OXIDOREDUKTÁZ ENZIMEK MODELLREAKCIÓINAK VIZSGÁLATA

OXIDOREDUKTÁZ ENZIMEK MODELLREAKCIÓINAK VIZSGÁLATA

DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS

Készítette: Baráth Gábor okleveles vegyész

Témavezető: Dr. Kaizer József egyetemi docens, az MTA doktora

PANNON EGYETEM KÉMIAI ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA

VESZPRÉM 2010

OXIDOREDUKTÁZ ENZIMEK MODELLREAKCIÓINAK VIZSGÁLATA Értekezés doktori (Ph.D.) fokozat elnyerése érdekében Írta: Baráth Gábor Készült a Pannon Egyetem Kémiai és Környezettudományi Doktori Iskolájának keretében. Témavezető: Dr. Kaizer József Elfogadásra javaslom (igen/nem). ………………………………. (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton ……...... %-ot ért el. Veszprém, …………………………….... ………………………………. a Szigorlati Bizottság elnöke Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: Dr. Joó Ferenc

igen/nem. ..…………………………… (aláírás)

Bíráló neve: Dr. Besenyei Gábor

igen/nem. ...…………………………… (aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …………%-ot ért el. Veszprém, ………………………………. .……………………………. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (Ph.D.) oklevél minősítése:…………………………….

.…………………………….. az EDT elnöke

Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Kaizer József egyetemi docensnek figyelméért, mindig hasznos gyakorlati és szellemi tanácsaiért. Köszönöm Dr. Speier Gábor egyetemi tanárnak munkám során nyújtott támogatását, valamint Dr. Pap József Sándor tudományos munkatársnak tanácsait és észrevételeit. Köszönettel tartozom Dr. Rockenbauer Antalnak és Dr. Korecz Lászlónak (MTA Kémiai Kutatóközpont) az ESR spektrumok felvételében és azok értékelésében nyújtott segítségét, Dr. Párkányi Lászlónak (MTA Kémiai Kutatóközpont) és Dr. Michel Giorginak (Spectropole, Université Aix-Marseille) a röntgendiffrakciós szerkezet-vizsgálatokért, valamint Dr. Larry Que Jr-nak (University of Minnesota) a rezonancia Raman vizsgálatokért. Köszönöm a Pannon Egyetem Szerves Kémia Intézeti Tanszéke minden dolgozójának önzetlen segítségét. Külön köszönet illeti Családomat, akik törekvéseimet mindvégig támogatták.

Baráth Gábor

Kivonat

Kivonat Oxidoreduktáz enzimek modellreakcióinak vizsgálata Készítette: Baráth Gábor, okleveles vegyész Témavezető: Dr. Kaizer József, egyetemi docens, az MTA doktora Az értekezésben bemutatott eredmények olyan enzimek modellezésére irányulnak, amelyek reakcióik során oxidálószerként dioxigént használnak fel. Ide sorolható a dioxigenázok közé tartozó flavonol 2,4-dioxigenáz, valamint az oxidázok közé sorolható pirokatechin oxidáz és 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz. A szervezetben az enzimek működése során melléktermékként reaktív oxigén származékok (ROS: Reactive Oxygen Species) és hidrogén-peroxid keletkezik, amelyek számos káros folyamat inicializálásában vesznek részt, így végül betegségekhez vezethetnek. A szuperoxid dizmutáz és kataláz – mint oxidatív stresszt csökkentő – enzimek és enzimmodell rendszerek iránti tudományos érdeklődés ennek köszönhetően az utóbbi években jelentősen megnőtt. A disszertációban bemutatásra kerülő kutatómunka ezekhez az enzimekhez kapcsolódik. Az enzimek aktív helyeinek tulajdonságaihoz igazodva célul tűztük ki új vas- és mangántartalmú komplexek előállítását és az enzimatikus reakcióknak megfelelő ún. bioutánzó reakciók, továbbá különböző szubsztrátumok oxidációs reakcióinak vizsgálatát. Az előállított modellvegyületek szerkezetét különböző spektroszkópiai módszerek (UV-VIS, IR, ESR, Mössbauer) és röntgendiffrakció segítségével jellemeztük. Az elvégzett részletes reakciókinetikai mérések alapján és a reakciók során keletkező intermedierek valamint termékek azonosítását követően (UV-VIS, ESR, rezonancia Raman, GC-MS), minden enzimmodell rendszer esetében javaslatot tettünk az oxigénezési és oxidációs reakciók lehetséges mechanizmusára vonatkozólag.

Abstract

Abstract Investigation of oxidoreductase mimics Written by: Gábor Baráth, Chemist Supervisor: Dr. József Kaizer, Associate Professor

The presented work was carried out in order to get insight into the mechanism of the flavonol 2,4-dioxygenase, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase, catechol oxidase, superoxide dismutase and catalase enzymes which play key role in the biosynthesis of various molecules in metabolic pathways and protect cells against such hazards. New manganese and iron complexes have been synthesized which were characterized with numerous spectroscopic (UV-VIS, IR, EPR, Mössbauer) and X-ray diffractometric methods. They served as good functional and structural models for the enzymes mentioned above. Various structural methods (UV-VIS, EPR, resonance Raman, GC-MS) were used to characterize the intermediates and products of the enzyme-like reactions. Detailed kinetic investigation of the catalytic reactions have been performed and reaction mechanisms were proposed.

Zusammenfassung

Zusammenfassung Studien über funkzionelle Modellsysteme Enzymes Oxidoreductase Von: Gábor Baráth, Diplomchemiker Mentor: Dr. József Kaizer, Professor für Chemie

Das Ziel der Doktorarbeit war die Untersuchung der Wirkungnsmechanismen von verschiedenen Metalloenzymen mit Hilfe von Modellverbindungen die zur Familie der Oxidoreduktasen gehören. Die Studien umfassten Untersuchungen von Flavonol 2,4dioxygenase, 1-Aminociklopropane-1-karbonsäure Oxidase, Pyrokatechin Dioxygenase, Superoxide Dismutase und Katalase. Diese Enzyme spielen eine Schlüsselrolle in der Biosynthese von verschiedenen Molekülen uns schützen die Zellen gegen aussere, schadliche Stoffen. Neue Mangan- und Eisen-Komplexe wurden synthetiziert, deren Struktur mit verschiedenen Methoden, wie UV-vis, IR, EPR und Mössbauer Spektroskopie sowie Röntgendiffraktion versichert wurde. Sie dienten als gute funkzionelle und strukturelle Modelle der genannten Enzyme. Diese analytische Methoden halfen auch die auftretende Intermediäre und Endprodukte zu identifizieren. Kinetische Untersuchungen von den Modellreaktionen wurden auch ausgeführt und Reaktionsmechanismen für die katalytische Reaktionen vorgeschlagen.

Rövidítések jegyzéke RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE TON

átalakítási arány (egységnyi katalizátorra vonatkoztatva)

ROS

reaktív oxigén származékok

FDO

flavonol 2,4-dioxigenáz

2,3-QDO

kvercetin 2,3-dioxigenáz

ES

enzim-szubsztrát (komplex)

Glu

glutaminsav

His

hisztidin

O(fla)

flavonolát

salenH2

bisz(szalicilidén-etilén-diamin)

O-bsH

O-benzoil-szalicilsav

dmf

N,N-dimetil-formamid

dmso

dimetil-szulfoxid

thf

tetrahidrofurán

ESR

elektron spin rezonancia

α-KGDO

α-ketosav-függő oxidázok/oxigenázok

TH

timin hidroxiláz

tauD

taurin dioxigenáz

P4H

prolil 4-hidroxiláz

4HPPD

4-hidroxi-fenil-piruvát dioxigenáz

ACCO

1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz

accH

1-amino-ciklopropán-1-karbonsav

Asp

aszparaginsav

MCD

mágneses cirkuláris dikroizmus

N-MeaccH

N-metil-1-amino-ciklopropán-1-karbonsav

acc-NH2

1-amino-ciklopropán-1-karbonsav-amid

acc-OMe

1-amino-ciklopropán-1-karbonsav-metilészter

BDE

kötésfelhasadási energia

aibH

2-amino-izovajsav

Asc

aszkorbát

DHAsc

dehidro-aszkorbát

pa

2-pikolil-amin

bpy

2,2’-bipiridil

Rövidítések jegyzéke phen

1,10-fenantrolin

tacn

1,4,7-triaza-ciklononán

PO

pirokatechin oxidáz

Cis

cisztein

SOD

szuperoxid dizmutáz

EXAFS

finomszerkezetű élközeli röntgenabszorpciós spektroszkópia

flaH

3-hidroxi-flavon

4’MeOflaH

3-hidroxi-4’-metoxi-flavon

4’ClflaH

3-hidroxi-4’-klór-flavon

4’NMe2flaH

3-hidroxi-4’-dimetilamino-flavon

O-MeObsH

metoxi-O-benzoil-szalicilsav

NEt3

trietil-amin

IR

infravörös spektroszkópia

UV-VIS

ultraibolya-látható spektroszkópia

py

piridin

GC

gázkromatográfia

MS

tömegspektrometria

NBT

nitroblue-tetrazolium

TOF

átalakítási frekvencia (egységnyi katalizátorra vonatkoztatva)

alaH

alanin

N4Py

N,N-bisz(2-piridilmetil)-N-di(2-piridil)metil-amin

m-CPBA

meta-klór-perbenzoesav

SIE

kinetikus oldószerizotóp effektus

PCET

protoncsatolt elektron transzfer

sz

szubsztrátum

indH

1,3-bisz(2’-piridil-imino)-izoindolin

4’MeindH

1,3-bisz(4’-metil-2’-piridil-imino)-izoindolin

6’MeindH

1,3-bisz(6’-metil-2’-piridil-imino)-izoindolin

bim2indh

1,3-bisz (2’-benzimidazoil-imino)-izoindolin

1’Me2bim2indh

1,3-bisz (1’metil-2’-benzimidazoil-imino)-izoindolin

dbcatH2

3,5-di-terc- butil-pirokatechin

catH2

pirokatechin

4Bu-catH2

4-butil-pirokatechin

4Me-catH2

4-metil-pirokatechin

Rövidítések jegyzéke Cl4catH2 dbsq

.-

tetrakloro-pirokatechin 3,5-di-terc- butil-szemikinon gyökanion

bpmpH

2,6-bisz[bisz(piridin-2-metilamino)metil]-4-metil-fenol

hbhpmipo

N,N,N’,N’-bisz[(2-hidroxibenzil)(N-metilimidazoil)]2-ol-1,3propéndiamin

bbppnolH2

N,N’-bisz(2-hidroxibenzil)-N,N’-bisz(pridilmetil)-2-hidroxi-1,3propiléndiamin

bisp

3,7-diazabiciklo[3,3,1]nonán

tpa

trisz-2-piridilmetil-amin

bpia

bisz-((pikolil)(N-metilimidazol-2-il)-amin)

salpnH2

N,N’-bisz(szalicilidén)-1,3-diamino-propán

2-OHsalpnH2

N,N’-bisz(2-hidroxi-szalicilidén)-1,3-diamino-propán

salpentOH

1,5-bisz(szalicilidénamino)pentán-3-ol

Mebimap

1,4-di-(2’-N-metilbenzimidazolilamino)-ftalazin

pa

pikolinát

paH

pikolin

tpaa

trisz{2-[N-(2-piridilmetil)amino]etil}amin

ntb

trisz(2-benzimidazoil-metil)amin

big

N,N-bisz[1-metil-2-imidazoil)metil]glicinát

tpen

N,N,N’,N’-(2-piridilmetil)etiléndiamin

(4MeO)4tpen

N,N,N’,N’-(4-metoxi-2-piridilmetil)etiléndiamin

bqpa

bisz(2-kinolilmetil)(2-metilpiridil)amin

6Me-bqpa

bisz(2-kinolilmetil)-6-metilpiridil-2-metilamin

6Me3-tpa

trisz-2-(6 metil)-piridilmetil-amin

ET

elektrontranszfer

PT

protontranszfer

HAT

hidrogénatom-transzfer; hidrogén absztrakció

Tartalomjegyzék

Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS ........................................................................................................................ 1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................ 3 2.1. Enzimek, mint biokatalizátorok....................................................................................... 3 2.2. Enzimmodellek ................................................................................................................ 5 2.3. Oxigenáz és oxidáz enzimek ........................................................................................... 6 2.4. A dioxigén reakciói ......................................................................................................... 7 2.5. Flavonoidok az élővilágban ............................................................................................. 9 2.6. Flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek (FDO) ...................................................................... 10 2.6.1. Réztartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzim és modellreakciói ............................. 10 2.6.2. Különböző átmenetifém-tartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek ..................... 15 2.7. -Ketoglutarát-függő oxidáz és oxigenáz enzimek (

KGDO) ................................... 17

2.7.1. 1-Amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz (ACCO) enzim és modellreakciói ...... 19 2.8. Pirokatechin oxidáz (PO) enzim és modellreakciói ...................................................... 22 2.9. Szuperoxid dizmutáz (SOD) enzimek és modellreakcióik ............................................ 26 2.10. Vas- és mangántartalmú kataláz enzimek és modellreakcióik .................................... 27 3. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ............................................................................ 33 3.1. Vas- és mangántartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz modellek ......................................... 33 3.1.1. Szintetikus Fe(III)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése ............... 33 3.1.2. Szintetikus Mn(II)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése ............... 42 3.1.3. A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata ................... 45 3.1.4. A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata ..................... 50 3.1.5. A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata ...................... 65 3.2. ACC oxidáz modellek.................................................................................................... 75 3.2.1. ACC oxidáz enzim modellreakcióinak vizsgálata .................................................. 75 3.3. Izoindolin-típusú ligandumok mangán- és vastartalmú komplexeinek előállítása ....... 84 3.3.1. Pirokatechin oxidáz modellek: 3,5-di-terc-butil-pirokatechin [Mn(6’R2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2-katalizált oxidációja ......................................................................................................................... 96 3.3.2. Kataláz és szuperoxid dizmutáz modellek............................................................ 103 3.3.2.1. A [MnII(ind)2] és a [MnII(4’Me2ind)2] komplexek kataláz-aktivitásának vizsgálata .................................................................................................................... 104

Tartalomjegyzék 3.3.2.2. A [MnII(ind)2] és a [MnII(4’Me2ind)2] és [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplexek szuperoxid dizmutáz aktivitásának vizsgálata ............................................................ 108 3.4. [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex katalitikus aktivitásának vizsgálata alkoholok oxidációs reakcióiban ........................................................................................ 110 4. ÖSSZEFOGLALÁS ......................................................................................................... 116 5. KÍSÉRLETI RÉSZ……………………..………………………………......................... 118 6. IRODALOMJEGYZÉK.………………………………………………………..……... 126

Bevezetés

1. BEVEZETÉS Az enzimek, mint a biológiai, biokémiai reakciók katalizátorai, szinte mindenütt megtalálhatók az élővilágban, működésükről azonban, csak az elmúlt évtizedek során szereztünk közelebbi ismereteket a mérés- és műszertechnika rohamos fejlődésének köszönhetően. A különböző vizsgálati módszerek (röntgendiffrakció, NMR, EXAFS) azonban az enzimek nagy molekulatömegének, nehézkes tisztíthatóságának és nehéz kristályosíthatóságának következtében gyakorlatilag csak a metalloenzimek tanulmányozása során alkalmazhatóak, de ott is csak korlátozottan. Egy viszonylag fiatal tudományág, a bioszervetlen kémia (biokoordinációs kémia), amely egyszerűen előállítható szerkezeti és működési modellek vizsgálatán keresztül próbálja felderíteni az aktív centrumban, vagyis a fémion koordinációs övezetében lejátszódó folyamatokat és az aktív hely spektroszkópiai viselkedését, az utóbbi években nagyarányú fejlődésen ment át. A modellreakciók vizsgálata arra is lehetőséget ad, hogy úgynevezett bioutánzó reakciókat dolgozzunk ki, egyrészt a preparatív hasznosítás, másrészt a homogén katalízis jobb megértése céljából. Az értekezésben bemutatott eredmények olyan enzimek modellezésére irányulnak, amelyek reakcióik során oxidálószerként dioxigént használnak fel. Ide sorolható a dioxigenázok közé tartozó flavonol 2,4-dioxigenáz, valamint az oxidázok közé tartozó pirokatechin oxidáz és 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz. A témakörök kiegészülnek, egyrészt

preparatív

alkalmazások,

másrészt

a

dioxigénaktiválás

mechanizmusának

megismerése céljából, ennek megfelelően kerülnek tárgyalásra a megfelelő szubsztrátumok vagy azokhoz szerkezetileg hasonló vegyületek átmenetifém komplexek által katalizált oxidációs és oxigénezési reakciói. Az élő szervezetben végbemenő oxidációs reakciók melléktermékeként reaktív oxigén származékok (ROS: szuperoxid gyök-anion, hidroxil gyök stb.) és hidrogén-peroxid keletkezik. A szuperoxid dizmutáz és kataláz enzimek – mint oxidatív stresszt csökkentő enzimek – és enzimmodell rendszerek iránti tudományos érdeklődés ennek köszönhetően az elmúlt években nagymértékben megnőtt. A dolgozat felépítése a következő: az irodalmi részben a témakör nagysága és szerteágazó jellege miatt csak az áttekintést segítő, összefoglaló közlemények kerültek feldolgozásra. Különös hangsúlyt kaptak a biológiai oxidációs, oxigénezési reakciók alapproblémái és azok eddigi ismeretei. Ezt követi egy rövid összefoglaló a tudományos eredményekről és azok értékeléséről, melynek alapját képező kísérletek részletes leírása a

1

Bevezetés kísérleti részben található. Az egyes rendszerekkel kapcsolatban megfogalmazott célokat, az elvégzett vizsgálatok eredményeinek összefoglalását, a levonható következtetésekkel együtt az adott témakörben ismertetjük.

2

Irodalmi áttekintés

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Enzimek, mint biokatalizátorok A biológiai katalizátorokat enzimeknek nevezzük. Működésük teszi lehetővé a kiválasztott kovalens kötések testhőmérsékleten történő felbontását és más, megfelelő kovalens kötések kialakítását. Nagyon specifikusan működnek, csak egy kiválasztott molekulatípusban egy adott kötést bontanak fel, a többit érintetlenül hagyják. Az élő szervezetekben minden anyag enzimreakciók sorozatán keresztül jön létre (anabolizmus), vagy bomlik le (katabolizmus). Érdekes, hogy még maguk az enzimek keletkezése

is

enzimek

által

katalizált.

Az

átalakulási

folyamatok

összességét

metabolizmusnak, vagy anyagcserének nevezzük (1. ábra).

Energia TERMÉK

TÁPANYAG

Metabolizmus (átalakítás) Katabolizmus (lebontás)

Anabolizmus (elõállítás)

Enzimatikus reakciók sorozata SZUBSZTRÁTUM 1. ábra Enzimreakciók szerepe az élő szervezetekben Az élőlények anyagcseréjében résztvevő szénvegyületek viszonylag egyszerűek, csak kevés tartalmaz 100-nál több atomot. Ha ezekre pontosan illeszkedő enzimfelületet akarunk elképzelni, akkor ennél lényegesen nagyobb méretre van szükség. Az enzimeknek szükségszerűen nagyságrendekkel nagyobb méretűeknek kell lenniük, mint amekkoráknak az anyagcserén átmenő anyagoknak. Ezek a molekulák lényegesen különböznek az átalakítandó vegyületektől, ezek a fehérjék. Amennyiben csak aminosavak alkotják őket, egyszerű fehérjékről beszélünk (proteinek, apoenzimek), ha nem fehérje természetű részt is tartalmaznak (prosztetikus csoport, koenzim), akkor összetett fehérjékről (proteidek, holoenzimek) van szó. Az enzimek aminosavakból épülnek fel, tehát a fehérjék családjába tartoznak. Molekulatömegük 1,2 × 104 – 5 × 105 Daltonig változhat [1]. Az enzimek alakfelismerő volta oly mértékben specifikus, hogy a reakcióban szereplő molekula teljes 3

Irodalmi áttekintés térszerkezetét figyelembe véve fejtik ki hatásukat. Mindezen tapasztalatok alapján a 19. század végén alakult ki az enzimek "kulcs-zár" elmélete, amelyhez 1958-ban, Daniel Koshland javasolt módosítást [2, 3]. Az enzim molekula csak a kiválasztott molekulához illeszkedhet alak és töltéstérkép szerint. Az enzimek geometriai szerkezete biztosítja, hogy csak egyetlen egy kiválasztott kötést torzítsanak el, éppen annak az aktiválási energiáját csökkentsék le (2. ábra). Ezért van az, hogy a nagyon sokféle, az összegképlet alapján lehetséges izomer közül az élő természetben csak meghatározott típusok fordulnak elő.

2. ábra Enzimműködés folyamata Egy enzim elsődleges szerkezete n darab aminosavból épül fel, tehát 20n féle variáció képzelhető el az aminosav-szekvencia kialakulásánál. Ha egy viszonylag kis fehérjét vizsgálunk, amelyet 100 aminosav alkot, a variációk száma 20100 vagy 10130, ami hatalmas szám, nagyobb, mint az összes molekula száma az univerzumban. Nem túlzás tehát azt állítani, hogy minden eddig ismert kémiai reakcióhoz létezik egy enzim, amely képes katalizálni azt. Természetesen megtalálni minden kémiai, biokémiai folyamathoz a megfelelő enzimet nem egyszerű feladat, valószínűleg nem is lehetséges. Az eddig ismert enzimek közel egyharmada fémiont (vagy fémionokat) tartalmaz, amelyek többféle módon kötődhetnek a fehérjéhez és többféle funkciót is elláthatnak. Ezeket két csoportra osztjuk: metalloenzimekre és fémionok által aktivált enzimekre. A metalloenzimekben a fémion az enzimmolekulába beépült alkotórész, a fémion és a fehérje sztöchiometrikus aránya meghatározott érték. Amennyiben a fémiont kiszakítjuk a metalloenzimből, az enzim elveszíti aktivitását. A fémionok által aktivált enzimek esetében egyensúly áll fenn a fémion és az enzim, továbbá a fémion aktiválta enzim között. Ennél az enzimcsoportnál a fémet egyszerű kémiai módszerekkel el lehet választani a fehérjétől anélkül, hogy az aktivitását teljesen elveszítené. A katalizált reakciók típusa szerint az enzimek az alábbi hat fő csoportba sorolhatók (1. táblázat) [4]: 4

Irodalmi áttekintés 1. táblázat Az enzimek csoportosítása a katalizált reakciók típusa szerint enzimcsoport

katalizált reakció(k)

hidrolázok

fehérjék peptid kötésének, poliszacharidok glikozidkötésének, zsírok, foszfátok észterkötésének hasítása

oxidoreduktázok

redoxireakciók, melyek során elektronok vagy hidrogénatom kerül át egyik molekuláról a másikra

transzferázok

egy meghatározott atomcsoport átvitele egyik molekuláról a másikra

izomerázok

különböző átrendeződéses reakciók

liázok

a szubsztrátum egy adott csoportjának hidrolitikus eltávolítása

ligázok

két molekula összekapcsolása

Az enzimek – ipari folyamatokban – biokatalizátorként történő felhasználása, napjainkban igen intenzíven kutatott terület. A legfőbb problémát az jelenti, hogy az iparban alkalmazott reakciókörülmények oly mértékben eltérnek a fiziológiás körülményektől, hogy legtöbb esetben az enzimek nem képesek kifejteni hatásukat. Az enzimek biokatalizátorként való felhasználásának előnyeit és hátrányait az 2. táblázatban foglaltuk össze [5-11]. 2. táblázat Enzimek biokatalizátorként való felhasználásának előnyei és hátrányai Előnyök nagy szelektivitás nagy aktivitás enyhe körülmények között nagy átalakítási arány (TON) biodegradábilis általában természetes anyagok

Hátrányok nagyon komplex molekulák magas előállítási költség belső fragmentálódás

2.2. Enzimmodellek Az enzimmodelleknek alapvetően két csoportját különböztetjük meg: vannak ún. szerkezeti és működési (funkcionális) modellek (3. ábra). Az enzimek szerkezeti modelljei az aktív centrum térbeli szerkezetének megismerését segítik elő, a modellek és az enzimek spektroszkópiai adatainak összehasonlításával. Mivel az alkalmazható ligandumok tárháza igen gazdag, azok felhasználásával egyre jobban megközelíthetővé válhat az enzim aktív

5

Irodalmi áttekintés centrumának felépítése. Azt azonban szem előtt kell tartani, hogy a szintetikus vegyületek gyakran túl stabilisak ahhoz, hogy katalitikus funkciókat lássanak el. A funkcionális (működési) modellek esetében nem a szerkezeti hasonlóság a meghatározó. A cél, az oxigénezési, oxidációs folyamat mechanizmusának megértése és ennek révén hasonló, mesterséges katalitikus reakciók kidolgozása. Az enzimek szelektivitását és aktivitását azonban nagyon nehéz reprodukálni, mivel a bioutánzó rendszerek gyakran a természetestől eltérő körülmények között működnek. Nem elképzelhetetlen azonban, hogy a gyors ütemben fejlődő modellek megközelítsék, illetve túllépjék a proteinek bizonyos tulajdonságait.

Szerkezet Szerkezeti modellek

Stabilis köztitermék

Reakció mechanizmus

Fémkomplex

Metalloenzim

Funkció

Funkcionális modellek

Instabilis köztitermék

Katalitikus reakció

3. ábra A metalloenzimek szerkezeti és működési modelljei 2.3. Oxigenáz és oxidáz enzimek Az enzimek egy rendkívül fontos csoportját képezik az oxidáz és oxigenáz enzimek, amelyek többsége a metalloenzimek csoportjába sorolható. Széles körben megtalálhatók különböző élő szervezetekben, állatokban, növényekben és mikroorganizmusokban. Funkciójukat tekintve kulcsfontosságú szerepet töltenek be, a növényi és állati szervezetek számára mérgező anyagok, valamint esszenciális vegyületek – mint a különböző aminosavak, cukrok, zsírsavak, vitaminok, lipidek, szteroidok – aerob körülmények között lejátszódó lebontási folyamataiban, illetve bioszintézisében. A degradációs folyamatok „reakcióhőjét” a sejtek energiaforrásként, a keletkező termékeket pedig szénforrásként hasznosítják. Az oxidáz és oxigenáz enzimek közös jellemzője, hogy az általuk katalizált folyamatokban a dioxigén nélkülözhetetlen. Az oxigenáz enzimek aktív centrumukban többnyire rezet, vasat vagy mangánt tartalmazó metalloenzimek, amelyek a dioxigén molekula egy vagy két oxigénatomjának beépülését katalizálják a megfelelő szerves szubsztrátumba. Első esetben monooxigenázokról (1), utóbbi esetben dioxigenázokról (2,3) beszélünk. 6

Irodalmi áttekintés Dioxigenázok esetében további két alcsoportot is megkülönböztethetünk, az intrailletve az intermolekuláris dioxigenázokat. Az intramolekuláris enzimek közös jellemzője, hogy a dioxigén mindkét atomja ugyanazon szubsztrátumba épül be (2), az intermolekuláris dioxigenázok esetében pedig a dioxigén atomjai két szubsztrátum között oszlanak meg (3). Az utóbbi években karakterizált vastartalmú dioxigenáz enzimek két csoportra oszthatók, a Fe(III)-iont tartalmazó intradiol dioxigenázokra, amelyek aktiválják a szubsztrátumot mielőtt a molekuláris oxigén reakcióba lépne velük és a Fe(II)-iont tartalmazó extradiol dioxigenázokra, melyek esetében a molekuláris oxigén aktiválása a kulcs lépés. [1214]. Készültek közlemények mangán- [15], magnézium- [16] és réztartalmú [17] dioxigenáz enzimekről is. Az oxidáz enzimek is aerob körülmények között fejtik ki hatásukat, de az oxigenázokkal ellentétben, itt az oxigén szubsztrátumba való beépülése nem játszódik le, az enzim a szubsztrátum oxidatív dehidrogéneződéséért felelős. A fenti reakciókban másodlagos termékként víz vagy hidrogén-peroxid keletkezik (4,5). −

+

S + O2 + 2e + 2H = SO + H2O

(1)

S + O2 = SO2

(2)

S + S’ + O2 = SO + S’O

(3)

−

+

O2 + 4e + 4H = 2H2O

(4)

SH2 + O2 = S + H2O2

(5)

2.4. A dioxigén reakciói Az aerob élőlényekben a dioxigén felhasználása egy négyelektronos redukción keresztül megy végbe, melynek során egy mol oxigén molekulából 2 mol víz keletkezik (6) [18]. Elektrongazdag, szerves tápanyagok (pl. glükóz) oxidációjával összekapcsolva, ez a folyamat biztosítja az aerob előlények energiaellátását. A biológiai oxidációk ezen típusát légzésnek nevezzük.

