PENGKLONAAN GEN Cd40 ligand (Cd40l) Mus musculus KE DALAM Escherichia coli TOP10

PENGKLONAAN GEN Cd40 ligand (Cd40l) Mus musculus KE DALAM Escherichia coli TOP10 Puji Rahayu1 1

Departemen Biologi, FMIPA UI, Kampus UI Depok 16424 [email protected]; [email protected]

Abstrak

Telah dilakukan pengklonaan gen Cd40 ligand (Cd40l) dari Mus musculus ke dalam sel inang Escherichia coli TOP10. Gen Cd40l adalah gen pengkode protein CD40L, anggota dari tumor necrosis factor (TNF) superfamily (TNFSF). CD40L merupakan salah satu kandidat adjuvan karena diketahui sebagai salah satu immunoagent paling efektif dari keluarga TNFSF. CD40L berikatan dengan reseptornya pada sel makrofag, sel T dan sel B yang teraktivasi berfungsi menginduksi aktivasi sel APC dan sel B. Penelitian bertujuan mengklona gen Cd40l ke dalam sel inang Escherichia coli TOP10 dengan perantara vektor pcDNA 3.1(+). Fragmen gen Cd40l tanpa mengandung start codon (ATG) dengan panjang 644 pasang basa, diamplifikasi melalui transkripsi balik dengan RNA sel PMBC mencit sebagai pola cetaknya. Gen Cd40l telah berhasil diklona ke dalam E.coli TOP10. Hasil analisis menunjukkan sekuen hasil klona memiliki similaritas 100% terhadap sekuen acuan pada database GeneBank yaitu Mus musculus CD40 ligand (Cd40lg), mRNA, coding sequence dengan accession number NM_011616.2 Kata kunci: adjuvan, Escherichia coli TOP10, gen Cd40l, pcDNA 3.1(+), pengklonaan

Abstract Cloning of Cd40 ligand (Cd40l) gene from Mus musculus into Escherichia coli TOP10 had been conducted. Cd40l gene encodes CD40L protein which is a member of the tumor necrosis factor super family (TNFSF). CD40L is one of candidate adjuvant as known as one of most effective immunoagent. Binding of CD40L to its receptor on the surface of macrophage, activated T cell, and activated B cell induces activation of APC and B cell. The aim of research is to clone Cd40l gene into E.coli TOP10 using pcDNA 3.1(+) vector. 644 base pairs of Cd40l fragment without start codon (ATG) was amplified from RNA PMBC cell with RT-PCR. Cd40l gene was successfully cloned to E.coli TOP10. The analysis showed 100% similarity between Cd40l clone and GeneBank database, Mus musculus CD40 ligand (Cd40lg), mRNA, coding sequence with accession number NM_011616.2 Keywords : adjuvant, Cd40l gene, cloning, Escherichia coli TOP10, pcDNA 3.1(+)

1. PENDAHULUAN Vaksinasi

adalah

pemberian

substansi

imunogenik untuk menstimulasi respon imun adaptif terhadap suatu penyakit.

conjugate vaccine, live attenuated viruses, synthetic vaccine, viral vector, dan DNA vaccine [1].

Vaksinasi dilakukan

Pengembangan vaksin dewasa ini lebih

sebagai upaya untuk mengurangi kejadian penyakit

banyak mengarah pada vaksin generasi ketiga yaitu

infeksi. Edward Jenner pada tahun 1796 mengawali

vaksin DNA. Vaksin DNA menggunakan plasmid

keberhasilan vaksinasi dengan membuktikan bahwa

yang mengkode antigen terbukti meningkatkan baik

vaksin dapat menginduksi kekebalan tubuh manusia

respon imun selular maupun respon imun humoral

terhadap smallpox.

dalam jangka waktu yang lama [1]. Keberhasilan

Berbagai tipe vaksin telah

banyak dikembangkan oleh para peneliti diantaranya

vaksinasi tidak hanya ditentukan oleh teknologi

Pengklonaan gen …, Puji Rahayu, FMIPA UI, 2013

rekayasa vaksin semata, tetapi juga faktor lain seperti

diharapkan meningkatkan respon imun selular oleh

metode, rute, dosis vaksinasi, serta adjuvan yang

sel T CD8+, meningkatkan aktivitas sel T CD4+ ,

meningkatkan imunogenitas vaksin. Sebagai contoh,

dan meningkatkan respon imun humoral melalui

vaksin HIV-1 telah banyak dikembangkan dan diuji

aktivasi sel B [1][2]. Formasi > 2-trimer CD40L

pada hewan coba. Hasilnya, pengembangan vaksin

merupakan adjuvan yang efektif bagi sel T CD8+.

DNA HIV-1 mutlak memerlukan adjuvan molekular

Penelitian tersebut mencoba 3 jenis formasi CD40L

untuk meningkatkan efikasi vaksin [1].

yaitu 1-trimer (bentuk asli CD40L), 2-trimer, dan 4-

Pengembangan vaksin DNA kini mengarah

trimer. Hasilnya, efektivitas bentuk soluble CD40L

pada penggunaan adjuvan molekular atau adjuvan

meningkat sesuai dengan valensinya (1< 2< 4).

gen. Adjuvan gen memiliki aktivitas biologik yang

Ketersediaan bentuk 4-trimer CD40L akan sangat

mampu menginduksi sistem imun sehingga berfungsi

bermanfaat dalam upaya pengembangan vaksin DNA

dalam membantu meningkatkan efikasi vaksin.

baik vaksin antivirus maupun vaksin antitumor [4].

