Quorum sensing
Ing. Hana Sýkorová, Ph.D. 2014
Vibrio fischeri • G- mořská bakterie • schopnost bioluminiscence otázka: Kdy svítí? odpověď: Jen za určité hustoty. otázka: Jak to pozná? odpověď: „Chemický jazyk“
Vibrio fischeri
Eupryma scolopes • oliheň (sepiola kropenatá), max 35mm • symbióza s V. fischeri • modulace luminiscence (predátoři)
Quorum Sensing kvórum z lat. quorum = „z nichž“ kvantitativní podmínka pro platnost (voleb, referenda…)
Quorum sensing • „vycítit kvórum“ • typ rozhodovacího procesu využívaného decentralizovanými skupinami k jednotné reakci • sociální druhy hmyzu – včely, mravenci… • bakterie – koordinace genové exprese v závislosti na místní hustotě populace
Quorum Sensing - bakterie mechanismus kterým pomocí signálních molekul bakterie reguluje expresi některých genů v závislosti na hustotě populace 60. léta – Alexander Tomasz (maďarský mikrobiolog) – přirozená kompetence (příjem DNA z prostředí) u Streptococcus pneumoniae
Mechanismus QS
Vibrio fischeri
LuxR
LuxI
LuxR
Luciferase Genes
Co je to za molekuly? N-(3-oxohexanoyl)-homoserin lakton (3-oxo-C6-HSL)
Co je to za molekuly?
Co je to za molekuly? • AHL = N-acyl homoserin-lakton • „Intra-species“
Communication
• molekuly specifické pro jednotlivé druhy
Autoinduktory typu 1 = AI-1
Bacteria constantly produce molecules called acylated homoserine lactones (AHLs) and release them into the environment. (The LuxR proteins comes into play later.)
If other bacteria are not in the vicinity, the AHLs will soon degrade and bacterial “silence” will prevail.
But if enough AHLproducing bacteria are nearby, the concentration of AHLs outside the bacteria will rise, signaling the increase in cell density around them.
(1) When a quorum (or critical number) of bacterial cells is reached, AHLs are able to bind to receptor proteins called LuxR. (2) That changes LuxR’s shape so that it can bind to DNA in the bacteria, like a key in a lock.
The LuxR “key” turns on a string of genes (1) that produce the components (2) to make an enzyme called luciferase (3), which generates light (bioluminescence). By similar biochemical processes, bacteria can produce several other collective behaviors. http://www.whoi.edu/page.do?pid=7501&tid=4142&cid=31613&i=1
Systém LuxI-LuxR systém G negat bakterií
Target Genes
• • • • •
LuxI – AHL synthase - konstitutivní syntéza bazálního množství AHL volná sekrece AHL do prostředí při vzrůstu koncentrace AHL v prostředí – aktivace regulátoru LuxR vazba LuxR na specifické palindromní sekvence „lux box“ zvýšení transkripce specifických genů (např. pro bioluminiscenci)
Systém LuxI-LuxR systém G negat bakterií
Target Genes
V. fischeri
Bioluminescence
P. aeruginosa
Virulence Factors, Biofilms
A. tumefaciens
Mating, Transfer of Mobile DNA
E. carotovora
Virulence Factors, Antibiotic Synthesis
Autoindukce
Systémy analogické „LuxI-LuxR“
A jak je to u G+ ? Signály G+ bakterií: • modifikované oligopeptidy • autoinducer peptides AIPs („feromon-like“ peptidy)
• • • • • •
syntéza peptidu ve formě prekurzoru modifikace sekrece přes ATP-Binding Casette (ABC) transportní komplex detekční systém – dvě složky fosforylace exprese specifických genů
Oligopeptidy jako induktory (AIP)
G- x G+ • • • •
LuxI – autoinducer synthase AHL – acyl homoserine lactone LuxR – receptor LuxR/AHL → transcription
• • • • • •
LuxS – autoinducer synthase AIP – auto-inducing peptide transporter for secretion HK receptor – histidin kinase RR – response regulator activated RR → transcription
Jak je to ve směsných kulturách?