O2 + 4H+ + 4e E0

2H 2O

(6)

= +0,815V

A triplett állapotú dioxigén két pártalan elektronnal rendelkezik, stabilis és ezért szingulett állapotú szerves szubsztrátumokkal szemben inert. A lényegesen nagyobb

7

Irodalmi áttekintés energiatartalmú,

instabilabb

szingulett

állapotú

dioxigén

reaktivitása

nagyobb

és

redoxirakciókban, valamint elektrociklikus reakciókban (pl. olefinekkel, Diels-Alder-típusú reakciókban) jól reagál (3. táblázat). 3. táblázat A dioxigén elektronállapotai és tulajdonságai [19-21] Elektronállapot 1

Σg

1 3

g

Σg

HOMO

Relatív energia

Élettartam (s)

orbitálok

(kJ)

Gáz - folyadék

Szerkezet

↑

↓

154,8

7,12

10-9

↑O − O↓

↑↓

−

92,0

3000

10-3

O=O

∞

↑O − O↑

↑

↑ x

0,0

∞

*y

A dioxigénnek a redoxireakciókban mutatott viszonylagos inertsége az első elektron termodinamikailag kedvezőtlen felvételével is magyarázható (E° = -0,32 V) [22]. A szuperoxid aktivitása ennek megfelelően lényegesen nagyobb [23]. A dioxigént felhasználó metalloenzimek és modellvegyületeik vizsgálata kapcsán felmerül a kérdés, hogy a dioxigén aktiválása milyen módon, milyen lépéseken keresztül valósul meg. Ennek megértésében sokat segíthet az intermedier-kutatás, amelynek feladata, hogy az enzimfolyamatokban és az azokat modellező bioutánzó rendszerekben a reaktív intermedierek elkülönítésén, spektroszkópiai jellemzésén keresztül információt nyújtson a dioxigén- és rajta keresztül a szubsztrátumaktiválás mechanizmusáról. A dioxigén-molekula termodinamikai inertsége feloldható olyan átmenetifémek segítségével, amelyek dioxigénnel komplexet képeznek. Az oxidáz és oxigenáz enzimek esetében a dioxigén aktiválását reaktív peroxo- és oxo-intermedierek képződésén keresztül képzelik el, amelyek reakciója (C–H aktiválás, oxigéntranszfer, stb.) a megfelelő szubsztrátum molekulával már könnyen értelmezhető (4. ábra) [24-28]. Az aerob élőlények a dioxigént több más reakcióban is felhasználják, többek között különböző molekulák bioszintézisében, továbbá molekulák vízoldhatóvá tételében a kiválasztást elősegítendő. A fenti reakciók legnagyobb része mono- és dioxigenáz enzimek által katalizált. A sejtek belsejében uralkodó reduktív környezetnek köszönhetően, az ott jelenlévő vegyületek az enzimek szabályozó hatását megkerülve, termodinamikailag képesek reakcióba lépni dioxigénnel, melynek során reaktív oxigén származékok (ROS: szuperoxid gyök-anion, hidroxil gyök, stb.) és hidrogén-peroxid keletkezik [29]. 8

Irodalmi áttekintés FeII Cu

I

FeII

Cu

FeII

O

O

I

O2

FeII

O2 (H+, e-)

O2 O

Peroxo

O

CuII

III

Fe

CuII

CuIII O

O

O

CuIII

Hemocianin, Tirozináz Katekoláz

FeIII

FeIV

O FeIII

O(H)

O

O

O

Oxo

O

O

O

FeIV O

O2 kofaktor (ketosav) FeIII OOR

O(H) FeIV

FeIV O

O

Metán monooxigenáz Ribonukleotid reduktáz

Naftalin dioxigenáz

TauD dioxigenáz Bleomicin

4. ábra Dioxigénaktiválás mechanizmusa átmenetifémek (Cu, Fe) jelenlétében 2.5. Flavonoidok az élővilágban A növényi flavonoidok szerepéről, kémiai szerkezetéről, élettani hatásáról az elmúlt negyven évben rendszeresen jelentek meg összefoglaló tanulmányok [30-32], de az emberi szervezetre gyakorolt hatásuk és jelentőségük még ma sem teljesen tisztázott. Szent-Györgyi és munkatársai már 1936-ban kimutatták, hogy a citrusfélékből származó két flavonoid (rutin, naringenin) csökkenti a kapillárisok törékenységét és permeabilitását [33]. A flavonoidokat Pvitaminnak nevezte el (P ~ permeabilitás), illetve C2-vitaminnak, mivel számos flavonoid képes a C-vitamint stabilizálni. Az 1950-es években a flavonoidok vitamin elmélete megdőlt. A hetvenes években felfedezték, hogy a növényekben az egyik leggyakrabban előforduló flavonoid, a kvercetin bizonyos körülmények között mutagén hatású, ezért nagy figyelem irányult a flavonoidok karcinogenitására, amelyet később nem sikerült egyértelműen bizonyítani. Napjainkban e korai eredményeket kissé elfeledve a legtöbb kutatócsoport a flavonoidok egészségvédő és betegségmegelőző hatását helyezi előtérbe. Jelenlegi ismereteink szerint több ezer különböző szerkezetű flavonoid létezik, amelyek egymástól az alapszerkezethez kapcsolódó hidroxilcsoportok számában, helyzetében,

9

Irodalmi áttekintés valamint a C2 - C3 szénatomok közötti kettős kötés meglétében, vagy hiányában térnek el egymástól. Ezeken belül az alábbi főbb csoportok különíthetők el [31]:

-Kalkonok

-Flavononok (bioflavonoidok)

-Auronok

-Antocianidinek

-Flavonok

-Izoflavononoidok

-Flavonolok A kalkonok és auronok jelenlegi ismeretek szerint kisebb jelentőséggel bírnak. A flavonok részt vesznek a növények színének és ízének kialakításában, a flavonolokat a növényvilág csaknem valamennyi tagja előállítja, legnagyobb koncentrációban a gyümölcsök héjában fordulnak elő. 2.6. Flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek (FDO) 2.6.1. Réztartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzim és modellreakciói A dioxigenáz enzimek egy kisebb csoportját képezik a flavonol 2,4-dioxigenázok (FDO = kvercetin 2,3-dioxigenáz (2,3-QDO), vagy kvercetináz), amelyek a flavonolok gyűrűbontási reakcióját katalizálják, a megfelelő O-benzoil-szalicilsavat és szén-monoxidot eredményezve (7) [34-38]. R R

O

-CO O

R

R OH

R

R O2

FDO enzim

O

R

C

O CO 2H

R

(7)

R= H; OH

Az első enzimet, amely ezen átalakulásokat katalizálja, több mint négy évtizeddel ezelőtt ismerték fel az Aspergillus fajaiban [39]. Az Aspergillus-ból izolált, kvercetinázok [40-43] spektroszkópiai vizsgálatai alapján igazolták, hogy a fenti enzim aktív centrumában rezet tartalmaz [17,41,44]. Bár az Aspergillus flavus-ból és Aspergillus niger-ből nyert enzimek spektroszkópiai és biokémiai vizsgálata során számos hasznos információhoz jutottak, az igazi áttörést az Aspergillus japonicus-ból izolált enzim (FDO) 1.6 Å felbontású röntgendiffrakciós szerkezet-meghatározása jelentette (5. ábra). A szerkezet alapján az enzim

10

Irodalmi áttekintés ~100 kDa molekulatömegű, két egyenként egy rezet tartalmazó alegységből álló homodimer. Az egymagvú centrumokat tekintve két egymástól eltérő geometria figyelhető meg [44].

5. ábra Az Aspergillus japonicus-ból izolált FDO enzim szerkezete és a réz(II)ion koordinációs övezete: A) Torzult tetraéderes koordináció B) Torzult trigonális bipiramisos koordináció [44] Az irodalomban több réztartalmú enzim-szubsztrát (ES) röntgenszerkezet is a rendelkezésünkre áll, amely alapján az ES komplex kialakulásával kapcsolatosan számos információhoz juthatunk [45,46]. Torzult síknégyzetes piramisos szerkezet kialakulása figyelhető meg kvercetin és kamferol koordinációja esetében ( = 0,38 és 0,41), a síkban két hisztidin [N(His66) és N(His112)] és a glutamát [O(Glu73)] ligandumok mellett a szubsztrát [O(fla)] egyfogú koordinációja figyelhető meg, a harmadik hisztidin [N(His68)] mindkét esetben apikális pozícióban van. Az ilyen módon kötött szubsztrátum jóval reaktívabb dioxigénnel szemben, mint a kelátban stabilizált forma (6. ábra).

6. ábra Az FDO enzim kvercetinnel képzett komplexének szimulációs röntgendiffrakciós szerkezete [44] A szubsztrátum egy- vagy kétfogú koordinációját a 7- és 4’-hidroxi-csoportok megléte vagy hiánya határozza meg. A szubsztrátum O3 és a glutamát nem koordinálódó O2 atomja 11

Irodalmi áttekintés közötti kölcsönhatások [2,43 Å (kamferol) és 2,66 Å (kvercetin)] azt sejtetik, hogy a glutamát protonált formában van jelen. A glutamát egyik lehetséges szerepe tehát a szubsztrátummolekula deprotonálása. A réz szerepét a kvercetin 2,3-dioxigenáz által katalizált enzimfolyamatokban, Simpson a következő általa feltételezett mechanizmusban vázolta fel (8) [42,45]:

O

O

O O O

+ O2

[ ENZIM-Cu ] + O

OH

O

O

O

O Cu-ENZIM

Cu-ENZIM

(8)

O

O

C O CO2 H

CO +

O

O

O

O

O

O

O O

O Cu-ENZIM

Cu-ENZIM

Az első fémtartalmú modellek előállítása Nishinaga és munkatársai nevéhez fűződik, akik [CoII(salen)], illetve [CuII(acetát)2] katalizátort alkalmaztak a flavonol-származékok dioxigénezési reakciójában [47,48]. Mivel a kobalttartalmú rendszer hatásosabbnak bizonyult a réztartalmú rendszernél (konverzió: ~37%), ezért a kiterjedtebb vizsgálatok ezen rendszerre irányultak. A III

reakcióban

[Co (salen)(OH)]

és

feltételezett flavonol

[CoIII(salen)(fla)]

reakciójában

állították

komplexet elő,

diklór-metánban

melynek

szerkezetét

röntgendiffrakciós méréssel meghatározták [49], majd vizsgálták oxigénezési reakcióját [50]. Megállapították, hogy a reakció oldószerfüggő, valamint hogy termékként az enzimatikus útnak megfelelő depszidet tartalmazó [CoIII(salen)(O-bs)] komplex keletkezik. Az oxigénezés dmf-ban és dmso-ban gyors, MeOH-ban lassú, míg thf-ban és CH2Cl2-ban nem megy végbe. A szubsztituensek hatását vizsgálva azt találták, hogy a 7-es és 4’-es szénen lévő hidroxivagy metoxicsoportok megnövelik a szubsztrátum reaktivitását, ami összhangban van az enzimatikus reakcióknál tapasztaltakkal. A reakcióelegy (dmf) ciklikus-voltametriás vizsgálata alapján azt találták, hogy a komplex az oldószer hatására disszociál és a dioxigén az így képződő flavonolát-anionnal lép reakcióba [51,52]. Ennek bizonyítására elvégezték a flavonol terc-BuOK jelenlétében történő 12

Irodalmi áttekintés oxigénezését is. A fentiek ismeretében javasolt mechanizmus (7. ábra) kritikus lépése a flavonolátion és a dioxigén reakciója. Nishinaga szerint ez egy közvetlen egylépéses, ún. koncertikus reakció, amely cikloaddíciós mechanizmussal, gyökintermedierek képződése nélkül játszódik le [53]. Mivel ezen reakció spintiltott (a szingulett állapotú szerves molekula nem képes reakcióba

lépni

az

alapállapotú

triplett

dioxigénnel

szingulett

állapotú

terméket

eredményezve) [54], ezért Nishinaga a látszólagos ellentétet triplett és szingulett állapotú töltésátviteli komplexek és a köztük fennálló ún. spinváltó átmenetek feltételezésével oldotta fel [55].

O

Ph

[CoIII(salen)(OH)]

OH

-H2O

O

Ph O

O

O

CoIII(salen) dmf

O

Ph III + [Co (salen)(dmf)x] O

O O

O2 /dmf/

Ph

O

Ph

O

O O Co (salen)

III + [Co (salen)(dmf)x]

O O

dmf

III

O

1

O

Ph

3 3

O

O2

O O

O O

O 3

[CT]

1

Ph

O

O

O O

O

spinváltó átmenet

Ph

M+

MO O O Ph O

O O

1

[CT]

7. ábra Flavonol báziskatalizált oxigénezésének javasolt mechanizmusa Összefoglalva tehát elmondható, hogy a Nishinaga által vizsgált terc-BuOK és kobalttartalmú rendszerekben a fém szerepe a szubsztrátum aktiválásában van, amely deprotonálódáson keresztül valósul meg. Mivel a fém oxidációs foka a reakció során nem

13

Irodalmi áttekintés változik, valamint a fémnek csak a bázikus karaktere dominál, ezért ezen rendszereket ún. báziskatalizált, „nem redoxaktív” fémtartalmú rendszereknek nevezzük. Speier és munkatársai a 8. ábrán feltüntetett ligandumokkal alkotott Cu(I)- és Cu(II)tartalmú komplexeket állítottak elő és alkalmaztak az enzimreakció vizsgálatára. Ezek során kiderült, hogy a fenti komplexek reakciói funkcionálisan jól modellezik az enzimet, tehát a megfelelő depszidet eredményezik, viszont csak kis sebességgel és erélyes körülmények között játszódnak le. Szerkezeti modellként ezek a rendszerek pedig még nem megfelelők, bár ennek a kísérletek elvégzésekor még gyakorlati akadályai voltak. Az enzim szerkezetéről ugyanis csak ezen komplexek vizsgálatát követően, krisztallográfiai mérések alapján kaptak pontos információt. Az enzimatikus tulajdonságoknak leginkább megfelelő komplexeket rézzel állították elő. Takeda és munkatársai flavonol származékok reaktív részéhez formailag hasonló 1,2ciklohexándion (illetve annak enolos formája), mint modellvegyület oxigénezési reakcióját vizsgálták metanolban CuCl2.5H2O katalizátor jelenlétében [56].

P N

N H3 C H3 C 1,10-fenantrolin [57]

N

N

2,2'-bipiridin [57]

trifenil-foszfán [58]

N

HN

N

N N HN

N

N

CH 3 N

N CH 3

CH 3

N CH 3

H 3C

N,N,N',N' -tetrametiletilén-diamin [57]

3,3'-imino-bisz(N,N-dimetil-propil-amin) [59]

N

HN

NH NH N

H 3C

N H

N

N N

N

1,4-(di-2'-piridil)amino-ftalazin [60]

N

N

NH N

N

N

1,3-bisz(2'-piridil-imino)-izoindolin [61]

8. ábra Flavonol 2,4-dioxigenáz modellek előállításánál használt ligandumok

14

Irodalmi áttekintés 2.6.2. Különböző átmenetifém-tartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek A réztartalmú FDO enzim mellett az első vastartalmú kvercetináz enzimet 2003-ban izolálták. Az enzimológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy az enzim aktív centruma nagy hasonlóságot mutat a korábban vizsgált réztartalmú enziméhez. A vizsgálatok során azt tapasztalták, hogy az enzim katalizálja a flavonolok oxigénezési reakcióit, tehát flavonol 2,4dioxigenáz aktivitást mutat. A spektroszkópiai vizsgálatok (ESR) alapján az aktív centrumban vas(II)- és vas(III)ion jelenléte is kimutatható volt [62]. Az inhibíciós vizsgálatok azonban arra utalnak, hogy a kvercetin átalakulásáért a vas(II)ion felelős. A kísérletek során a Fe(II) specifikus inhibitorok – 1,10-fenantrolin és 2,2‘-bipiridin – 50 százalékos inhibíciót okoztak mindössze 200 μM koncentrációban. Érdemes megjegyezni, hogy a Fe(III) specifikus inhibítor (Tiron) a kísérletek során növekedést eredményezett az aktivitásban, alátámasztva a vas(II) szerepét [63]. A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FDO) szerkezetét a 9. ábra szemlélteti. A vastartalmú FDO enzimek a réztartalmúakhoz hasonlóan két, egyenként egy vasat tartalmazó alegységből álló homodimer. Mindkét alegységben – melyek között csekély geometriai eltérés figyelhető meg – a Fe(II)-ion pentakoordinált formában helyezkedik el. A szerkezetek között megfigyelhető eltérések a fémet megkötő glutamát nyílt és zárt geometriai formái közti különbségnek tulajdoníthatók (10. ábra) [64].

9. ábra A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FDO) szerkezete [64] Shaab és munkatársai Escherichia coli baktérium segítségével különböző kétvegyértékű fémet tartalmazó kvercetináz enzimeket állítottak elő. Mn(II), Co(II) és Cu(II) hozzáadása esetén aktív enzim keletkezett, míg Zn(II), Fe(II) és Cd(II) alkalmazása során nem

15

Irodalmi áttekintés volt szignifikáns aktivitás-növekedés. Az ily módon előállított Mn(II)- és Co(II)-tartalmú kvercetinázokat tisztították és jellemezték. Az ESR spektrumok alapján megállapították, hogy a Mn(II)-tartalmú enzimben a két mangánion oktaéderes koordinációjú. A kinetikai vizsgálatok során kimutatták, hogy a mangántartalmú enzim mintegy negyvenszer nagyobb aktivitást mutat, mint a Fe(II)-tartalmú kvercetináz és közel azonos aktivitású, mint a Cu(II)tartalmú (4. táblázat), az eredmények alapján tehát a kvercetináz enzim aktív centruma feltételezhetően Mn(II)-tartalmú [65].

10. ábra A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FDO) szerkezete [64]

4. táblázat A kvercetináz enzimek kinetikai adatai: a) A kvercetináz enzim aktív centrumában lévő fém; b) [63] Féma

Atomok/alegység

kkat (s-1)

KM (µM)

KM(O2)( µM)

Mn

1,8

25±1

4,0±0,9

90±10

Co

0,65

6,7±0,2

7,5±0,5

79±5

Fe

0,80b

0,65±0,02

5,2±0,6

150±9

16

Irodalmi áttekintés 2008-ban Merkens és csoportja egy új organizmusból, a Streptomyces baktériumból különítettek el FDO enzimet Escherichia coli baktérium segítségével. A baktériumból kinyert természetes enzimhez különböző átmenteti fémeket adva vizsgálták az aktivitásokat, hasonlóan, mint a B. subtilis esetében. A Ni(II) és Co(II) fémiont tartalmazó enzim a kinetikai mérések során nagy aktivitást mutatott a Mn(II), Fe(II), Cu(II), Zn(II) központi fémiont tartalmazó enzimekhez képest (5. táblázat) [66]. 5. táblázat A kvercetináz enzimek kinetikai adatai: a) A kvercetináz enzim aktív centrumában lévő fém; b) [67] Féma

Atomok/alegység

kkat (s-1)

KM (µM)

KM(O2)( µM)

Fe

0,44 b

1,5±0,1 b

14,1±0,7 b

-

Co

0,33

7,6±0,5

0,96±0,05

1230±310

Ni

0,55

40,1±3,4

5,75±0,12

256±45

Berreau és munkatársai vas-, mangán-, kobalt- nikkel- réz- és cinkartalmú flavonolát komplexeket állítottak elő, és vizsgálták, hogyan befolyásolja a központi fémion tulajdonsága a szerkezeti, spektroszkópiai és redoxi tulajdonságokat, valamint tanulmányozták a ligandumkicserélődési reakcióikat. A komplexek dioxigénnel való reakcióját csak a vas(II)komplex esetében végezték el, amelynek során az enzimatikus úttól eltérően egy µ-Ovas(III)komplex keletkezett [68]. Funkcionálisan működő vas-, mangán-, és nikkeltartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimmodell-rendszerek

az

irodalomban

eddig

még

nem

ismertek,

tehát

ezen

modellreakciókról szerzett tapasztalataink segíthetnek tisztázni a fém(ek) enzimben betöltött szerepét. 2.7. -Ketoglutarát-függő oxidáz és oxigenáz enzimek (

KGDO)

Az oxidoreduktáz enzimek fontos csoportját képezik az -ketoglutarát-függő oxidázok és oxigenázok [69], amelyek különböző, biológiailag fontos vegyületek, pl. aminosavoldalláncok hidroxilezési reakcióinak katalízisét végzik. Az

-ketosav ebben az esetben

kofaktorként, vagyis az enzim működését elősegítő csoportként funkcionál. Általánosságban elmondható róluk, hogy

-ketosav jelenléte nélkül az enzimatikus

reakció (kevés kivétellel) nem játszódik le. Másik fontos sajátságuk, hogy bár aminosav-

17

Irodalmi áttekintés szekvenciájuk jelentős változatosságot mutat, az aktív helyük szinte kivétel nélkül két hisztidines nitrogénnel és egy glutaminsavból, vagy aszparaginsavból származó karboxilátfunkcióval kötött vas(II)iont tartalmaz. A 2N,O donoratom-csoport mellett még három vízmolekula kapcsolódik a vas(II)centrumhoz (11. ábra) [70], így alakul ki a hatos koordináció.

(His)N R

(His)N

OH2

II

(Glu)O

OH2

N(His) O FeII OH2

O

SH R

(His)N

N(His) O FeII

(Glu)O

O

R

O

O

SH O2

N(His) O FeII

(Glu)O

Fe

-KG

OH2

SOH RCOOH CO2

(His)N

N(His)

OCO O

(His)N

R

(Glu)O

N(His) O FeIV O

OCO O

(His)N

R

(Glu)O

N(His) O FeIV O O O

SOH SH

11. ábra A vastartalmú

R O

(His)N (Glu)O

N(His) O FeIII O O2

SH

R O

SH

KG-függő dioxigenázok reakcióira javasolt általános mechanizmus

A 11. ábrán látható javasolt mechanizmus [71] épp ezért szinte az összes enzimre érvényes. Első lépésben az

KGDO

-ketosav kétfogú ligandumként való koordinációja

történik öttagú kelátgyűrű képződése közben. Ezzel párhuzamosan két vízmolekula kiszorul a koordinációs övezetből. A szubsztrátum ezután megkötődik a vas(II)ion közelében, kiszorítva a maradék vízmolekulát a vas(II)ion mellől, utat nyitva egy dioxigén molekula koordinációjának. A vas(III)hoz kapcsolódó szuperoxo-ligandum ezután már képes a ketosav ketonos szénatomját támadni, peroxo-vas(IV) intermedier kialakulását eredményezve. Az O O kötés felhasadásával végül létrejön az oxovas(IV) egység, amely a közelben rögzített szubsztrátum C H kötését támadja. A termékek (hidroxilezett szubsztrátum, szén-dioxid és karbonsav) a ciklus zárásaként elhagyják az aktív helyet. Az előbbi átmeneti állapotok közül többnek a röntgenszerkezete is ismert. A fenti mechanizmussal írható le többek között az alábbi enzimek működése, a nukleinsavak metabolizmusát katalizáló timin hidroxiláz (TH) (9) [72]; a taurin dioxigenáz (tauD) (10), amelynek a szulfit metabolizmusban van szerepe [73]; a prolil 4-hidroxiláz (P4H) (11), amely a kollagént stabilizáló 4-hidroxi-prolint állítja elő [74]; a 4-hidroxi-fenil-piruvát dioxigenáz (4HPPD) (12), ahol maga a kofaktor a szubsztrátum is egyben [75]. A fenti kiragadott példákból látható, hogy ezen enzimek igen fontos szerepet játszanak az élő 18

Irodalmi áttekintés szervezetek anyagcsere folyamatainak szabályozásában. Nem csoda, hogy számos réz- és vastartalmú modell született működésük jobb megértésére, illetve hasonló, gyakorlati szempontból fontos reakciók katalizálására [76-80].

O

O HN O

TH N H

H2N

O

HN O

OH TH N H

SO3H

HN O

tauD

O CHO

TH

N H

O

SO3H

H2N

CO2H

HN

(9) N H

H2N

+ H 2SO 3

(10)

O

OH OH

R

N

P4H O

R

N

R'

(11) O

R' OH

HO

O

4HPPD

HO OH

O

OH

(12)

O

2.7.1. 1-Amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz (ACCO) enzim és modellreakciói Az etilén növényi hormon, a gyümölcsök érését gyorsítja, és a növények virágzására hat, a magvak csírázását és a hagymák, gumók kihajtását befolyásolja. Az etilént a kertészetben és a gyümölcstermesztésben is felhasználják hormonhatása miatt, mivel a zölden szedett gyümölcsöknek (például a banánnak) segíti az utóérését, és időzíthető vele egyes dísznövények virágzása (bizonyos határok között). A növényekben az etilén bioszintézisének utolsó lépése az 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav (accH) átalakítása, melyet az ACC oxidáz enzim katalizál (13) [81-84].

CO2NH 3+

ACCO 2 H+ + 2 e -

+ HCN + CO2 + 2H 2O

(13)

A Petunia hybrida-ból izolált enzim (ACCO) szerkezetét a 12. ábra szemlélteti. Röntgendiffrakciós mérések alapján megállapították, hogy a központi fémionhoz 2 hisztidin 19

Irodalmi áttekintés (His177, His234) és egy aszparaginsav (Asp179), (2N, O) koordinálódik egyfogú ligandumként [85].

