Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
ANALISIS EKSPRESI KLON GEN CVPDr DALAM SEL Escherichia coli A.A. Putu Sri Mahayani UNTAG Surabaya
[email protected]
ABSTRACT The effort to control CVPD was done, but it did not fulfil the expectation properly. One of the new approach to control the CVPD plant diseases were genetics approach expedient i.e. by isolating and resistant gene cloning or resistant against CVPD. Jeruk kingkit was far family of citrus plant which was resistant to CVPD. One of genetics transformation technique by Agrobacterium vector , have been isolated and cloned from DNA fragments successfully that were contain genes for resistance against CVPD disease (CVPDr gene) from Triphasia trifolia (Jeruk kingkit). Those DNA fragments were cloned in plasmid of pUC18 vector and were cared in the Escherichia coli JM109 cell, so that this research aims to detect CVPDr gene expression in the Escherichia coli JM109 cell, to compare CVPDr gene expression in the Escherichia coli JM109 cell with proteins which were isolated from T. trifolia and Siamese citrus. The bacteria were cultivated at liquid LB medium by adding agarose gel 1.5 g that contain ampicillin 100 ppm, and those bacteria were cultured at agarose gel LB medium that contain ampicillin 100 ppm. Colonies of growth bacterium were taken to be isolated their plasmids with the DNA agarose gel electrophoresis 1%. Obtainable DNA were cut by restriction enzymes endonuclease EcoRI and BamHI. Bacteria proteins were compared with the citrus plan proteins. Protein molecules which were yield from CVPDr gene cloning in the Escherichia coli JM109more or less 17 kDa its large. The similar large molecules exist at the sample proteins which were isolated from T. trifolia (Jeruk kingkit) . Kata kunci: Bakteri Escherichia coli JM109, CVPD, Jeruk kingkit., T. trifolia.
PENDAHULUAN Di Indonesia penyakit yang menimbulkan kerusakan dan kerugian tanaman jeruk yang paling penting adalah CVPD (Setiawan dan Trisnawati, 1999). CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration) merupakan penyakit terpenting dan penyebab utama kehilangan hasil perkebunan jeruk di hampir semua negara terutama Asia dan Afrika. CVPD disebabkan oleh bakteri gram negatif Liberobacter asiaticum yang ditularkan serangga
vektor Diaphorina citri (Subandiyah, 2001) . Gejala khas CVPD adalah daun terlihat menguning dengan tulangtulang daun menjadi lebih hijau. Daun tidak dapat berkembang dengan baik sehingga daun menjadi lebih kecil, buah menjadi kecil-kecil, keras, dan kulitnya menjadi menguning. Daun tanaman yang terserang CVPD mengalami klorosis dengan gejala menyerupai defisiensi unsur nitrogen, seng, mangan dan zat besi (Setiawan dan Trisnawati, 1999). Penyebab penyakit CVPD awalnya diperkirakan adalah virus. Sejalan dengan perkembangan
ISSN 2302-2612
33
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