Cross talk
Vibrio harveyi • 2 systémy komunikace:
AI-1 • molekula = AHL • produkce LuxLM • senzor LuxN AI-2 • molekula = furanon • produkce LuxS • senzor LuxP, LuxQ
Fosforylační kaskáda: LuxN (LuxQ) → LuxU → LuxO LuxO – kontrola transkripce represoru X exprese luciferázového operonu luxCDABE
Vibrio harveyi
LuxS systém – „bakteriální esperanto“ Actinobacillus actinomycetemcomitans Actinobacillus pleuropneumoniae Actinobacillus suis Bacillus anthracis Bacillus halodurans Bacillus subtilis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium acetobutylicum Clostridium difficile Clostridium perfringens Deinococcus radiodurans Escherichia coli MG1655 Escherichia coli O157:H7 Enterococcus faecalis Haemophilus influenzae Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae Lactococcus lactis Leuconostoc oenos Listeria monocytogenes Mannheimia haemolytica
Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pasteurella multocida Pasteurella trehalosi Porphyromonas gingivalis Proteus mirabilis Salmonella paratyphi Salmonella typhi Salmonella typhimurium Shewanella putrefaciens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus gordonii Streptococcus mutans Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Vibrio anguillarum Vibrio vulnificus Yersinia pestis
LuxS systém – vlastnosti pod kontrolou AI-2 Actinobacillus actinomycetemcomitans Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium difficile Clostridium perfringens Escherichia coli K12 Escherichia coli EHEC O157:H7 Escherichia coli EPEC Haemophilus influenzae Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae Lactobacillus reuteri Listeria monocytogenes Mannheimia haemolytica Neisseria meningitidis Photorhabdus luminescens Porphyromonas gingivalis Salmonella typhi Salmonella typhimurium Serratia marcescens Shigella flexneri Staphylococcus epidermis Streptococcus gordonii Streptococcus mutans Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Vibrio anguillarum Vibrio cholerae Vibrio fischeri Vibrio harveyi
Periodontal virulence, Mixed-species biofilms Growth Biofilms Development Virulence Motility, Toxins Virulence, Toxins Virulence, Toxins AI-2 transport, Biofilms, Cell division, DNA processing, Iron uptake Virulence, Type III Secretion , Motility Motility, Type III Secretion Virulence, Cell invasion Motility, Biofilms Biofilms Biofilms in mice Biofilms Virulence, Encapsulation, Adhesion Virulence, Bacteremia Antibiotic production Virulence, Proteases Hemin acquisition, Stress response Biofilms AI-2 transport, Biofilms Virulence in C. elegans, Hemolysin, Antibiotic production VirB (virulence factor) Virulence, Biofilms Mixed-species biofilms Virulence, Biofilms, Competence, Stress response Virulence, Persistence, Competence Virulence factors, Protease, Hemolysin Protease Virulence, Toxins, Biofilms Bioluminescence, Colonization Bioluminescence, Biofilms, Siderophore, Virulence, Type III Secretion, Protease
Bakteriální esperanto – LuxS systém společný prekurzor = produkt LuxS : • 4,5-dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) spontánní cyklizace → autoiduktor AI-2 • furanony • někdy vázaný bór
Syntéza AI-2
Syntéza AI-1 a AI-2: společný prekurzor SAM
SAM – S-adenosylmethionin SAH – S-adenosylhomocystein SRH – S-ribosylhomocystein AHL – acyl-homoserin lakton (AI-1) DPD – dihydroxy-pentandion (prekurzor AI-2)
Vibrio harveyi
Salmonella typhimurium, E. coli AI-2
Jak spolu komunikují?
G+: AIP
Cross Talk: AI-2
G-: AI-1 = AHL
Jak spolu komunikují?