Fe

12. ábra ACC oxidáz enzim szerkezete [85] Az ACC oxidáz enzim eltérően a többi

KGDO proteintől, működéséhez nem 2-

oxoglutarát, hanem aszkorbát koszubsztrát szükséges, emellett a szén-dioxid (vagy bikarbonát), mint aktivátor játszik szerepet az etilén szintézise során. Mágneses cirkuláris dikroizmus (MCD) vizsgálatokkal alátámasztották, hogy az enzim aktív centrumában jelenlévő vas(II)ion alapállapotban hatos koordinációjú, hasonlóan a többi, ebbe a csoportba tartozó enzimhez. A szubsztrátum koordinációját tekintve szintén eltérés tapasztalható a többi KGDO enzimtől. Míg utóbbi esetben az α-ketosav jobban kötődik a központi fémionhoz, mint az átalakítandó szubsztrátum, addig az ACCO enzim esetében az szubsztrátum (accH) mind az amino-, mind pedig a karboxilát-csoportján keresztül közvetlenül koordinálódik a központi vas(II)ionhoz. A szubsztrátum és a koszubsztrát hozzáadását követően az aktív helyen ötös koordináció alakul ki, amely elősegíti a dioxigén megkötődését és aktiválását. Ezen eredmények összhangban vannak a korábban elvégzett ún. „steady-state” kinetikai mérésekkel, ahol bebizonyították, hogy a szubsztrátum a dioxigén előtt koordinálódik a központi fémionhoz. Az azonban még nem tisztázott, hogy a koszubsztrát az accH előtt vagy a dioxigén után kordinálódik a vas(II)ionhoz [82, 86-94]. 2006-ban Klinman és munkatársai 3 nyíltláncú, valamint 4 gyűrűs aminosavval végeztek mechanizmus vizsgálatokat. Megállapították, hogy a gyűrűs származékok esetében etilén keletkezett, az alifás aminosavak esetében pedig dekarboxileződés játszódott le. A kinetikai vizsgálatok eredményeit a 6. táblázatban foglaltuk össze. Az adatokból jól látható, 20

Irodalmi áttekintés hogy nincs egyértelmű összefüggés a szubsztrátumok szerkezete, kötésfelhasadási energiái és a reakció sebessége között (kkat). Ebből arra lehet következtetni, hogy a sebességmeghatározó lépés a szubsztrátum aktiválását megelőzően történik, melynek során egy oxovas(IV) részecske alakul ki. A reakciók feltételezett mechanizmusát a 13. ábra szemlélteti [95]. 6. táblázat ACC oxidáz enzim kinetikai vizsgálatának eredményei (BDE: kötésfelhasadási energia) Szubsztrátum

kkat (s-1)

KM (µM)

BDE (kcal/kmol)

accH

36,4±1,4

0,099±0,018

97,4

N-MeaccH

12,2±0,5

0,107±0,021

91,4

acc-NH2

11,3±0,6

0,214±0,047

87,1

acc-OMe

27,3±1,7

2,76±0,55

97,3

aibH

22,1±1,6

0,92±0,29

100,0

D-alanin

29,8±0,9

4,42±0,49

98,8

glicin

9,5±0,6

1,0±0,4

99,0

C OH C OH E - Fe(II)

C O -O C 2

H2N

C

C O

R1 R2

E - Fe(III)

C OH

-O C 2

OH

E - Fe(III) O

-O C 2

H2N

C 1

E - Fe(III) O2H

R2

4

R1

C O

H2N

C

OH

R1 R2

2

R1

E - Fe(III)

C O -O C 2

E - Fe(IV) H2O

O

C

C O

CO2 R1, R2 = CH3

C O

HN

R1

C

HN

R2

C OH C O

-O C 2

OH

C O

O2 C OH

R1, R2 =

C O

E - Fe(III)

R2

HN

C O -O C 2

H2N

C

DHAsc

R1 R2

Asc

3

C O

-O C 2 E - Fe(II) H N OH2 2

13. ábra ACCO enzim feltételezett működési mechanizmusa (Asc: aszkorbát; DHAsc: dehidro-aszkorbát)

21

C 5

R1 R2

Irodalmi áttekintés Első lépésként a szubsztrátum kétfogú ligandumként való koordinációja történik meg öttagú kelátgyűrű képződése közben. Ezt követően aszkorbát jelenlétében a dioxigén koordinálódik a központi fémionhoz (1). A vas(III)hoz kapcsolódó szuperoxo-ligandum ezután már képes az aszkorbát szomszédos szénatomját támadni (2), a sebességmeghatározó lépésben oxovas(IV) intermedier kialakulását eredményezve (3), amely közvetlenül felelős a szubsztrátum aktiválásáért, melynek során egyelektronos oxidáción keresztül iminoil-gyök keletkezik (4). Aszkorbát felesleg esetén az oxovas(IV) intermedier reakciója a szubsztátummal és az aszkorbáttal kompetitív (egymással versengő) reakciót eredményez, amelynek során a kiindulási Fe(II)-komplex és víz keletkezik (5) [95]. Az irodalomban csupán néhány példa található réz-, vas-, mangán- és kobalttartalmú enzim-szubsztrát komplexekre, amelyek oxidációja etilént eredményez, katalitikusan működő rendszer azonban ezidáig nem ismert [96-98]. Simaan és munkatársai a 14. ábrán látható ligandumokkal és szubsztrátumokkal réz(I)-, réz(II)- és vas(III)tartalmú (ES) komplexeket állítottak elő, és vizsgálták reakciójukat hidrogén-peroxid oxidálószerrel. Azt tapasztalták, hogy minden esetben az enzimatikus útnak megfelelő termékek keletkeznek, tehát ezen komplexek funkcionálisan jól modellezik az ACC oxidáz enzimet. A vizsgálatok során megállapították, hogy bázis (NaOH) hozzáadásával lényegesen növelhető a képződő etilén mennyisége. Ezt azzal magyarázták, hogy bázis hatására a hidrogén-peroxid deprotonálódik, melynek következtében reaktív fém-peroxo komplex alakul ki [99-102]. bpy

pa

phen

tacn H N

Ligandumok: H2 N

N

N

N

aibH

N

HN NH

accH

NH 2

Szubsztrátumok:

N

NH 2

OH O

OH O

14. ábra ACC oxidáz modellek előállításánál használt ligandumok és szubsztrátumok (pa: 2-pikolil-amin; tacn: 1,4,7-triaza-ciklononán; aibH: 2-amino-izovajsav) 2.8. Pirokatechin oxidáz (PO) enzim és modellreakciói A

pirokatechin

oxidáz

az

oxidoreduktázok

csoportjába

tartozó

kétmagvú

rézcentrummal rendelkező metalloenzim, amely a pirokatechinek (o-difenolok) oxidatív 22

Irodalmi áttekintés dehidrogénezését katalizálja o-kinonná, melléktermékként vizet, vagy hidrogén-peroxidot szolgáltatva (14) [103].

OH OH

O

O2 pirokatechin oxidáz

+ H 2O (H2 O2 )

(14)

O

Az enzim növényi szövetekben, rovarokban valamint egyes rákfélékben egyaránt kimutatható. A pirokatechin oxidázt 1937-es első elkülönítése óta számos növényből és gyümölcsből (burgonya, spenót, alma, szőlő, licsi) sikerült kinyerni [104,105], de az enzim röntgendiffrakciós szerkezete csak pár évvel ezelőtt vált ismertté [106]. Az aktív centrumban lévő rézion szerkezete, spektroszkópiai sajátságai alapján három jellegzetes formát különböztethetünk meg: az enzim alapállapotához tartozó ún. met-formát, valamint az oxidált (oxi-) és redukált (deoxi-) formát (16. ábra). Az édesburgonyából (Ipomoea batatas) elkülönített enzimről megállapították, hogy monomer szerkezetű, molekulatömege 39 kDa, ellipszoid alakú, és mérete hozzávetőlegesen 55

45

45 Å. A fehérje másodlagos szerkezetét hat α-hélix építi fel, amelyek által

kialakított üregben, melyet két diszulfid-híd (Cis11–Cis28 és Cis27–Cis89) kapcsol össze a nitrogénben gazdag N-terminális résszel, helyezkedik el az aktív centrum (15. ábra). Az aktív centrumban található réz(II)ionok mindegyikéhez három hisztidin kapcsolódik. A Cu(A)ion a His88, His109 és a His118 imidazolos nitrogénatomjaihoz koordinálódik, a Cu(B)ion pedig a

15. ábra Az Ipomoea batatas-ból elkülönített pirokatechin oxidáz szerkezete [106]

23

Irodalmi áttekintés His240, His244 és a His274 aminosavakkal létesít koordinatív kötést. Az egymástól 2,9 Å távolságra lévő réz(II)ionok hidroxo-hídon keresztül kapcsolódnak, trigonális bipiramisos geometriát kialakítva, ahol az apikális pozicióban a His109 és a His240 foglal helyet (15.ábra) [106]. Az enzimről nyert információk birtokában az enzim hatásmechanizmusa a fentiekben említett határformákon keresztül a 16. ábra alapján írható le. Az enzimfolyamat sztöchiometriáját tekintve elmondható, hogy az enzim egy molja két mol szubsztrátumot oxidál és ehhez egy mol dioxigént használ fel. A szubsztrátum oxidációja tehát kétféle módon valósul meg, egyik esetben anaerob, míg a másik esetben aerob körülmények között. A pirokatechin oxidáz enzim működésének megismerésére és megértésére irányuló tudományos közlemények számos szerkezeti és funkcionális modellt tartalmaznak. Ezen modellek

többnyire

egy-

vagy

kétmagvú

rézkomplexekre

épülnek,

melyeket

a

legváltozatosabb tulajdonságokkal rendelkező ligandumok felhasználásával állítottak elő. Az enzim ismertetése során felvázolt három állapot közül a legtöbb tanulmány a met-formára (17. ábra) született. O + H2O O

His

3H+

His

His CuII

CuII O H

His

OH

His

OH

His

2H+ met-forma His His

O O CuII

O

His

CuII O

His

His

O

His

CuII

His

His

His

O CuII O H

His 2H+

His His

H+

OH O OH

His

His His

His

O CuII

CuII O

His

His

O2

His

His

CuI

CuI

His

His

oxi-forma

His

+ H2O O

His dezoxi-forma

16. ábra Pirokatechin oxidáz feltételezett hatásmechanizmusa A modellvegyületek között többnyire kétmagvú rézkomplexekkel találkozhatunk (7. táblázat), melyekben a réz(II)ionok távolsága a ligandum tervezésével és a hídligandumok (µOH, µ-RO, µ-O, µ-RCO) helyes megválasztásával tetszés szerint változtatható (18. ábra). 24

Irodalmi áttekintés

17. ábra A met-forma aktív centrumában kialakuló koordinációs övezet

N N

OH

N

N

N

N

OH N

N

N

N N

N

L1

L2

N

N

N N OH

N

N

N

N

N

N

N

N

N

L3

N

L4

Br

Br N

N

N

N

N

N N

OH

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

L6

L5 Et2N

N

OH HN

2N

H

N NH

N H

L7 NEt2

2

Me2N

L8

2N

H

N NH

N H

L9

18. ábra Pirokatechin oxidáz modellek előállításánál használt ligandumok 25

NMe2

2

Irodalmi áttekintés A pirokatechinek oxidációja során a legnagyobb katalitikus aktivitás abban az esetben volt megfigyelhető, amikor a rézionok távolsága kisebb, mint 5 Å. Ennek hátterében sztérikus okok állnak, nevezetesen a két réz(II)ionnak olyan távolságban kell lennie egymástól, ami lehetővé teszi a pirokatechin koordinációját (μ-1,2-) és azon keresztüli oxidációját [113]. Ezt a feltételezést támasztja alá az a tapasztalat is, hogy a kétmagvú komplexek többnyire jobb katalitikus sajátságokkal rendelkeznek, mint egymagvú analógjaik [114,115]. Egyes tanulmányokban az oxidáció sebessége és a rézkomplexek redoxpotenciálja között fennálló kapcsolat lehetősége is felmerült, azonban direkt korrelációt egy esetben sem találtak [116]. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy az enzimfolyamatban a dirézcentrumnak kétféle kritériumnak kell megfelelnie, a szubsztrátum által könnyen redukálhatónak, a dioxigén által pedig könnyen oxidálhatónak kell lennie. Az irodalomban mangántartalmú pirokatechin oxidáz modellre is található példa [117119], ennek oka, hogy a pirokatechin dioxigenázoknak mangántartalmú képviselőjük is ismeretes. 7. táblázat Pirokatechin oxidáz funkcionális modelljei L

Cu−Cu

Komplex

(Å)

KM (M)

kkat

kkat/KM

(s-1)

(M-1s-1)

L1

[Cu2(LO)(OAc)(H2O)](ClO4)2 [107]

3,40

8,6 ×10-4

2,8 ×10-3

3,30

L2

[Cu2(LO)(OTf)](OTf)2 [108]

3,70

2,9 ×10-3

3,3 ×10-2

11,4

L3

[Cu2(LO)(OH)](ClO4)2 [109]

2,96

1,5 ×10-3

2,4 ×10-2

16,4

4.9 ×10

-3

-2

5,67

-4

-2

5,9 ×10

248

L4

.

[Cu2(LO)(OH)2](ClO4)2 H2O [110]

-

2,8 ×10

L5

[Cu2(LO)(OH)(H2O)(EtOH)](ClO4)2[111]

2,90

2,4 ×10

L6

[Cu2(LO)(OMe)(MeOH)(ClO4)]ClO4[111]

2,94

3,1 ×10-4

1,3 ×10-3

43

L7

[Cu2(LH2)(MeCN)4](ClO4)6.2H2O [112]

-

2,2 ×10-3

5,0 ×10-2

22,7

L8

[Cu2L(OMe)(MeOH)](ClO4)2 [110]

4,53

7,9 ×10-5

6,3 ×10-5

8,0

L9

[Cu2L(OH)(BF4)2](BF4)2 [110]

3,45

8,9 ×10-5

7,8 ×10-1

8741

2.9. Szuperoxid dizmutáz (SOD) enzimek és modellreakcióik A szuperoxid dizmutázok (SOD) olyan metalloenzimek, amelyek a szervezetben lejátszódó oxidációs reakciók melléktermékeként keletkező szuperoxid gyök-aniont alakítják vízzé és hidrogén-peroxiddá (15) [120]. A szuperoxid gyök-anion önmagában is képes 26

Irodalmi áttekintés diszproporcionálódásra, ennek sebessége azonban nem elegendő ahhoz, hogy a termelődő gyök, károsító hatását megelőzze. A SOD enzimek a diffúziós kontroll hatását elérő sebességgel reagálnak a szuperoxid gyök-anionnal, így ezek az enzimek jelentik az elsődleges védelmet a szervezet számára az oxidatív stressz ellen [121].

M(n+1)+

O2

+

M(n+1)+ + 2H + + O2 2O 2

+

2H +

Mn+

+

O2

M(n+1)+

+

H 2O 2

H 2 O2

+

O2

(15)

A SOD enzimek a bennük található fém minősége alapján három csoportba sorolhatók: vannak főként prokariótákban előforduló vas- (FeSOD) [122,123], főként eukariótákban fellelhető réz/cink- (CuZnSOD) [124] és minden élőlényben jelen lévő mangántartalmú (MnSOD) [125] képviselőik. A mangánt illetve vasat tartalmazó enzimek szerkezetéről kiderült, hogy nagyon hasonlóak egymáshoz [126], míg a réz/cink szerkezete az előbbiektől jelentős mértékben eltér [127]. A természetes SOD enzimek hiányos működését, ennek következtében a szuperoxid gyök-anion kumulálódását számos betegség (pl. rák, gyulladásos betgségek stb.) kiváltó okaként tartják számon [128]. Ennek eredményeképpen az utóbbi évtizedben jelentős érdeklődés irányult mesterséges helyettesítők előállítására és vizsgálatára [129-135]. Annak ellenére, hogy Fe, Mn és Cu/Zn tartalmú modelleket egyaránt előállítottak és teszteltek, in vivo helyettesítőként való alkalmazásra leginkább a MnSOD utánzó vegyületek alakalmasak. Ez főként a szabad Mn(II)-ion kisebb toxicitásának köszönhető A helyettesített penta-azaciklusokkal és a salen-ligandumokkal képzett komplexek eljutottak a klinikai tesztekig. [136139]. 2.10. Vas- és mangántartalmú kataláz enzimek és modellreakcióik Az élő szervezetekben felhalmozódó hidrogén-peroxid bomlási folyamatai a sejtfalra nézve káros, reaktív oxigén szármzékokhoz (szuperoxid, hidroxilgyök stb.) vezethetnek. Ennek kiküszöbölésére az élő szervezetekben ún. kataláz enzimek (19. ábra) szolgálnak, amelyek a hidrogén-peroxid vízzé és dioxigénné történő reakcióját katalizálják (16). Ezen enzimek a vas-, illetve mangántartalmú metalloenzimek csoportjába sorolhatók.

27

Irodalmi áttekintés A kataláz enzimek a szuperoxid dizmutázok mellett a szervezetünk első védelmi vonalát képezik a gyökökkel szemben. Nemcsak az oxidatív stressz ellen nyújtatnak védelmet, hanem megelőzik/megelőzhetik különféle degeneratív betegségek (pl. rák) kialakulását, valamint a sejtöregedést is [140, 141].

2H2O2

kataláz

2H2O + O2

(16)

19. ábra Az emberi kataláz enzim [142] A Fe-kataláz enzimek négy polipeptidláncból épülnek fel, egy tetramer molekulát képezve. Egyetlen lánc több mint 500 aminosavból áll. A tetrameren belül 4 hem található, csakúgy, mint a katalázokkal rokon hemoglobin, citokróm és klorofill molekulákban. A Fekatalázok enzimatikus aktivitásáért a hem felelős, amely egy prosztetikus csoport, a biológiai aktivitást ezen feszített szerkezetnek tulajdonítják. Valamennyi enzim közül a Fe-kataláz enzimek átalakítási aránya (TON) a legmagasabb: egy molekula enzim 6 millió molekula hidrogén-peroxidot képes vízzé és dioxigénné bontani egyetlen perc alatt. A hem (20. ábra) egy protoporfirin gyűrűt tartalmaz, közepén egy vasionnal. A protoporfirin gyűrű négy pirrol gyűrűből épül fel melyeket metilén-csoportok kapcsolnak össze. Négy metil, két vinil és két propionát oldallánc kapcsolódik a protoporfirin gyűrűhöz, a gyűrű közepén a vas Fe(II) és Fe(III) formában is megtalálható [143]. Arról, hogy a vas(II)tartalmú komplexek miként bontják a hidrogén-peroxidot, a kutatók már több mint száz éve vitatkoznak, de még mindig nem létezik egységesen elfogadott elmélet. A rengeteg e témával foglalkozó publikáció és a sok elvégzett kísérlet 28

Irodalmi áttekintés ellenére, még az sem tisztázott, hogy a vas milyen oxidációs állapotain keresztül játszódik le a folyamat, illetve hogy gyökös, vagy ionos jellegű reakcióról van e szó (17-20).

Oxigén | Szén | Nitrogén | Hidrogén | Vas 20. ábra A Fe-kataláz enzimekben található hem szerkezete [143] Fe(II)-Fe(IV) átmenet (ionos) [144]: Fe 2+ + H 2O 2

FeO2+ + H2 O

FeO2+ + H2 O2

Fe 2+ + H 2O + O2

(17) Fe(II)-Fe(III) átmenet (gyökös) [145] : Fe 2+ + H 2O 2

Fe 3+ + .OH + H 2O

Fe 2+ + .OH

Fe 3+ + H 2O

(18)

Fe(II)-Fe(III)-Fe(V) átmenet (ionos) [146]: 2+

Fe

+ H 2O2

H+

3+

Fe OOH

29

Fe5+=O + H2O

(19)

Irodalmi áttekintés Fe(III)-Fe(V) átmenet (ionos) [147]: Fe 3+ + HO2 -

[FeOOH]2+

[FeOOH]2+

HO + FeO3+

FeO3+ + H2 O2

Fe3+ + O 2 + H 2 O

(20)

A Mn-tartalmú kataláz enzimeket a Thermus thermophilus [148], a Lactobacillus plantarum [149,150] és a Thermoleophilum album [151] baktériumokból izolálták. Ezen enzimek röntgenszerkezete alapján megállapítást nyert, hogy az aktív centrum két egymástól 3,13 Å távolságra lévő mangániont tartalmaznak, melyek karboxiláthídon keresztül kapcsolódnak (21. ábra).

21. ábra A Thermus thermophilus -ból elkülönített kataláz enzim szerkezete [152] A Mn-katalázokban a két mangán-magot először ESR-spektroszkópiával mutatták ki. Ezzel a technikával jellemezték a hármas és négyes oxidációs állapotokat is [153-155]. A meghatározott

antiferromágneses

csatolási

állandók

alapján

szerkezeti

modellekkel

összehasonlítva már a röntgenszerkezetek ismerete előtt valószínűsítették, hogy az aktív helyen a mangánionok (µ-OH)(µ-karboxilát) híddal vannak összekapcsolva [156]. ESR-rel a Mn (II,II) katalázban található mangánionok antiferromágneses csatolását is sikerült igazolni. EXAFS spektroszkópiával vizsgálva az egyes oxidációs állapotokat a Mn–Mn távolság észrevehetően lerövidül 2,7 Å-re a katalitikusan inaktív (III,IV) formában. Ez az alak valószínűleg bisz(µ-oxo)-hidat tartalmaz [157]. A Mn-katalázok fiziológiai aktivitását kizárólag csak a (II,II) és (III,III) oxidációs állapotoknak lehet tulajdonítani. A ping-pong

30

Irodalmi áttekintés ciklusú mechanizmus a két egymásba könnyen átalakítható oxidációs állapotnak köszönhető (22. ábra) [158, 159]. O

O O2

O OH O O Glu

O H

O

Mn III

N His O

O Glu

H 2O

OH2 H Mn II

N His

O H

O

H O

O

O

NHis

HOOH

OGlu

A

NHis

D

O

C

O

O

Mn II

H 2N His

B

E

O

Mn II O H

O

H O OH2

O

Mn III

N His O

O OH2

O O Glu

Mn III O O H

O

NHis

Mn II

H2 N His H2 O

H2 O OH O

O

O Mn II

O H

O

O

NHis

22. ábra A kétmagvú mangán-katalázok lehetséges mechanizmusa [160] A mangántartalmú katalázokról spektroszkópiai módszerekkel megállapították, hogy az enzimatikus reakció során redukált Mn(II,II), illetve oxidált Mn(III,III) formában vannak jelen. A vegyes oxidatív állapotok az enzimatikus reakcióban nem játszanak szerepet [158]. A reakció első lépésében a szubsztrátum közvetlenül az ún. terminális (szélső) oldali Mn(II)-t támadja meg, leszorítva onnan a vízmolekulát (A→B, 22. ábra). Az internális (belső) oldali fehérjerész karboxilát csoportja protonpuffer funkciót tölt be, deprotonálja a H2O2-t, majd később átad egy protont, és ezáltal tud víz képződni. A koordinált peroxid terminális helyzetből (B) elfordul, majd a µ-η2–peroxo-híd képződik (C). A szubsztrátum redukálódik, víz lép ki, és a mangánionok távolsága lecsökken ~3,6 Å-ről 3,1 Å-re (C→D). A továbbiakban a µ-oxo-híd protonálásával a híd felhasad és újabb szubsztrátum molekula lép a koordinációs övezetbe (D→E). Ezután intramolekulárisan két elektron kerül a dimangán(III) centrumra a terminálisan koordinált peroxidról, ami dioxigén fejlődéséhez és az enzim redukált formájának visszanyeréséhez vezet (E→A). Az enzimatikus reakció spontán lejátszódását biztosító negatív szabadenergia-változás az elektronátadásokat kísérő, azokkal 31

O

NHis

O

HOOH

O Glu

OH HO OH 2

O

O

O

H 2O

Mn II

Mn III O O H

O

Irodalmi áttekintés csatolt protontranszfer-reakciók kedvező energiamérlegének tudható be. A protonpufferként jelen lévő nem koordinált karboxilát funkció pKa értéke ugyanis az elképzelések szerint a ciklust kísérő töltéseloszlás változások miatt megváltozik a két részfolyamatban (A→B→C→D és D→E→A) [160]. Egy alternatív mechanizmus egymásba kölcsönösen átalakuló Mn2II(µ-OH2) és Mn2III(µ-O)2 intermedierekre alapozza a katalitikus ciklust [161]. A fenti enzimeknek direkt felhasználása gyógyászati célokra korlátozott, a sejtmembránok alacsony permeabilitása és a nagy molekulatömeg következtében. Az irodalomban számos példa található különféle átmenetifém-tartalmú (Cu, Fe, Mn) komplexekre, amelyeket a kataláz enzimek szerkezeti és/vagy működési modelljeiként vizsgáltak [162-172].

32

Eredmények és értékelésük

3. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 3.1. Vas- és mangántartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz modellek A 2.6. fejezetben felvázolt előzmények alapján célkitűzésünk az volt, hogy vas- és mangántartalmú funkcionális modelleket dolgozzunk ki, melyek tanulmányozásával betekintést nyerhetünk mind a szubsztrátum-, mind a dioxigénaktiválás mechanizmusába. A kapott eredmények összevetése a korábban vizsgált réztartalmú enzimmodell rendszerekkel az átmenetifémek enzimekben betöltött szerepére nézve is hasznos információt nyújthatnak. A növényi világban előforduló antioxidáns sajátságokkal rendelkező flavonolok komplexképző (kelátképző) sajátságáról szerzett ismeretek – a fenti szempontok mellett – mind az élelmiszeriparban, mind a gyógyászatban felhasználhatók, a szervezet számára nélkülözhetetlen nyomelemek (pl. vas, mangán) bevitelének tervezése során. 3.1.1. Szintetikus Fe(III)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése A korábbiakban (2.6. fejezet) ismertetett enzimológiai és modellvizsgálatok alapján valószínűsíthető, hogy a kvercetin oxidatív dekarbonilezési reakciója a szubsztrátum koordinációjával, majd az azt követő aktiválásával indul. A dioxigénezés – feltételezések szerint – az így kialakuló reaktív komplexen keresztül valósul meg. Ennek bizonyítása céljából

vas(III)tartalmú

modellvegyületeket

állítottunk

elő,

egy

homoleptikus,

[FeIII(4’MeOfla)3] és négy vegyesligandumú, [FeIII(4’Rfla)(salen)] (salenH2: bisz-szalicilidénetilén-diamin) összetételű komplexet. A [FeIII(O-bs)(salen)] modellvegyületet direkt úton is előállítottuk, amelynek spektroszkópiai vizsgálata megkönnyíti, az oxigénezési reakciók termékeiként keletkező [FeIII(O-bs)(salen)], és [FeIII(O-MeObs)3] komplexek

fizikai jellemzését és szerkezeti

azonosítását (lásd később 3.1.4.). A modellvegyületeket a (21-24) egyenletek alapján állítottuk elő.

OMe O FeCl3

+

MeOH, 3NEt3

3

Ar

OH O

33

Fe III(4'MeOfla) 3

(21)

Eredmények és értékelésük Cl OH

HO + FeCl3 N

N

MeOH

FeIII

O

O

(22)

Ar N

N

salenH 2

O R

Cl FeIII

O

O

O +

N

4'RflaH

O

MeOH, Et3N Ar

N

FeIII

O

R: H-, MeO-, Cl-, Me2 N-

N

(23)

O N

O Cl

O III

O

Fe

O

O + O-bsH

N

O

MeOH, Et3N Ar

N

FeIII

O N

(24)

O N

A termékek összetételét elemanalízissel, szerkezetüket pedig IR és UV-VIS spektroszkópiai módszerek, valamint egykristály röntgendiffrakció segítségével jellemeztük (8. táblázat). A komplexek spektroszkópiai adatait tekintve a következőket emelnénk ki: Az UV-VIS spektrumon a szabad 4’R-flavonolhoz rendelhető abszorpció (340-350 nm) a komplexképződés következtében eltűnt, 407-445 nm-en új abszorpciós sávok jelentek meg. Ezen 60-100 nm körüli batokróm eltolódások a koordinálódott flavonolát ligandumok ππ* töltésátviteli sávjaihoz rendelhetők. A termékekről készült IR spektrum alapján a következő állapítható meg. A szabad flavonolban lévő 4-C=O csoport intenzív

CO

sávjának kb. 50 cm-1 értékkel eltolódik, ami a

komplexképződés eredményeként létrejött öttagú kelátgyűrű kialakulására utal [173]. A salenH2 ligandum koordinációját az 1629 és 1045 cm-1 körüli értéknél mejelenő

CN

sáv

támasztja alá. A [FeIII(O-bs)(salen)] komplexről készült IR felvétel alapján megállapítható, hogy a flavonolra jellemző sáv eltűnt, helyette megjelentek az O-benzoil-szalicilsav karboxilcsoportjára jellemző szimmetrikus illetve aszimmetrikus νCO2 rezgések 1600 és 1400 cm-1 körül, továbbá a νCO rezgés 1700 cm-1 körül. A karboxil csoport szimmetrikus és 34

Eredmények és értékelésük aszimmetrikus rezgései közötti különbség alapján (

C

= 159 cm-1), az O-benzoil-

szalicilsav kétfogú koordinációja feltételezhető [61]. Az 1000 cm-1, valamint 1600 cm-1 körül lévő sávok a salenH2 ligandum νCN vegyértékrezgéseihez rendelhetők, utalva annak koordinációjára. Az aromás gyűrű νaromásCH rezgéseihez rendelhető a 3000 cm-1 körül található sáv, ami ugyancsak a salenH2 ligandum valamint az O-bsH koordinációjára is utal. 8. táblázat A [FeIII(4’MeOfla)3] és a [FeIII(4’Rfla)(salen)] komplexek fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex CO:

[FeIII(4’MeOfla)3]

IR (cm-1)

UV-VIS

Op.

