PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L

PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L

TESIS

Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh gelar Magister Sains Program Studi Biosains

oleh : Didik Wahyudi S-900908003

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

i

PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L

TESIS

Oleh : Didik Wahyudi S-900908003

Telah disetujui oleh Tim Pembimbing Pada tanggal 5 Agustus 2010

Komisi Pembimbing

Pembimbing I

Nama

Tanda Tangan

Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D

Tanggal

5 Agustus 2010.

NIP. 196008091986121001.

Pembimbing II Dr. Artini Pangastuti, M.Si. NIP. 197505312000032001.

Mengetahui Ketua Program Studi Biosains Program Pascasarjana

Dr. Sugiyarto, M.Si. NIP. 196704301992031002.

ii

5 Agustus 2010.

PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L

TESIS

Oleh : Didik Wahyudi S-900908003

Telah dipertahankan di depan penguji Dinyatakan telah memenuhi syarat Pada tanggal

Jabatan Ketua

Agustus 2010

Nama

Tanda Tangan

Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D

Tanggal

..................... ... Agustus 2010

NIP. 195708201985031004. Sekretaris

Dr. Sugiyarto, M.Si.

..................... ... Agustus 2010

NIP. 196704301992031002. Anggota Penguji. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D

.................... ... Agustus 2010

NIP. 196008091986121001. Dr. Artini Pangastuti, M.Si.

..................... ... Agustus 2010

NIP. 197505312000032001.

Mengetahui Direktur Program Pascasarjana UNS

Ketua Program Studi Biosains

Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D.

Dr. Sugiyarto, M.Si.

NIP. 195708201985031004.

NIP. 196704301992031002

iii

PERNYATAAN ARISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa : 1. Tesis yang berjudul Penghambatan Quorum Sensing pada Pseudomonas aeruginosa oleh Alpinia galanga L ini adalah karya penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang secara tertulis di kutip dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah Tesis ini dapat dibuktikan terdapat unsur-unsur jiplakan, maka saya bersedia Tesis beserta gelar MAGISTER saya dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku (UU No. 20 tahun 2003, pasal 25 ayat 2 dan pasal 70). 2. Tesis ini merupakan hak milik Prodi Biosains PPs-UNS. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi Tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin Ketua Prodi Biosanis PPs-UNS dan minimal satu kali publikasi menyertakan tim pembimbing sebagai Author. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu semester (6 bulan sejak pengesahan Tesis) saya tidak melakukan publikasi dari sebagian atau keseluruhan tesis ini, maka Prodi Biosains PPs-UNS berhak mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosains PPS-UNS, Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini, maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.

Surakarta,

Agustus 2010

Mahasiswa

Didik Wahyudi.

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat dan kasih karuniaNya, maka penulis dapat menyajikan tulisan Tesis yang berjudul: Penghambatan Quorum Sensing Pada Pseudomonas aeruginosa oleh Ekstrak Alpinia galanga L. Penelitian ini diawali dengan karakterisasi rimpang A. galanga L (Lengkuas) dan isolasi P. aeruginosa dari sampel klinis di Rumah Sakit Dr. Moewardi, kemudian dilakukan pengujian awal terhadap kemampuan ekstrak A. galanga L dalam menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa dengan menggunakan indikator produksi enzim eksoproteasenya, karena produksi enzim tersebut diatur oleh sistem quorum sensing bakteri. Sistem quorum sensing pada P. aeruginosa diawali dari syarat minimal jumlah bakteri yang harus ada di dalam suatu lingkungan, yaitu 107 – 108 sel, kemudian bakteri akan terpicu untuk mengeluarkan faktor virulensinya, pada kondisi yang optimal bisa sampai membentuk biofilm. Setelah ditemukan konsentrasi ekstrak A. galanga L yang bisa menghambat produksi enzim eksoprotease secara kualitatif dilanjutkan uji secara kauntitatif, juga dilakukan perhitungan terhadap jumlah bakteri pada konsentrasi tersebut. Di dalam tulisan ini, disajikan pokok-pokok bahasan yang meliputi pengukuran parameterparameter diatas yaitu jumlah bakteri, produksi enzim baik secara kualitatif maupun luantitatif dan pembentukan biofilmya. Nilai penting penelitian ini adalah menemukan alternatif bahan antibakteri yang baru untuk mengatasi adanya efek samping dari mengkonsumsi antibiotik, Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi, alternatif dan pengetahuan tentang penanggulangan penyakit infeksi dan bermanfaat untuk menjadi wacana baru tentang bahan pengawet makanan organik yang meminimalkan efek samping yang bisa ditimbulkan oleh bahan pengawet kimiawi. Hasil Penelitian menunjukkan bahwa ekstrak A. galanga L mempunyai kemampuan untuk menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa pada konsentrasi 8% berat/vol, namun pada konsentrasi tersebut pertumbuhan P. aeruginosa tidak terhambat, tetapi pembentukan biofilmnya terhambat. Tidak ada perbedaan antara kemampuan penghambatan A. galanga L baik dengan pelarut etanol dan etil asetat. Perlu diadakan penelitian lanjutan tentang identifikasi zat kimia spesifik pada ekstrak A. galanga L tersebut yang mempunyai kemampuan menghambat sistem quorum sensing pada P. aeruginosa baik dengan pelarut etanol maupun etil asetat, juga penelitian terhadap beberapa bakteri yang lain, dan terhadap beberapa jenis tanaman obat yang lain, yang kita ketahui Indonesia memiliki keanekaragaman yang sangat tinggi. Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih banyak kekurangan dan keterbatasan, walaupun telah dikerahkan segala kemampuan untuk lebih teliti, tetapi masih dirasakan banyak kekurangtepatan, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi semua pihak.