G+: AIP
Cross Talk: AI-2
G-: AI-1 = AHL
AI-3: Komunikace na vyšší úrovni
AI-3/epinefrin/norepinefrin • • • • •
katecholaminy (adrenalin/noradrenalin) - krátké peptidy (neuropeptidy) AI-3 – podobná aromatická sloučenina „interkingdom communication“ komunikace hostitel x mikroflóra produkce: • bakterie • houby • rostliny • vyšší živočichové • člověk: ovlivnění mozkových funkcí • hypotéza: složení střevní mikroflóry do jisté míry ovlivňuje chování (myši x Lbc. rhamnosus)
AI-3/epinefrin/norepinefrin • poprvé popsáno u EHEC kmenů E. coli (např. E. coli O157:H7) • kolonizují střevní epitel, produkce toxinu (shigatoxin/verotoxin) • HUS – hemolyticko-uremický syndrom • tvorba tzv. „attaching and effacing“ (AE) lézí – kódovány chromozomálními ostrovy patogenity LEE • AI-3 a epinefrin/norepinefrin – shodný receptor (membrána) • AI-3: produkce běžnou střevní mikroflórou
• epinefrin/norepinefrin: produkce hostitelem (kontrakce hladkého svalstva) • obdobné systémy: Shigella, Salmonella, ….
epinefrin
norepinefrin
AI-3 systém u EHEC E. coli
Sekrece typu III = „injekce“ (G- patogeny)
Konkrétní příklady podrobněji
Vibrio harveyi – 3 paralelní systémy
AHL: HAI-1 (3OHC4-homoserin lakton); syntéza LuxM LuxN (senzor) histidin-kináza AI-2: furanosyl-borát-diester; syntéza LuxS vazba na LuxP a následně na LuxQ (histidin kináza) CAI-1: 3-aminotridekan-4-one; syntéza CsqA CsqS (senzor) histidin-kináza
Role „Small RNA“ v regulaci QS sRNA – small RNA Qrr – Quorum Regulatory RNA nízká hladina AI = nízká hustota buněk P-LuxO → aktivace transkripce 5 regulačních sRNA (Qrr1-5); společně s chaperonem Hfq, destabilizace mRNA pro regulátor LuxR (luxR-mRNA). LuxR nutný pro aktivaci transkripce operonu luxCDABE → nesvítí
vysoká hladina AI = vysoká hustota buněk defosforylovaný LuxO → translace luxRmRNA → produkce LuxR → transkripce operonu luxCDABE → svítí
Vibrio cholerae
• • • • •
G- fakultativně anaerobní tyčinka původce cholery (inkubační doba 12-72h) vazba na některé druhy řas a zooplanktonu množí se v tenkém střevě (TCP – toxin coregulated pilus) produkce enterotoxinu – choleratoxin (CT)
Vibrio cholerae QS: exprese virulentních faktorů + biofilm x exprese proteázy
• analogie s V. harveyi • 2 systémy: • AI-2/LuxPQ • CAI-1/CqsS • absence systému AI-1/LuxN • analog LuxR = HapR
exprese virulentních faktorů a tvorba biofilmu – za nízkých koncetrací
Vibrio cholerae Infekční cyklus V. cholerae:
vps - Vibrio polysaccharide synthesis CT - expression of cholera toxin TCP - toxin coregulated pilus (colonization factor) HapA – hemaglutin protease
biofilm = ochrana (nízkému pH v žaludku) ↓ střevo – rozvolnění biofilmu ↓ kolonizace (exprese CT, TCP) ↓ nárůst počtu buněk ↓ aktivace proteázy (HapA) ↓ uvolnění buněk z epitelu ↓ ven z hostitele ↓ biofilm = přežití ve vnějším prostředí
Vibrio harveyi x V. cholerae
Pseudomonas aeruginosa • • • • • • • •
G- aerobní pohyblivá nefermentující tyčinka často slizovitý obal v odpadních vodách, na rostlinách a v půdě často v nemocničním prostředí (katetry, dýchací přístroje) kolonizace sliznic dýchacího a močového ústrojí infekty popálenin, oka, sepse novorozenců vážný problém – pacienti s cystickou fibrózou QS kontrola: faktory virulence (elastáza, exotoxin A, pyocyanin) tvorba biofilmu
Pseudomonas aeruginosa dva systémy řízené AHL (Las, Rhl) • N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (3OC12-HSL) x LasI/R elastáza, proteáza, exotoxin A • N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) x RhlI/R rhamnolipidy, pyocyanin, elastáza, fosfatáza
Las
Rhl
Pseudomonas aeruginosa
Zjednodušené schéma QS u Ps. aeruginosa
• LasI – produkce AHL1 • LasR-AHL1 komplex iniciace exprese virulentních faktorů (lasB elastáza, lasA proteáza, toxA enterotoxinA, aprA alk. fosfatáza) indukce transkripce rhlR • RhlI – produkce AHL2 • RhlR-AHL komplex exprese virulentních faktorů (lasB, aprA) exprese dalších specifických genů (rhamnolipidy, pyocyanin, cytotoxický lektin)