Inisiasi T cell-dependent immune response dalam melawan

antigen

membutuhkan

antigen

Berdasarkan penelitian-penelitian yang telah

yang

dilakukan, Laboratorium Institue Human Virology

diadministrasikan bersama dengan adjuvan. Adjuvan

and cancer Biology Universitas Indonesia (IHVCB-

yang sudah banyak dikenal contohnya Freud’s

UI),

adjuvan baik complete maupun incomplete (CFA

pengembangan prototipe vaksin H5N1 dengan

atau IFA), akan tetapi penggunaanya dilarang untuk

CD40L sebagai adjuvannya.

manusia karena bersifat toksik. Adjuvan tersebut

pengklonaan atau perbanyakan gen pengkode protein

juga memperlihatkan kerusakan pada hewan coba

CD40L perlu dilakukan sebagai tahap awal untuk

seperti pemberian CFA secara intradermal yang

aplikasi selanjutnya. Gen Cd40l yang akan diklona

menyebabkan ulserasi dan nekrosis kulit.

Para

tidak akan mengandung sekuen start codon (ATG),

peneliti mencoba mengatasi permasalahan tersebut

karena akan difusikan dengan gen HA sebagai

yaitu dengan mengembangkan berbagai adjuvan

kandidat vaksin H5N1 pada penelitian selanjutnya.

alternatif untuk meningkatkan efikasi vaksin, salah

Gen Cd40l tanpa start codon (ATG) didapat dari

satunya adjuvan yang berbasis gen (adjuvan gen) [1].

hasil transkripsi balik (RT-PCR) mRNA yang

Adjuvan dapat berupa molekul sitokin, kemokin, dan

diekstraksi dari sel PMBC mencit (Mus musculus).

kostimulator [2]. CD40 ligand (Cd40l) merupakan

Pengklonaan memerlukan sel inang yang mampu

salah satu kandidat adjuvan kostimulator dengan

menerima vektor dan melakukan sekresi protein dari

target besarnya yaitu aktivasi sel antigen presenting

hasil ekspresi protein pada gen asing, yaitu sel inang

cell (APC) sebagai barrier pertama pengenalan

Escherichia coli TOP10 yang dapat memberikan

antigen secara spesifik dan aktivasi sel B dalam

efisiensi transformasi hingga mencapai 107 CFU/ml.

membentuk antibodi.

CD40L atau dikenal juga

Pengklonaan gen juga memerlukan suatu vektor

sebagai CD154 adalah anggota dari tumor necrosis

untuk melakukan transformasi dan perbanyakan gen

factor super family (TNFSF) yang terekspresi

di dalam sel inang. Vektor yang akan digunakan

terutama pada sel T CD4+ aktif. Pemberian adjuvan

yaitu pcDNA 3.1 (+) karena merupakan vektor yang

CD40L dalam bentuk soluble bersama dengan vaksin

memiliki sifat high copy number.

berfungsi mengaktifkan sel APC dan sel B karena

bertujuan untuk mengklona gen Cd40 ligand (Cd40l)

interaksinya dengan CD40 yang terdapat pada

yang tidak mengandung sekuen start codon (ATG)

permukaan sel APC dan sel B [3]. Adjuvan CD40L

dari Mus musculus ke dalam E.coli TOP10

saat

ini


sedang

berusaha

melakukan

Oleh karena itu,

Penelitian

menggunakan vektor pcDNA 3.1 (+).

Hipotesis

penelitian adalah gen CD40 Ligand (Cd40l) yang tidak mengandung sekuen start codon (ATG) dari Mus musculus dapat diklona ke dalam E.coli TOP10 menggunakan vektor pcDNA 3.1 (+).

Tabel 1. Pasangan primer dalam amplifikasi

2. METODOLOGI PENELITIAN

Primer MSCD40L_F1

Amplifikasi dan Purifikasi Fragmen Gen Cd40l dengan Teknik RT-PCR Sintesis

DNA

sisipan

Cd40l

yang

CD40L_R2

menyandi protein CD40L dilakukan melalui proses

Sekuen 5’-AATT AAGCTT-GGA GGA AGTCATAGAAGATTGGATAAGGTC G-3’ 5’-CCCC GAATTC ACTAGTTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAA AG-3’

amplifikasi polymerase chain reactor reverse transcriptase (RT-PCR) menggunakan RNA yang

Purifikasi

amplikon

dilakukan

diekstraksi dari sel PMBC mencit sebagai materi

menggunakan Qiagen PCR Purification Kit [5].

genetik pola cetaknya. Amplifikasi DNA penyandi

Amplikon gen Cd40l hasil purifikasi kemudian

protein CD40L menggunakan reagen One Step RT-

divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarosa

PCR Superscript III/Taq Platinum dan pasangan

0,8 % pada tegangan 100 V selama 30 menit.

primer MSCD40L_F1 dan CD40L_F2 (Tabel 1). Campuran reaksi RT-PCR terdiri atas 25 μl 2x

Isolasi Vektor pcDNA 3.1 (+)

reaction mix, 1 μl primer MSCD40L_F1 10 mM, 1

Isolasi pcDNA 3.1(+) dilakukan dengan

μl primer MSCD40L_F1 10 mM, 1 μl enzim

metode dari QIAGEN [6]. pcDNA 3.1(+) diambil

Superscript III RT/Taq mix, 5 μl RNA , 17 μl

dari replica plate yang ada di IHVCB-UI,

ddH2O. Campuran reaksi dibuat untuk 1 kali reaksi

diinokulasikan ke dalam 50 ml medium LB cair

dengan total volume reaksi yaitu 50 μl. Campuran

yang telah ditambahkan dengan ampisilin sebanyak

reaksi ditempatkan pada tabung microtube 0,2 ml

50 μl. Kultur tersebut kemudian diinkubasi pada

Tabung microtube 0,2 ml yang berisi

suhu 37° C selama 16 jam. Kultur dipindahkan ke

campuran reaksi dimasukkan ke dalam thermal

dalam tabung Falcon 50 ml dan disentrifugasi pada

cycler engine, kemudian dilakukan pengaturan suhu

kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit. Supernatan

optimum berdasarkan protokol superscript III/Taq

yang terbentuk kemudian dibuang secara perlahan-

mix RT-PCR.