Surakarta, Agustus 2010.

Penulis,

v

UCAPAN TERIMA KASIH

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tak ternilai kepada : 1. Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D, sebagai Direktur Pascasarjana Universitas Sebelas Maret, dan sekaligus Penguji dalam ujian tesis ini. 2. Dr. Sugiyato, M.Si sebagai Ketua Program Studi Biosains dan sekaligus Penguji dalam ujian tesis ini. 3. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc, Ph.D. sebagai Pembimbing I, di tengah kesibukannya yang luar biasa selalu meluangkan waktu untuk membimbing dan memberikan masukan dan saran untuk penyelesain tulisan ini. 4. Dr. Artini Pangastuti, M.Si sebagai Pembimbing II, yang telah memberikan ide, gagasan dan beberapa literature yang dibutuhkan oleh penulis untuk penyusunan tulisan ini dan arahan dalam pelaksanaan penelitian tesis ini. 5. Ketua dan Pengurus Yayasan Pendidikan Farmasi Nasional Surakarta, yang memberikan ijin dan beasiswa studi secara penuh sampai lulus. 6. Direktur dan seluruh Staf Karyawan AAK Nasional Surakarta, yang telah mendukung penulis selama masa studi dan penulisan tesis ini 7. Prof Dr. dr. J. Priyambodo MS, Sp.MK sebagai Kepala Laboratorium Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Dr. Moewardi Surakarta, yang telah membantu dalam pengadaan sampel kuman. 8. Prof, dr. Bhisma Murti, M.Sc, Ph.D yang telah membantu dalam hal uji statistik dan analisis data pada penelitian ini. 9. Drg. HM. Taufik A.K, M.Kes sebagai Kepala Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta yang telah memberikan ijin serta akses seluas-luasnya untuk menggunakan semua peralatan, bahan, media reagensia, dan sarana prasarana laboratorium. 10. Bpk. Sigit Sulistya, S.Si, Koordinator Laboratorium Mikrobiologi Klinik Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta yang telah membantu pelaksanaan penelitian baik secara teknis maupun non teknis. 11. Dra. Darwani, M.Sc Bidang diklat Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta yang telah membimbing pelaksanan penelitian dan memberikan banyak masukan, ide dan gagasan tentang penelitian tesis ini. 12. Ibu Novena Yety Lindawati, S.Farm, Apt yang telah membantu proses ekstraksi Alpinia galanga L di laboratorium Farmasi Akademi Farmasi Nasional Surakarta. 13. Seluruh Staf dosen Program Studi S2 Biosains yang telah memberikan ilmunya dan selalu terbuka untuk setiap masukan dari mahasiswa. 14. Teman-teman mahasiswa S2 Biosains angkatan 2008 yang selalu memberikan dukungan dan selalu bekerja sama selama masa perkuliahan. 15. Keluargaku tercinta yang laur biasa; Istriku, Anakku, Bapak, Ibu, KakakKakak dan Adik-Adik yang telah memberi semangat dan motivasi serta selalu mendukung dalam doa.