penguasaan ilmu dan teknologi serta penelitian lebih lanjut tentang penyebab penyakit CVPD, diketahui bahwa penyebab penyakit CVPD adalah bakteri (Sandrine et al., 1996). Berdasarkan analogi terhadap MLO, penyebab CVPD disebut BLO (bacterium like organism) atau GO (greening organism) (Nakashima et al., 1996). Kondisi lingkungan pertanaman jeruk di Indonesia yang beragam, diduga dapat menyebabkan mutasi dan variasi genetik pada bakteri CVPD, karena mutasi dan variasi genetik pada makhluk hidup dapat dipengaruhi lingkungan (Gardner, 1991), sehingga pengendalian CVPD dilakukan terhadap vektor dan patogen. Pengendalian vektor dilakukan dengan menggunakan insektisida dan pengendalian hayati. Pengendalian patogen pada pohon terinfeksi dilakukan dengan injeksi tanaman dengan antibiotik seperti tetrasiklin hidroklorida, pemotongan bagian tanaman bergejala, pembongkaran tanaman sakit dan menggantinya dengan tanaman sehat (Da Graca, 1991). Semua tanaman jeruk budidaya rentan terhadap serangan penyakit CVPD. Berbagai usaha pengendalian telah dilakukan tetapi belum memberi harapan yang memadai, salah satu pendekatan baru dalam usaha pengendalian penyakit CVPD adalah upaya pendekatan secara genetik yaitu dengan mengisolasi dan mengklon gen ketahanan terhadap CVPD (Wirawan & Subandiyah, 2000). Fragmen DNA tersebut diklon dalam plasmid vektor pUC18 dan dipelihara dalam sel E. coli JM109. Klon plasmid rekombinan itu disebut pWR27 (Wirawan et al., 1998). Jeruk kinkit (Triphasia trifolia) berasal dari Cina. Di Indonesia di tanam di pekarangan mempunyai daun majemuk ganda tiga, anak daun berbentuk bulat telur, tepinya beringgit, pada ketiak daun terdapat duri lurus, agak panjang, bunga
berwarna putih berbau harum. Buah buni, berongga tiga masing-masing berisi satu biji pipih (Anonim, 1988). Hasil penelitian Wirawan & Subandiyah (2000) menunjukkan bahwa tanaman jeruk kinkit menunjukkan tanda potensial sebagai tanaman yang tahan terhadap serangan penyakit CVPD, sedangkan jeruk siam tidak tahan CVPD. Beberapa jenis tanaman daun jeruk terserang CVPD dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1.
Beberapa Jenis Daun Jeruk a. Daun jeruk siam tersera ng CVPD (sakit) b. Daun jer uk sia m tida k terserang CVPD (sehat) c. Daun jeruk kink it Bakteri Escherichia coli digunakan dalam kloning sebagai organisme inang untuk rekombinan molekul DNA. Salah satu langkah dalam kloning adalah pemulihan vektor. Vektor adalah wahana dimana DNA asing dipindahkan ke organisme inang baru dan dapat diekspresikan dari DNA asing di dalam inang baru (Brown, 1991). Molekul DNA sel E. coli hampir 1000 kali lebih panjang dari selnya sendiri dan karenanya harus betulbetul berlipat untuk dapat masuk ke dalam badan inti yang biasanya berukuran 1 mm. Dinding luar sel E. coli dilapisi oleh selongsong atau kapsul yang terbentuk dari senyawa berlendir (Sambrook et al., 2001). Bakteri E. coli biasanya hidup pada usus pencernaan manusia dan hewan berdarah panas. Pertumbuhannya membutuhkan zat makanan berupa unsur bahan organik seperti karbon, hidrogen, nitrogen,
ISSN 2302-2612
34
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
fosfor, belerang, oksigen, ion anorganik seperti kalium, natrium, besi, magnesium, kalsium klorida, dan vitamin. Kebutuhan gizi dan sumbersumber energi metabolik pada berbagai bakteri sangat beragam. Bakteri yang sedang tumbuh salah satu unsur tersebut harus ada. Ciri khas bakteri E. coli antara lain kemampuan perlekatan pada sel inang dan invasi sel pada jaringan inang (Jawetz et al., 1996). Faktor pertumbuhan adalah suatu senyawa organik yang harus ada dalam sel supaya sel tersebut dapat tumbuh, tetapi sel tidak dapat mensintesisnya. Faktor-faktor yang harus diperhatikan selama pertumbuhan bakteri E. coli adalah zat makanan, pH, suhu, udara, serta adanya ion-ion anorganik (Sambrook et al., 2001).