lahan. Pelet kemudian dilarutkan dengan larutan P1

Reaksi dilakukan sebanyak 35

siklus. Tahapan sintesis cDNA dilakukan pada suhu o

55 C selama 30 menit, denaturasi awal dilakukan o

(+RNAse)

sebanyak

2,5

ml

dan

campuran

dihomogenkan dengan vorteks. Campuran tersebut

pada suhu 94 C selama 2 menit. Tahap denaturasi

kemudian ditambahkan dengan larutan P2 sebanyak

dilakukan pada suhu 94oC selama 15 detik, tahap

2,5 ml dan dihomogenkan dengan cara tabung

o

annealing pada suhu 55 C selama 30 detik, dan o

dibolak-balik sebanyak 6 kali. Sebanyak 3,5 ml

tahap polimerisasi pada suhu 68 C selama 1 menit.

larutan N3 ditambahkan ke dalam campuran, dan

Polimerisasi akhir pada suhu 68 oC selama 5 menit

dihomogenkan dengan cara dibolak-balik lagi sebanyak 6 kali, kemudian diinkubasi dalam lemari pendingin selama 10 menit 4°C. Campuran


kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000

campuran reaksi digesti dilakukan dalam pada suhu

rpm selama 10 menit dengan suhu 4°C. Supernatan

4oC. Campuran dibuat untuk 2x reaksi. Reaksi

pada falcon yang dihasilkan dipindahkan ke dalam

digesti pertama menggunakan enzim HindIII.

QIAprep Spin Column (QSC) yang pada bagian

Campuran reaksi digesti yang digunakan untuk

bawahnya telah diletakkan sebanyak 850 μl ke

digunakan setiap 1x reaksi adalah sebanyak 10 μl

tabung koleksi, kemudian disentrifugasi selama 1

10X BSA, 10 μl NEB buffer 2, dan 55 μl ddH2O

menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Filtrat yang

dimasukkan ke dalam tabung microtube 1,5 ml.

ada pada tabung koleksi dibuang dan sebanyak 500

Campuran dihomogenasikan dan dispin selama 30

μl buffer PB ditambahkan ke dalam QSC, kemudian

detik. Campuran di aliquot ke dalam dua tabung

disentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000 rpm

microtube 1,5 ml. Sebanyak 20 μl pcDNA 3.1(+)

selama 1 menit. Filtrat yang tertampung di dalam

hasil isolasi dimasukkan ke dalam satu tabung

tabung koleksi dibuang dan sebanyak 750 μl buffer

microtube 1,5 ml pertama dan 20 μl gen Cd40l

PE (+ etanol) ditambahkan ke dalam QSC, lalu

dimasukkan ke tabung microtube 1,5 ml kedua.

tabung disentrifugasi kembali pada kecepatan

Enzim HindIII sebanyak 5 μl dimasukkan ke dalam

12.000 rpm selama 1 menit. Filtrat yang ada pada

setiap

tabung koleksi dibuang dan tabung disentrifugasi

kemudian dihomogenisasi dan dispin. Reaksi

kembali pada kecepatan 12.000 rpm selama 1

digesti dilakukan selama 16 jam pada suhu 37°C

menit. QIAprep Spin Column (QSC) kemudian

untuk vektor dan 1 jam pada suhu 37°C untuk DNA

diletakkan di atas tabung microtube 1,5 ml yang

Cd40l. Hasil restriksi sebanyak 3 μl kemudian

steril dan ditambahkan sebanyak 20 μl buffer EB,

divisualisasikan pada elektroforesis gel agarosa

kemudian didiamkan pada suhu 25oC 1 menit.

0,8% pada tegangan 100 V selama 30 menit. Hasil

Campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan

digesti pertama dengan enzim HindIII, dipurifikasi

12.000 rpm selama 1 menit.

dengan QIAquick Spin Column.

Supernatan pada

campuran

reaksi

digesti.

Campuran

Digesti kedua

falcon dipindahkan kembali sebanyak 850 μl dan

menggunakan enzim EcoRI, dengan cara yang sama

dilakukan langkah yang sama hingga elusi dengan

seperti pada enzim HindIII. Namun, buffer yang

buffer EB sampai supernatant habis. Filtrat yang

dibutuhkan

tertampung

ml

pcDNA 3.1 dan gen Cd40l yang didigesti dengan

merupakan hasil dari proses isolasi vektor pcDNA

EcoRI merupakan DNA yang telah didigesti dengan

3.1(+). Hasil isolasi sebanyak 3 μl tersebut

HindIII sebelumnya.

pada

tabung

microtube

1,5

merupakan

buffer

khusus

EcoRI.

kemudian divisualisasikan pada elektroforesis gel agarosa 0,8% pada tegangan 100 V selama 30 Purifikasi Hasil Digesti pcDNA 3.1(+) dan Gen

menit.