Surakarta, Agustus 2010.

Penulis,

vi

MOTTO

Semangat..........!

vii

PERSEMBAHAN

Karya ini kupersembahkan untuk: Wiwied dan Yosua

viii

PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L

Didik Wahyudi; Sutarno; Artini Pangastuti Program Studi Magister Biosains, Program Pasca Sarjana-UNS Surakarta

ABSTRAK Quorum sensing merupakan suatu proses yang memungkinkan bakteri dapat berkomunikasi dengan mensekresikan molekul sinyal yang disebut autoinducer atau molekul sinyal sebagai ”bahasa”. Sistem quorum sensing juga mengontrol perilaku bakteri melalui pengubahan ekspresi gen oleh molekul sinyal. Perilaku bakteri yang diatur sistem quorum sensing antara lain: Bioluminescen, sekresi virulensi, sporulasi, konjugasi, produksi enzim ekstraseluler, pembentukan biofilm dan produksi pigmen. P. aeruginosa merupakan opportunistik pathogenic penyebab utama nosocomial infection. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan ekstrak Alpinia galanga L dalam menghambat quorum sensing P. aeruginosa. Penelitian diawali dengan isolasi P. aeruginosa dari Rumah Sakit Dr. Moewardi Surakarta, sampai uji sensitivitas terhadap antibiotik menggunakan media biakan Luria bertani (LB). Ekstraksi di lakukan dengan menggunakan pelarut etanol dan etil asetat. Uji kemampuan ekstrak A. galanga L dalam penghambatan quorum sensing bakteri tersebut berdasarkan produksi enzim eksoprotease yang dihasilkan oleh P. aeruginosa dengan metode spot plate pada media LB agar yang ditambahkan 2% susu skim, dilanjutkan dengan uji pembentukan Biofilm dengan menggunakan metode microtiter plate PVC, dilakukan juga perhitungan jumlah sel bakteri untuk mengetahui pertumbuhan P. aeruginosa tersebut dengan metode Optical density (spektrofotometer). Semua eksperimen dilakukan dengan ulangan tiga kali. Data dianalisis dengan menggunakan satu arah analisis varians (ANOVA) dengan P-nilai 0,05 menggunakan perangkat lunak statistik paket SPSS. Hasil Penelitian menunjukkan bahwa ekstrak A. galanga L mempunyai kemampuan untuk menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa pada konsentrasi 8% berat/vol, namun pada konsentrasi tersebut pertumbuhan P. aeruginosa tidak terhambat, tetapi pembentukan biofilmnya terhambat. Tidak ada perbedaan antara kemampuan penghambatan A. galanga L baik dengan pelarut etanol dan etil asetat.

Kata kunci: Quorum sensing, Pseudomonas aeruginosa, Alpinia galanga L.

ix

QUORUM SENSING INHIBITION OF Pseudomonas aeruginosa BY Alpinia galanga L EXTRACT Didik Wahyudi; Sutarno; Artini Pangastuti Master of Bioscience, Postgraduate of Sebelas Maret University Surakarta

ABSTRACT

Quorum sensing is a process that allows bacteria to communicate with secreting a signal molecule called autoinducer or signal molecules as the "language". Quorum sensing system also controls the behavior of the bacteria in gene expression modification by signal molecules. The behaviors of bacteria that are regulated by quorum sensing are: Bioluminescen, secretion of virulence, sporulation, conjugation, extracellular enzyme production, biofilm formation and pigment production. P. aeruginosa is an opportunistic pathogenic major cause of nosocomial infection (infections acquired from hospitals), these cases often occur in various hospitals in Indonesia. The Objective of this research is to determine the ability of A. galanga L extracts in inhibiting quorum sensing in P. aeruginosa. The research started with the isolation of P. aeruginosa from Dr. Moewardi Hospital in Surakarta, to test the sensitivity to antibiotics using culture media of Luria Bertani (LB). Extraction was done by using ethanol and ethyl acetate. The ability test of A. galanga L extracts in the inhibition of bacterial quorum sensing was based on the production of eksoprotease enzyme produced by P. aeruginosa using spot plate on LB agar medium was added 2% skim milk, followed by the formation test biofilm microtiter plate using PVC, also performed calculations to determine the number of bacterial cells of P. aeruginosa growth by optical density method (spectrophotometer). All experiments conducted with three replications. Data were analyzed by using one-way analysis of variance (ANOVA) with P-value of 0.05 using SPSS statistical software package. Research results showed that the A. galanga L extract has the ability to inhibit quorum sensing system of P. aeruginosa at a concentration of 8% wt / vol, but the concentration was not hampered the growth of P. aeruginosa, but inhibited the biofilm formation. There was no difference between the ability of inhibition of A. galanga L both with ethanol and ethyl acetate.