Pseudomonas aeruginosa dva systémy řízené AHL (Las, Rhl) • N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (3OC12-HSL) x LasI/R elastáza, proteáza, exotoxin A, alkalická fosfatáza • N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) x RhlI/R rhamnolipidy, pyocyanin, elastáza, proteáza třetí systém = PQS (Pseudomonas quinolone signal system) • 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone (PQS) x PqsR • regulace mezi systémy Las a Rhl Pqs
Pseudomonas aeruginosa nejde o pralalelní nezávislé systémy, ale o systémy navzájem komplikovaně propojené
• systém Las nadřazen • systém PQS „propojovací“ • LasR → regulace syntézy PQS → exprese rhlR a rhlI
Agrobacterium tumefaciens • gramnegativní bakterie • infikuje dvouděložné rostliny (nádory v rostlinných pletivech) • princip: průnik části DNA bakterie (Ti-plasmid = tumor inducing, T-DNA) do rostlinné buňky, začlenění do genomu rostliny • inkorporovaná bakteriální DNA: • geny pro produkci rostlinných hormonů, které vedou k vytvoření nádoru • geny pro rostlinnou produkci opinů - energetický zdroj pro bakterii • přenos Ti plasmidů kontrolován QS systémem (Tra systém) – analogie LuxI/R
Agrobacterium tumefaciens QS kontrola: • konjugační přenos Ti-plasmidů • TraI/TraR – lokalizace na Ti-plasmidu • konjugace vyžaduje 2 typy signálů 1. AHL (TraI bakterie) 2. opin (od hostitele) • funkce opinů • zdroj energie • signální molekula 2 typy regulačních opinů v procesu konjugace: • „octapine-type“ – octapin: indukce TraR přes aktivátor OccR • „nopaline-type“ – agrocinopin: indukce TraR přes inaktivaci represoru AccR bazální hladina exprese traI → nízká hladina AHL → + opiny → exprese traR → TraR-AHL → vyšší exprese traI → vyšší hladina AHL…
TraR-AHL → exprese operonů tra (mobilizace Ti-plasmidu) + trb (tvorba pórů pro přechod plasmidu) + traM ( TraM - řada regulačních funkcí)
Erwinia carotovora • • • •
čeleď Enterobacteriaceae rostlinný patogen (měkká hniloba brambor) poprvé izolována z karotky produkce pektolytických a celulolytických enzymů (narušení rostl. pletiv) QS – dva systémy LuxI/R • produkce extracelulárních enzymů (ExpI/ExpR) – napadení pletiv až při dosažení dostatečné hustoty populace • produkce karbapenemových antibiotik (CarI/CarR) – simultánně s exoenzymy = potlačení kompetitivní mikroflóry • oba systémy - identický AHL
Erwinia carotovora x Serratia sp.
podobné systémy, ale různá regulace
Zástupci G+
Streptococcus pneumoniae
• „pneumococcus“ • grampozitivní, aerobní, α-hemolytický, viridující kok (ve dvojicích) • běžně kolonizuje sliznici horních cest dýchacích (v neopouzdřené formě) - kolonizováno je až 70 % dětí
• podmíněný patogen – v opouzdřené formě může vyvolávat závažné infekce – meningitidy, pneumonie, sepse • faktory virulence - pneumolysin O, neuraminidáza, purpurogenní toxin, polysacharidové pouzdro (zabraňuje fagocytóze)
Streptococcus pneumoniae QS: • navození stavu přirozené kompetence (systém Com)
Přirozená kompetence • geneticky programovaný fyziologický stav dovolující příjem makromolekul DNA • DNA vstoupí do recipientní buňky za určitých růstových podmínek → kompetentní buňka • Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae
1-Bacterial cell DNA 2-Bacterial cell plasmids 3-Sex pili 4-Plasmid of foreign DNA from a dead cell 5-Bacterial cell restriction enzyme 6-Unwound foreign plasmid 7-DNA ligase I 8-integated DNA
Streptococcus pneumoniae QS: • • • •
navození stavu přirozené kompetence (systém Com) podíl na regulaci virulence a tvorby biofilmu signální molekula: CSP (Competence Stimulating Peptide) – 17ak CSP – vyštěpením z prekurzoru ComC (41ak)
Streptococcus pneumoniae
The precursor of the signaling molecules, ComC, is processed and secreted by the activity of the membrane-associated ComAB machinery. The competence stimulating peptide (CSP) interacts with membrane-associated histidine kinase ComD. This interaction results in the phosphorylation of the regulator ComE (ComE∼P). The activated regulator ComE∼P positively (+) stimulates the transcription rate of the Com-dependent promoters (Pcom). This leads to the increased production of the alternative sigma factor ComX, which in turn by interaction with the RNA polymerase core enzyme results in differential transcription of many secondary Com-dependent genes.