Cd40l dengan QIAquick Spin Column

Digesti gen Cd40l dan DNA Vektor pcDNA

Purifikasi

hasil

digesti

dilakukan

berdasarkan QIAGEN [7]. Sebanyak 95 μl vektor

3.1(+) dengan Enzim HindIII dan EcoRI

pcDNA 3.1(+) dan gen Cd40l hasil digesti diVektor pcDNA 3.1(+) dan gen Cd40l yang

running pada low melting agar (LMA) 1%.

dengan

Sebelumnya agar LMA 1% disiapkan yaitu 1 gr

menggunakan enzim restriksi endonuklease HindIII

LMA powder dilarutkan dalam 100 buffer TAE 1x

dan EcoRI secara sekuensial. Proses pembuatan

sampai volume 100 ml, kemudian dihomogenkan.

telah

dipurifikasi

kemudian

didigesti


Sebanyak 80 μl crystal violet ditambahkan ke

yang terdapat pada microtube 1,5 ml ditutup

dalam larutan LMA.

dengan alumunium foil dengan posisi agak terbuka

Larutan dituang ke dalam setelah

dan diinkubasi pada heatblock pada suhu 50oC

mengeras

selama 30 menit. Hasil purifikasi divisualisasi pada

tangki

gel agarosa 0,8% pada tegangan 100 V selama 30

elekroforesis yang telah diisi buffer TAE 1x.

menit. Konsentrasi DNA diukur menggunakan alat

Kertas parafilm disiapkan sebagai tempat untuk

spektrofotometer ThermoScientific Nanodrop 2000

mencampur DNA dengan loading buffer crystal

Spectrophotometer.

cetakan

gel

yang telah diberi sisir

mendingin.

Gel

LMA

yang telah

kemudian

dimasukkan

ke

dalam

violet 6x. Sebanyak 6 μl loading buffer 6x ditambahkan dengan 100 μl DNA. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam sumur pada gel.

Ligasi Gen Cd40l ke dalam Vektor pcDNA 3.1(+)

Gel LMA yang mengandung DNA dipotong Reaksi ligasi gen Cd40l ke dalam vektor

kemudian dimasukkan dalam eppendorf 1,5 ml dan

pcDNA 3.1(+) dilakukan berdasarkan Sambrook &

ditimbang. Potongan gel ditambahkan QXI dengan

Russel [8].

Perbandingan molar antara pcDNA

volume sebanyak 3x berat gel, 10 μl natrium asetat,

3.1(+) dan gen Cd40l adalah 1:3.

dan 10 μl QIAEXII.

pembuatan campuran reaksi ligasi dilakukan di es,

Campuran dihomogenkan

dengan cara divorteks, kemudian diinkubasi pada suhu 50oC selama 30 menit.

Selama proses

inkubasi campuran dibolak balik 6--7 kali setiap 2 menit. Campuran kemudian disentrifugasi 12.000 rpm selama 1 menit, supernatan yang terbentuk dibuang. Pelet selanjtnya dicuci menggunakan PE (+Etanol)

sebanyak

500

μl.

Campuran

disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit, supernatan dibuang.

Pelet

dilarutkan kembali dengan 500 μl PE (+Etanol),

Proses

pada suhu 4oC. Campuran reaksi terdiri atas 15,1 μl ddH2O, 1 μl DNA vektor, 0,9 μl DNA target, 2 μl 10x buffer ligasi, dan 1 μl enzim T4 ligase. Kontrol ligasi dibuat dengan campuran yang sama, akan tetapi tidak ditambahkan DNA sisipan. Campuran

reaksi

ligasi

tersebut

kemudian

diinkubasi selama 16 jam pada suhu 16°C. Hasil reaksi ligasi kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli TOP10 yang telah dijadikan kompeten terlebih dahulu.

sentrifugasi 12.000 rpm, 1 menit, supernatan dibuang. Elusi dilakukan dengan menambah buffer

Pembuatan Sel Kompeten dan Transformasi ke

EB sebanyak 20 μl ke dalam microtube yang berisi

dalam E. coli TOP10

pelet, homogenisasi dengan vorteks, kemudian diinkubasi selama 1 menit pada suhu 25 oC.

Sel kompeten dibuat berdasarkan metode

Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000

Ausubel dkk. [9]. Sebanyak 100 μl kultur E. coli

rpm selama 1 menit, supernatan dipindahkan ke

TOP10 yang telah diinkubasi selama 16 jam

dalam microtube 1,5 ml steril. Pelet ditambahkan

diinokulasikan ke dalam 20 ml medium LB cair

kembali dengan buffer EB 20 μl, homogenisasi

steril. Kultur diinkubasi dalam shaker incubator

dengan vorteks, kemudian inkubasi pada suhu 25 oC

pada suhu 37°C selama 2,5 jam. Kultur kemudian

selama 5 menit.

diinkubasi di dalam es selama 15 menit. Hasil

Campuran disentrifugasi pada

kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Supernatan

inkubasi

selanjutnya

disentrifugasi

dengan

dipindahkan lagi ke microtube 1,5 ml. Supernatan

kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi


dengan 4 ml 0,1 M MgCl2 dingin. Hasil resuspensi

Isolasi DNA Rekombinan pcDNA 3.1(+) - Cd40l

kembali diinkubasi di dalam es selama 15 menit, Isolasi

kemudian disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi kembali dibuang dan pelet diresuspensi dengan 400 μl 0,1 M CaCl2 dingin.

DNA

rekombinan

dilakukan

dengan menggunakan QIAprep spin Miniprep kit berdasarkan

QIAGEN

[6].

Hasil

isolasi

divisualisasi menggunakan gel agarosa 0,8%.

