizace DNA, proteinových komlexů, fosfolipidů a někt. bílkovin, působí jako fixáž i jako barvivo (dodává vhodný kontrast)
také pro kontrastování řezů na síťkách a negativní kontrastování
Pufry pH ovlivňuje stabilitu fixačních činidel pH fixáže musí odpovídat pH v buňce (6,8 – 7,2) fosforečnanový – nejpoužívanější, nejlevnější, často napadán mikroorganismy – je třeba dělat čerstvý (Sorensenův, PBS -Phosphate Buffered Saline) směs fosforečnanu a hydrogenfosforečnanu sodného 0,1 – 0,05 M Na – kakodylanový pufr – jedovatý – obsahuje arsen, není kontaminován mikroorganismy, dražší
Odvodnění
buňky vystavujeme vzrůstající koncentraci odvodňující látky Etanol CH3CH2OH v nižší koncentraci extrahuje proteiny (špatně fixované proteiny se rozpouštějí), ve vyšší fosfolipidy, špatně se mísí s pryskyřicemi (nutné další rozpouštědlo – propylenoxid, butanol) používat pouze čistý (nikdy denaturovaný)
aceton, propylenoxid, butanol
Zalévací média dnes používány především epoxidové více složkové pryskyřice (Eppon, Spurr) Epon – 4 složkový Durcupan AM, Durcupan B, Epon 812, Durcupan C (akcelerátor) Spurr - 4 složkový ERL (Vinylcyclohexene Dioxide) DER (Diglycidyl Ether of Polypropylene Glycol) NSA (Nonenyl Succinic Anhydride) DMAE (Dimethylaminoethanol)- akcelerátor nejnižší viskozita ze zalévacích pryskyřic dobře proniká do objektů (vhodný i pro tlustostěnné buňky a tkáně), řezy stabilní v EM paprsku
https://www.youtube.com/watch?v=xlr-Gx_7DHI
Preparáty pro TEM Základem všech preparátů je elektronmikroskopická síťka (angl. grid) o průměru 3 mm různě vnitřně členěná, růz. materiál
používáme Cu 300 mesh Preparáty musí být: dostatečně tenké, bezvodé, stabilní v EM, kontrastní ( docílíme např. stínováním parami těžkých kovů nebo impregnací vodnými roztoky těžkých kovů) pokrytá formvarovou blankou
Disperzní systémy např. křemičité šupiny, frustuly malých rozsivek, izolované bičíky, loriky, izolované mikrofibrily BS (nakapou se na síťku, nechají uschnout, propláchnou, příp. kontrastují
SiO2 poskytuje dostatek kontrastu
negativně kontrastováno UAc
Ultratenké řezy
zalité v epoxidovém médiu nebo kryořezy
Uhlíkové otisky
nahrazeny SEM
Relativní rozměry a pomůcky k pozorování
D:\Obrazky Lumix Fz38\EM_podklady _2\Výběr\P1040420_ relative sizes.jpg
The first TEM
Ernst Ruska: Nobel Prize in physics 1986
Knoll and Ruska, first TEM in 1931 Idea and first images published in 1932 By 1933 they had produced a TEM with two magnetic lenses which gave 12 000 times magnification.
Electron Microscope Deutsches Museum, 1933 model
The first SEM Německý vědec, fyzik a vynálezce, 600 patentů na poli EM, lékařské technologie, jaderné technologie, fyziky plazmatu, radiová a televizní tech.
For ten years after World War II, he worked in the Soviet Union on their atomic bomb project and was awarded a Stalin Prize.
Manfred von Ardenne, first SEM in 1937 a true microscope with high magnification by scanning a very small raster with a demagnified and finely focused electron beam
Basic TEM Electron source (HV= 200kV) Apertures
Magnetic lenses Sample holder
Vacuum in the column better than 10-6 Pa
Fluorescence screen Recording media (Film/CCD/ TV)
Pedals for tilting the sample
A.E. Gunnæs
MENA3100 V13
Systémy elektronového mikroskopu
Zdroj elektronů – katoda (různé typy) Zdroj urychlovacího napětí: násobič napětí, možnost volby 20 – 100 keV u konvenčního TEM. 200 -3000 keV u vysokonapěťového EM Elektromagnetické čočky, tvoří sloupec (tubus) mikroskopu Stínitko, CCD kamera Vakuová soustava: hodnota provozního vakua 10-4 – 10-8 hPa.