Key-words: Quorum Sensing, Pseudomonas aeruginosa, Alpinia galanga L.

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... LEMBAR PERSETUJUAN .............................................................................. LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................ PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS ............................... KATA PENGANTAR ........................................................................................ UCAPAN TERIMA KASIH .............................................................................. MOTTO ........................................................................................................... PERSEMBAHAN ............................................................................................. ABSTRAK ........................................................................................................ ABSTRACT...................................................................................................... DAFTAR ISI ..................................................................................................... DAFTAR TABEL .............................................................................................. DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................

i ii iii iv v vi vii viii ix x xi xiii xiv xvi

BAB 1. PENDAHULUAN A. B. C. D.

Latar Belakang Masalah ................................................................ Perumusan Masalah ..................................................................... Tujuan penelitian ........................................................................... Manfaat Penelitian .........................................................................

1 4 5 5

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA DAN KERANGKA KONSEP PENELITIAN A. Tinjauan Pustaka ........................................................................... 1. Sistem Quorum sensing .......................................................... 2. Autoinducer .............................................................................. 3. Mekanisme Umum Quorum Sensing ....................................... 4. Quorum Sensing Hubungannya dengan Patogenitas Bakteri.. 5. Pencegahan Quorum Sensing ................................................. 6. Potensi Desian Anti Quorum Sensing ..................................... 7. Lengkuas (A. galanga L)................................................... 8. P. aeruginosa ....................................................... B. Kerangka Pemikiran....................................................................... C. Hipotesis.........................................................................................

6 6 8 9 15 16 19 20 22 30 31

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .............................................................. A. Waktu dan Tempat Penelitian......................................................... B. Alat dan Bahan Penelitian ............................................................. C. Prosedur Penelitian ....................................................................... C.1. Karakterisasi dan Ekstraksi A. galanga L..................................... C.2. Isolasi Bakteri Uji ......................................................................... C.3. Persiapan Media Biakan .............................................................. C.4. Penentuan Kurva Standar Pertumbuhan P. aeruginosa............... C.5. Uji Kualitatif Penghambatan Sistem quorum sensing................... C.6. Pengukuran Pertumbuhan P. aeruginosa ....................................

32 32 32 33 33 34 36 36 37 38

xi

C.7. Pengujian Kuantitatif Aktivitas Enzim Eksoprotease P.aeruginosa ............................................................................... C.5. Uji Pembentukan Biofilm dengan Microtiter Plate (PVC).............. D. Analisis Statistik ............................................................................. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. Karakterisasi Bakteri Uji, P. aeruginosa. ....................................... B. Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa ................................................ C. Uji Kualitatif Penghambatan Quorum Sensing berdasarkan enzim eksoprotease yang dihasilkan oleh P. aeruginosa .............. D. Penghambatan Produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etanol.................... E. Penghambatan Produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etil asetat.............. F. Penghambatan Aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa secara kuantitatif ............................................................................ G. Hasil Uji Pembentukan biofilm P.aeruginosa dengan Microtiter Plate Polivinil Chlorida ...................................................................

39 40 41

43 47 49

52 55 57 63

BAB V. PENUTUP A. Kesimpulan .................................................................................... B. Saran ............................................................................................. DAFTARA PUSTAKA ...................................................................................... LAMPIRAN-PLAMPIRAN ................................................................................

xii

70 70 71 76

DAFTAR TABEL

Tabel 1.