MATERI DAN METODA Penelitian ini nenggunakan metode survei dan test yang dilakukan terhadap obyek dan penelitian. Adapun rancangan prosedurnya dibuat sebagai berikut ini : 1. Pengambilan sample terhadap daun jeruk kinkit dan daun jeruk siam. 2. Dilakukan uji di labolatrium bioteknologi pertanian jurusan hama dan penyakit tumbuhan fakultas pertanian universitas Udayana Denpasar . 3. Dari hasil labolatrium kita dapat mengetahui bahwa daun jeruk kinkit tahan terhadap serangan CVPD
PEMBAHASAN
Gambar 2. Kerangka Konsep Penelitian
Pembiakan Bakteri Hasil pembiakan bakteri E. coli JM109 yang membawa gen CVPD r yang diklon pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli JM109 dapat terlihat dengan tumbuhnya koloni pada media LB agar yang mengandung 100 ppm ampicillin. Koloni-koloni yang tumbuh merupakan gen CVPD r yang diklon pada pUC18 dalam sel E. coli JM109 (pWR27). Bakteri tersebut membawa plasmid yang menyandi gen tahan terhadap ampicillin. Koloni-koloni yang tumbuh merupakan pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli JM109. pUC18 merupakan vektor kloning membawa paling sedikit satu gen yang memberikan resistensi terhadap ampicillin pada sel tuan rumah dan seleksi untuk transformasi dengan menanam sel pada medium agar yang mengandung ampicillin (Brown, 1991). Bakteri dapat ditumbuhkan tanpa banyak kesulitan karena campuran nutrien penting yang seimbang pada konsentrasi yang tepat dan penggunaan antibiotik yang sesuai menyebabkan bakteri tersebut
ISSN 2302-2612
35
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
tumbuh. Bakteri E. coli adalah bakteri berbentuk batang dengan ukuran panjang 1 – 3 mm serta lebar 0,4 – 0,7 mm, bersifat gram negatif, tidak berkapsul, dapat bergerak aktif karena mempunyai flagela peritrik, bersifat aerob. Suhu untuk pertumbuhan berkisar 4 0 C-46 0 C dengan suhu optimum 37 0 C. Sedangkan pH optimum untuk pertumbuhan adalah 7,0 – 7,5 (minimum 4,0 dan maksimum 8,5). Bakteri E. coli relatif peka terhadap suhu dan pemanasan (Jawetz et al., 1996). Isolasi DNA Plasmid Bakteri Hasil isolasi DNA plasmid bakteri E. coli JM109 yang r mengandung gen CVPD yang diklon pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli JM109 dapat terlihat dengan terbentuknya pita DNA pada elektroforesis 1 % agarose. Hal ini menunjukkan bahwa memisahnya kedua jenis DNA yaitu DNA plasmid dan DNA kromosom bakteri yang besar jumlahnya terdapat dalam sel. Plasmid yang paling besar ukurannya hanya 8% ukuran kromosom E. coli dan kebanyakan plasmid lebih kecil dari ukuran tersebut, oleh karena itu pemecahan sel harus dilakukan dengan pelan-pelan untuk mencegah pemecahan DNA bakteri secara menyeluruh (Brown, 1991). Kebanyakan plasmid terdapat dalam bentuk molekul DNA berunting rangkap. Kedua unting DNA merupakan lingkaran utuh, molekulnya digambarkan sebagai CCC (Covalenthy Closed Circular) DNA yang berarti lingkaran tertutup kovalen. Covalenthy Closed Circular DNA bila satu unting yang utuh molekulnya digambarkan sebagai OC DNA atau lingkaran terbuka (open circles), sedangkan DNA kromosom lebih longgar dan mempunyai ukuran yang sangat panjang, sehingga mudah dipisahkan sewaktu isolasi.