Streptococcus pneumoniae QS: • • • • • •
navození stavu přirozené kompetence (systém Com) podíl na regulaci virulence a tvorby biofilmu signální molekula: CSP (Competence Stimulating Peptide) – 17ak CSP – vyštěpením z prekurzoru ComC (41ak) rychlá odpověď – rychlé navození stavu kompetence a jeho ukončení důvod? – buňky ve stavu kompetence jsou citlivé k autolýze
Competence in Streptococcus pneumoniae (red line) rises sharply at a specific growth stage (blue line), followed by a rapid decline. Optical Density (OD550) was used to measure cell number and resistance to erythromycin (Ery-R) was used to assess competence (příjem DNA s rezistencí k Ery)
Staphylococcus aureus
Elektronový mikroskop
Světelný mikroskop (po obarvení dle Grama)
Typické kolonie na selektivním médiu
• gram-pozitivní kok • člověk = přirozený hostitel (20-50%) - kůže, vlasy, sliznice • záněty kůže a měkkých tkání • výskyt v potravinách – masné produkty, lahůdkové saláty, mléčné výrobky, pudinky • riziko – produkce termostabilních enterotoxinů (var 20min) • enterotoxikóza – zvracení, průjem, křeče (během 1-6 hodin)
Staphylococcus aureus systém arg = accessory gene regulator • dva operony, dva promotory (P2 a P3) P2: produkce a detekce signálu AIP P3: RNAIII = regulační úloha + δhemolysin → inhibice biofilmu
AIP
Staphylococcus aureus
1. exprese adhesinů – kolonizace 2. nárůst populace, nedostatek živin 3. exprese exoenzymů a toxinů 4. uvolnění buněk 5. nové působiště s dostatkem živin
Bacillus subtilis • G+ aerobní tyčinka • tepelně odolné spóry (120°C/30min) • QS: dva systémy pod kontrolou AIP • ComX – regulace přirozené kompetence • CSF – spolurace (Competence and Sporulating Factor) • kompetence: příjem DNA na pomezí exponenciální a stacionární fáze • sporulace: při limitaci živin
ComX
Bacillus subtilis – kompetence (Com)
• cca 10% buněk B.subtilis na počátku stac. fáze ve stavu kompetence
Bacillus subtilis • „přepínání“ mezi procesy kompetence a sporulace CSF • role v obou mechanismech • intracelulární signál • při nízké hustotě stimulace aktivity ComP/A • při vysoké hustotě „přepnutí“ do procesu sporulace
Jiné signální molekuly QS DSF – diffusible signal factor • poprvé u Xanthomonas campestris • další G-: Burkolderia, Pseudomonas, Stenotrophomonas… • zákl. struktura: mastné kyseliny
indol • podrobně popsáno u E. coli indol
Xanthomonas campestris - DSF
• G- aerobní tyčinka • rostlinný patogen – bakteriální skvrnitost • produkce extracelulárních enzymů (proteázy, pektinázy, celulázy) • kontrola QS: produkce enzymů, biofilm, rezistence k toxinům
• signální molekula: DSF = diffusible signal factor
Xanthomonas campestris - DSF • RpfF – signal synthesis • RpfC – detection • RpfG – signal transduction
RpfG • fosfodiesteráza • štěpí intracelulární cyklický nukleotid diguanosin-monofosfát (c-di-GMP) ; tzv. „second messenger“ – malé efektorové molekuly mající nezastupitelnou roli v řadě signálních drah a regulačních procesů
propojení mechanismů quorum sensing a c-di-GMP
Xanthomonas campestris - DSF
At low cell densities, when the concentration of DSF is low, RpfC interacts with RpfF and decreases its activity. In this state RpfG (green) is unphosphorylated and inactive. This leads to an increase in c-di-GMP levels. C-di-GMP binds to the transcription factor Clp (gray) to abrogate its ability to bind DNA. At high cell density, RpfC binds to DSF, leading to phosphorylation of RpfG, which activates its PDE activity and decreases the c-di-GMP pool. RpfF no longer binds to RpfC and produces more DSF. The decrease in c-di-GMP activates Clp, which then induces target gene expression either directly or through modulation of other transcription factors.