KBr

(dmf)

(˚C)

1547

aromás CH-ek:

alifás CH-ek:

[FeIII(fla)(salen)]

1549

CN:

1628, 1032

[FeIII(4’MeOfla)(salen)]

1547

CN:

1627, 1034

1542

CN:

1629, 1027

alifás CH-ek:

[FeIII(4’NMe2fla)(salen)]

[FeIII(O-bs)(salen)]

CN:

1630, 1034

logε (411 nm) =

barna

268-270

barna

261-264

barna

220-222

barna

243-2245

barna

4,15

logε (419nm) = 4,11

logε (445 nm) =

1493, 3056

4,25

2931

CN:

1628, 1034

CO:

1731 -

CO2:

257-260

4,25

2799 (OCH3)

1542

alifás CH-ek:

logε (407 nm) =

1493, 3062

CO:

aromás CH-ek:

barna

1493, 3060

CO:

aromás CH-ek:

211-214

4,68

1491, 3064

CO:

aromás CH-ek:

logε (411 nm) =

2836 (OCH3)

CO:

aromás CH-ek:

[FeIII(4’Clfla)(salen)]

1491, 3065

Szín

1544, 1385

aromás CH-ek:

1492, 3010

35


23. ábra A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex röntgenszerkezete A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex dmf-ból éterdiffuzióval történő átkristályosítása után barna kristályokhoz jutottunk, melyek röntgendiffrakciós mérésre alkalmasnak bizonyultak. A komplexről készült röntgenszerkezet a 23. ábrán látható, a hozzá tartozó adatokat a 9. és a 10. táblázat tartalmazza. A szerkezet ismeretében megállapítható, hogy a központi ionhoz három 4’-metoxi-flavonolát ligandum kapcsolódik homoleptikus komplexet képezve. Az egyes ligandumok a vassal stabilis öttagú kelátgyűrűt képeznek, a Fe–O távolságok különbsége a részleges π- delokalizációval magyarázható. 9. táblázat A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex fontosabb geometriai jellemzői

Fe1–O2

Kötéshossz (Å) 1,955(7)

O3–C8


Fe1–O1

2,109(8)

O3–C8

1,404(15)

O1–C1

1,306(12)

C9–C1

1,367(14)

O2–C9

1,299(13)

C1–C2

1,490(15)

O3–C7

1,302(13)

Kötés

Kötés

O2–Fe1–O1 kötésszög 79,4(3)º

36

Eredmények és értékelésük 10. táblázat A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex krisztallográfiai adatai Komplex

[FeIII(4’MeOfla)3]

Összegképlet Szín Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport Elemi cella méretei a [Å] b [Å] c [Å] γ (°)

C48H33O12Fe barna 646,2 g/mol 293 (2) K Mo-Ka, λ = 0,71073 Å hexagonális P31c

Elemi cella térfogata [Å3] Z

4154,2(2) 6

15,4880(5) 15,4880(5) 19,9970(5) 120,00

Sűrűség (számított) [Mg/m3]

1,55

-1

Abszorpciós koeff., μ [mm ] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Max. és min. transzmisszió Θ-tartomány [°] Index tartományok

Gyűjtött reflexiók Független refl. száma

1,10 3960 0,3 × 0,05 × 0,05 nincs 1,52 ≤ ° ≤ 22,71 0 ≤ h ≤ 16 -14 ≤ k ≤ 0 -20 ≤ l ≤ 21 2081 1820

Végső R [I > 2σ(I)]

R1 = 0,0728; wR2 = 0,1943

A [FeIII(fla)(salen)] komplex Mössbauer spektroszkópiai vizsgálatát elvégezve a szerkezetre nézve a következő megállapításokat tehetjük (24. ábra). 1. Az izomereltolódás értéke alapján (δ = 0,49 mm/s) megállapíthatjuk, hogy a központi vasion nagyspinszámú (S = 5/2) Fe(III)-ion formájában vesz részt a komplexképzésben. 2. A kvadrupólfelhasadás értéke (ΔEQ = 1,44 mm/s) alapján a vasion körül oktaéderes geometria kialakulása valószínűsíthető.

37


24. ábra A [FeIII(fla)(salen)] komplex Mössbauer spektruma δ = 0,49 mm/s; ΔEQ = 1,44 mm/s

25. ábra A [FeIII(fla)(salen)] komplex röntgenszerkezete A [FeIII(fla)(salen)] komplex CH2Cl2-os oldatából, éterdiffúziós eljárással sikerült röntgendiffrakciós mérésre alkalmas egykristályt növesztenünk, a komplex röntgenszerkezete 38

Eredmények és értékelésük a 25. ábrán látható, a hozzá tartozó adatok a 11. és 12. táblázatban találhatóak. A szerkezet alapján megállapítható, hogy a flavonol kétfogú ligandumként – stabilis öttagú kelátgyűrűt kialakítva – koordinálódik a központi fémionhoz. 11. táblázat A [FeIII(fla)(salen)] komplex fontosabb geometriai jellemzői

Fe1–O1


Fe1–O1_2

1,935(4)

O1A–Fe1–O2 kötésszög: 161,72(16)º

Fe1–O2

2,139(4)

O3–Fe1–N1 kötésszög: 158,85(19)º

Fe1–O3

1,955(4)

Fe1–N1

2,141(5)

Kötés

Kötés Fe1–N1_2


O1–Fe1–N1_2 kötésszög: 158,29(19)º

A [FeIII(O-bs)(salen)] komplex esetében is sikerült egykristályt növesztenünk, amely röntgendiffrakciós vizsgálatán keresztül a 26. ábrán látható szerkezethez jutottunk. Az ábra alapján elmondható, hogy az O-benzoil-szalicilsav kétfogú ligandumként koordinálódik a központi fémionhoz, ami alátámasztja az IR mérések eredményeit. A szerkezethez tartozó adatokat az 13. és a 14. táblázat tartalmazza.

26. ábra A [FeIII(O-bs)(salen)] komplex röntgenszerkezete 39


12. táblázat A [FeIII(fla)(salen)] komplex krisztallográfiai adatai Komplex

[FeIII(fla)(salen)]


C31H23FeN2 O5 piros 559,4 g/mol 293 (2) K Mo-Ka, λ = 0,71075 Å triklin P1


1411(2) 2


1,317

Abszorpciós koeff., μ [cm-1] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Max. és min. transzmisszió Θ-tartomány [°] Index tartományok


0,576 578 0,68 × 0,55 × 0,43 nincs 3,18 ≤ ° ≤ 22,47 -11 ≤ h ≤ 11 -12 ≤ k ≤ 12 -14 ≤ l ≤ 14 12569 2536


R1 = 0,0773; wR2 = 0,1571

10,505(9) 12,060(11) 13,489(12) 85,29 (2)

A komplexek szerkezetét tekintve, összességében megállapítható, hogy azok összhangban vannak a spektroszkópiai mérések eredményeivel, a vas körül kialakuló koordinációs övezet mindhárom esetben ([FeIII(4’MeOfla)3], [FeIII(fla)(salen)] és [FeIII(Obs)(salen)]) leginkább torzult oktaéderes geometriával írható le.

40

Eredmények és értékelésük 13. táblázat A [FeIII(O-bs)(salen)] komplex fontosabb geometriai jellemzői

Fe1–O1


Fe1– O2

1,912(2)

O1-Fe1-O2 kötésszög: 95,98(10)º

Fe1–O3

2,156(2)

O2-Fe1-N2 kötésszög: 86,43(11)º

Fe1–O4

2,106(2)

Fe1–N1

2,131(3)

Kötés

Kötés Fe1–N2


O1-Fe1-N2 kötésszög: 161,33(12)º

14. táblázat A [FeIII(O-bs)(salen)] komplex krisztallográfiai adatai Komplex

[FeIII(O-bs)(salen)]


C30H23FeN2 O6 fekete 563,4 g/mol 203 (2) K Mo-Ka, λ = 0,71073 Å monoklin P2/n


5562(13) 4

22,501(3) 10,164(1) 25,507(4) 90 (2)


1,432

-1

Abszorpciós koeff., μ [cm ] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Max. és min. transzmisszió Θ-tartomány [°] Index tartományok


0,592 2496 0,40 × 0,25 × 0,25 nincs 1,06 ≤ ° ≤ 28,65 0 ≤ h ≤ 30 0 ≤ k ≤ 13 -34 ≤ l ≤ 32 13979 8858


R1 = 0,0711; wR2 = 0,1463

41

Eredmények és értékelésük 3.1.2. Szintetikus Mn(II)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése A mangántartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzim modellezése céljából piridin (py) ligandum, valamint egyszerű mangán(II)vegyületek felhasználásával szintetikus enzim– szubsztrátum komplexeket állítottunk elő (24, 25), melyek összetételét elemanalízissel, szerkezetüket spektroszkópiai (IR, UV-VIS) mérésekkel és röntgendiffrakcióval (15. táblázat) jellemeztük.

O O O

O

Mn (ClO4 )2 + 2

Mn

MeOH, 2NEt 3 Ar

II

OH

O

(24)

O

O O

[MnII(fla)2 ] +

MeOH

2

[MnII(fla)2(py)2 ]

(25)

Ar

N

15. táblázat A [MnII(fla)2] és [MnII(fla)2(py)2] komplexek fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex

[MnII(fla)2]

[MnII(fla)2(py)2]

Szín

zöld

zöld

Op. (˚C)

232-235

257-260

CO:

IR (cm-1)

CO:

1542

aromás CH-ek:

1491, 3048

aromás CH-ek: CN:

UV-VIS (dmf)

lg ε(424) = 4,36

1542 1491, 3070

1032

lg ε(433) = 4,14

Az IR spektroszkópiai vizsgálat alapján látható, hogy a flavonol mindkét komplex esetében kelátligandumként kapcsolódik a mangán(II)ionhoz ( hogy a

CO

CO

= 60 cm-1). Az a tény,

értékek megegyeznek, arra utal, hogy az axiális helyzetben koordinálódó piridin 42

Eredmények és értékelésük ligandumok nem befolyásolják a kelátgyűrűben kialakuló delokalizációs viszonyokat.

A

3000 cm-1 fölötti sáv a 2-fenilcsoport aromás C-H rezgéseihez tartozik, a piridilcsoportok koordinációját az 1032 cm-1-nél jelentkező sáv bizonyítja. A komplexek UV-VIS spektrumán a szabad flavonolra jellemző elnyelés nem látható ~340 nm-nél, helyette 424- és 433 nm-nél találunk új sávokat, amelyek a koordinált flavonolát-ligandum

* elektronátmenetéhez

rendelhető. A [MnII(fla)2(py)2] komplex metanolból éterdiffúzióval történő átkristályosítása során röntgendiffrakciós mérésre alkalmas kristályokat kaptunk. A röntgendiffrakciós méréshez tartozó krisztallográfiai adatokat a 16. táblázat, a fontosabb kötésszög és kötéstávolság értékeket a 17. táblázat tartalmazza. A komplex röntgenszerkezete a 27. ábrán látható. A mangánion körüli koordinációs övezet oktaéderes geometriával írható le. A mangánion síkjában a két flavonoláto-ligandum oxigénatomjai találhatók (O1 és O3, illetve O1_2 és O3_2), axiális pozícióban a két piridin nitrogénatomja helyezkedik el (N1 és N1_2). A két flavonol elhelyezkedése teljesen szimmetrikus a mangáncentrumra nézve, ami a kötésszögekből is jól látható (N1–Mn1–O3, 180° és O2–Mn1–O2_2 180°), a flavonolát ligandumok egymáshoz képest transz-helyzetben vannak.

27. ábra A [MnII(fla)2(py)2] komplex röntgenszerkezete

43


16. táblázat A [MnII(fla)2(py)2] komplex krisztallográfiai adatai Komplex Összegképlet Szín Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport Elemi cella méretei a [Å] b [Å] c [Å] (°) (°) (°) Elemi cella térfogata [Å3] Z Sűrűség (számított) [Mg/m3] Abszorpciós koeff., [mm-1] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Θ tartomány [°] Index tartományok

Gyűjtött reflexiók Független refl, száma Végső R [I > 2 (I)]

[MnII(fla)2(py)2] C40H28MnN2O6 zöld 687,51 293 K Mo-K , = 0.71073 Å triklin P1 8,310(6) 10,095(6) 11,167(5) 113,361(4) 97,542(4) 106,255(4) 1109,3 2 1,438 0,470 355 0,12 × 0,30 × 0,50 nincs 2,07 °  26,37 0 h 10 -12 k  12 -13 l 13 2882 2667 R1 = 0,0444, wR2 = 0,1354

17. táblázat A [MnII(fla)2(py)2] komplex fontosabb kötésszögei és kötéstávolságai Atompárok Mn1–O2 Mn1–O3 Mn1–N1 C1–O2 Atomok N1–Mn1–O3 N1–Mn1–O2 N1–Mn1–N1_2 O2–Mn1–O2_2

Kötéshossz (Å) 2,127(9) 2,183(8) 2,348(9) 1,374(7) Kötésszögek (°) 88,83(10) 91,17(11) 180,00(12) 180,00(11)

44

Atompárok C2–O1 C9–O3 C1–C2

Kötéshossz (Å) 1,236(14) 1,257(14) 1,385(14)

Atomok O2–Mn1–O3 N1–Mn1–O2 O3–Mn1–O3_2 O2–Mn1–O2_2

Kötésszögek (°) 76,81(9) 90,99(10) 180,00(11) 103,95(12)

Eredmények és értékelésük 3.1.3. A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex dioxigénezési reakcióját N,N-dimetil-formamidban, 80, 85, 90 és 95 °C-on végeztük. A reakció végén a termékkomplexet savval bontottuk és a termékek (O-benzoil-szalicilsav és annak hidrolizált származékai: benzoesav, szalicilsav) mennyiségét diazometánnal történő kezelés után GC-vel határoztuk meg. A termékek azonosítása GC-MS módszerrel történt. A kapott termékek alapján megállapíthatjuk, hogy a komplex dioxigénezése az enzimatikus útnak megfelelő termékeket eredményezte, tehát a vizsgált reakció a flavonol 2,4-dioxigenáz enzim funkcionális modelljének tekinthető.

28. ábra A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex dioxigénezési reakciójának lefutása [FeIII(4’MeOfla)3]0 = 2,2 × 10-4 M; [O2]0 = 1,56 × 10-3 M; dmf; T = 90 °C A reakció mechanizmusának tisztázása céljából részletes reakciókinetikai méréseket végeztünk. A reakciók időbeli lefutását UV-VIS spektroszkópiás módszerrel, a koordinált flavonolátra jellemző π-π* töltésátviteli sáv időbeli változásán keresztül követtük. A komplex aktuális koncentrációjának számolását a Lambert-Beer-törvény alapján végeztük. A 28. ábra a komplex dioxigénezése során kapott UV-VIS spektrumot szemlélteti. A kinetikai vizsgálatokat dmf oldószerben 90°C-on végeztük. A 29. ábrán egy tipikus oxigénezési görbét láthatunk, amely a komplex aktuális koncentrációjának időbeli változását mutatja. A komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében egyenest ad (30. ábra), ami arra utal, hogy a reakció részrendje a komplexre vonatkozóan egy (R = 99,78 %).

45


29. ábra A FeIII(4’MeOfla)3 koncentrációjának változása az idő függvényében [FeIII(4’MeOfla)3]0 = 2,2 × 10-4 M; [O2]0 = 1,56 × 10-3 M; dmf; T = 90 °C

30. ábra A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében III [Fe (4’MeOfla)3]0 = 2,2 × 10-4 M; [O2]0 = 1,56 ×10-3 M; dmf; T = 90 °C A reakcióra a (26) általános sebességi egyenlet írható fel, melynek értelmében az egyes komponensek részrendjét különböző komplex (18. táblázat, 1-4. mérés), valamint dioxigén koncentrációk (18. táblázat, 1, 5-6. mérés) mellett történő mérésekkel határozhatunk meg. m

-d[Fe]/dt = k [Fe] [O2]

n

(26)

A (26) általános egyenlet állandó dioxigén koncentráció esetén a következő formára egyszerűsödik (27, 28). n

k’ = k [O2]

[O2] = állandó

46

(27)


m

-d[Fe]/dt = k’ [Fe]

(28)

A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex részrendjének megállapítása céljából a (27, 28) egyenletek szerint ábrázoltuk a reakció kezdeti sebességét a komplex kiindulási koncentrációinak függvényében (31. ábra), amely eredményeként megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,94 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (m = 1).

31. ábra A reakciósebesség változása a kiindulási komplexkoncentráció függvényében [O2]0 = 1,56 × 10-3 M; dmf; T = 90 °C Hasonló módszerrel állapítottuk meg, hogy a reakció első rend szerint függ a dioxigén koncentrációjától. A (26) általános egyenlet állandó komplex koncentráció esetén a következő (29, 30) formában írható fel:

m

k’’ = k [Fe]

[Fe] = állandó

(29)

n

(30)

-d[Fe]/dt = k’’ [O2]

A 32. ábrán látható, hogy az összefüggés lineárisnak adódott (R = 99,87 %), ami annyit jelent, hogy a dioxigén részrendje a sebességi egyenletben egy (n = 1). A kinetikai vizsgálatok alapján a (31) bimolekulás sebességi egyenlet írható fel. III

III

-d[Fe (4’MeOfla)3]/dt = k [Fe 4’MeOfla)3] [O2]

47

(31)


32. ábra A reakciósebesség változása a dioxigénkoncentráció függvényében [FeIII(4’MeOfla)3]0 = 2,2 ×10-4 M; dmf; T = 90 °C

33. ábra A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius-diagramja [FeIII(4’MeOfla)3]0 = 2,2 ×10-4 M; dmf

34. ábra A [FeIII(4,MeOfla)3] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring-diagramja [FeIII(4’MeOfla)3]0 = 2,2 ×10-4 M; dmf 48

Eredmények és értékelésük 18. táblázat A [FeIII(4’MeOfla)3] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai Mérés

T

[FeIII(4’MeOfla)3]0

[O2]0

-d[Fe]/dt

k

száma

(°C)

(10-4 M)

(10-3 M)

(10-7 Ms-1)

(M-1s-1)

1

90

2,20

1,56

1,28

0,37±0,019

2

90

1,70

1,56

1,05

0,39±0,018

3

90

0,90

1,56

0,54

0,39±0,017

4

90

0,70

1,56

0,43

0,39±0,019

5

90

2,20

3,72

3,33

0,40±0,021

6

90

2,20

7,44

6,28

0,38±0,020

7

80

2,20

1,45

1,11

0,25±0,011

8

85

2,20

1,56

1,23

0,28±0,013

9

95

2,20

1,61

1,38

0,44±0,021

Különböző hőmérsékleten meghatározva (18. táblázat, 1, 7-9. mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (33, 34. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg.

EA = 2,303 R

d lgk

(32)

d(T-1 ) d lg(kT-1 )

H = 2,303 R

S = 4,573 lg(kT-1)

G =

H

(33)

d(T-1) 49,17 + EAT-1

(34)

(35)

T S

Az aktiválási paraméterek 90 C-ra a következők:

EA = 43 kJ mol-1

ΔH

= 40 kJ mol-1

ΔS = -144 J mol-1 K-1

ΔG

= 92 kJ mol-1

A számolt értékek alapján megállapítható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS ) nagy negatív értéke asszociatív mechanizmusú, bimolekulás reakcióra utal. 49

Eredmények és értékelésük 3.1.4. A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakcióit N,N-dimetil-formamidban 90, 95, 100 és 105 °C-on végeztük. A termékelegy összetételének meghatározása a 3.1.3. fejezetben leírtak szerint történt. Ennek eredményeként kijelenthetjük, hogy ebben az esetben is az enzimatikus útnak megfelelő (O-benzoil-szaliciláto)-vas(III)komplex keletkezett. A reakció mechanizmusának meghatározása céljából itt is részletes reakciókinetikai méréseket végeztünk. Az egyes reaktánsok részrendjének meghatározása céljából a reakciók vizsgálata különböző komplex- (20. táblázat, 1-4. mérés) és dioxigén-koncentrációknál (20. táblázat, 2, 5-6. mérés) történt. A sebességi egyenlet felírása a (26-31) egyenletekkel megegyező módon történt. A 35. ábrán a komplex aktuális koncentrációjának logaritmusát ábrázoltuk az idő függvényében. Látható, hogy a logaritmizált értékekre jó regressziójú egyenes illeszthető (R = 99,64 %), ami a komplex egyes részrendjére utal. A reakciósebességi értékeket a kiindulási komplex-koncentráció függvényében ábrázolva megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,40 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (36. ábra). A 37. ábra – ahol a kezdeti reakciósebességi értékek szerepelnek a dioxigén koncentráció függvényében – a dioxigén egyes részrendjét támasztja alá (R = 99,90 %).

35. ábra A [FeIII(fla)(salen)] koncentráció logaritmusának változása az idő függvényében [FeIII(fla)(salen)]0 = 2,50 × 10-4; [O2]0 = 1,64 × 10-3 M; dmf; T = 100 °C

50


36. ábra A kezdeti reakciósebesség változása a komplex koncentráció függvényében [O2]0 = 1,64 × 10-3 M; dmf; T = 100 °C

37. ábra Az oxigénezési reakció kezdeti sebessége az O2 koncentrációjának függvényében [FeIII(fla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; dmf; T = 100 °C A kinetikai vizsgálatok alapján a [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciója a (31) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le, ahol mind a komplex, mind a dioxigén részrendje egy. III

III

-d[Fe (fla)(salen)]/dt = k [Fe (fla)(salen)] [O2]

(36)

Különböző hőmérsékleten meghatározva (20. táblázat, 2, 7-9.mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (38, 39. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. Az aktiválási paraméterek 100 C-ra a következők: 51

Eredmények és értékelésük EA = 79 kJ mol-1

ΔH

= 76 kJ mol-1

ΔS = -94 J mol-1 K-1

ΔG

= 111 kJ mol-1

A számolt értékek alapján elmondható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS ) nagy negatív értéke asszociatív mechanizmusú, bimolekulás reakcióra utal.

38. ábra A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius-diagramja [FeIII(fla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; dmf

39. ábra A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring-diagramja [FeIII(fla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; dmf A különböző flavonol származékokat tartalmazó komplexekkel elvégezve a dioxigénezési reakciót, a log (kAR / kAH)-t (ahol R = 4’ helyen lévő szubsztituens) ábrázolva a szubsztituens

állandók

(σ)

függvényében

egyenest

kaptunk

(40.

ábra),

melynek

meredekségéből a (37) Hammett egyenlet reakcióállandójának értéke -0,54-nek adódott (19. táblázat). dlog kA

R

/ kAH = ρ σ

52

(37)


Az a tény, hogy a Hammett-összefüggés lineáris azt mutatja, hogy a sebesség meghatározó lépés érzékeny a 2-es szénatom elektronsűrűségét befolyásoló tényezőkre. A σ állandó negatív előjele pedig arra utal, hogy elektrondonor szubsztituensek a központi fém redoxpotenciálját a negatívabb irányba eltolva megkönnyítik a dioxigén aktiválását, ezáltal növelik a reakció sebességét. Ezen folyamat a vas(II)ion és a dioxigén közötti intermolekuláris elektronátmenettel értelmezhető. 19. táblázat A flavonol származékok szubsztituens állandói és a [FeIII(4’Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakcióinak sebességi állandói R

σ

kA

(4’RflaH)

[174]

(10-2 M -1s-1)

Me2N-

-0,83

6,10

MeO-

-0,27

2,80

H-

0,00

2,07

Cl-

0,23

1,36

40. ábra A [FeIII(4’Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakciójának Hammett-diagramja [FeIII(4’Rfla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; [O2]0 = 1,64 × 10-3 M; dmf; T = 100 °C Az elvégzett kísérletek eredményeként valószínűsíthető, hogy a [Fe III(4’MeOfla)3] és a [FeIII(4’Rfla)(salen)] komplexek dioxigénnel való reakciója – amely a (38) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le – azonos mechanizmus szerint játszódik le. -d[Fe] / dt = k[Fe][O2]

53

(38)

Eredmények és értékelésük 20. táblázat A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai Mérés

T

[FeIII(fla)(salen)]

[O2]

-d[Fe]/dt

k

száma

(°C)

(10-4 M)

(10-3 M)

(10-9 Ms-1)

(10-2 M-1s-1)

1

100

1,07

1,64

3,08

1,75±0,11

2

100

1,93

1,64

6,55

2,07±0,12

3

100

2,50

1,64

8,40

2,05±0,14

4

100

3,00

1,64

11,10

2,25±0,12

5

100

1,93

3,91

15,60

2,10±0,15

6

100

1,93

7,81

32,80

2,18±0,17

7

90

1,93

1,56

2,91

0,96±0,05

8

95

1,93

1,61

4,51

1,45±0,09

9

105

1,93

1,65

8,71

2,73±0,15

A vas(III)komplexek esetében feltételezhető, hogy az oldatban a [Fe III(fla)(salen)] ([FeIII(4’MeOfla)3]) komplex egyensúlyban van egy (flavonoxi)vas(II)vegyülettel. Ez az egyensúly, amely feltételezésünk szerint az alsó nyíl irányába tolódik el, intramolekulás elektronátmenettel írható le. A következő ún. sebesség-meghatározó lépésben a vas(II)ion reagál a molekuláris oxigénnel és egy (szuperoxo)vas(III)komplex képződik, amely trioxametallociklussá, majd a 4-es C-atomon bekövetkező nukleofil addíciós lépésben, endoperoxid szerkezetté rendeződik át. Ezt a lépést követi a heterociklusos gyűrű felhasadása és a szénmonoxid kilépése mellett kialakul a termék (O-benzoil-szalicilát), továbbra is a központi 54

Eredmények és értékelésük fémhez

ligandumként

kapcsolódva.

A

vas(III)komplexek

oxigénezésére

javasolt

mechanizmust a (39) egyenlet írja le. A komplexek dioxigénnel való reakcióját

18

O2-vel is elvégeztük. A reakciók

eredményeként [FeIII(18O-MeObs)3] és [FeIII(18O-bs)(salen)] komplexekhez jutottunk, melyek azonosítása az infravörös spektrumuk alapján történt. [FeIII(18O-MeObs)3] IR (KBr): ν (C=16O) = 1734 cm-1

ν (C=18O) = 1714 cm-1

ν (CO16O) = 1547, 1380 cm-1

ν (CO18O) = 1514, 1364 cm-1

[FeIII(18O-bs)(salen)] IR (KBr): ν (C=16O) = 1736 cm-1

ν (C=18O) = 1711 cm-1

ν (CO16O) = 1550, 1378 cm-1

ν (CO18O) = 1512, 1363 cm-1

A termékek elhidrolizálása és diazo-metánnal történő kezelése után kapott reakcióelegyet tömegspektrométerrel összekötött gázkromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá, amely alapján kimutatható volt az 18O-benzoil szalicilsav metilésztere. m/e: 260(M+, 0,4); 229(0,11); 227(0,17); 225(1,0); 107(25); 105(100)

Az

18

O-benzoil szalicilsav metilészteréhez rendelhető molekulacsúcs (m/e: 260 (256

+4); C15H12O2) alapján elmondható, hogy a dioxigén mindkét atomja beépült a komplexbe. Mivel a gázelegyben jelzett CO nincs, ez azt jelenti, hogy a 3-CO hasad ki, a CO-ban lévő oxigén a flavonolból származik. A korábbi fejezetekben ismertetett modellvegyületek szerkezetének ismeretében megállapíthatjuk, hogy azok – a szubsztrátum koordinációjának tekintetében – lényegesen eltérnek az enzimológiai vizsgálatoknál tapasztaltaktól. A szubsztrátum az enzim aktív centrumában

egyfogú,

modellvegyületeink

esetében

pedig

kétfogú

ligandumként

koordinálódik a központi fémionhoz – stabilis öttagú kelátgyűrűt kialakítva –, melynek következtében komplexeink viszonylag inertek dioxigénnel szemben (csak erélyes körülmények között játszódnak le a reakciók). Ennek magyarázata abban rejlik, hogy az enzim aktív centrumában fellépő van der Waals-kölcsönhatások és hidrogénkötések gátat szabnak az energetikailag stabilis, öttagú kelátgyűrű kialakulásának. Az ilyen módon kötött szubsztrátum lényegesen reaktívabb dioxigénnel szemben, mint a kelátban stabilizált forma. 55

Eredmények és értékelésük Szintetikus modelljeink esetében a geometria tervezésével, az öttagú kelátgyűrűben kialakuló delokalizációs viszonyokat befolyásolhatjuk, de a szubsztrátum koordinációjának módját ( egyfogú/kétfogú) nem.