Hasil resuspensi diinkubasi di dalam es selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada suhu 4°C dengan

Verifikasi DNA rekombinan dengan teknik PCR

kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit. Supernatan Koloni rekombinan yang menunjukkan

kembali dibuang dan pelet diresuspensi dengan 200 μl CaCl2 dingin.

hasil positif pada PCR koloni kemudian yang

Proses transformasi dilakukan berdasarkan

tumbuh dari hasil transformasi diverifikasi dengan

sebanyak 4 tabung

teknik PCR. Verifikasi PCR menggunakan primer

microtube 1,5 ml steril disiapkan terlebih dahulu,

dari pcDNA 3.1(+) yaitu CMV_F dan BHG_R.

kemudian tiap microtube ditambahkan 50 μl sel

Campuran reaksi untuk satu koloni yaitu 1 μl buffer

kompeten

DNA

dream taq 10x, 0,4 μl MgCl 50mM, 0,05 μl primer

tabung

CMV_F 20 μM, 0,05 μl primer BHG_R 20 μM, 0,2

microtube (tabung 1). Sebanyak 5 μl kontrol ligasi

μl dNTPs 10 mM, 1 μl enzim dream taq, 7,3 μl

dimasukkan ke dalam tabung 2 dan sebanyak 1 μl

ddH2O, dan DNA template yang diambil dari plate

vektor pcDNA 3.1(+) wild type dimasukkan ke

hasil

dalam tabung 3. Kontrol negatif terhadap proses

sebanyak 30 siklus dengan kondisi sebagai berikut:

transformasi menggunakan sel kompeten TOP10

tahap denaturasi awal dilakukan pada suhu 95oC

saja tanpa dicampur dengan pcDNA 3.1(+) (tabung

selama 5 menit kemudian dilanjutkan dengan tahap

4). Keempat tabung microtube tersebut diinkubasi

denaturasi pada suhu 95oC selama 15 detik. Tahap

di es selama 1 jam lalu dikejutpanaskan dalam air

annealing dilakukan pada suhu 55oC selama 30

hangat

detik, kemudian tahap polimerisasi awal pada suhu

Sambrook & Russel [8].

TOP10.

rekombinan

38°

Sebanyak

dimasukkan

C

selama

ke

90

5

μl

dalam

detik,

kemudian

dimasukkan kembali ke dalam es selama 60 detik,

72oC

transformasi.

selama

1

Reaksi

menit,

PCR

dilakukan

ditambahkan

tahap

o

dan diletakkan pada suhu ruang 25oC. Medium

polimerisasi akhir pada suhu 72 C selama 5 menit.

SOC yang sudah dicairkan pada suhu 37°C

Hasil PCR divisualisasi dengan gel agarosa 0,8%

ditambahkan ke dalam keempat tabung tersebut

100 V selama 30 menit.

sebanyak 200 μl. Kultur kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 37°C selama 1 jam. Masing-masing kultur kemudian diinokulasikan ke dalam medium

Verifikasi DNA Rekombinan Dengan Teknik Digesti Menggunakan Enzim HindIII

LB padat yang mengandung ampisilin. Kultur

DNA rekombinan yang menunjukkan hasil

kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 16

positif pada PCR koloni selanjutnya diisolasi

jam.

dengan QIAminiprep kit dari QIAGEN.

Hasil

isolasi selanjutnya diverifikasi dengan teknik digesti (linearisasi) menggunakan enzim HindIII. Alat-alat yang akan digunakan disiapkan dalam


keadaan

steril

dan

penyiapan

bahan-bahan

Produk

amplifikasi

dipurifikasi

atau

dilakukan dalam keadaan dingin. Kemudian bahan-

dimurnikan dari kontaminan dan dianalisis pada

bahan tersebut dimasukkan ke tabung microtube 1,5

elektroforesis gel agarosa 0,8% menggunakan

ml, masing-masing berurutan NEB2 1 μl, 10X BSA

marka DNA mix ladder memperlihatkan adanya

1 μl, dan ddH2O 4,7 μl, lalu ditambahkan juga

pita DNA yang cukup tebal yang bermigrasi antara

enzim HindIII sebanyak 0,3 μl. Campuran reaksi

600-700 pb, sesuai dengan panjang pita DNA

digesti ditambahkan 3 μl DNA rekombinan ke

Cd40l dari Mus musculus yang diharapkan, yaitu

dalam masing campuran, kemudian dilakukan spin.

sebesar 644 pb. Ukuran tersebut berdasarkan pada

o

Selanjutnya, campuran diinkubasi pada suhu 37 C

data

selama 1 jam. Visualisasi dilakukan menggunakan

NM_011616.2

elektroforesis gel agarosa 0,8% pada tegangan 100

(Cd40lg), mRNA), coding sequence dan tempat

V selama 30 menit. pcDNA 3.1(+) wildtype juga

pelekatan primer yaitu terletak pada basa ke 151--

didigesti sebagai kontrol.

795 bp (644 bp). Hasil analisis produk Purifikasi

GeneBank

dengan

(Mus

accession

musculus

number

CD40

ligand

amplifikasi gen Cd40l dapat dilihat pada Gambar1. Sekuensing DNA Rekombinan dan Analisis Hasil Sekuen Sekuensing dilakukan menggunakan alat dari

Applied

Biosystem

Hitachi.

Pengerjaan

sekuensing tersebut dilakukan oleh staff peneliti di IHVCB-UI, Salemba. Hasil sekuensing berupa elektroferogram selanjutnya diubah dalam format fasta untuk kemudian dilakukan nucleotide BLAST (BLASTN)

dan

BLASTX

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

pada dan

situs mengacu

pada petunjuk manual dalam situs tersebut.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN Gambar 1. Hasil purifikasi PCR DNA Cd40l Sintesis DNA sisipan penyandi protein CD40L atau gen Cd40l dilakukan melalui proses

DNA sisipan Cd40l yang telah dipurifikasi

amplifikasi polymerase chain reactor reverse

kemudian didigesti dengan enzim restriksi HindIII

transcriptase (RT-PCR) menggunakan RNA yang

dan EcoRI secara sekuensial.

diekstraksi dari sel PBMC mencit sebagai materi

ditambahkan pada ujung 5’ primer pada tahap awal

genetik pola cetaknya. Amplifikasi DNA penyandi

desain primer karena tidak akan memotong

protein CD40L menggunakan reagen One Step RT-

fragmen gen yang akan diklona ke dalam vektor

PCR Superscript III/Taq Platinum dan pasangan

dan fragmen yang telah diamplifikasi dapat

primer

disisipkan ke dalam Multiple Cloning Site (MCS)

MSCD40L_F1

dan

CD40L_F2,

dilakukan pada suhu annealing 55°C.

serta

pada

vektor

pengklonaan.


pcDNA Enzim

3.1

(+)

HindIII

Enzim restriksi

untuk dengan

proses situs

pemotongan A|AGCTT dan Enzim EcoRI dengan situs

pemotongan

G|AATTC

sama-sama

menghasilkan ujung tidak rata (Gambar 2).