Tabel 2.

Tabel.3

Tabel.4

Tabel 5.

Tabel 6.

Tabel 7.

Tabel 8

Hasil Uji Sensitivitas antibiotik terhadap P. aeruginosa Hasil Isolasi dari RSU Dr. Moewardi Surakarta…………...……

44

Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa dengan menggunakan spektrofotometer.........................................................................

47

Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni P. aeruginosa dengan pemberian ekstrak galanga L dengan pelarut Etanol pada medium pertumbuhannya. ...........

52

Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni P. aeruginosa dengan pemberian ekstrak A. galanga L dengan pelarut etil asetat ..........................................................

55

Nilai optical density pertumbuhan P. aeruginosa pada berbagai jenis perlakuan.............................................................

58

Tabel daftar unit aktivitas enzim eksoprotease pada P. aeruginosa pada beberapa perlakuan...................................

60

Nilai Rata-rata produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa pada beberapa perlakuan dengan ekstrak A. galanga L...........

62

Rata-rata Produksi biofilm (berdasarkan Optical Density) pada P. aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi 6% dan 8%.....................................................

64

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 01.

Mekanisme QS pada bakteri Gram-negatif.................................

10

Gambar 02.

Mekanisme QS pada Vibrio fischeri............................................

11

Gambar 03.

Mekanisme QS pada bakteri Gram-positif, Staphylococcus aureus. P2 dan P3 masing-masing merupakan promotor untuk gen agrBDCA dan NAIII....................................................

14

Gambar 04.a. Skema umum pencegahan QS degradasi senyawa AI...............

18

Gambar 04.b. Skema umum pencegahan QS kompetisi...................................

18

Gambar 04.c. Skema umum pencegahan QS antagonis...................................

18

Gambar 05.

Target yang berpotensi untuk pencegahan QS.........................

19

Gambar 06.

A. galanga L................................................................................

21

Gambar 07.

P. aeruginosa..............................................................................

24

Gambar 08.

Berbagai infeksi Pseudomonas pada beberapa situs tubuh manusia (Mayasari, Evita, 2006).....................................

27

Kerangka pemikiran penghambatan system quorum sensing pada P. aeruginosa oleh ekstrak A. galanga L ...........................

30

Gambar 09.

Gambar 10.

Kurva pertumbuhan P. aeruginosa pada media Luria Bertani yang diukur dengan Spektrofotometer............................ 48

Gambar 11.

Produksi enzim eksoprotease menyebabkan terbentuknya zona bening di sekitar koloni P. aeruginosa................................

51

Penghambatan produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa oleh ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol........................

54

Penghambatan produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa oleh ekstrak A. galanga L dengan pelarut etil Asetat...........

56

Pengukuran Nilai Optical Density P. aeruginosa pada berbagai perlakuan......................................................................

59

Kurva produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa.....................

61

Gambar 12.

Gambar 13.

Gambar 14.

Gambar 15.

xiv

Gambar 16.

Gambar 17.

Rata-rata Produksi biofilm pada P. aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak Alpinia alanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi 6% dan 8%......................................................

64

Besarnya penurunan produksi biofilm P. aeruginosa pada jam ke 20 sampai jam ke 40 inkubasi pada microtiter plate PVC…………………………………………………

66

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1

One Way Anova untuk jumlah bakteri pada beberapa perlakuan dengan SPSS 13 .....................................................

77

One way Anova produksi enzim eksoprotease pada beberapa perlakuan dengan SPSS 13 ......................................

81

One way Anova Pembentukan Biofilm P. aeruginosa pada beberapa perlakuan dengan SPSS 13 ……..

85

Lampiran 4

Beberapa komposisi Media Biakan Bakteri................................

87

Lampiran 5

Tabel Uji Biokimia Identifikasi Bakteri Gram Negatif bentuk Batang............................................................................

88

Surat Keterangan Telah melakukan Penelitian di balai laboratorium Kesehatan Yogyakarta..........................................

89

Beberapa Foto Aktivitas Penelitian di Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.........................................

90

Daftar Riwayat Hidup Penulis ....................................................

93

Lampiran 2

Lampiran 3

Lampiran 6

Lampiran 7

Lampiran 8

xvi