K+

H H C H

O

K+

K+ O

O

O

O

acetát

K+

O O

O

fenil-acetát

difenil-acetát

trifenil-acetát

41. ábra A dioxigénezési reakciókhoz használt karboxilát koligandumok

O

O Ph O

O O

Ph O

FeIII O

N

+RCO2

O O

N

N

FeIII O O N O

R -

-

-

R = Ph3 C ; Ph2 CH ; PhCH2 ;

CH 3-

42. ábra A flavonol koordinációs módjának megváltozása trifenil-acetát koligandum jelenlétében A 4’R szubsztituensek elektronikus hatásának reakciósebességre gyakorolt hatása mellett (40. ábra) vizsgáltuk, hogy különböző a 41. ábrán látható karboxilát koligandumok sztérikus hatása miként befolyásolja a [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakcióját (43. ábra). Az ábrán jól látható, hogy elektronküldő szubsztituens jelenlétében a reakció sebessége 2,5-szeresére növelhető, míg trifenil-acetát koligandum esetében ez az érték 171-szeres. Feltételezésünk szerint, a jelentős reaktivitás növekedés a flavonol koordinációs módjának megváltozásával magyarázható (42. ábra). Karboxilát koligandumok jelenlétében a dioxigénezési reakciókat N,N-dimetilformamid oldószerben, 35, 40, 45 és 50 °C-on végeztük. A reakciók időbeli lefutását UV-VIS spektroszkópiás módszerrel, a koordinált flavonolátra jellemző π-π* töltésátviteli sáv időbeli változásán keresztül követtük. A komplex aktuális koncentrációjának számolását a LambertBeer-törvény alapján végeztük. A termékelegy összetételének meghatározása a 3.1.3. fejezetben leírtak szerint történt. 56


43. ábra 4’R szubsztituensek elektronikus és karboxilát koligandumok sztérikus hatása a [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójára III [Fe (4’Rfla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; [RCOOK] = 1,93 × 10-3 M; [O2]0 = 1,64 × 10-3 M; dmf; T = 100 °C A részletes kinetikai vizsgálatokat dmf oldószerben 40°C-on trifenil-acetát koligandum jelenlétében végeztük. A 44. ábrán egy tipikus dioxigénezési görbét láthatunk, amely a komplex aktuális koncentrációjának időbeli változását mutatja. A komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében egyenest ad (45. ábra), ami arra utal, hogy a reakció részrendje a komplexre vonatkozóan egy (R = 95,78 %).

44. ábra A [FeIII(fla)(salen)] koncentrációjának változása az idő függvényében [FeIII(fla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; [Ph3COOK] = 1,93 × 10-3 M; [O2]0 = 1,13 × 10-3 M; dmf; T = 40 °C

57


45. ábra A [FeIII(fla)(salen)] komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében III [Fe (fla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; [Ph3COOK]0 = 1,93 × 10-3 M; [O2]0 = 1,13 ×10-3 M; dmf; T = 40 °C A reakcióra a (40) általános sebességi egyenlet írható fel, melynek értelmében az egyes komponensek részrendjét különböző komplex (22. táblázat, 2-5. mérés), valamint dioxigén koncentrációk (22. táblázat, 3, 11-12. mérés) mellett történő mérésekkel határozhatunk meg. m

n

o

-d[Fe]/dt = k [Fe] [O2] [karboxilát]

(40)

A (40) általános egyenlet állandó dioxigén és koligandum koncentráció esetén a következő formára egyszerűsödik (41, 42). n

o

k’ = k [O2] [karboxilát]

[O2] = állandó; [karboxilát] = állandó

m

-d[Fe]/dt = k’ [Fe]

(41)

(42)

A [FeIII(fla)(salen)] komplex részrendjének megállapítása céljából a (41, 42) egyenletek szerint ábrázoltuk a reakció kezdeti sebességét a komplex kiindulási koncentrációinak függvényében (46. ábra), amely eredményeként megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,66 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (m = 1). Hasonló módszerrel állapítottuk meg, hogy a reakció első rend szerint függ a dioxigén koncentrációjától. A (40) általános egyenlet állandó komplex és koligandum koncentráció esetén a következő (43, 44) formában írható fel:

58


m

k’’ = k [Fe] [karboxilát]

n

[Fe] = állandó; [karboxilát] = állandó

-d[Fe]/dt = k’’ [O2]

n

(43)

(44)

A. 47. ábrán látható, hogy az összefüggés lineárisnak adódott (R = 99,40 %), ami annyit jelent, hogy a dioxigén részrendje a sebességi egyenletben egy (n = 1).

46. ábra A reakciósebesség változása a kiindulási komplexkoncentráció függvényében [O2]0 = 1,13 × 10-3 M; [Ph3COOK]0 = 1,93 × 10-3 M; dmf; T = 40 °C

47. ábra A reakciósebesség változása a dioxigénkoncentráció függvényében [FeIII(fla)(salen)]0 = 1,93 ×10-4 M; [Ph3COOK]0 = 1,93 × 10-3 M; dmf; T = 40 °C

59

Eredmények és értékelésük Vizsgáltuk, hogy a reakció sebessége hogyan függ a trifenil-acetát koligandum koncentrációjától (22. táblázat, 3, 6-10. mérés). A (40) általános egyenlet állandó komplex és dioxigén koncentráció esetén a következő (25, 46) formában írható fel: m

k’’’ = k [Fe] [O2]

n

[Fe] = állandó; [O2] = állandó

o

-d[Fe]/dt = k’’’ [karboxilát]

(45)

(46)

A 48. ábrán látható, hogy az összefüggés lineárisnak adódott (R = 96,50 %), ami annyit jelent, hogy a koligandum részrendje a sebességi egyenletben egy (o = 1). A kinetikai vizsgálatok alapján a (47) sebességi egyenlet írható fel. III

III

-d[Fe (fla)(salen)]/dt = k [Fe (fla)(salen)] [O2] [karboxilát]

(47)

48. ábra A reakciósebesség változása a karboxilát koncentráció függvényében [FeIII(fla)(salen)]0 = 1,93 ×10-4 M; [O2]0 = 1,13 × 10-3 M; dmf; T = 40 °C Különböző hőmérsékleten meghatározva (22. táblázat, 3, 13-15. mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (49, 50. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. Az aktiválási paraméterek 40 C-ra a következők:

EA = 37 kJ mol-1

ΔH

= 35 kJ mol-1

ΔS = -120 J mol-1 K-1

ΔG

= 73 kJ mol-1

60


A számolt értékek alapján megállapítható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS ) nagy negatív értéke asszociatív mechanizmusú reakcióra utal.

49. ábra A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius diagramja trifenil-acetát koligandum jelenlétében III [Fe (fla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; [Ph3COOK]0 = 1,93 × 10-3 M; dmf

50. ábra A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring diagramja trifenil-acetát koligandum jelenlétében [FeIII(fla)(salen)]0 = 2,2 ×10-4 M; [Ph3COOK]0 = 1,93 × 10-3 M; dmf A log (kAR / kAH)-t (ahol R = 4’ helyen lévő szubsztituens) ábrázolva a szubsztituens állandók (σ) függvényében egyenest kaptunk (51. ábra), melynek meredekségéből a (37) Hammett-egyenlet reakcióállandójának értéke -0,78-nak adódott (21. táblázat).

61

Eredmények és értékelésük 21. táblázat A flavonol származékok szubsztituens állandói és a [FeIII(4’Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai trifenil-acetát jelenlétében R

σ

kA

(4’RflaH)

[174]

(102 M -1s-1)

Me2N-

-0,83

19,09

MeO-

-0,27

6,48

H-

0,00

5,23

Cl-

0,23

2,61

51. ábra A [FeIII(4’Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakciójának Hammett-diagramja trifenil-acetát koligandum jelenlétében III [Fe (4’Rfla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; [O2]0 = 1,13 × 10-3 M; [Ph3COOK] = 1,93 × 10-3 M; dmf, T = 40 °C Az

elvégzett

kísérletek

eredményeként

valószínűsíthető,

hogy

karboxilát

koligandumok jelenlétében a [FeIII(4’Rfla)(salen)] komplexek dioxigénnel való reakciója a (47) sebességi egyenlettel írható le. Feltehetően a fém oxidációfoka a reakció során nem változik, első lépésként a szubsztrátumról (flavonol) elektron lép át az oxigénre, szuperoxid gyök-aniont és flavonoxil gyököt eredményezve. Az alapvető különbség tehát a koligandumot nem tartalmazó rendszer mechanizmusához képest az, hogy míg abban az estben a szubsztrátum, addig ebben az estben a dioxigén aktiválása a kulcs lépés. A szuperoxid jelenlétét UV-VIS spektroszkópiával, NBT (nitroblue-tetrazolium) hozzáadásával sikerült igazolnunk (53. ábra). A folyamat során a fém bázikus karaktere dominál, ezért ezen rendszereket ún. báziskatalizált, ’nem redoxaktív’ fémtartalmú rendszereknek nevezzük. A 52. ábra a [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési

62

Eredmények és értékelésük reakcióinak mechanizmusát szemlélteti koligandum nélkül (A) és koligandum jelenlétében (B). 22. táblázat A [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai trifenilacetát koligandum jelenlétében Mérés

T

[FeIII(fla)(salen)]0

[O2]0

[Ph3COOK]

-d[Fe]/dt

k

száma

(°C)

(10-4 M)

(10-3 M)

(10-3 M)

(10-7 Ms-1)

(102 M-1s-1)

1

40

1,93

1,13

-

0,0082

0,00004

2

40

1,07

1,13

1,93

1,32

5,67±0,34

3

40

1,93

1,13

1,93

2,12

5,02±0,35

4

40

2,50

1,13

1,93

2,70

5,05±0,31

5

40

3,00

1,13

1,93

3,38

5,17±0,41

6

40

1,93

1,13

0,96

0,74

3,52±0,23

7

40

1,93

1,13

1,35

1,24

4,20±0,30

8

40

1,93

1,13

1,54

1,37

4,08±0,22

9

40

1,93

1,13

2,31

2,90

4,35±0,28

10

40

1,93

1,13

3,86

4,09

4,86±0,33

11

40

1,93

2,69

1,93

4,05

4,05±0,24

12

40

1,93

5,38

1,93

9,75

4,12±0,28

13

35

1,93

1,08

1,93

1,63

4,06±0,32

14

45

1,93

1,23

1,93

3,07

6,71±0,40

15

50

1,93

1,41

1,93

4,13

7,86±0,51

A komplexek dioxigénnel való reakcióját

18

O2-vel is elvégeztük. A reakciók

eredményeként [FeIII(18O-bs)(salen)] komplexekhez jutottunk, amelynek azonosítása az infravörös spektrum alapján történt. [FeIII(18O-bs)(salen)] IR (KBr): ν (C=16O) = 1732 cm-1 ν (CO16O) = 1548, 1375 cm-1

ν (C=18O) = 1708 cm-1 ν (CO18O) = 1515, 1368 cm-1

A termékek elhidrolizálása és diazo-metánnal történő kezelése után kapott reakcióelegyet tömegspektrométerrel összekötött gázkromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá, amely alapján kimutatható volt az 18O-benzoil szalicilsav metilésztere.

63

Eredmények és értékelésük m/e: 260(M+, 0,4); 229(0,11); 227(0,17); 225(1,0); 107(25); 105(100)

Az

18


+4); C15H12O2) alapján elmondható, hogy a dioxigén mindkét atomja beépült a komplexbe. Mivel a gázelegyben jelzett CO nincs, ez azt jelenti, hogy a 3-CO hasad ki, a CO-ban lévő oxigén a flavonolból származik.

(A)

(B)

O

O Ph

Ph O O

K 1'

O Fe III O

N

O

+RCO2

O FeIII O

O

N

N O N O

K1

R -O2 O

-

+O2

K 2'

O

Ph

Ph O O N

O

O

Fe II O

O O

N

FeIII O

N O N O

k lassú -CO +O2

R +O 2

-CO

-

k' lassú

O O O O O Fe III O N

Ph

O

O

N

Ph

O O

O

FeIII O

N O N O

R = Ph 3C -; Ph 2CH- ; PhCH2 -; CH 3R

52. ábra [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának mechanizmusa, koligandum nélkül (A) karboxilát koligandum jelenlétében (B)

64


t (perc)

.-

NBT + O2

53. ábra Folytonos vonal: [FeIII(fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának időbeli lefutása trifenil-acetát koligandum jelenlétében [FeIII(4’Rfla)(salen)]0 = 1,93 × 10-4 M; [O2]0 = 1,13 × 10-3 M; [Ph3COOK]0 = 1,93 × 10-3 M; dmf; T = 40 °C; szaggatott vonal: szuperoxid gyök-anion és NBT reakciójában képződő diformazán abszorpciós sávja 3.1.5. A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakcióit dmf oldószerben 100, 105, 110 és 115 °C-on végeztük. A termékelegy összetételének meghatározása a 3.1.3. fejezetben leírtak szerint történt. Ennek eredményeként kijelenthetjük, hogy ebben az esetben is az enzimatikus útnak megfelelő (O-benzoil-szaliciláto)-mangán(II)komplex keletkezett. A

reakció

mechanizmusának

tisztázása

érdekében

indokolt

volt

részletes

reakciókinetikai mérések elvégzése. Az egyes reaktánsok részrendjének meghatározása céljából a reakciók vizsgálata különböző komplex- (23. táblázat, 1-4. mérés) és dioxigénkoncentrációknál (23. táblázat, 3, 5-6. mérés) történt. A sebességi egyenlet felírása a (26-31) egyenletekkel megegyező módon történt. A komplex aktuális koncentrációjának kiszámolását a Lambert-Beer-törvény alapján végeztük. Az 54. ábra a komplex dioxigénezése során kapott UV-VIS spektrumot szemlélteti. A 55. ábrán a komplex aktuális koncentrációjának logaritmusát ábrázoltuk az idő függvényében. Látható, hogy a logaritmizált értékekre jó regressziójú egyenes illeszthető (R = 99,61%), ami a komplex egyes részrendjére utal.A reakciósebességi értékeket a kiindulási komplex-koncentráció függvényében ábrázolva megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,52 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (56. ábra).

65

Eredmények és értékelésük Az 57. ábra – ahol a kezdeti reakciósebességi értékek szerepelnek a dioxigén koncentráció függvényében – a dioxigén egyes részrendjét támasztja alá (R = 99,56 %). A kinetikai vizsgálatok alapján a [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakciója a (48) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le, ahol mind a komplex, mind a dioxigén részrendje egy. II

II

-d[Mn (fla)2(py)2]/dt = k [Mn (fla)2(py)2] [O2]

(48)

54. ábra A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakciójának lefutása [MnII(fla)2(py)2]0 = 1,50 × 10-4; [O2]0 = 1,64 × 10-3 M; dmf; T = 100 °C

55. ábra A [MnII(fla)2(py)2] koncentráció logaritmusának változása az idő függvényében [MnII(fla)2(py)2]0 = 1,50 × 10-4 M; [O2]0 = 1,64 × 10-3 M; dmf; T = 100 °C

66


56. ábra A kezdeti reakciósebesség változása a komplex koncentráció függvényében [O2]0 = 1,69 × 10-3 M; dmf; T = 110 °C

57. ábra Az oxigénezési reakció kezdeti sebessége az O2 koncentrációjának függvényében [MnII(fla)2(py)2]0 = 1,50 × 10-4 M; dmf; T = 110 °C Különböző hőmérsékleten meghatározva (23. táblázat, 3, 7-9. mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (58, 59. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. Az aktiválási paraméterek 110 C-ra a következők:

EA = 52 kJ mol-1

ΔH = 49 kJ mol-1

ΔS = -137 J mol-1 K-1

ΔG = 101 kJ mol-1

67

Eredmények és értékelésük A számolt értékek alapján elmondható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS ) nagy negatív értéke asszociatív mechanizmusú, bimolekulás reakcióra utal.

58. ábra A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius-diagramja [MnII(fla)2(py)2]0 = 1,50 × 10-4 M; dmf

59. ábra A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring-diagramja [MnII(fla)2(py)2]0 = 1,50 × 10-4 M; dmf 23. táblázat A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai T

[MnII(fla)2(py)2]0

[O2]0

száma

(°C)

-4

(10 M)

-3

(10 M)

(10 Ms )

(M s )

1

110

0,40

1,69

1,01

0,15±0,007

2

110

0,87

1,69

2,14

0,15±0,007

3

110

1,50

1,69

3,18

0,13±0,005

4

110

1,74

1,69

3,89

0,13±0,006

5

110

1,50

4,03

6,01

0,10±0,004

Mérés

68

-d[Fe]/dt -8

-1

k -1 -1

Eredmények és értékelésük 23. táblázat A [MnII(fla)2(py)2] komplex dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai Mérés

T

[MnII(fla)2(py)2]0

[O2]0

-d[Fe]/dt

k

száma

(°C)

(10-4 M)

(10-3 M)

(10-8 Ms-1)

(M-1s-1)

6

110

1,50

8,45

11,9

0,09±0,004

7

100

1,50

1,64

1,96

0,08±0,003

8

105

1,50

1,65

2,36

0,09±0,005

9

115

1,50

1,65

3,69

0,15±0,006

Az elvégzett kísérletek eredményeként valószínűsíthető, hogy a [Mn II(fla)2(py)2] komplex dioxigénnel való reakciója a (48) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le. A részletes reakciókinetikai méréseket követően a [MnII(fla)2] komplex esetében is vizsgáltuk, hogy különböző karboxilát koligandumok (41. ábra) hogyan befolyásolják a dioxigénezési reakció sebességét. Vizsgáltuk a reakciósebesség változását különböző koligandum koncentrációknál, melynek eredményeként, minden esetben telítési görbét kaptunk (60. ábra, 25. táblázat). A 24. táblázatban összefoglaltuk a karboxilát koligandumok reakciósebességre gyakorolt hatását (vr). Az eredmények alapján megállapítható, hogy a reakciósebesség csak kis mértékben változik a [FeIII(fla)(salen)] rendszerhez képest. A 27. ábrán

bemutattuk

a

[MnII(fla)2(py)2]

komplex

röntgenszerkezetét,

ami

alapján

megállapítottuk, hogy a mangánion síkjában a két flavonoláto-ligandum oxigénatomjai találhatók, axiális pozícióban a két piridin nitrogénatomjai helyezkednek el. A [MnII(fla)2] komplex esetében az axiális pozíciók üresek, oldatban az oldószer (dmf) koordinációja tételezhető fel. Karboxilát koligandumok jelenlétében a dmf kiszorul a koordinációs övezetből, helyette, a koligandum koordinálódik a központi fémhez. Ebben az esetben a karboxilát koligandumok sztérikus hatása nem érvényesül – a flavonol koordinációjának módja nem változik – a reakciósebesség növekedése a koligandumok elektronikus hatásával magyarázható. Különböző hőmérsékleten meghatározva a k (sebességi állandó) értékét az Arrheniusés az Eyring-összefüggés minden esetben lineárisnak adódott (karboxilát koligandumok jelenlétében). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. A aktiválási entalpiát ábrázolva az aktiválási entrópia függvényében lineáris összefüggést kaptunk, amely alapján megállapítható, hogy a reakció során, karboxilát koligandum hozzáadásával sem változik meg a reakció mechanizmusa (izokinetikus reakciók) (61. ábra, 25. táblázat).

69


60. ábra A kezdeti reakciósebesség változása trifenil-acetát koligandum jelenlétében [MnII(fla)2]0 = 1,50 × 10-4 M; [O2]0 = 1,69 × 10-3 M; dmf; T = 110 °C 24. táblázat A karboxilát koligandumok reakciósebességre gyakorolt hatása a [MnII(fla)2] komplex dioxigénezési reakciójában Koligandum

vmax (×10-8 Ms-1)

vr

-

3,18

1

37,0

11,6

21,7

6,8

108,9

34,2

58,1

18,3

CH3CO2

-

PhCH2CO2 Ph2CHCO2 Ph3CCO2

-

-

61. ábra Aktiválási paraméterek változása karboxilát koligandumok hatására [MnII(fla)2]0 = 1,50 × 10-4 M; [O2]0 = 1,56× 10-3 M; dmf; T = 90 °C

70

Eredmények és értékelésük 25. táblázat A [MnII(fla)2] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai karboxilát koligandumok jelenlétében Mérés

ko-

T

[MnII(fla)2]0

[O2]0

[koligandum]

-4

-3

-3

-d[Mn]/dt -8

-1

k ( M-1s-1)

száma

ligandum

(°C)

(10 M)

(10 M)

(10 M)

1

-

110

1,50

1,69

-

3,18

2

CH3CO2

110

1,50

1,69

0,75

6,91

-

3

CH3CO2

110

1,50

1,69

1,50

10,9

-

4

CH3CO2

110

1,50

1,69

3,00

20,2

-

5

CH3CO2

110

1,50

1,69

4,50

28,8

-

6

CH3CO2

110

1,50

1,69

6,00

33,0

-

7

CH3CO2

110

1,50

1,69

7,50

35,7

-

8

CH3CO2

110

1,50

1,69

9,00

36,9

1,45±0,09

9

CH3CO2

110

1,50

1,69

11,00

37,0

-

80

1,50

1,47

9,00

10,9

0,49±0,008

90

1,50

1,56

9,00

17,9

0,76±0,011

100

1,50

1,64

9,00

27,1

1,10±0,07

110

1,50

1,69

1,50

5,1

-

110

1,50

1,69

3,00

9,01

-

110

1,50

1,69

4,50

11,6

-

110

1,50

1,69

6,00

16,0

-

110

1,50

1,69

7,50

19,4

-

110

1,50

1,69

9,00

20,9

0,79±0,013

110

1,50

1,69

11,00

21,7

-

80

1,50

1,47

9,00

5,0

0,23±0,005

90

1,50

1,56

9,00

9,1

0,39±0,007

100

1,50

1,64

9,00

12,9

0,52±0,006

110

1,50

1,69

0,15

15,1

-

110

1,50

1,69

0,30

31,4

-

110

1,50

1,69

0,45

45,1

-

110

1,50

1,69

0,75

72,3

-

10

CH3CO2

-

11

CH3CO2

12

CH3CO2

13

PhCH2CO2

14

PhCH2CO2

15

PhCH2CO2

16

PhCH2CO2

17

PhCH2CO2

18

PhCH2CO2

19

PhCH2CO2

20

PhCH2CO2

21

PhCH2CO2

22

PhCH2CO2

23 24

-

Ph2CHCO2 Ph2CHCO2

25

Ph2CHCO2

26

Ph2CHCO2

-

71

(10 Ms )

0,13±0,005

Eredmények és értékelésük 25. táblázat A [MnII(fla)2] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai karboxilát koligandumok jelenlétében Mérés

ko-

száma

ligandum

27

Ph2CHCO2

28

Ph2CHCO2

29

Ph2CHCO2

30

Ph2CHCO2

31

Ph2CHCO2

32

Ph2CHCO2

33

Ph3CCO2

34

Ph3CCO2

35

Ph3CCO2

36

Ph3CCO2

37

Ph3CCO2

38

Ph3CCO2

39

Ph3CCO2

40

Ph3CCO2

41

Ph3CCO2

42

Ph3CCO2

-

--

--

---

-

T

[MnII(fla)2]0

[O2]0

[koligandum]

(°C)

-4

(10 M)

-3

(10 M)

-3

(10 M)

(10 Ms )

110

1,50

1,69

1,50

105,3

4,16±0,11

110

1,50

1,69

2,25

107,2

-

110

1,50

1,69

3,00

108,9

-

80

1,50

1,47

1,50

17,7

0,81±0,009

90

1,50

1,56

1,50

33,7

1,44±0,08

100

1,50

1,64

1,50

53,3

2,17±0,09

110

1,50

1,69

0,15

13,0

-

110

1,50

1,69

0,30

26,5

-

110

1,50

1,69

0,45

39,1

-

110

1,50

1,69

0,75

47,8

-

110

1,50

1,69

1,50

56,7

2,24±0,10

110

1,50

1,69

2,25

57,2

-

110

1,50

1,69

3,00

58,1

-

80

1,50

1,47

1,50

23,8

0,94±0,05

90

1,50

1,56

1,50

32,1

1,27±0,09

100

1,50

1,64

1,50

46,1

1,82±0,08

-d[Mn]/dt -8

-1

k ( M-1s-1)

A Mn(II)-komplex esetében feltételezhető, hogy a reakció a sebesség-meghatározó lépéssel

indul,

melyben

a

Mn(II)-ion

reagál

a

molekuláris

oxigénnel

és

egy

(szuperoxo)mangán(III)-komplex képződik, amely trioxa-metallociklus, majd a 4-es Catomon bekövetkező nukleofil addíciós lépésben, endoperoxid szerkezetté rendeződik át. Ezt a lépést követi a heterociklikus gyűrű felhasadása és a szén-monoxid kilépése mellett kialakul a termék (O-benzoil-szalicilát), továbbra is a központi fémhez ligandumként kapcsolódva. A mangán(II)komplexek oxigénezésére javasolt mechanizmust a (49) egyenlet írja le. A komplex dioxigénezési reakcióját

18

O2-vel is elvégeztük. A reakció eredményeként

II 18

[Mn ( O-bs)2] komplexhez jutottunk, melynek azonosítása az infravörös spektrum alapján történt.

72

Eredmények és értékelésük [MnII(18O-bs)2] IR (KBr): ν (C=16O) = 1734 cm-1

ν (C=18O) = 1714 cm-1

ν (CO16O) = 1547, 1380 cm-1 ν (CO18O) = 1514, 1364 cm-1 A termékek elhidrolizálása és diazo-metánnal történő kezelése után kapott reakcióelegyet tömegspektrométerrel összekötött gázkromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá, amely alapján termékként az 18O-benzoil szalicilsav metilészterét sikerült kimutatni: m/e: 260(M+, 0,4); 229(0,11); 227(0,17); 225(1,0); 107(25); 105(100)

Az

18


+4); C15H12O2) alapján elmondható, hogy a dioxigén mindkét atomja beépült a komplexbe. Ezt támasztja alá az is, hogy a reakció lejátszódása után a gázelegyben jelzett szén-monoxidot nem sikerült kimutatni.