Vektor plasmid pcDNA 3.1(+) digunakan dalam penelitian karena bersifat high copy number [8]. Visualisasi hasil isolasi vektor pcDNA 3.1(+)

Hasil digesti kemudian dipurifikasi dari

pada gel agarosa 0,8% memperlihatkan tiga

gel dengan menggunakan QIAEX purification kit

topologi yang berbeda berdasarkan kecepatan

dari QIAGEN.

migrasinya (Gambar 4) [11].

Purifikasi gel LMA dengan

Berdasarkan

penggunaan crystal violet memberikan keuntungan

topologinya, bentuk supercoiled paling cepat

antara lain mencegah kerusakan DNA (DNA

sehingga berada pada bagian paling bawah pada gel

damage) yang disebabkan paparan UV apabila

(huruf C), diikuti bentuk linear (huruf B) dan

tidak menggunakan crystal violet.

nicked circle (huruf A). Pengukuran konsentrasi

Penggunaan

crystal violet memungkinkan visualisasi migrasi

hasil isolasi vektor pcDNA 3.1(+)

dilakukan

DNA tanpa menggunakan UV. Purifikasi gel LMA

menggunakan nanodrop. Konsentrasi vektor yang

bertujuan untuk memastikan pengotor berupa enzim

dihasilkan yaitu 1032,8 ng/μl dengan kemurnian

dan garam yang akan mengganggu dalam proses

A260/A280 sebesar 1,88.

kloning dapat dihilangkan [7][10]. Visualisasi pada gel agarose 0,8% menunjukkan terbentuknya pita tunggal bermigrasi pada ukuran yang diinginkan (644 bp) (Gambar 3). Konsentrasi DNA hasil purifikasi gel DNA Cd40l - HindIII- EcoRI yaitu sebesar 40,3 ng/μl dengan kemurnian pada panjang gelombang A260/A280 yaitu 1,9.

Gambar 2. Skema pemotongan fragmen gen Cd40l Gambar 4. Isolasi vektor pcDNA 3.1 (+)

Vektor hasil isolasi didigesti menggunakan HindIII dan EcoRI. Analisis pada gel agarosa 0,8% dengan marka DNA mix ladder dan pcDNA 3.1(+) wild

type

sebagai

kontrolnya

menunjukkan

terbentuknya pita tunggal DNA yang bermigrasi lebih lambat dibandingkan wild type berukuran 5.428 pb (gambar 5; lajur 3) menunjukkan plasmid yang terlinearisasi. Konsentrasi hasil purifikasi gel Gambar 3. Hasil LMA Digesti gen Cd40l dengan HindIII dan EcoRI

LMA digesti plasmid pcDNA 3.1(+) dengan enzim HindIII dan EcoRI yaitu sebsar 100,4 ng/μl dengan kemurnian


yaitu

1,89.

Gambar 5. Digesti dan hasil purifikasi digesti vektor pcDNA 3.1(+)

DNA Cd40l dan vektor pcDNA 3.1(+)

wild type dengan konsentrasi 10 ng/μl, dan kontrol

yang telah didigesti dan dipurifikasi selanjutnya

negatif

diligasi dengan menggunakan enzim T4 DNA

kompeten. Metode heat shock dapat menghasilkan

ligase. Nilai rasio molar antara DNA vektor dengan

nilai efisiensi sebesar 105--106 cfu/μg DNA

DNA sisipan yang digunakan dalam penelitian

(Sambrook & Russel 2001: 1.24).

yaitu 1:3. Jumlah molekul DNA sisipan yang lebih

transformasi dapat dihitung dari jumlah colony

banyak dibandingkan dengan DNA vektor akan

forming unit per μg DNA yang ditambahkan [13].

meningkatkan frekuensi atau peluang ligasi DNA

Hasil

sisipan ke dalam vektor [12].

menunjukkan efisiensi yang tinggi yaitu sebesar

Kontrol ligasi

digunakan dalam penelitian untuk mengetahui

transformasi

perhitungan

yaitu

hanya

efisiensi

berisi

sel

Efisiensi

transformasi

8,25 x 105 cfu/μg.

adanya DNA vektor yang mengalami resirkulasi.

Pertumbuhan bakteri terlihat berupa koloni

Kontrol negatif ligasi merupakan vektor pcDNA

putih pada plate sebaran hasil ligasi pcDNA 3.1(+)-

3.1 (+) linear yang direaksikan dengan enzim T4

Cd40l, menunjukkan keberhasilan ligasi. Namun

DNA ligase tanpa penambahan DNA sisipan. Hasil

demikian, perlu verikasi lebih lanjut apakah koloni

ligasi DNA Cd40l ke dalam pcDNA 3.1 (+) akan

yang tumbuh membawa DNA sisipan Cd40l.

menghasilkan DNA rekombinan sebesar 6072 pb,

Koloni putih juga tumbuh pada kontrol positif

gabungan antara DNA vektor sebesar 5428 pb dan

transformasi, yaitu pcDNA 3.1(+) wildtype (10

DNA sisipan 644 pb.

ng/μl).