Covalenthy Closed Circular (CCC) DNA yang mempunyai struktur terteir yang tahan terhadap denaturasi maka utas tunggal akan melekat bersama lebih erat, sehingga berasosiasi kembali lebih cepat sehingga mudah terdenaturasi, oleh karena itu bila denaturasi diterapkan maka DNA kromosom akan terdenaturasi dan berpresipitasi sehingga DNA plasmid akan tetap utuh (Sambrook et al., 2001). Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Endonuklease Restriksi Hasil pemotongan DNA plasmid bakteri E. coli JM109 yang mengandung gen CVPD r yang diklon pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli JM109 dengan enzim endonuklease restriksi Pemberian enzim endonuklease restriksi untuk memotong DNA menjadi fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda-beda. Enzim endonuklease restriksi akan menempati suatu molekul DNA dan bergeser sepanjang heliks DNA hingga mengenali urutan pasangan basa spesifik untuk berhenti bergeser, kemudian enzim endonuklease restriksi akan memotong DNA pada urutan pasangan basa spesifik. Tempat urutan pasangan basa spesifik ini disebut juga situs restriksi. Pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi mengenal urutan spesifik pada molekul DNA yang dipotong. Enzim Eco RI yang disintesis oleh E. coli mempunyai urutan pengenal GAATTC. Enzim Bam HI yang disintesis oleh Bacillus amynololique faciens mempunyai urutan pengenal GGATCC. Ujungujung hasil pemotongan dengan enzim endonuklease restriksi Eco RI dan Bam HI . Ujung-ujung Pemotongan Enzim Eco RI dan Bam HI Pemotongan molekul DNA dengan tepat perlu pada pembentukan DNA rekombinan (kloning gen). Vektor dipotong posisi tunggal untuk membuka lingkaran
ISSN 2302-2612
36
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
sehingga molekul DNA baru dapat diinsersikan. Vektor harus dipotong pada posisi yang sama sebab pemotongan secara random tidak memuaskan DNA pUC18 (Sambrook et al., 2001). Tempat pemotongan enzim restriksi pada molekul DNA, meninggalkan bekasnya berupa tonjolan ujung 5’. Ujung-ujung ini dapat mengadakan ikatan hidrogen dengan ujung DNA lainnya yang dipotong oleh enzim yang sama. Potongan enzim restriksi atau fragmen restriksi yang ujungnya tidak rata atau menonjol dinamakan ujung lengket, tetapi ada pula enzim endonuklease restriksi yang memotong membentuk ujung tumpul (Brown, 1991). DNA pUC18 (Sambrook et al., 2001) Analisis Total Protein Bakteri Analisis total protein bakteri dilakukan dengan teknik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sebagai pemisah. Gel poliakrilamid dapat memisahkan protein berdasarkan massanya. Protein dalam gel dapat dilihat setelah diwarnai dengan biru coomassie yang ditandai oleh adanya pita. Hasil analisis protein bakteri E. coli JM109 yang mengandung gen CVPD r yang diklon pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli JM109 Berdasarkan analisis protein tersebut, dapat terlihat bahwa protein khas terlihat lebih kurang 17 kDa yaitu pada CVPD r yang diklon pada pUC18 dalam sel E. coli JM109 (pWR27 ,sedangkan pada pUC18 tidak terlihat adanya gen tahan CVPD Hal ini disebabkan karena bakteri patogen mempunyai kemampuan perlekatan pada sel kloning, dimana untuk pertumbuhan bakteri membutuhkan zat molekul berupa unsur bahan organik yaitu karbon, hidrogen, nitrogen, fosfor, belerang, oksigen, ion anorganik seperti kalium, natrium, besi,
magnesium, kalsium (Jawetz et al., 1996).
dan
vitamin
Analisis Total Protein Bakteri dengan Total Protein Daun Jeruk Kinkit dan Jeruk Siam Analisis total protein bakteri dengan total protein daun jeruk kinkit dan daun jeruk siam dilakukan dengan teknik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sebagai pemisah. Gel poliakrilamid dapat memisahkan protein berdasarkan massanya. Protein dalam gel dapat dilihat setelah diwarnai dengan biru coomassie yang ditandai oleh adanya pita. Hasil analisis protein bakteri dengan protein tanaman jeruk kinkit dan daun jeruk siam dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Analisis Total Protein Bakteri dengan Jeruk Kinkit dan Jeruk Siam Ket: M (Marker Protein) Lajur 1,2 pWR27 Lajur 3,4 Jeruk Kinkit, Lajur 5 jeruk siam sehat, Lajur 6,7 jeruk siam sakit. Tanda panah menunjukkan pita protein tahan CVPD.