O + O2 O O

k1 lassú

k2 O

O O

Mn II

O

O

O

O

O

O

Mn III

O

Mn II

(49)

k3 O O O O

MnII

k5 -CO

O O O

ANu

Mn

O

k4

O O

O

II

O O

O II

Mn

A funkcionális modellek vizsgálata alapján a következő megállapítások tehetők: Az elvégzett részletes reakciókinetikai vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a reakciók a flavonol 2,4-dioxigenáz enzim funkcionális modelljeinek tekinthetők. Az azonos összetételű (homoleptikus komplexek), de eltérő fémtartalmú modellrendszerek vizsgálata egyértelművé tette, hogy a fémnek kitüntetett szerepe van mind az enzim-, mind a modellreakciókban. A 26. táblázat az általunk vizsgált vas(III)- illetve mangán(II)tartalmú rendszerekre kapott k értékeket tartalmazza, összehasonlítva a [CuII(fla)2] komplexre korábban meghatározott értékkel [175]. A sebességértékeket összevetve megállapítható, hogy 73

Eredmények és értékelésük a mangán(II)- és vas(III)komplexek esetében az oxigénezés sebessége körülbelül egy nagyságrenddel nagyobb, mint a réznél. A vas(III)- és mangán(II)tartalmú rendszereket összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy mindkét esetben az enzimatikus útnak megfelelő termékeket kaptuk, de eltérő mechanizmus szerint. Mn(II) esetében a dioxigén, míg Fe(III) esetében a szubsztrátum aktiválása a meghatározó lépés. A szubsztrátum fémhez történő koordinációjának módja nagymértékben kihat az oxigénezés sebességére. A szintetikus modellkomplexek dioxigénnel szembeni viszonylagos inertsége a stabilis öttagú kelátgyűrű kialakulásával magyarázható. Karboxilát koligandumok jelenlétében a dioxigénezési reakciók sebessége mintegy 2 nagyságrenddel növelehető, ami a flavonol

koordinációs

módjának

megváltozásán

keresztül

értelmezhető.

Karboxilát

koligandum jelenlétében a reakció mechanizmusa is megváltozik, ebben az esetben a dioxigén aktiválása a kulcslépés, melynek eredményeként szuperoxid gyök-anion képződik, amit sikerült UV-VIS spektroszkópiai módszer segítségével igazolnunk. 26. táblázat A [FeIII(4’MeOfla)3], [FeIII(fla)(salen)], [MnII(fla)2(py)2] és [CuII(fla)2] komplexek oxigénezési reakcióinak k értékei dmf-ban, 90 ºC-on kH(k4’MeO) Komplex (M-1s-1) [FeIII(4’MeOfla)3]

0,40

[FeIII(fla)(salen)]

0,01 (0,018)

[MnII(fla)2(py)2]

0,07

[CuII(fla)2]

0,01(0,014)

74

Eredmények és értékelésük 3.2. ACC oxidáz modellek Az etilén, mint növekedési hormon fontos szerepet játszik a növények érési és más növekedési folyamataiban. A növényi sejtek a fenti folyamatokon kívül számos más esetben is termelnek etilént, pl. különféle stressz (fizikai sérülés, fagyás, kiszáradás, nehézfémsó mérgezés) esetén, ezért az ACCO enzim által katalizált folyamat megértése potenciális mezőgazdasági és kereskedelmi fontossággal is kecsegtethet. Célunk volt, hogy a reakció termékeinek, intermedierjeinek azonosítása után az előállított komplexek felhasználásával katalitikus rendszereket dolgozzunk ki. Modellvegyületként az irodalomban már ismert [FeIII(salen)Cl] komplexet választottuk [176]. A választást az indokolta, hogy a salenH2 ligandum könnyen, olcsón előállítható, Fe(III)komplexei nem érzékenyek, továbbá, számos salen-típusú ligandummal előállított, különböző átmenetifémet tartalmazó komplex (Mn, Co, Fe, Pd, Ni, Cu) bizonyult katalitikusan aktívnak szerves vegyületek oxidációs reakcióiban [177-179]. 3.2.1. ACC oxidáz enzim modellreakcióinak vizsgálata A funkcionális modellek kidolgozása során szubsztrátumként 1-amino-ciklopropán-1karbonsavat (accH), 2-amino-izovajsavat (aibH) – mint alternatív szubsztrátum – és alanint (alaH), oxidálószerként hidrogén-peroxidot, katalizátorként pedig [FeIII(salen)Cl] komplexet használtunk. A komplex aktivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy katalizálja az aminosavak oxidációját (50-52), a reakciókat gázkromatográfiás méréssel követtük nyomon a termékek koncentrációjának időbeli változásán keresztül. CO 2NH 3+

H 2O 2 [FeIII(salen)Cl]

+ HCN + CO 2

(50)

+ NH3 + CO2

(51)

accH CO 2NH 3+ aibH CO 2H NH 3+ alaH

H 2O 2

O

[FeIII(salen)Cl]

H 2O 2 [FeIII(salen)Cl]

O H

+ NH3 + CO2

(52)

Az oxidációs reakciókat dmf/víz 3:1 arányú keverékében, 1:5000:5000 komplex, szubsztrátum, hidrogén-peroxid arány mellett, 25 ºC hőmérsékleten végeztük. Az oldószer75

Eredmények és értékelésük elegy kiválasztását az indokolta, hogy míg a komplex dmf-ban, addig a szubsztrátum vízben oldódik jól. A megfelelő összetétel meghatározásához, különböző dmf/víz arányok mellett végeztük el az oxidációs reakciókat és azt találtuk, hogy 3:1 arányú dmf/víz elegyben érhető el a legnagyobb hozam (62. ábra). Az aminosavak oxidációs reakciói során elért TOF (átalakulási frekvencia) és hozam értékeket a 63. ábra szemlélteti.

62. ábra A hozam változása a dmf/víz arány függvényében a 2-amino-izovajsav oxidációs reakciójában [FeIII(salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [aibH]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; T = 25 °C

63. ábra Aminosavak oxidációs reakcióiban elért hozam és TOF értékek [FeIII(salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [sz]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; [NH4OH] = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C; aibH* bázis nélkül A 63. ábrán látható, hogy a reakció csak a 2-amino-izovajsav esetén játszódik le bázis (NH4OH) hozzáadása nélkül. A 64. ábrán látható, hogy a reakció egy indukciós periódussal kezdődik, majd ezt követően telítésbe megy át, bázis hozzáadásával az indukciós periódus csökken. Feltételezésünk szerint a bázis az aminosav deprotonálásában játszik szerepet, 76

Eredmények és értékelésük amelynek eredményeként könnyebben alakul ki a fém-szubsztrátum komplex, ezáltal gyorsítva a reakció lejátszódását.

64. ábra Bázis hatása 2-amino-izovajsav oxidációs reakciójában [Fe (salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [aibH]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 1,13 × 10-2 M; ■ bázis nélkül; ▲ [NH4OH] = 0,28 × 10-2 M; ● [NH4OH] = 1,80 × 10-2 M; [NH4OH] = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C III

A megfelelő körülmények meghatározását követően a 2-amino-izovajsav szubsztrátum esetében részletes reakciókinetikai vizsgálatokat végeztünk, melynek során vizsgáltuk a reakciósebesség változását a komplex, a szubsztrátum és a hidrogén-peroxid koncentrációk függvényében.

65. ábra A reakciósebesség változása a szubsztrátum kiindulási koncentrációjának függvényében [FeIII(salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C

77

Eredmények és értékelésük A

szubsztrátum

részrendjének

meghatározása

során

Michaelis-Menten-típusú

összefüggéshez jutottunk (65. ábra), amely alapján valószínűsíthető a 2-amino-izovajsav koordinációja, amely a [FeIII(salen)Cl] és a szubsztrátum közötti előegyensúlyi lépéssel írható le (53). A reakciósebességi értékek reciprokát ábrázolva a szubsztrátum koncentráció reciprokának függvényében az ún. Lineweaver-Burk egyeneshez jutottunk (R = 98,30 %), amelyből KM értéke 7,8 mmol-nak adódott (66. ábra).

0

66. ábra Lineweaver-Burk egyenes [FeIII(salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C A [FeIII(salen)Cl] komplex részrendjének meghatározása érdekében, vizsgáltuk a reakciósebességi értékek alakulását a kiindulási komplexkoncentrációk függvényében (azonos szubsztrátum és hidrogén-peroxid koncentráció mellett). A 67. ábrán látható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,23 %), ami a komplexre nézve elsőrendű kinetikára utal.

67. ábra A reakciósebesség változása a komplex kiindulási koncentrációjának függvényében [aibH]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C 78

Eredmények és értékelésük A reakciókat különböző H2O2-koncentrációk mellett elvégezve és a sebességértékeket meghatározva a hidrogén-peroxidra nézve is egyes részrendhez jutottunk (68. ábra; R = 99,60 %).

68. ábra A reakciósebesség változása a hidrogén-peroxid kiindulási koncentrációjának függvényében [FeIII(salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [sz]0 = 3,60 × 10-2 M; [NH4OH] = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C; aibH* bázis nélkül A 68. ábrán látható, hogy a kísérleteket a többi aminosav esetében elvégezve is lineáris összefüggést kaptunk a hidrogén-peroxid koncentrációjának változtatása esetén (AIBH: R = 99,96 %; ALAH: R = 98,44 %; ACCH: R = 98,13 %). A részletes reakciókinetikai méréseket követően, különböző spektroszkópiai módszerek segítségével (UV-VIS, ESR) próbáltunk információt nyerni a reakció során esetlegesen kialakuló intermedierekről, azonban nem kaptunk értékelhető eredményeket. Rajagopal és munkatársai 2009-ben spektroszkópiailag bizonyították, hogy a [FeIII(salen)Cl] komplexből hidrogén-peroxiddal egy [FeIV=O(salen)]●+ reaktív intermedier keletkezik, szulfidok és szulfoxidok oxidációs reakcióiban [180]. Korábban van Eldik és csoportja hasonló eredményeket kapott a fenti reakciók vizsgálata során [181]. Annak eldöntése céljából, hogy a reaktív oxovas részecskék képesek-e az aminosavak oxidációjára, az irodalomban jól ismert [FeII(N4Py)(ClO4)2] komplexet választottuk modellvegyületként, amely jól meghatározott módon reagál különböző oxidálószerekkel (H2O2, PhIO, m-CPBA), termékként szobahőmérsékleten is stabilis oxovas(IV) komplexet eredményezve [182-187]. A komplex aktivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy katalizálja az aminosavak oxidációját. A 69. és 70. ábra az 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav és a 2-amino-izovajsav oxidációs reakciói során elért hozam és átalakítási frekvencia értékeket szemlélteti. 79

Eredmények és értékelésük Megállapítható, hogy mindkét esetben a [FeII(N4Py)(ClO4)2] komplex aktívabbnak bizonyult, a [FeIII(salen)Cl] komplexnél.

69. ábra 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidációs reakciójában elért hozam és TOF értékek III A: [Fe (salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [accH]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; B: [FeII(N4Py)(ClO4)2]0 = 7,20 × 10-6 M; [accH]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; [NH4OH] = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C

70. ábra 2-amino-izovajsav oxidációs reakciójában elért hozam és TOF értékek A: [FeIII(salen)Cl]0 = 7,20 × 10-6 M; [aibH]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; B: [FeII(N4Py)(ClO4)2]0 = 7,20 × 10-6 M; [aibH]0 = 3,60 × 10-2 M; [H2O2]0 = 3,60 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C UV-VIS spektroszkópia segítségével sikerült kimutatnunk az aibH szubsztrátum oxidációs reakciója során kialakuló oxovas(IV) intermedier jelenlétét (71. ábra). A mechanizmus tisztázása érdekében vizsgáltuk, hogy nehézvízben (D2O), milyen sebességgel játszódnak le a reakciók. A 27. táblázatban összefoglaltuk a kapott SIE (oldószer izotóp effektus) értékeket, amelyek 1,3 és 3,9 értékek közé esnek. Látható, hogy a két komplexre kapott SIE értékek közel azonosak, ami alapján feltételezhető, hogy mindkét komplex 80

Eredmények és értékelésük esetében azonos mechanizus szerint játszódnak le az oxidációs reakciók, tehát [FeIII(salen)Cl] komplex esetében is feltételezhető, hogy egy reaktív oxovas(IV) gyök-kation keletkezik, ami összhangban van a korábbi irodalmi eredményekkel.

t

. 71. ábra Oxovas(IV) intermedier bomlása 2-amino-izovajsav oxidációja során [Fe (N4Py)(ClO4)2]0 = 1,00 × 10-3 M; [aibH]0 = 1,00 × 10-2 M; [H2O2]0 = 1,00 × 10-2 M; dmf/víz; T = 25 °C II

27. táblázat Oldószer izotóp effektus értékek aminosavak oxidációs reakcióiban Komplex

Szubsztrátum

SIE

[FeIII(salen)Cl]

accH

3,9

[FeIII(salen)Cl]

alaH

2,5

[Fe (salen)Cl]

aibH

1,3

[FeII(N4Py)(ClO4)2]

aibH

1,4

III

CO2 NH 3+

-H +

CO 2NH 2

+H+

(53)

S [Fe]

+ S

[Fe-S] + H 2 O2

lassú PCET

[O=Fe IV-S] vagy [O=FeIV-S]

(-H +, -e -)

81

[Fe-S]

(54)

[O=FeIV-S] vagy [O=Fe IV-S]

(55)

CO2NH

(56)

Eredmények és értékelésük Az elvégzett reakciókinetikai vizsgálatok alapján, feltételezésünk szerint a reakció két előegyensúlyi lépéssel indul (53, 54), ennek eredményeként egy fém-szubsztrátum komplex alakul ki, melynek hidrogén-peroxiddal történő reakciója során oxovas(IV) reaktív intermedierek alakulnak ki (55), majd a sebességmeghatározó lépésben PCET – protoncsatolt elektron transzfer – folyamat révén kialakul egy szubsztrát-gyök, melynek bomlásával a termékek kialakulása levezethető (56). A kinetikai mérések erdményeit a 28. táblázatban foglaltuk össze. 28. táblázat Aminosavak oxidációs reakcióinak kinetikai adatai Mérés száma

Subsz.

[Fe]0

[H2O2]0

[S]0

[NH4OH]

-5

(10 M)

-2

(10 M)

-2

(10 M)

-2

(10 M)

-d[sz]/dt

TOF

t

Hozam

(10 Ms )

(1/h)

(perc)

(%)

-5

-1

1

aibH

0,72

3,60

3,60

-------

1,41

4437

50

79,8

2

aibH

0,94

3,60

3,60

-------

2,01

6211

40

82,8

3

aibH

1,15

3,60

3,60

-------

2,26

6021

40

80,3

4

aibH

1,44

3,60

3,60

-------

2,73

7853

30

78,5

5

aibH

0,72

3,60

0,34

-------

0,56

10000

30

100

6

aibH

0,72

3,60

0,66

-------

0,92

10000

30

100

7

aibH

0,72

3,60

1,08

-------

1,17

10000

30

100

8

aibH

0,72

3,60

2,16

-------

1,42

7327

40

97,7

9

aibH

0,72

3,60

2,88

-------

1,43

7500

40

100

10

aibH

0,72

1,13

3,60

-------

0,50

1344

50

22,4

11

aibH

0,72

2,25

3,60

-------

0,96

3112

40

41,5

12

aibH

0,72

1,13

3,60

0,28

0,56

2160

30

21,6

13

aibH

0,72

1,13

3,60

1,8

0,85

2300

30

23

14

aibH

0,72

1,13

3,60

3,60

0,95

2460

30

24,6

15

aibH

0,72

2,25

3,60

3,60

1,15

3637

40

48,5

16

aibH

0,72

3,60

3,60

3,60

1,79

4800

40

64

17

aibD

0,72

1,13

3,60

-------

0,42

1200

90

36

18

aibD

0,72

2,25

3,60

-------

0,74

1760

90

52,8

82

Eredmények és értékelésük 28. táblázat Aminosavak oxidációs reakcióinak kinetikai adatai Mérés száma

Subsz.

[Fe]0

[H2O2]0

[S]0

[NH4OH]

-d[sz]/dt

TOF

t

Hozam

(10-5 M)

(10-2 M)

(10-2 M)

(10-2 M)

(10-5 Ms-1)

(1/h)

(perc)

(%)

90

76,8

19

aibD

0,72

3,60

3,60

-------

1,15

2560

20

alaH

0,72

3,60

3,60

-------

-------

------- ------- -------

21

alaH

0,72

1,13

3,60

3,60

0,14

373

210

26,1

22

alaH

0,72

2,25

3,60

3,60

0,25

606

210

42,4

23

alaH

0,72

3,60

3,60

3,60

0,35

1226

210

85,8

24

alaD

0,72

3,60

3,60

3,60

0,14

558

360

67

25

accH

0,72

3,60

3,60

-------

-------

26

accH

0,72

3,60

3,60

3,60

0,10

361

340

40,9

27

accH

0,72

12,60

3,60

3,60

0,51

1361

140

63,5

38

accH

0,72

18,00

3,60

3,60

0,85

2739

100

91,3

29

accD

0,72

18,00

3,60

3,60

0,22

733

180

44

------- ------- -------

Az eredmények figyelembevételével megállapítható, hogy a [FeIII(salen]Cl] komplex hatékony

katalizátornak

bizonyult

1-amino-ciklopropán-1-karbonsav

oxidációjában.

Termékként az enzimatikus útnak megfelelően etilén keletkezett, tehát ezen rendszer funkcionális ACC oxidáz modellnek tekinthető. Az oxidációs reakciók kiterjeszthetők más aminosavakra is: 2-amino-izovajsavra (aibH) és alaninra (alaH). [FeII(N4Py)(ClO4)2] komplex esetében FeIV=O intermedier jelenlétét is sikerült kimutatnunk, az elvégzett reakciókinetikai vizsgálataink alapján javaslatot tettünk az oxidációs reakciók lehetséges mechanizmusára. Feltételezésünk szerint, mindkét komplex esetében FeIV=O intermedieren keresztül megy végbe az átalakulás.

83

Eredmények és értékelésük 3.3. Izoindolin-típusú ligandumok mangán- és vastartalmú komplexeinek előállítása A szintetikus modellvegyületek előállításához szubsztituált 1,3-bisz(2’-piridil-imino)izoindolin

(6’R2indH;

4’R2indH)

és

1,3-bisz

(2’-benzimidazoil-imino)-izoindolin

(1’R2bim2indH) ligandumokat választottuk (72. ábra). Ezt az indokolta, hogy a fenti ligandumok szerkezetüket tekintve nagyon hasonlatosak a porfirin-vázhoz, valamint, hogy az irodalomban talált 1,3-bisz(2’-piridil-imino)-izoindolin-tartalmú fémkomplexek közül egyes ruténium- [188] és kobalttartalmú [189] komplexek hatásosnak bizonyultak különféle oxidációs reakciókban. Az 6’R2indH háromfogú ligandum, amelynek szerkezete a 73. ábrán látható tautomer szerkezetekkel írható le. N R

H N

N

N

N

R=

N

N

NH N R

indH

N

4'Me 2indH

6'Me 2indH

bim2 indH

1'Me 2bim2 indH

72. ábra A modellvegyületek előállításához alkalmazott ligandumok

N

HN

N

NH N

N

N N

N

N

73. ábra Az 1,3-bisz(2’-piridil-imino)-izoindolin (6’R2indH) szerkezete 29. táblázat A 6’Me2indH ligandum fontosabb kötésszögei és kötéstávolságai Atompárok N1–C1 N1–C4 N2–C1 N2–C9 N3–C9 N3–C10 Atomok C1–N1–C4 N1–C4–N4 N4–C15–N5

Kötéshossz (Å) 1,386(3) 1,396(3) 1,291(3) 1,402(3) 1,344(3) 1,345(3) Kötésszögek (°) 112,14(19) 130,2(2) 119,0(2)

Atompárok N4–C4 N4–C15 N5–C15 N5–C16 C1–C2 C2–C5 Atomok C1–N2–C9 C4–N4–C15 N2–C9–N3 84

Kötéshossz (Å) 1,278(3) 1,413(3) 1,339(3) 1,351(3) 1,472(3) 1,387(3) Kötésszögek (°) 122,8(2) 122,1(2) 120,8(2)

Eredmények és értékelésük 30. táblázat A 6’Me2indH ligandum krisztallográfiai adatai 6’Me2indH sárga 327,39 295 K MoK ( = 0,71070 Å) Monoklin P21/C

Ligandum Szín Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport Elemi cella méretei a [Å] b [Å] c [Å] (°) (°) (°) Elemi cella térfogata [Å3] Z Sűrűség (számított) [Mg/m3] Abszorpciós koeff,, [mm-1] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Index tartományok

17,1287(2) 18,4423(2) 10,8367(2) 96,5780(7) 90,00 3400,70(8) 8 1,279 0,080 1376 0,75 × 0,658 × 0,408 nincs -20 h 20 -21 k 21 -12 l 12 5856 5048 R1 = 0,0647, wR2 = 0,1358

Gyűjtött reflexiók Független refl, száma Végső R [I>2 (I)]

A 74. ábra a 6’-metil-szubsztituált ligandum röntgenszerkezetét szemlélteti. A szerkezetből kitűnik, hogy a 73. ábrán feltüntetett egyensúly a hidrogénkötések miatt az alsó nyíl irányába van eltolódva. A ligandum krisztallográfiai adatait a 30. táblázat, a fontosabb kötéstávolság és kötésszög értékeket a 29. táblázat tartalmazza. A ligandumok azon szerkezeti sajátságát kihasználva, hogy a komplexképzésben mind semleges, mind deprotonált formában is részt vehetnek, felhasználásukkal új mangán- és vastartalmú komplexek előállítását tűztük ki célul.

N Mn II(ClO4)2 × 6H 2O +

N

Me MeCN

NH

Ar N

N

[Mn(6'R2indH)(H 2O) 2(MeCN)](ClO4) 2

Me indH: R = H; 6'Me2indH: R = Me

85

(57)


74. ábra A 6’Me2indH ligandum röntgenszerkezete Pirokatechin oxidáz modellként [Mn(6’R2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 összetételű modellvegyületeket a (57) egyenlet alapján állítottuk elő. A termékek összetételének és szerkezetének meghatározása elemanalízis, valamint spektroszkópiai (IR, UV-VIS, ESR) és röntgendiffrakciós mérések alapján történt (31. táblázat). A komplexek elemanalízise azt mutatta, hogy a mért értékek mindkét komplex esetében megfelelnek a feltételezett szerkezetekre számolt értékekkel, indH esetében röntgendiffrakciós szerkezetmeghatározás is történt. A [MnII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex infravörös spektrumában az 1600 cm-1 felett jelentkező két intenzív sáv (1657, 1626) az 1,3-bisz(2’-piridil-imino)-izoindolin protonált (semleges) formában történő koordinációját mutatja. A sávok egyértelműen nem rendelhetőek egyedi rezgésekhez, az irodalomban megjelenésüket a ligandumban lévő iminoés

2’-piridilcsoportok

csatolt

rezgésével

magyarázzák

[189].

A

2’-piridilcsoport

koordinációját jelzi az 1009 cm-1-nél észlelt sáv is. A 3326 cm-1-nél jelentkező elnyelés a ligandum NH vegyértékrezgéséhez (νNH) rendelhető. A perklorát-anion jelenlétét az 1097 és 627

cm-1-es

rezgések

támasztják

alá.

Hasonló

[MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex esetében is.

86

spektrumot

kapunk

a

Eredmények és értékelésük Az UV-VIS spektrumon a szabad izoindolinhoz rendelhető három jellemző abszorpciós sáv (366, 385, 408 nm) a komplexképződés következtében nem tolódott el, ami az IR eredményekkel összhangban a ligandum protonált (semleges) formában történő koordinációját bizonyítja. 31. táblázat A [MnII(6’R2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplexek fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex

[Mn(indH)](ClO4)2

[Mn(6’Me2indH)](ClO4)2

Szín

aranysárga

citromsárga

Op, (˚C)

286-289

149-151

1657

1658

1626

1634

1132

1113

NH: 3326

NH: 3334

ClO4: 1097, 627

ClO4: 1098, 625

lg ε (371 nm) = 4,42

lg ε (370,5 nm) = 4,41

IR (cm-1)

UV-VIS (dmf)

75. ábra A [MnII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex röntgenszerkezete

87


[MnII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2

komplex

MeCN-MeOH

elegyből

éterdiffuzióval történő átkristályosítása után barna kristályokhoz jutottunk, melyek alkalmasnak bizonyultak röntgendiffrakciós mérésre, azonban a kristály minősége nem tette lehetővé a szerkezet további finomítását. A komplexről készült röntgenszerkezet a 75. ábrán látható. A komplex geometriáját tekintve leginkább torzult négyzetes bipiramisos szerkezettel írható le. Az alapsíkban a mangán(II)ion körül a háromfogú indH ligandum és az oldószermolekula (MeCN) nitrogénjei helyezkednek el. Az alapsíkra merőlegesen két vízmolekula koordinációja figyelhető meg. A [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex dmf-ban készült ESR felvételén ( 76. ábra) a mangán(II)ionokra jellemző hatvonalas jel látható (g = 2,0011, AMn = 94,14 G).

76. ábra A [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplexről készült ESR felvétel (dmf) folytonos vonal: elméleti értékek, pontok: számított értékek . R

N Mn II(ClO4 )2 × 6H 2 O + 2

N MeOH, 2NEt3

NH N

Ar

[Mn(4'R2 ind)2 ]

N

indH: R = H 4'Me 2indH: R = Me

R

88

(58)

Eredmények és értékelésük A [MnII(4’R2ind)2] (R = H, CH3) összetételű, homoleptikus szerkezetű kataláz illetve szuperoxid dizmutáz modellvegyületeinket a (58) egyenlet szerint állítottuk elő, szerkezetüket spektroszkópiai (IR, UV-VIS) és röntgendiffrakciós méréssel (32-34. táblázat) is igazoltuk 32. táblázat A [MnII(ind)2] és a [MnII(4’Me2ind)] komplexek fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex

[Mn(ind)2]

[Mn(4’Me2ind)2]

Szín

vöröses-barna

zöldes-barna

Op, (˚C)

137-140

161-164

1569

1569

1103

1103

lg ε(424 nm) = 4,52

lg ε(423,5 nm) = 4,73

IR (cm-1) UV-VIS (dmf)

77. ábra A [MnII(ind)2] komplex röntgenszerkezete A [MnII(ind)2] komplex infravörös spektrumában az 1600-1660 cm-1 közötti tartományban intenzív sávok nem találhatók, ez egyértelműen arra utal, hogy az 1,3-bisz(2’89

Eredmények és értékelésük piridil)-izoindolin

ligandum

egyszeresen

deprotonált

formában

vesz

részt

a

komplexképzésben. Az 1569- és 1103 cm-1 hullámszám értékeknél található elnyelések szintén a deprotonált ind ligandum koordinációjára utalnak [61]. Az 1001 cm-1-nél jelentkező sáv a 2’-piridilcsoportok koordinációját jelzik. Az UV-VIS spektrumon a szabad izoindolinhoz rendelhető három jellemző abszorpciós sáv (366, 385, 408 nm) közül a legalacsonyabb hullámhossz értéknél található eltűnt, a másik két abszorpciós sáv a komplexképződés következtében eltolódott (424, 451 nm). Ezen 40-50 nm-es batokróm eltolódások a koordinálódott, deprotonált izoindolinátligandum π-π* töltésátviteli sávjaihoz rendelhetők hozzá. Hasonló spektroszkópiai adatokat kaptunk a [MnII(4’Me2ind)2] összetételű komplexekre is. A MnII(ind)2 komplexet – MeCN-MeOH elegyből éterdiffuzióval – sikerült egykristály-diffrakciós

mérésen

keresztül

is

jellemezni.