Dráhy elektronů v trysce - thermionic gun http://www.ammrf.org.au/myscope/tem/background
Electron column column filled with a set of electromagnetic lenses, the sample port and airlock, and a set of apertures that can be moved in and out of the path of the beam. The contents of the column are under vacuum.
clony sample viewing chamber with a screen (produces an image via fluorescence when impacted by the projected electrons) CCD camera positioned either above or below the screen
Magnetic lens system Electomagnetic lenses shape the electron beam, which travels in a spiral trajectory. Each lens is constructed of a coil of copper wire through which a current runs. There is a hole in the center through which the beam travels. High vacuum inside of the column, density of molecules which can interfere with the electron beam are minimised.
Sample chamber
Electron interaction with the specimen e-
Backscattered electrons Auger electrons Cathodoluminescence
Secondary electrons X-rays
Absorbed electrons EBIC
Specimen
Elastically scattered electrons
Inelastically scattered electrons
Transmitted electrons
Gas Heating Cooling
SEM beam of electrons focused at the specimen surface and systematically scanned across the surface of a specimen. Never a real image of the sample - SEM image is in the form of a serial data stream i.e. it is an electronic image. Screen scanned in synchrony with the beam on the specimen one-to-one relationship between points on the specimen and points on the screen Construction of the image: point-by-point and line-by-line.
High vacuum mode and pump system
Focus and lenses Condenser lens converges the cone of the electron beam to a spot below it. This initial convergence can be at different heights, that is, close to the lens, or further away. The closer it is to the lens, the smaller the spot diameter at the point of convergence – small spot size Objective lens is focusing the beam onto the sample.
Spot size The size (cross sectional diameter) that the cone of the beam makes on the surface of the sample affects: 1) the resolution of the image 2) the number of electrons generated (therefore the graininess of the image) At low magnifications we use a larger spot-size than at higher magnifications The number of dwell points (spots in the row in the diagram) is constant for any one magnification so that: - too small spot size – gaps in signal - too large a spot size - overlap and average the signal http://www.ammrf.org.au/mysco pe/sem/practice/virtualsem/bone. php
Sample preparation for Scanning electron microscopy (SEM) a biological specimen is: • chemically fixed • dehydrated through an acetone or ethanol series • dried at the critical point ‐ a method used to minimize specimen distortion due to drying tensions. For dry samples, this process is not necessary. • the samples are mounted on a stub of metal with adhesive (carbon tape) • coated with thin layer (nm) of metal such as Gold/Palladium • observed in the microscope
Critical Point Drying http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/critical_drying.aspx What is Critical Point Drying? process: continuity of state for which there is no apparent difference between the liquid and gas state of a medium (nulové povrchové napětí) • za určité teploty a tlaku (voda: +374°C a 3212 p.s.i. – zničení vzorku horkem x CO2 31°C and 1072 p.s.i) povrchové napětí téměř nulové (nedojde k poničení během vysychání) • CO2 univerzálně používané médium – nemísí se s vodou; přechodové médium – většinou aceton • přeměna CO2 z kapalné do plynné fáze přes kritický bod bez zničujícího povrchového napětí
Critical Point Drying http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/critical_drying.aspx What is Critical Point Drying? Critical Point Drying is so named as it includes, as part of its process, the occurrence known as the continuity of state for which there is no apparent difference between the liquid and gas state of a medium, the surface tension between this interface reducing to zero. This occurs at a specific temperature and pressure with resulting density, and is known as the Critical Point. This condition of zero surface tension can be used to dry Biological Specimens, avoiding the damaging effects of surface tension. In biological specimens we are mainly concerned with the removal of water. Unfortunately, the critical point for water of +374°C and 3212 p.s.i. is inconvenient, and would cause heat damage to the specimen. The most common and convenient transitional medium for critical point drying is Carbon Dioxide (CO2), which has a critical point at 31°C and 1072 p.s.i. However, it is not miscible with water, and therefore, we have to involve a third medium, commonly Acetone, which is termed the intermediate fluid. We can now convert our transitional fluid, typically CO2, from liquid to gas without surface tension at the critical point.
Sputter coating redukuje nabíjení vzorku (pokrytí tenkou vrstvou Au, AU-Pd, Pt) In conventional SEM sputter coating a gold (goldpalladium, or platinum) target is bombarded with heavy gas atoms (usually argon but air is a fair substitute). Metal atoms ejected from the target by the ionised gas cross the plasma to deposit onto the any surface within the coating unit including the specimen. A low vacuum environment is used (0.1 to 0.05 mbar),