Protein khas terdapat lebih kurang pada 17 kDa yang merupakan protein tahan terhadap CVPD yang terdapat pada jeruk kinkit dan pWR27. Hal ini disebabkan jeruk kinkit mempunyai ketahanan terhadap CVPD. Perbedaan pembentukan molekul protein tersebut kemungkinan merupakan reaksi molekuler tanaman, pada jeruk siam sehat maupun sakit tidak terlihat adanya pita lebih kurang pada 17 kDa sebab jeruk siam tidak memiliki ketahanan terhadap serangan
ISSN 2302-2612
37
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
penyakit CVPD. Akibatnya protein transpot ion sel tanaman akan terganggu yang mengakibatkan sel tanaman kekurangan mineral atau unsur hara tertentu (Setiawan dan Trisnawati, 1999). Jeruk siam yang terserang CVPD agar protein dapat berfungsi dengan baik maka protein yang berperan sebagai protein transpot akan mengikat senyawa spesifik. Menurut Toha (2001) suatu senyawa yang akan ditranspot harus berikatan terlebih dahulu dengan protein transpot spesifik sehingga nantinya senyawa tersebut akan mampu dibawa melewati membran. KESIMPULAN 1. Klon gen CVPD r dapat diekspresikan dalam sel E. coli JM109. 2. Molekul protein yang dihasilkan dari klon gen CVPD r dalam sel E. coli JM109 mempunyai besar molekul lebih kurang 17 kDa. 3. Molekul protein dengan besar molekul yang sama juga ditemukan pada sampel protein yang diisolasi dari jeruk kinkit.
DAFTAR PUSTAKA Anonim. 1988. Ensiklopedi Indonesia. PT. Ichtiar Baru – Van Hoeve Jakarta. Brown, T.A.1991. Pengantar Kloning Gen. Alih Bahasa : Soemiati, A.M. Yayasan Essentia Medika. Yogyakarta. Da Graca, J.V. 1991 Citrus greening disease. Phytopathol 29 : 10936. Departemen of Microbiology and Plant Pathology. University of Natal. Platermaritzburg south Africa. Gardner, E.J 1991. Principles of Genetic. New York : John Wiley & Sons. Jawetz, E. J. L. Melnik, E. A. Adelberg, G.F. Brooks, J. S. Butel , and L.
N. Omston. 1996 Medika Microbiology. Edisi 20. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Setiawan, A. I. & Y. Trisnawati. 1999. Peluang Usaha dan Pembudidayaan Jeruk Siem. Penebar Swadaya. Jakarta. Sambrook, J., E. F. Miniatis, T. 2001. Molecular Cloning. A Laboratorium Manual. 3nd. ED. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York. Subandiyah, S. 2001. Bioteknologi untuk identifikasi dan deteksi patogen tumbuhan. Makalah Seminar Regional VPFI Komda Jateng dan DIY di Universitas Wangsa Menggala, Yogyakarta. 3 Pebruari 2001. Tjitrosoepomo, G. 1981. Taksonomi Tumbuhan. Bhratara Karya Aksara. Jakarta. Toha. A. A. H. 2001 Deoxyribo Nucleac Acid. Keanekaragaman, Ekspresi, Rekayasa dan Efek Pemanfaatannya. Seri Biokimia. Penerbit Alfabeta. Bandung. Wirawan, I. G. P. 1996. Molekular Mechanism of Grown Gall Tumor Induction by Agrobacterium Tumefaciens. Graduate Course of Biochemical regulation, Graduate Scholl of Agriculture Sciences Nagoya University, Nagoya Japan. Wirawan, I. G. P., N. Arya., S. Subandiyah. 1998. Isolasi Loci Resisten terhadap CVPD dengan Metode Transformasi Menggunakan Agrobacterium Tumefaciens. Laporan Riset Unggulan Terpadu V. Kantor Menteri Negara Riset Teknologi. Dewan Riset Nasional. Jakarta. Wirawan, I. G. P., & S. Subandiyah. 2000. Penelitian Aspek Biologi Molekul Penyakit CVPD Tanaman Jeruk. Seminar Sehari Perhimpunan Fotopatologi Indonesia. Malang.
ISSN 2302-2612
38