A

komplexről

készült

röntgenszerkezet a 77. ábrán látható. A szerkezet alapján megállapítható, hogy a komplexben a mangánion körül kialakuló koordinációs övezet torzult oktaéderes geometriával írható le. A központi ionhoz két izoindolinát ligandum kapcsolódik homoleptikus komplexet képezve. 33. táblázat A röntgenszerkezetből számított kötésszögek és kötéstávolság értékek

Mn1–N8


Mn1–N3

2,164(3)

N8–Mn1–N3 kötésszög: 178,46(14)º

Mn1–N6

2,288(3)


Mn1–N5

2,295(4)

Mn1–N1

2,296(4)

Kötés

Kötés Mn1–N10



34. táblázat [MnII(ind)2] komplex krisztallográfiai adatai Komplex

[MnII(ind)2]

Összegképlet Szín Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport

C36H24N10Mn vörös 651,6 g/mol 293 K Mo-Ka, λ = 0,71073 Å monoklin P 21/c 90

Eredmények és értékelésük 34. táblázat [MnII(ind)2] komplex krisztallográfiai adatai Komplex Elemi cella méretei a [Å] b [Å] c [Å] α (°) β (°) γ (°)

[MnII(ind)2]


2996,64 (7) 4

16,3324(2) 12,0581(2) 17,5129(2) 90,00 119,67 (4) 90,00


1,444

-1

Abszorpciós koeff,, μ [mm ] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Max, és min, transzmisszió Θ-tartomány [°] Index tartományok

0,487 1340 0,3 × 0,2 × 0,2 nincs 2,15 ≤ ° ≤ 26,19 0 ≤ h ≤ 20 -13 ≤ k ≤ 0 -21 ≤ l ≤ 18 12877 4676

Gyűjtött reflexiók Független refl, száma

A [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 összetételű komplexet az (59) egyenlet alapján állítottuk elő. A termék összetételének és szerkezetének meghatározása elemanalízis és spektroszkópiai (IR, UV-VIS, Mössbauer) valamint röntgendiffrakciós mérések alapján történt. A komplex elemanalízise alapján, a mért értékek megfelelnek a feltételezett szerkezetekre számolt értékekkel.

N FeII(ClO 4) 2 × 6H2 O

+

N MeCN

NH N

Ar

[FeII(indH)(H 2O)2(MeCN)](ClO4)2

(59)

N

A [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex infravörös spektrumában az 1600 cm-1 felett jelentkező két intenzív sáv (1654, 1626) az 1,3-bisz(2’-piridil-imino)-izoindolin 91

Eredmények és értékelésük protonált (semleges) formában történő koordinációját mutatja. A 2’-piridilcsoport koordinációját jelzi az 1012 cm-1-nél észlelt sáv is. A 3332 cm-1-nél jelentkező elnyelés a ligandum NH vegyértékrezgéséhez (νNH) rendelhető. A perklorát-anion jelenlétét az 1082 és 625 cm-1-es rezgések támasztják alá. Hasonló spektrumot kaptunk a korábban már ismertetett [MnII(6’R2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplexek esetében is. Az UV-VIS spektrumon a szabad izoindolinhoz rendelhető három jellemző abszorpciós sáv (366, 385, 408 nm) a komplexképződés következtében nem tolódott el, ami összhangban az IR eredményekkel a ligandum protonált (semleges) formában történő koordinációját bizonyítja. A [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex Mössbauer spektroszkópiai vizsgálatát elvégezve a szerkezetre nézve a következő megállapításokat tehetjük. 1. Az izomereltolódás értéke alapján (δ = 1,096 mm/s) megállapíthatjuk, hogy a központi vasion nagyspinszámú (S = 2) Fe(II)-ion formájában vesz részt a komplexképzésben. 2. A kvadrupól felhasadás értéke (ΔEQ = 3,71 mm/s) alapján a vasion körül oktaéderes geometria kialakulása valószínűsíthető.

78. ábra [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex röntgenszerkezete

92

Eredmények és értékelésük 35. táblázat A röntgenszerkezetből számított kötésszögek és kötéstávolság értékek

Fe1–N1


Fe1–N3

2,211(5)

N1–Fe1–N6 kötésszög: 178,80(4)º

Fe1–N5

2,199(5)

N5–Fe1–N3 kötésszög: 172,44(18)º

Fe1–N6

2,104(6)

Fe1–O9

2,153(4)

Kötés

Kötés Fe1–O10


O9–Fe1–O10 kötésszög: 175,31(19)º

36. táblázat [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex krisztallográfiai adatai Komplex

[FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2

Összegképlet Szín Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport Elemi cella méretei a [Å] b [Å] c [Å] α (°) β (°) γ (°)

C20H20N6FeCl2O10 vörös 631,2 g/mol 293 K Mo-Ka, λ = 0,71073 Å monoklin C 2/c


4996,4 (5) 8


1,678

Abszorpciós koeff,, μ [mm-1] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Max, és min, transzmisszió Θ-tartomány [°] Index tartományok

0,886 2576 0,4 × 0,3 × 0,3 nincs 2,72 ≤ ° ≤ 25,99 0 ≤ h ≤ 35 0 ≤ k ≤ 12 -19 ≤ l ≤ 19 17743 4003 R1 = 0,0846, wR2 = 0,1774

28,523(2) 11,191(5) 15,973(10) 90,00 101,499 (4) 90,00

Gyűjtött reflexiók Független refl, száma Végső R [I > 2 (I)] 93

Eredmények és értékelésük A [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex MeCN-ből éterdiffuzióval sikerült röntgendiffrakciós mérésre alkalmas egykristályt is növesztenünk. A komplexről készült röntgenszerkezet a 78. ábrán látható, a hozzá tartozó adatokat a 35. és 36. táblázat tartalmazza. Összhangban a Mössbauer erdményekkel, a komplex geometriája leginkább torzult oktaéderes szerkezettel írható le, az alapsíkban a vas(II)ion körül a háromfogú indH ligandum és az oldószermolekula (MeCN) nitrogénjei helyezkednek el. Az alapsíkra merőlegesen két vízmolekula koordinációja figyelhető meg. A [FeII(1’Me2bim2ind)2] összetételű, homoleptikus szerkezetű komplexet, mint szuperoxid dizmutáz modellt, a (60) egyenlet szerint állítottuk elő, szerkezetét spektroszkópiai (IR, UV-VIS) és röntgendiffrakciós méréssel (37-38. táblázat) is igazoltuk.

N N

N FeII(ClO 4) 2 × 6H2 O + 2

MeOH, 2NEt3

NH N

Ar

[FeII(1'Me 2bim2ind)2 ]

N N

79. ábra A [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplex röntgenszerkezete 94

(60)

Eredmények és értékelésük A felvett infravörös spektrumon (kálium-bromid-pasztillával) az 1654 cm-1-nél jelentkező gyenge sáv, valamint az N-H vegyértékrezgés hiánya 3200 cm-1 körül az bim2indH deprotonáltságára és a ligandumra [1,3-bisz(2’-benzimidazoil-imino)-izoindolin] jellemző 3480 cm-1-nél jelentkező éles sáv eltűnése is a deprotonált formában történő koordinációra utalnak. Az UV-VIS spektrumon látható - * átmenetek 430, 455 és 485,5 nm-nél szintén a deprotonált ligandum jelenlétét támasztják alá. A [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplexet dmf-ból átkristályosítva egykristályok váltak ki, melyek röntgendiffrakciós mérésre alkalmasnak bizonyultak A komplexről készült röntgenszerkezet a 79. ábrán látható. A szerkezet alapján megállapítható, hogy a komplexben a vas(II)ion körül kialakuló koordinációs övezet leginkább torzult oktaéderes geometriával írható le. A központi ionhoz két benzimidazoil-izoindolinát ligandum koordinálódik homoleptikus komplexet képezve. 37. táblázat A [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplex fontosabb kötésszögei és kötéstávolságai

Fe1–N1_2


Fe1–N1

2,057(17)

N1_2–Fe1–N1 kötésszög: 173,68(6)º

Fe1–N6

2,129(17)

N6–Fe1–N6_2 kötésszög: 169,62(6)º

Fe1–N6_2

2,132(17)

Fe1–N4

2,136(17)

Kötés

Kötés Fe1–N4_2


N4–Fe1–N4_2 kötésszög: 168,40(7)º

38. táblázat [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplex krisztallográfiai adatai Komplex

[FeII(1’Me2bim2ind)2]

Összegképlet Szín Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport Elemi cella méretei a [Å] b [Å] c [Å] α (°)

C48H35 FeN14 zöld 863,75 g/mol 293 K Mo-Ka, λ = 0,71070 Å triklin P1 13,0522 (19) 14,261 (3) 14,691 (2) 63,98 (6) 95

Eredmények és értékelésük 38. táblázat [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplex krisztallográfiai adatai Komplex β (°) γ (°)

[FeII(1’Me2bim2ind)2] 74,43 (6) 70,72 (6)


2994,9 (7) 2


1,250

-1

Abszorpciós koeff,, μ [mm ] F(000) Kristály mérete [mm] Abszorpciós korrekció Max, és min, transzmisszió Θ-tartomány [°] Index tartományok

0,378 894 0,61 × 0,56 × 0,54 nincs 3,05 ≤ ° ≤ 27,10 -16 ≤ h ≤ 16 -18 ≤ k ≤ 18 -18 ≤ l ≤ 18 10065 7964 R1 = 0,0495, wR2 = 0,1377

Gyűjtött reflexiók Független refl, száma Végső R [I > 2 (I)]

3.3.1. Pirokatechin oxidáz modellek: 3,5-di-terc-butil-pirokatechin [Mn(6’R2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2-katalizált oxidációja A pirokatechinek lebontását a természetben az oxidáz és oxigenáz enzimek végzik. A pirokatechin oxidáz a multiréz oxidázok csoportjába tartozó metalloenzim, amely a pirokatechinek kinonná történő oxidációjáért felelős. A mangántartalmú pirokatechin dioxigenáz a pirokatechin gyűrűbontási reakcióját végzi, amely eredményeként alifás karbonsavszármazékokhoz jutunk. Az irodalomban számos réztartalmú modell található, mangántartalmú rendszerekről azonban kevés információ áll rendelkezésünkre. Az oxidáz és oxigenáz enzimekhez kapcsolódó vizsgálataink amellett, hogy közelebb visznek bennünket az enzimek hatásmechanizmusának megértéséhez, preparatív szempontból is felértékelődhetnek pl, a környezetre káros aromás vegyületek lebontása kapcsán. Az enzimológiai és a modellkísérletek alapján valószínűsíthető, hogy a fenti enzimek működését legfőképp a központi fémek koordinációs övezete, minősége és azok egymáshoz képesti távolsága befolyásolja. Modellrendszereinkben a fém (mangán) szerepét, a szubsztrátum és a dioxigén aktiválásának mechanizmusát próbáltuk tisztázni. A funkcionális modellek kidolgozása során szubsztrátumként 3,5-di-terc-butil-

96

Eredmények és értékelésük pirokatechint (dbcatH2), oxidálószerként dioxigént, katalizátorként pedig a 3.3. fejezetben ismertetett [MnII(6’R2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2-összetételű komplexeket használtuk. A komplexek katalitikus aktivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy mindkét komplex katalizálja a 3,5-di-terc-butil-pirokatechin 3,5-di-terc-butil-benzokinonná (dbq) és vízzé történő oxidációját (61).

OH OH

O

O2 [Mn II(6'R2 indH)(H2 O) 2(MeCN)](ClO 4) 2

+ H 2O

(61)

O

indH: R = H; 6'Me 2indH: R = Me

A kiindulási anyagok és a termékek aktuális koncentrációját gázvolumetrikus méréssel (dioxigénfelvétel) és UV-VIS spektroszkópiával (dbq: 400 nm) határoztuk meg. A reakcióban H2O2 jelenlétét (jodometria) nem sikerült kimutatnunk. A fentiek figyelembevételével a reakciók sztöchiometriáját is sikerült meghatároznunk. A 80. ábra a dbcatH2 aktuális koncentrációjának változását mutatja a két katalizátor jelenlétében. Mivel lényeges különbség a két komplex aktivitásában nem figyelhető meg, ezért a részletes vizsgálatokat csak a [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2] komplex esetében végeztük el.

80. ábra A 3,5-di-terc-butil-pirokatechin mangán-katalizált oxidációja -4  [Mn(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 = 1,67 × 10 M; -4  [Mn(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 = 1,67 × 10 M; dmf; T = 40 ºC A 81. ábrán a reakció során felhasznált dioxigén mennyiségét ábrázoltuk az idő függvényében, amely alapján megállapítható, hogy a reakcióban a kinon (3,5-di-terc-butil97

Eredmények és értékelésük benzokinon) mellett víz keletkezik, mivel a felvett dioxigén koncentrációja fele a pirokatechin koncentrációjának. A reakciót 3,4,5,6-tetra-kloro-pirokatechin szubsztrátum hozzáadásával is elvégeztük, melynek során részleges inhibíciót tapasztaltunk (81. ábra). A 3,4,5,6-tetra-kloropirokatechint mintegy 40 %-os konverzió értéknél adagoltuk a reakcióelegyhez. Az észlelt jelenség arra utal, hogy a komplex és a szubsztrátum között egyensúly áll fenn, tehát a szubsztrátum oxidációja a fémhez kötött formában játszódik le.

81. ábra A 3,5-di-terc-butil-pirokatechin katalitikus oxidációja  [dbcatH2]0 = 0,1 M; [[MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2]0 = 1,33 × 10-3 M; II -3  [dbcatH2]0 = 0,1 M; [[Mn (6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2]0 = 1,33 × 10 M; [Cl4catH2]t=40 = 0,1 M; dmf; T = 40 ºC

82. ábra A reakciósebesség változása a szubsztrátum kiindulási koncentrációjának függvényében II [[Mn (6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2]0 = 1,67 × 10-4 M; [O2]0 = 1,13 × 10-3 M; dmf; T = 40 ºC

98

Eredmények és értékelésük A reakció mechanizmusának kiderítése céljából részletes reakciókinetikai méréseket végeztünk. Az egyes reaktánsok részrendjének meghatározása céljából a méréseket különböző szubsztrátum- (39. táblázat, 1-6. mérés), komplex- (39. táblázat, 4, 7-11. mérés) és dioxigénkoncentrációk (39. táblázat, 4, 12-13. mérés) mellett végeztük el. A

szubsztrátum

részrendjének

meghatározása

során

Michaelis-Menten-típusú

összefüggéshez jutottunk (82. ábra), amely alapján szintén valószínűsíthető a pirokatechin koordinációja, amely a [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 és a szubsztrátum közötti előegyensúlyi lépéssel írható le (62). A reakciósebességi értékek reciprokát ábrázolva a szubsztrátumkoncentráció reciprokának függvényében az ún, Lineweaver-Burk egyeneshez jutottunk (R = 99,40 %), amelyből KM értéke 30 mmol-nak adódott (83. ábra).

83. ábra Lineweaver-Burk egyenes

84. ábra A reakciósebesség változása a komplexkoncentráció függvényében [dbcatH2]0 = 1,25 × 10-2 M; [O2]0 = 1,13 × 10-3 M; dmf; T = 40 °C 99

Eredmények és értékelésük A [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex részrendjének meghatározása érdekében,

vizsgáltuk

a

reakciósebességi

értékek

alakulását

a

kiindulási

komplexkoncentrációk függvényében (azonos szubsztrátum- és dioxigén-koncentráció mellett). A 84. ábrán látható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,14 %), ami a komplexre nézve elsőrendű kinetikára utal. A reakciókat különböző O2-koncentrációk mellett elvégezve és a kezdeti sebesség értékeket meghatározva a dioxigénre nézve is egyes részrendhez jutottunk (85. ábra; R = 99,17 %). A különböző koncentrációk beállításához O2/Ar gázelegyeket alkalmaztunk.

85. ábra A reakciósebesség változása a dioxigénkoncentráció függvényében [dbcatH2]0 = 1,25 × 10-2; [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 = 1,67 × 10-4 M; dmf; T = 40 °C

86. ábra A reakciósebesség változása a pirokatechinszármazékok redoxpotenciáljának függvényében [RcatH2]0 = 1,25 × 10-2; [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 = 1,67 × 10-4 M; dmf; T = 55 °C

100

Eredmények és értékelésük A vizsgálatainkat a 3,5-di-terc-butil-pirokatechin mellett további pirokatechinszármazékokra is kiterjesztettük. A reakciósebességi állandókat meghatározva azt találtuk, hogy elektronküldő csoportok a pirokatechin-gyűrűn nővelik az oxidáció sebességét (86. ábra). Hasonló eredményhez jutottak vastartalmú rendszerek vizsgálata során is [190]. A reakciókinetikai mérések alapján a mechanizmus a (62-67) egyenletekkel írható le. [MnII(6'Me2 indH)]2+ + 3,5-dbcatH2

K1

[MnII(6'Me2 indH)(3,5-dbcatH)]+ + H+

(62)

[MnIII(6'Me2 indH)(3,5-dbcatH)(O2)]+

(63)

[MnIII(6'Me2ind)(O2 H)]+ + 3,5-dbsq + H+

(64)

[Mn III(6'Me 2ind)(O2 H)]+ + 3,5-dbsq + H+

[MnIV(6'Me2 ind)(O)]+ + 3,5-dbq + H2 O

(65)

[MnIV(6'Me2 ind)(O)]+ + 3,5-dbcatH 2

[Mn II(6'Me2 ind)]+ + 3,5-dbq + H 2 O

(66)

[Mn II(6'Me2 indH)]2+

(67)

[MnII(6'Me2 indH)(3,5-dbcatH)]+ + O2 [Mn III(6'Me 2indH)(3,5-dbcatH)(O2 )]+

K2 k3 (lassú)

[MnII(6'Me2 ind)]+ + H +

Feltételezésünk szerint a reakció két előegyensúlyi lépéssel kezdődik, melyekkel a pirokatechin és a dioxigén koordinációja (értelmezhető) írható le (62-63). Ezen lépések eredményeként egy dioxigén addukthoz jutunk, majd a következő sebességmeghatározó lépésben az így képződött vegyület, (hidroperoxo)mangán(III)komplexre, illetve szemikinongyökanionra bomlik (64). A kialakult reaktív szerkezet pirokatechin jelenlétében további gyors lépésekben a termék kinonná és vízzé alakul át (65-67).

87. ábra A reakcióelegy UV-VIS spektruma A 3,5-di-terc-butil-pirokatechin oxidációja során a reakcióelegy UV-VIS spektrumán . a 730 nm-en jelentkező elnyelés a szemikinon-gyökanionhoz (dbsq -) [191], míg az 550 nm

101

Eredmények és értékelésük körüli abszorpció a pirokatechin és a keletkező benzokinon között kialakuló töltésátviteli komplexhez rendelhető [192] (87. ábra). A kimutatott gyökös intermedier összhangban van a javasolt mechanizmussal. A fenti gyök jelenlétét ESR mérések segítségével is sikerült kimutatnunk (88. ábra).

88. ábra A reakcióelegy ESR spektruma

39. táblázat A pirokatechin [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2-katalizált oxidációjának reakciókinetikai adatai Mérés

T

[Mn]0

[dbcatH2]0

[O2]0

-d[dbcatH2]/dt

száma

(°C)

-4

(10 M)

-3

(10 M)

-3

(10 M)

(10-7 Ms-1)

1

40

1,67

1,67

1,13

2,57±0,129

2

40

1,67

4,17

1,13

6,84±0,29

3

40

1,67

8,33

1,13

10,9±0,50

4

40

1,67

12,5

1,13

14,5±0,59

5

40

1,67

16,7

1,13

17,0±0,82

6

40

1,67

25,0

1,13

18,6±0,76

7

40

0,12

12,5

1,13

1,97±0,10

8

40

0,25

12,5

1,13

3,60±0,16

9

40

0,50

12,5

1,13

6,66±0,33

10

40

0,75

12,5

1,13

8,09±0,35

11

40

1,00

12,5

1,13

10,9±0,57

12

40

1,67

12,5

2,69

35,0±1,50

13

40

1,67

12,5

5,37

60,7±2,48

102

Eredmények és értékelésük Az eredményeinket összehasonlítottuk néhány, az irodalomból ismert enzim, valamint enzimmodell katalitikus aktivitásával (40. táblázat). Ebből látható, hogy a legnagyobb pirokatechin oxidáz aktivitás kétmagvú (Cu(II,II) és Mn(III,III)) komplexek esetében érhető el. 40. táblázat Néhány pirokatechin oxidáz enzim és enzimmodell katalitikus aktivitása kkat (s-1)

KM (mM)

kkat/KM (M-1s-1)

2,29

2,50

916

0,024

1,49

16,11

0,25

6,40

39,06

[CuII2(hbhpmipo)( -OAc)]2+ [195]

0,0045

-

-

[CuII2(H2bbppnol)( -OAc)(H2O)2]2+ [107]

0,0079

0,79

10

[CuII2(bisp)(NCCH3)2]4+ [196]

0,017

0,071

239,43

[CuI(4Me2ind)I2] [197]

0,018

0,26

69,23

[CuII2(4Me2ind)2( -OH) (MeOH)]ClO4 [198]

0,0063

8,44

0,75

[MnIII2( -O)(tpa)2](BPh4)2 [199]

0,093

0,50

186

38

489

77,71

0,014

12,70

1,07

Enzim/enzimmodell Ipomoea Batatas katekol oxidáz [193] [CuII2(bpmp)( -OH)]2+ [109] II

+

[Cu (bpmp)(OAc)2] [194]

[MnII(indH)Cl2] [200] [MnII(6’Me2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 Megállapítottuk,

hogy

az

általunk

előállított

és

jellemzett

[MnII(6’R2indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2-összetételű komplexek oxidáz aktivitást mutatnak a 3,5-di-terc-butil-pirokatechin 3,5-di-terc-butil-benzokinonná (dbq) történő oxidációja során. A vizsgált reakciók szelektívek és más helyettesített pirokatechinekre is kiterjeszthetők. A detektált intermedierek és a részletes reakciókinetikai mérések alapján javaslatot tettünk a rendszer lehetséges mechanizmusára. 3.3.2. Kataláz és szuperoxid dizmutáz modellek Az anyagcsere során az élő szervezetben reaktív oxigén származékok (ROS) képződnek, ezek a következők: hidroxil (OH•), szuperoxid (O2•-), nitrogén-monoxid (NO•) és peroxil (RO2•) gyökök. A peroxinitrit (ONOO-), a hipoklórossav (HOCl), a hidrogén-peroxid

103

Eredmények és értékelésük (H2O2), valamint a szingulett oxigén (1O2) és az ózon (O3) nem szabad gyökök, de könnyen szabad gyökös reakcióhoz vezetnek a szervezetben [29]. A kis molekulatömegű katalizátorok, melyek utánozzák a természetes enzimek funkcióját, használhatók számos betegség megelőzésére és gyógyítására, ahol az eredeti enzimek nem működnek. A szintetikus enzimek sok olyan betegség esetében használhatók, ahol a nem kívánt, toxikus, metabolikus melléktermékek túltermelése szerepet játszik a betegség kialakulásában és folytatásában. A SOD és kataláz utánzó vegyületeknek több előnyük is van a természetes enzimekkel szemben, például a sejtek közötti tér megközelítésének képessége, nagyobb áthatolóképesség a membránokon, hosszabb élettartam a vérben (az emberi enzimek rövid ideig stabilak) [129]. A mangán(II)tartalmú komplexek előállítása ezenfelül új katalizátorrendszerek kidolgozását is lehetővé teszi, amelyek alkalmazásra találhatnak olyan, gyakorlati szempontból is fontos területeken, mint a textilfehérítés ill, a cellulózipar. Ismeretes, hogy e két ágazatban jelenleg a hidrogén-peroxid ill, más peroxigénvegyületek fémkomplex katalizátorok jelenlétében történő aktiválása az uralkodó módszer (bleach catalysis). Modellvegyületeink tervezése során a fenti szempontoknak való megfelelés vezérelt bennünket. 3.3.2.1. A [MnII(ind)2] és a [MnII(4’Me2ind)2] komplexek kataláz-aktivitásának vizsgálata A [MnII(ind)2] és [MnII(4’Me2ind)2] komplexek kataláz-aktivitásának vizsgálata azt mutatta, hogy mindkét komplex katalizálja a hidrogén-peroxid bomlását. A reakciókat N,Ndimetil-formamidban, 20 ˚C-on végeztük. A reakciókinetikai méréseket gázvolumetriás módszerrel, a keletkező dioxigén térfogatának mérésén keresztül végeztük. A 89. ábrán látható, hogy a reakció egy indukciós periódussal kezdődik, majd ezt követően telítésbe megy át. A reakció lejátszódása után további hidrogén-peroxidot adva a reakcióelegyhez, további dioxigénképződés figyelhető meg, ami arra utal, hogy a katalizátor több cikluson keresztül sem veszíti el katalitikus aktivitását. A reakciókinetikai vizsgálatokat dmf oldószerben, 20 ˚C végeztük. A hidrogénperoxid bomlásának eredményeként keletkező dioxigén koncentráció változásának sebességét mértük a komplexek (41. táblázat, 1-4. mérés) és a szubsztrátum (41. táblázat, 5-12. mérés) koncentrációjának függvényében. A szubsztrátum (hidrogén-peroxid) mennyiségét állandó értéken tartva a [MnII(ind)2] komplexre nézve elsőrendű kinetikát kaptunk (90. ábra; R = 99,54 %). A MnII(4’Me2ind)2 komplexre nézve szintén elsőrendű kinetikához jutottunk. 104


89. ábra A hidrogén-peroxid [MnII(ind)2]-katalizált bomlása [Mn(ind)2] = 1,54 ×10-3 M; [H2O2]0 = 0,195 M; [H2O2]t=35 = 0,195 M; dmf; T = 20 °C

90. ábra A reakciósebesség változása a kiindulási [MnII(ind)2] koncentráció függvényében [H2O2]0 = 0,195 M; dmf; T = 20 °C

91. ábra A katalitikus bontás során mért reakciósebesség értékek a H2O2 koncentrációjának függvényében -3  [Mn(ind)2]0 = 1,02 ×10 M;  [Mn(4’Me2ind)2]0 = 1,02 × 10-3 M; dmf; T = 20 °C 105


komplexek

koncentrációját

állandó

értéken

tartva,

a

hidrogén-peroxid

koncentrációját változtatva telítési görbékhez jutottunk, (91. ábra) ami Michaelis-Mententípusú kinetikára utal. Az eredményekből meghatároztuk a katalízis sebességét kkat, a Michaelis-állandót KM és a katalízis jóságát (hatékonyságát) (kkat/KM) (42. táblázat). A reakciókinetikai mérések alapján a reakció mechanizmusa a (68-71) egyenletekkel írható fel. Az irodalomban hasonló mechanizmust feltételeznek [Mn II(salen)]-tartalmú rendszer esetében is [205]. Feltételezésünk szerint a reakció első lépésében alakul ki a tulajdonképpeni katalizátor (68). A kialakuló Mn(III)-komplex hidrogén-peroxiddal reagálva egy mangán(III)-hidrogénperoxid adduktott eredményez (69), melynek heterolitikus bomlása a sebességmeghatározó lépés (70). A keletkező Mn(V)-oxo komplex hidrogén peroxid jelenlétében Mn(III)komplexre, vízre és oxigénre bomlik (71).