Hasil ligasi dan kontrol

Kontrol negatif transformasi yang hanya

negatif ligasi kemudian sama-sama ditransformasi

berisi

ke dalam sel inang.

menunjukkan pertumbuhan sama sekali.

sel

kompeten

E.

coli

TOP10

tidak Hasil

Transformasi yang dilakukan meliputi

tersebut menandakan tidak terjadi kontaminasi

hasil ligasi pcDNA3.1(+)- Cd40l, kontrol negatif

selama proses transformasi [8]. Hasil transformasi

ligasi, kontrol positif yaitu vektor pcDNA 3.1 (+)

dapat

dilihat


pada

gambar

6,

sedangkan

perhitungan koloni yang tumbuh dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Perhitungan hasil transformasi

Gambar 6. Hasil transformasi pcDNA 3.1(+)-Cd40l ke dalam E.coli TOP10

Verifikasi dilakukan

koloni

dengan

hasil

sebesar 644 pb. Hasil analisis pada gel agarosa

menggunakan enzim Dream Taq polymerase untuk

0,8% menggunakan marka DNA mix ladder

membuktikan

3.1(+)

menunjukkan adanya pita DNA pada lajur 1--3, 6,

membawa DNA sisipan merupakan Cd40l atau

dan 12 yang bermigrasi pada ukuran sekitar 900 pb.

lainnya.

Hasil

vektor

PCR

terletak antara situs restriksi HindIII dan EcoRI

dengan

apakah

teknik

transformasi

pcDNA

Amplifikasi menggunakan pasangan

tersebut

sesuai

dengan

ukuran

yang

primer vektor yaitu CMV_F dan BHG_R, sehingga

diharapkan yaitu sebesar 915 pb.

akan mengapit daerah vektor yang membawa DNA

agarosa 0,8% hasil amplifikasi PCR koloni

sisipan. Skema amplifikasi verifikasi rekombinan

rekombinan dapat dilihat pada gambar 8. Hasil

dapat dilihat pada gambar 7.

positif

Berdasarkan skema letak DNA sisipan Cd40l, koloni yang membawa sisipan akan

verifikasi

PCR,

Visualisasi

menunjukkan

adanya

kandidat plasmid yang membawa DNA sisipan Cd40l pada koloni 1--3, 6, dan 12.

berukuran 915 pb, hasil dari amplifikasi daerah vektor sebesar 271 pb dan DNA sisipan Cd40l yang


hasil digesti yaitu sebesar 6072 pb, hasil jumlah dari ukuran plasmid pcDNA 3.1(+) sebesar 5428 pb dan DNA sisipan Cd40l sebesar 644 pb.

Hasil

digesti rekombinan bermigrasi diantara marka DNA berukuran sekitar 6000 pb, sesuai dengan ukuran plasmid rekombinan yang diharapkan yaitu 6072 pb. Hasil tersebut menunjukkan ukuran plasmid rekombinan yang lebih besar dan membawa DNA sisipan yaitu Cd40l.

Gambar 7. Skema amplifikasi koloni rekombinan pcDNA 3.1 (+)-Cd40l

Gambar 8. PCR koloni pcDNA 3.1(+)-Cd40l

Gambar 9. Isolasi dan verifikasi digesti plasmid rekombinan pcDNA 3.1(+)-Cd40l

Koloni rekombinan no. 1 dan 2 yang menunjukkan hasil positif pada PCR koloni selanjutnya diisolasi menggunakan QIAminiprep kit dari QIAGEN.

Hasil isolasi diverifikasi dengan

cara dilinearisasi menggunakan enzim HindIII untuk mengetahui ukuran plasmid rekombinan. Visualisasi gel agarosa 0,8% hasil isolasi dan digesti plasmid rekombinan dapat dilihat pada gambar 9. Analisis pada gel agarosa 0,8% dengan marka DNA mix ladder menunjukkan adanya migrasi yang lebih lambat pada hasil isolasi plasmid

rekombinan

koloni

no.

1

dan

2

dibandingkan plasmid pcDNA 3.1(+) wildtype. Hal tersebut menunjukkan ukuran plasmid rekombinan koloni no.1 dan 2 lebih besar dibandingkan wildtype dan membawa DNA sisipan (gambar 4.11;

Plasmid rekombinan pcDNA 3.1(+) koloni 2 yang memberikan hasil positif pada verifikasi PCR dan digesti, selanjutnya diverifikasi dengan metode sekuensing.

Sekuensing bertujuan untuk

mengetahui urutan nukleotida rekombinan. Selama proses amplifikasi ataupun pengklonaan fragmen DNA Cd40l memungkinkan terjadinya perubahan basa atau mutasi, sehingga diperlukan analisis lebih lanjut melalui sekuensing. Primer yang digunakan adalah pasangan primer dari vektor pcDNA 3.1(+), yaitu CMV_F dan BHG_R. Hasil sekuensing berupa elektroferogram, yaitu hasil analisis yang menampilkan grafik peak yang mewakili basa nukleotida hasil pembacaan mesin sequencer. Peak tersebut diterjemahkan menjadi

lajur 1 dan 2). Panjang basa yang diharapkan dari


basa-basa nitrogen untuk memudahkan analisis sekuen dengan program BLASTN. Hasil

elektroferogram

Hasil sekuensing juga dianalisis melalui program

memperlihatkan

BLASTN

pada

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.

situs program

916 basa yang terbaca. Sekuen Cd40l terbaca pada

BLASTN membandingkan sekuen nukleotida yang

elektroferogram, yaitu pada basa ke 200 sampai

di-upload ke situs GeneBank (query) dengan

basa ke 844. Hasil tersebut kemudian digunakan

sekuen pada database [14]. Hasil alignment sekuen

dalam analisis alignment menggunakan software

klona dengan data pada gene bank ditunjukkan

bioedit. Aligment dilakukan untuk membandingkan

pada gambar 11. Analisis BLASTN menunjukkan

dan mengetahui similaritas sekuen hasil kloning

bahwa sekuen Cd40l yang diklona ke dalam

dengan sekuen acuan yang telah diunduh dari

pcDNA 3.1(+) memiliki persentase kemiripan

GeneBank

(maximum identity) sebesar 100% dengan sekuen

dengan

NM_011616.2

(Mus

nomor

akses

musculus

GeneBank

CD40

ligand

acuan Mus musculus CD40 ligand (Cd40lg) mRNA,

(Cd40lg), mRNA) . Hasil alignment menunjukkan

complete cds. (Tabel 2). Menurut Hall [15],

hasil kloning homolog dengan sekuen acuan.