Indol jako signální molekula QS • produkce indolu - E. coli, některé kmeny Shigella, Enterococcus faecalis, V. cholerae, Aeromonas… (G- i G+) • indol – různé funkce (extracelulární signál, tvorba biofilmu, kontrola virulence, stabilita plasmidů… • signál QS – popsáno r. 2007 • řada podobností s AI-2 • TnaA – tryptofanáza (rozklad tryptofanu na indol + pyruvát + NH3)
Indol jako signální molekula QS
• TnaA – tryptofanáza (rozklad tryptofanu na indol + pyruvát + NH3)
Architektura systémů QS • paralelní: V. harvey / V.cholerae • propojené: Ps. aeruginosa (komplikovaně propojené Las, Rhl, Pqs) • kompetitivní: B. subtilis (přepínání mezi kompetencí a sporulací) • blesková reakce „On-Off“ : S. pneumonie (CSP - kompetence)
• odpověď na podnět hostitele: A. tumefaciens (opiny)
Využití znalostí o QS Quorum Quenching (QQ) = „zhášení“ inhibice QS na různých úrovních
Využití • medicína – nový typ „antibiotik“ • potravinářství – konzervanty, prevence kontaminace zaměřeno především na kontrolu virulence a tvorby biofilmu
Inhibice QS 3 strategies can be applied
Targeting signal generation
Targeting AHL signal dissemination
Targeting the signal receptor
Signal precursor
Signal precursor
Signal precursor
X Signal
Signal receptor
Signal
X
Signal receptor
Signal
X
Signal receptor
Inhibitory QS malé molekuly • kompetitivní inhibice – vazba na signální receptor • nejčastěji AHL-dependentní inhibitory • přírodní furanony • řasa Delisea pulchra • L-canavanine – luštěniny (až 5% sušiny) • grapefruit • cinnamaldehyd (skořicovník) • modifikace přírodních látek – zvýšení účinnosti
makromolekuly – „QQ enzymes“ • řada bakterií (konkurenční boj) • nejčastěji degradace signální molekuly (AHL, AI-2, DSF, PQS) • AHL laktonázy – hydrolýza laktonu • AHL acylázy – hydrolýza amidové vazby (lakton + m.kyselina) • AHL oxidázy a reduktázy – modifikace AHL • např. Bacillus sp. – metalo-β-laktamáza AiiA
Inhibitory QS – QQ enzymy
Laktonázy x Erwinia carotovora
Lactonase AiiA expression in plants inhibits virulence effects of Erwinia carotovora. E. carotovora was inoculated onto leaves of tobacco (a and b) or potato tuber slices (c), transformed with an aiiA expression vector (top row) or untransformed (bottom row). The extent of tissue maceration was measured at 20 h (a), 40 h (b), and 48 h (c).
Inhibice v systému LuxS
Possible AI-2-based druggable targets. (1) LuxS; (2) AI-2 transporter (such as LsrB); (3) efflux pump for AI-2; (4) extracellular receptor for AI-2 (such as LuxP); (5) intracellular receptor for AI-2; (6) AI-2-regulated transcription factor or repressor (such as LsrR); (7) small regulatory RNA (sRNA) mediated quorum sensing (QS) circuit.