semakin besar persentase identity suatu sekuen

Primer Cd40l yang mengandung enzim restriksi

dengan sekuen lain menunjukkan bahwa sekuen

HindIII dan EcoRI terlihat pada hasil sekuensing,

tersebut

menunjukkan DNA sisipan yang berhasil diklona

Presentasi identity sebesar 100% menunjukkan

ke dalam pcDNA 3.1(+) (Gambar 10).

semua basa hasil klona identik dengan sekuen

memiliki

kemiripan

yang

acuan.

Gambar 8. Analisis sekuensing pcDNA 3.1(+)-Cd40l menggunakan software bioedit


tinggi.

Tabel 2. Hasil analisis BLAST-N

Gambar 11. Hasil alignment sekuen klona Cd40l Mus musculus dengan sekuen pada GeneBank


is needed to stimulate maximal T cell

4. KESIMPULAN Gen Cd40l dari sel PMBC mencit telah berhasil diklona ke dalam sel inang Escherichia coli TOP10 menggunakan vektor ekspresi pcDNA 3.1 (+). Gen hasil klona Cd40l tidak mengandung sekuen start codon (ATG), memiliki similaritas sebesar 100% dengan sekuen acuan pada GeneBank yaitu Mus musculus CD40 ligand (Cd40lg), mRNA, coding sequence dengan accession number NM_011616.2

responses in the absence of CD4+ T cell help. The Journal of Immunology 178: 2844-52. [4] Stone, G.W., S. Barzee, V. Snarsky, K. Kee, C.A. Spina, X.F. Yu, & R.S. Kornbluth. 2006. Multimeric soluble CD40 ligand and GITR ligand as adjuvants for human immunodeficiency virus DNA vaccines. Journal of Virology 80(4): 1762-72. [5] QIAGEN. 2002. QIAquick® Spin Handbook. QIAGEN Distributor, Singapura: 36 hlm.

UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih diberikan kepada Dr. dr.

[6] QIAGEN. 2006. QIAprep® Miniprep Handbook: For purification of molecular

Budiman Bela, Sp.MK dan DR. Abinawanto atas

biology grade DNA. QIAGEN Distributor,

bimbingannya. Terlebih kepada Institute Human

Indonesia: 54 hlm.

Virology and Cancer Biology University of

[7] QIAGEN. 2008b. QIAEX® Handbook: For

Indonesia (IHVCB-UI) selaku lembaga pemegang

DNA extraction from agarose and

proyek, penyediaan tempat, alat, dan bahan bagi

polyacrilamide gels and for desalting and

berlagsungnya penelitian ini. Kepada dr. Fera

concentrating DNA from solution.

Ibrahim, M.Sc, Ph.D. selaku kepala laboratorium

QIAGEN Distributor, Australia: 24 hlm.

IHVCB-UI, serta seluruh jajaran dosen Biologi

[8] Sambrook, J. & D.W. Russell. 2001. Molecular

FMIPA UI atas masukan dan pembelajaran

cloning: A laboratory manual, vol 1. 3rd

sehingga penelitian ini menjadi lebih baik lagi.

ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York: xxvii + 1.1--7.94 hlm.

DAFTAR ACUAN

[9] Ausubel, M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. seidman, J.A. Smith &

[1] Murphy, K., P. Travers, & M. Walport. 2008.

K. Struhl. 2003. Current protocols in

Immunobiology. 7th ed. Garland

molecular biology. John Wiley &

Science, New York: 494 hlm.

Sons, Inc., New York: xii + xiii +

[2] Pietravalle, F., S.L. Henchoz, H. Blasey, J.P. Aubry, G. Elson, M.D. Edgerton,

29B.1.17 + A.1K.26 hlm. [10] Invitrogen. 2012. S.N.A.P UV gel purification

J.Y. Bonnefoy, & J.F. Gauchat. 1996.

kit. www.invitrogen.com/1/1/10556-s-n-a-

Human native soluble CD40L is a

p--uv-gel-purification-kit.html. 18

biologically active trimer, processed inside

November 2012. pk. 14.15.

microsomes. The Journal of Biological Chemistry 271(11): 5965-5967. [3] Maria, G.H., L. Shen, & K.L. Rock. 2007. CD40-CD40L ligand interaction between dendritic cells and CD8+ T cells

[11] Dellis, S. 2004. Understanding plasmid DNA. 5 hlm. http://www.cofc.edu/~delliss/ virtuallabbook/ PreLabReadings/Ex6.html. 20 . September 2010, pk.19.30. [12] Knoche, K. & D. Kephart. 1999. Cloning


blunt-end pfu DNA polymerase generated PCR fragment into pGEM-T vector system. Promega Notes 71: 10--14. [13] Dower, W.J.F., F. Miller & C.W. Ragsdale. 1988. High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research 16(13): 6127-6145. [14] Hughes, A.E. 1993. Sequence database and the internet. Method in Molecular Biology 167: 215--223. [15] Hall, B.E. 2001. Phylogenetic trees made easy: A how to manual for molecular biologists. Sinauer Associates, Inc., Massachusetts : 179 hlm.


PENGKLONAAN GEN Cd40 ligand (Cd40l) Mus musculus KE DALAM Escherichia coli TOP10

Recommend Documents