Pseudomonas aeruginosa - QQ
Pseudomonas aeruginosa - QQ QS: • systémy las, rhl (+ regulační pqs) • faktory virulence • problém - multirezistentní kmeny • QQ – možná strategie terapie
Potenciální cíle QQ:
1. LasR / RhlR 2. AHL (3O-C12-HSL; C4-HSL) 3. lasI/lasR a rhlI/rhlR exprese
Pseudomonas aeruginosa - QQ Cíl QQ: LasR / RhlR
• analogy AHL • kompetice o LasR (RhlR) • inhibice aktivace LasR → nedochází k expresi elastázy • sloučeniny: s anilinovým kruhem, syntetické halogenované furanony
Pseudomonas aeruginosa - QQ Cíl QQ: AHL • AHL-specifické protilátky
• enzymové štěpení – laktonázy (problém s distribucí do místa infekce)
• blokace na úrovni LasI (inhibice produkce syntézy AHL - dráha SAM)
Pseudomonas aeruginosa - QQ Cíl QQ: lasI/lasR a rhlI/rhlR exprese • inhibice regulačních faktorů potřebných pro expresi
• „antisense“ oligonukleotidy – vazba na lasR/lasI → inhibice translace
Něco navíc
Transgenní E. coli „The beauty of this solution is that it uses P.aeurginosa’s own weapons against it“
Transgenní E.coli - produkce LasR – rozpoznání komunikace Ps. aeruginosa zaznamenání signálu LasR - exprese dvou genů • pyocin • lyzační protein – uvolnění pyocinu Účinnost – až 99% buněk Ps. aeruginosa v suspenzi; až 90% buněk v biofilmu (Saeidi, Wong, Lo, Nguyen, Ling, Leong, Poh & Chang. 2011. )
„Odposlech“ Chromobacterium violaceum • G- fakultativně anaerobní krátká tyčinka • pigment violacein (atb účinek) • produkuje pigment v přítomnosti AHL s krátkým řetězcem • mutantní kmeny – blokace syntézy AHL (biosenzory)
test produkce AHL
Test látek s anti-QS účinkem
Biosenzory AHL • neprodukují signál • mají receptor (LuxR) • reportérový gen (GFP, luciferáza…) • biosenzory pro různá spektra AHL (AHL s krátkým nebo dlouhým řetězcem…)
TCL přeliv: • extrakt rozdělem TCL • přeliv agarem s reportérovým kmenem • vznik „spotů“ • některé tvarově specifické 3-O-AHL kapky 3-OH-AHL kulaté
Shrnutí systémy komunikace
signální molekuly fenotypy řízené QS inhibice QS
Systémy komunikace intra-species AI-1, AIP inter-species AI-2
inter-kingdom AI-3
Systémy komunikace
Signální molekuly QS Základní: acyl-homoserin laktony (AHL) AI-1 G negativní analogie V. fischeri furanony AI-2 Vibrio sp. – furanosyl-borát diester cross-talk (G+ i G-) oligopeptidy AIP modifikace G pozitivní
Další: AI-3 epinefrin/norepinefrin buňka-hostitel, EHEC CAI-1 tridekanony (ketony s řetězcem C13) Vibrio harveyi, V. cholerae PQS = 2-heptyl-3-hydroxy-4-chinolon Pseudomonas aeruginosa DSF – nenasycené mastné kyseliny Difusible Signal Factor Xanthomonas campestris indol mezidruhová komunikace , E. coli
Fenotypy regulované QS
Konkrétní příklady • • • •
Vibrio fischeri - modelový systém LuxI/LuxR Vibrio harveyi / Vibrio cholerae – paralelní systémy, role small-RNA Pseudomonas aeruginosa – navzájem propojené systémy Las, Rhl, PQS E. coli – zákl. systém AI2 - Lsr, EHEC kmeny komunikace s hostitelem přes AI-3, indol • Agrobacterium – přenos plasmidů, opiny • Erwinia – extracelulární proteiny + antibiotika • Xanthomonas – propojení se systémem c-di-GMP, DSF • Streptococcus pneumoniae - kompetence • S. aureus – systém Arg • Bacillus subtilis – přepínání mezi stavem sporulace a kompetence
Děkuji za pozornost!
[email protected]