Mn(II)

+

H2 O2

Mn(III)

+

H2 O2

Mn(III) K1

OH

+

Mn(III) O O

+ OH

H

(68) (69)

H Mn(III) O O Mn(V)

O +

H

k2

H

lassú k3 gyors

H2 O2

Mn(V)

O +

Mn(III)

+

(70)

H2 O

H2 O +

O2

(71)

Az eredményeinket összehasonlítottuk néhány, az irodalomból ismert Mn-tartalmú enzim, valamint Mn-tartalmú enzimmodell katalitikus aktivitásával (41. táblázat). Ebből látható, hogy a mangántartalmú enzimmodellek aktivitása több nagyságrenddel kisebb, mint a mangántartalmú enzimek aktivitása. 41. táblázat A hidrogén-peroxid [MnII(ind)2]-katalizált bomlásának reakciókinetikai adatai Mérés

T

[Mn]0

[H2O2]0

d[O2]/dt

száma

(°C)

(10-3 M)

(10-1 M)

(10-5 Ms-1)

1

20

0,53

1,95

3,34±0,15

2

20

0,78

1,95

4,97±0,24

3

20

1,03

1,95

6,22±0,29

4

20

1,55

1,95

8,50±0,36

5

20

1,02

0,33

1,99±0,09

106

Eredmények és értékelésük 41. táblázat A hidrogén-peroxid [MnII(ind)2]-katalizált bomlásának reakciókinetikai adatai Mérés

T

[Mn]0

[H2O2]0

d[O2]/dt

száma

(°C)

(10-3 M)

(10-1 M)

(10-5 Ms-1)

6

20

1,02

0,49

3,52±0,18

7

20

1,02

0,66

4,39±0,20

8

20

1,02

0,82

4,71±0,23

9

20

1,02

0,99

5,04±0,24

10

20

1,02

1,40

6,24±0,31

11

20

1,02

3,20

6,16±0,026

12

20

1,02

4,40

6,21±0,29

42. táblázat Néhány kataláz enzim és enzimmodell katalitikus aktivitása Enzim/enzimmodell T. thermophilus kataláz [202]

kkat (s-1)

KM (mM)

kkat/KM (M-1s-1)

2,6 ×105

83

3,1 ×106

L. plantarum kataláz [203]

2,0 ×105

350

0,6 ×106

T. album kataláz [151]

2,6 ×104

15

1,7 ×106

[Mn(bpia)( -OAc)]2(ClO4)2 [170]

2,4 × 10-1

0,045

5,2

[Mn (salpn)O]2 [164]

2,5 ×102

250

1 ×103

[MnII2(2-OHsalpn)2] [204, 205]

4,2-21,9

10,2-118

160-990

[Mn2(tacn)( -O )2( -OAc)(OAc)2] [206]

5,5

-

-

[MnII2(L1)( -OAc)(H2O)]2+ [207-210]

2,1

0,3

700

6,60 ×10-1

36

18

6,18

43,1

143

6,00 ×10-2

19

3,2

2,60 ×10-1

82

3,2

II

[MnII2(salpentO)( -OAc)-( -OMe)(MeOH)2] [211] [MnII2( -OH)(Mebimap)(OAc)3] [212] [MnII(ind)2] II

[Mn (4’Me2ind)2]

Összefoglalásként megállapíthatjuk, hogy a [MnII(4’R2ind)2]-összetételű komplexek katalizálják a H2O2 vízzé, illetve dioxigénné való bomlását, tehát reakcióik funkcionális kataláz modellnek tekinthetők. A kinetikai vizsgálatok ismeretében kijelenthetjük, hogy a szubsztituensek helyes megválasztása nagymértékben befolyásolja a reakció sebességét.

107

Eredmények és értékelésük 3.3.2.2. A [MnII(ind)2] és a [MnII(4’Me2ind)2] és [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplexek szuperoxid dizmutáz aktivitásának vizsgálata

A szuperoxid dizmutáz enzim és modelljei aktivitásának mérése közvetlen és közvetett módszerekkel is történhet. A közvetlen mérés azonban csak költséges és nagy időfelbontású technikákkal valósítható meg, mint a lézer villanófény fotolízis, a stopped-flow és az impulzus radiolízis. Helyettük közvetett módszereket alkalmaznak, ahol a relatív sebességi állandót határozzák meg egy referencia reagenssel szemben (McCord-Fridovich módszer) [213, 214]. A szuperoxid gyök-anion forrásaként egy enzimatikus reakciót választottunk, melynek során xantin oxidáz jelenlétében xantin uronsavvá alakul (92. ábra), a reakció eredményeképpen pedig felszabadul a szuperoxid gyök-anion. A NBT egy sárga színű tetrazolium-só, melyet a szuperoxid gyök-anion kékeslila színű mono-, illetve diformazánná redukál. A reakció megfelelő mennyiségű xantin oxidáz hozzáadására indul. A reakció tehát UV-VIS spektrofotométerrel nyomon követhető.

92. ábra A xantin/xantin oxidáz rendszer működése NBT és citokróm c(III) reagens jelenlétében A 43. táblázat tartalmazza a [MnII(ind)2], [MnII(4’Me2ind)2] és [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplexek mért IC50 értékeit és az ezekhez tartozó kSOD sebességi állandókat.

108

Eredmények és értékelésük 43. táblázat [MnII(4’R 2ind)2] és [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplexek IC50 és kSOD értékei Komplex

T (°C) IC50 (10-6 M) kSOD (106 M-1 s-1)

[MnII(ind)2]

25

3,54 ± 0,14

2,87 ± 0,11

[MnII(4’Me2ind)2]

25

9,44 ± 1,11

1,08 ± 0,13

[FeII(1’Me2bim2ind)2

25

3,30 ± 0,11

3,06 ± 0,15

A reakciókat elvégeztük úgy is, hogy referenciaként NBT reagens helyett citokróm c(III) reagenst alkalmaztunk. A xantin uronsavvá való átalakulása során felszabaduló szuperoxid gyök-anion redukálja a vas(III)tartalmú citokróm c vegyületet vas(II)tartalmú citokróm c vegyületté (90. ábra). A reakcióban keletkező redukált forma fényelnyelését követjük UV-VIS spektrofotométerrel 550 nm-en. Az 44. táblázat tartalmazza a [MnII(ind)2], [MnII(4’Me2ind)2] és [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplexek mért IC50 értékeit és az ezekhez tartozó kSOD sebességi állandókat. 44. táblázat [MnII(4’R 2ind)2] és [FeII(1’Me2bim2ind)2] komplexek IC50 és kSOD értékei Komplex

T (°C) IC50 (10-6 M) kSOD (106 M-1 s-1)

[MnII(ind)2]

25

3,79 ± 0,15

2,66 ± 0,10

[MnII(4’Me2ind)2]

25

10,3 ± 1,21

0,98 ± 0,12


25

3,3 ± 0,11

3,28 ± 0,15

Az eredményeinket összehasonlítottuk néhány az irodalomból ismert szuperoxid dizmutáz enzim, valamint enzimmodell katalitikus aktivitásával (45. táblázat). Látható, hogy az általunk előállított modellvegyületek szuperoxid dizmutáz aktivitása nagyságrendileg megegyezik a korábban vizsgált rendszerekével. Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy a fenti komplexek a szuperoxid dizmutáz enzim funkcionális

modelljeinek tekinthetők. A

komplexek jellemzését

követően, indirekt

módszerekkel mértük azok SOD utánzó aktivitását NBT és citokróm c(III) indikátorok jelenlétében. A mérések során igazoltuk, hogy mindegyik komplex mutat aktivitást, továbbá kizártuk egyes lehetséges mellékreakciók fellépését az alkalmazott indikátor és a modellkomplexek között, illetve a xantin oxidáz enzim és a modellvegyületek között.

109

Eredmények és értékelésük 45. táblázat Néhány szuperoxid dizmutáz enzim és enzimmodell katalitikus aktivitása kSOD (M-1s-1)

IC50 (M)

2,0 × 108

-

Cu/Zn-SOD [129]

2,2 × 109

-

Mn-SOD [216]

8,0 × 108

-

[Mn (pa)2(pah)(H2O)] [217,218]

4,6 × 105

IC50 50 µM NBT = 6,5 × 10-6

[MnII(tpaa)]2+ [219]

1,3 × 106

IC50 22 µM cyt c = 4,3 × 10-6

[MnII(ntb)(salicylate)]+ [220]

3,9 × 106

IC50 46µ MNBT = 0,7 × 10-6

[MnII(ntb)(terephtalate)] [221]

4,3 × 106

IC50 46 µM NBT = 0,6 × 10-6

[FeII(big)]2+ [222]

4,1 × 104

IC50 10 µM cyt c = 1,3 × 10-6

[FeII(tpen)]2+ [222]

1,4 × 107

IC50 10 µM cyt c = 0,5 × 10-6

[FeII((4MeO)4tpen)]2+ [222]

7,0 × 107

IC50 10 µM cyt c = 0,1 × 10-6

[MnII(ind)2]

2,9 × 106

IC50 170 µM NBT = 3,5 × 10-6

[MnII(4’Me2ind)2]

1,1 × 106

IC50 170 µM NBT = 9.4 × 10-6


3,1 × 106

IC50 170 µM NBT = 3,3 × 10-6

Enzim/enzimmodell Fe-SOD [215]

II

3.4. [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex katalitikus aktivitásának vizsgálata alkoholok oxidációs reakcióiban Az alkoholok oxidációja az egyik legfontosabb szerves kémiai reakció, ennek megfelelően számos átmenetifém-tartalmú komplexet állítottak elő és vizsgálták katalitikus aktivitásukat alkoholok oxidációs reakcióiban [223-233]. Oxidálószerként a hidrogén-peroxid bizonyult a leghatékonyabbnak [234]. Az alkoholok aldehidekké történő oxidációja kulcsfontosságú szerepet játszik különböző illatanyagok és élelmiszer adalékok szintézise szempontjából [235, 236]. Az elmúlt években igen intenzíven kutatott területté vált a nem-hem típusú vas(II)iont tartalmazó komplexek vizsgálata, amelyek hatékonynak bizonyultak különböző alkánok, alkének és alkoholok katalitikus oxidációjában. Az oxidációs reakciók során, különböző spektroszkópiai módszerek segítségével (UV-VIS, EXAFS, Mössbauer, rezonancia Raman) vas-oxo és -peroxo intermedierek kialakulását bizonyították [237-240]. Az oxidációs reakciók kidolgozása során, vizsgáltuk különböző alkoholok (benzil110

Eredmények és értékelésük alkohol és szubsztituált származékai) oxidációs reakcióit, oxidálószerként hidrogén-peroxidot, katalizátorként pedig [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplexet használtunk. A komplex aktivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy katalizálja az alkoholok oxidációját (72), az oxidációs reakciókat acetonitril oldószerben, 1:100:250 komplex, szubsztrátum, hidrogénperoxid arány mellett, 25 ºC hőmérsékleten végeztük (hozam = 34%). OH

O

H2 O2

R

R

[FeII(indH)(H 2O)2 (MeCN)](ClO4) 2

(72) H

R = H-, Me-, MeO-, Cl-, NO 2

46. táblázat Relatív sebességi állandó értékek alkoholok oxidációs reakcióiban R

σ [174]

krel

H-

0

1

MeO-

-0,27

2,08

Me-

0,00

1,50

Cl-

0,23

0,68

NO2-

0,81

0,076

krel = [RPhCHO]/[PhCHO] / [RPhCH2OH]/[PhCH2OH]

93. ábra Alkoholok oxidációs reakciójának Hammett-diagramja [[FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2]0 = 2,0 × 10-5 M; [H2O2] = 5,0 × 10-3 M; [alkohol] = 2,0 × 10-3 M; MeCN; T = 25 °C

111


Kompetitív

(egymással

versengő)

reakciókban

vizsgáltuk,

hogy

különböző

szubsztituensek, hogyan befolyásolják az oxidációs reakciók sebességét. A log krel-t ábrázolva a szubsztituens állandók (σ) függvényében egyenest kaptunk (93. ábra), melynek meredekségéből a (37) Hammett-egyenlet reakcióállandójának értéke -1,3-nak adódott, ami alapján feltehetően polarizált, ionos átmeneti állapotokon keresztül játszódik le a reakció, amelyek kialakulása egy fém és szubsztrátum közötti töltésátvitellel értelmezhető. Az oxidációs reakciók során kapott relatív sebességi állandó értékeket a 46. táblázatban foglaltuk össze. Az

oxidációs

reakciók

során,

a

[FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2

komplex

acetonitriles oldatához hidrogén-peroxidot adva, az oldat élénkzöld színűvé változott. UVVIS spektroszkópia segítségével próbáltunk információt nyerni, a folyamat során kialakuló reaktív köztitermékről. Szobahőmérsékleten (20 °C) a képződő részecske (94.ábra, λ = 697 nm; ε ≈ 800) mintegy 45 másodperc alatt bomlik el, alacsonyabb hőmérsékleten vizsgálva a reakciót azt tapasztaltuk, hogy lényegesen növelhető a részecske élettartama (-25 °C-on ~3600s). Ezt követőn ESR és rezonancia Raman vizsgálatokat végeztünk a képződő intermedier jellemzésére. Az intermedier ESR inaktívnak bizonyult, a reakció során képződő részecske Raman spektruma a 95. ábrán látható. A gerjesztési rezonancia Raman profilokat a 96. ábra szemlélteti.

t (sec)

94. ábra A [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2komplex és hidrogén-peroxid reakciója során kialakuló részecske bomlása II [[Fe (indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2]0 = 2,8 × 10-3 M; [H2O2]0 = 2,8 × 10-2 M; MeCN; T = 20 °C

112


95. ábra A [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2komplex és hidrogén-peroxid reakciója során kialakuló intermedier rezonancia Raman spektruma II [[Fe (indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2]0 = 2,8 × 10-3 M; [H2O2]0 = 2,8 × 10-2 M; MeCN; T = 20 °C

96. ábra Gerjesztési rezonancia Raman profilok [[Fe (indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2]0 = 2,8 × 10-3 M; [H2O2]0 = 2,8 × 10-2 M; MeCN; T = 20 °C II

A fenti módszerek alkalmazásával hasznos információkhoz jutottunk a képződő intermedier szerkezetéről. A Raman spektrumon látható (93. ábra) rezgések, a νs(Fe-O-O-Fe) 113

Eredmények és értékelésük (458 és 445 cm-1) és ν(O-O) (884 és 837 cm-1) vegyértékrezgésekhez rendelhetők (47. táblázat) [241]. A különböző oxigénizotópok közötti energiaeltolódás a Hook-törvény alapján értelmezhető. Az elvégzett spektroszkópiai vizsgálatok értelmében, az általunk vizsgált rendszerben

egy

kétmagvú

(µ-oxo)(µ-1,2-peroxo)-divas(III)-komplex

feltételezhető (97. ábra, [ox 4]), az ESR inaktivitás a két

kialakulása

vas(III)ion között fellépő

antiferromágneses csatolásnak tulajdonítható. 47. táblázat (µ-Oxo)(µ-1,2-peroxo)-divas(III)-komplexek UV-VIS és rezonancia Raman adatai UV-VIS

Komplex

ν(O-O) 18

νs(Fe-O-O-Fe)

(MeCN)

[Δ O2]

[Δ18O2]

FeIII2(µ-Oxo)(µ-1,2-peroxo)(6Me-bqpa)2 [241]

λmax = 650 nm

853 [-45]

463 [-15]

FeIII2(µ-Oxo)(µ-1,2-peroxo)(bqpa)2

λmax = 620 nm

844 [-44]

464 [-16]

λmax = 640 nm

847 [-44]

463 [-21]

λmax = 697 nm

884 [-47]

458 [-13]

[242] FeIII2(µ-Oxo)(µ-1,2-peroxo)(6Me3-tpa)2 [242] FeIII2(µ-Oxo)(µ-1,2-peroxo)(ind)2

A kinetikai és spektroszkópiai vizsgálatok alapján nem kizárható, hogy az alkoholok oxidációjáért a képződő (µ-oxo)(µ-1,2-peroxo)-divas(III)-, illetve a belőle származtatható FeIII-FeIV=O-komplex a felelős (97. ábra, [ox 6]). Hasonló intermedier kialakulását javasolták a ribonukleotid reduktáz enzim esetében is [243, 244]. O

O O FeII

H 2 O2

FeIII

OOH [ox 1]

FeIII

Fe III

V O Fe O [ox 2] [ox 3]

FeIV

Fe III

O

O

[ox 4]

[ox 5]

FeIV

O FeIV

Fe III O [ox 6]

97. ábra (µ-Oxo)(µ-1,2-peroxo)-divas(III)-komplex kialakulása és bomlási folyamata 114

Eredmények és értékelésük Az alkoholok oxidációja feltételezésünk szerint a 98. ábrán szemléltetett általános reakciómechanizmus szerint játszódik le. A kinetikai vizsgálataink során mért kinetikus izotópeffektus érték alapján (KIE = 1,8), feltehetően protoncsatolt elektron transzfer folyamaton keresztül játszódik le a reakció. Első lépésként (A) egy fém és szubsztrátum között történő elektronátmenet történik (ET), melynek eredményeként szubsztrát gyök-kation alakul ki. Ezt követően (B) proton transzferen keresztül (PT) szubsztrát gyök keletkezik, melynek kialakulása a sebességmeghatározó lépés. Irodalmi adatok alapján, az aldehid képződése nem geminális diolon keresztül valósul meg (D), O18-as vizsgálatok segítségével kimutatták, hogy hidrogén absztrakció történik (C) [245].

[ox]n+

R HAT + H C H KIE ~ 50 OH A

ET

[ox-H](n-1)+

R H C H + OH KIE < 5

[ox] (n-1)+

+

R C H OH

-[ox](n-1)+ -H 2 O C -[ox](n-1)+

B

D

O R C H

R HO C H

-H2 O

O R C H

OH

PT

98. ábra Alkoholok oxidációs reakcióinak javasolt mechanizmusa Megállapítottuk,

hogy

az

általunk

[FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2-összetételű

komplex

előállított katalizálja

és a

jellemzett benzil-alkohol

oxidációját. A vizsgált reakciók szelektívek és más helyettesített benzil-alkohol származékra is kiterjeszthetők. A detektált intermedierek és a reakciókinetikai mérések alapján javaslatot tettünk a rendszer lehetséges mechanizmusára.

115

Összefoglalás

4. ÖSSZEFOGLALÁS A doktori kutatómunka céljául különböző, az oxidoreduktázok családjába tartozó metalloenzim

hatásmechanizmusának

vizsgálatát

tűztük

ki,

egyszerűen

előállítható

modellvegyületek vizsgálatán keresztül. Az értekezésben bemutatott munka alapkutatás jellegű, így az eredmények elsősorban a tudományos ismereteink bővítését szolgálják. A flavonol 2,4-dioxigenáz enzim funkcionális modellezése céljából flavonolátomangán(II) és -vas(III) komplexeket állítottunk elő. Az előállított vegyületek összetételét elemanalízissel, szerkezetét pedig spektroszkópiai módszerekkel (UV-VIS, IR, Mössbauer) valamint röntgendiffrakcióval azonosítottuk. Vizsgáltuk az előállított modellvegyületek dioxigénnel való reakcióját, megállapítottuk, hogy a reakciók során az enzimatikus útnak megfelelő termékek keletkeznek, tehát ezen vegyületek funkcionális flavonol 2,4-dioxigenáz modellnek tekinthetőek. Vizsgáltuk a dioxigénezési reakciókat különböző karboxilát koligandumok

jelenlétében

is.

Azt

tapasztaltuk,

hogy a

reakciók

sebessége

(a

[FeIII(fla)(salen)] komplex esetében) mintegy két nagyságrenddel növelhető trifenil-acetát hozzáadásával, ami a flavonol koordinációs módjának megváltozásával értelmezhető. A reakció során keltkező szuperoxid gyök-anion jelenlétét sikerült UV-VIS spektroszkópiai módszer segítségével kimutatnunk. A kapott eredmények összhangban vannak az enzimológiai vizsgálatoknál tapasztaltakkal. Az ACC oxidáz enzim modellreakcióinak vizsgálata esetében, vizsgálatainkat 1amino-ciklopropán-1-karbonsavval (accH), 2-amino-izovajsavval (aibH) és alaninnal (alaH) is elvégeztük. Katalizátorként [FeIII(salen)Cl] komplexet, oxidálószerként pedig hidrogénperoxidot használtunk. Az eredmények alapján megállapítható, hogy mindhárom esetben az enzimatikus útnak megfelelő termékeket kaptuk. [FeII(N4Py)(ClO4)2] komplex esetében FeIV=O intermedier jelenlétét is sikerült kimutatnunk. Pirokatechin oxidáz modellként Mn(II)-tartalmú komplexeket állítottunk elő. Szerkezetüket

spektroszkópiai

(IR,

UV-VIS,

ESR)

mérésekkel

és

egy

esetben

röntgendiffrakcióval igazoltuk. Vizsgáltuk az előállított komplexek pirokatechin oxidáz és/vagy pirokatechin dioxigenáz aktivitását, a pirokatechinek dioxigénnel való reakciójában. Megállapítottuk, hogy az általunk előállított és jellemzett komplexek oxidáz aktivitást mutatnak. ESR spektroszkópia segítségével a folyamat során keletkező szemikinongyökanion jelenlétét is sikerült igazolnunk. Kataláz modellvegyületként két mangán(II)tartalmú komplexet állítottunk elő. Szerkezetüket

spektroszkópiai

(IR,

UV-VIS) 116

mérésekkel,

illetve

egy

esetben

Összefoglalás röntgendiffrakcióval igazoltuk. Megállapítottuk, hogy az előállított komplexek katalizálják a H2O2 vízzé, illetve dioxigénné való dizmutációját, tehát reakcióik funkcionális kataláz modelleknek tekinthetők. Szuperoxid dizmutáz modellként a [MnII(4’R2ind)2] (R = H, CH3) és a [FeII(1’Me2bim2ind)2] összetételű, homoleptikus komplexeket vizsgáltuk, melyek szerkezetét spektroszkópiai (IR, UV-VIS) és röntgendiffrakciós méréssel is igazoltuk. A komplexek jellemzését követően, indirekt módszerekkel mértük azok SOD utánzó aktivitását NBT és citokróm c(III) indikátorok jelenlétében. A mérések során igazoltuk, hogy mindegyik komplex mutat aktivitást, továbbá kizártuk egyes lehetséges mellékreakciók fellépését az alkalmazott indikátor és a modellkomplexek között, illetve a xantin oxidáz enzim és modellkomplexek között. Vizsgáltuk egy nem-hem típusú vas(II)iont tartalmazó komplex katalitikus aktivitását alkoholok oxidációs reakcióiban. Azt tapasztaltuk, hogy a [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2 komplex aktív katalizátornak bizonyult, továbbá rezonancia Raman spektroszkópia segítségével sikerült információt nyernünk a folyamat során kialakuló reaktív intermedierről. Az elvégzett részletes reakciókinetikai mérések alapján, minden enzimmodell rendszer esetében (kivéve szuperoxid dizmutáz) javaslatot tettünk az oxigénezési és oxidációs reakciók lehetséges mechanizmusára vonatkozólag.

117

Kísérleti rész

5. KÍSÉRLETI RÉSZ Kísérleteinket levegő és nedvesség gondos kizárásával, inert technika alkalmazásával végeztük.

Az

alkalmazott

Ar

gázt

szárítottuk

(P2O5,

blaugél),

szén-dioxid-

és

oxigénmentesítettük KOH illetve DEOXO katalizátorral töltött oszlopokkal. A használt oldószereket standard módszerekkel tisztítottuk, szárítottuk és argon alatt tároltuk. A műszeres vizsgálatok az alábbi készülékeken készültek: spektrofotométer: Shimadzu UV-160A UV-VIS, spektrofotométer: Agilent 8453, infravörös spektrofotométer: Thermo Nicolet Avatar 330 FT-IR, gázkromatográf (GC): HP 5830A (lángionizációs detektor), CIP SIL 8CB kolonna, gázkromatográf (GC): HP 5890A (lángionizációs detektor), Super Cowax 10 kolonna, gázkromatográf (GC-MS): HP5890II/5971 (tömegszelektív detektor) CIP SIL 8CB kolonna, elemi analizátor: Carlo Erba EA 1108 C,H,N,S, ESR készülék: Bruker ELEXYS E500 CW, röntgendiffraktométer: Rigaku R-AXIS, röntgendiffraktométer: Nonius Kappa CCD. A 4’RflaH (4’Me2NflaH; 4’MeOflaH; 4’ClFlaH) [52], az indH (6’R2indH; 4’R2indH) [246] és a bim2indH (1’R2bim2indH) ligandumokat [247], a [FeIII(salen)Cl] [176], valamint a [MnII(fla)2] és [MnII(fla)2(py)2] [248], komplexeket az irodalomban leírt módszerek alapján állítottuk elő. A többi vegyszer kereskedelmi termék volt. [FeIII(MeOfla)3]: 17 g (1 mmol) FeCl3-ot , majd 0,80 g (3 mmol) MeOflaH-ot bemértünk és feloldottuk 15 cm3 MeOH-ban argon atmoszféra alatt. Ehhez az oldathoz hozzáadtunk 0,42 cm3 (3 mmol) NEt3–t. Az oldatot két órán át kevertettük argon alatt. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, metanollal és éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk. A kapott komplexet dmf-ban feloldottuk és éter diffúzióval kristályosítottuk. Hozam: 0,62 g (72 %). Op.: 211-214 ˚C. UV-VIS (λmax, dmf): 411 nm (log ε, 4,68). IR (KBr): 3447, 3203, 2386, 1604, 1547, 1491, 1457, 1421, 1412, 1353, 1307, 1256, 1213, 1180, 1158,

118

Kísérleti rész 1111, 1024, 911, 836, 757, 677, 623, 543, 503 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C48H33O12Fe): C, 67,17; H, 3,85; mért: C, 66,95; H, 3,95. [FeIII(fla)(salen)]: Bemértünk 0,36 g (1,0 mmol) [FeIII(salen)Cl]-ot, és 0,24 g (1,0 mmol) flavonolt. 15 cm3 tisztított MeOH-t adtunk hozzá, Ar-atmoszféra alatt fél órát kevertettük, majd ehhez az oldathoz hozzáadtunk 0,139 cm3 (1 mmol) NEt3–t. Az oldatot szárazra pároltuk, majd levegőn, kevés éterrel és metanollal mostuk, ezt követően vákuumban szárítottuk. Hozam: 0,46 g (82 %). Op.: UV-VIS (λmax, dmf): 403 nm (log ε, 4,24). IR (KBr): 3448, 3064, 2925, 1629, 1545, 1490, 1450, 1419, 1307, 1214, 1045, 903, 757, 624, 547. Elemanalízis (%): számított (C31H24N2O5Fe): C, 66,44; H, 4,32; N, 5,00; mért: C, 66,38; H, 4,37; N, 4,95. Mössbauer: δ = 0,49 mm/s; ΔEQ = 1,44 mm/s; tisztaság: 82 %. [Fe(4’Clfla)(salen)] (0.15 g, 90%); UV-Vis. (λmax, DMF): 411 nm (log ε, 4.15). IR (KBr): 3432, 3195, 3007, 2975, 2921, 2802, 2676, 2488, 1715, 1643, 1627, 1597, 1587, 1566, 1547, 1512, 1493, 1485, 1470, 1445, 1426, 1397, 1382, 1357, 1326, 1291, 1239, 1207, 1203, 1152, 1086, 1034, 1012, 901, 836, 759, 618, 551, 491, 420 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C31H22N2O5FeCl): C, 62,70; H, 3,73; N, 4,72; mért: C, 62,91; H, 3,65; N, 4,93. [Fe(4’MeOfla)(salen)] (0.12 g, 73%); UV-Vis. (λmax, DMF): 419 nm (log ε, 4.11). IR (KBr): 3432, 3187, 3005, 2970, 2934, 2799, 2676, 2488, 1708, 1629, 1603, 1555, 1542, 1512, 1499, 1471, 1445, 1421, 1401, 1381, 1355, 1339, 1305, 1295, 1261, 1252, 1237, 1219, 1174, 1110, 1027, 904, 858, 830, 792, 764, 756, 614, 588, 507, 454, 420 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C32H25N2O6Fe): C, 65,21; H, 4,28; N, 4,75; mért: C, 65,41; H, 4,03; N, 4,86. [Fe(4’NMe2fla)(salen)] (0.15 g, 87%); UV-Vis. (λmax, DMF): 445 nm (log ε, 4.25). IR (KBr): 3420, 3187, 3015, 2975, 2931, 2795, 2676, 2492, 1712, 1630, 1602, 1542, 1493, 1469, 1444, 1418, 1365, 1340, 1306, 1257, 1213, 1198, 1151, 1034, 1008, 943, 903, 854, 823, 790, 762, 614, 538, 511, 464, 422 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C33H28N3O5Fe): C, 65,79; H, 4,68; N, 6,98; mért: C, 65,53; H, 4,45; N, 7,08. [FeIII(O-bs)(salen)]: Bemértünk 0,57 g (1,6 mmol) [FeIII(salen)Cl]-ot, és 0,38 g (1,6 mmol) O-benzoil-szalicilsavat. 10 cm3 tisztított MeOH-t adtunk hozzá, Ar-atmoszféra alatt fél órát kevertettük, majd ehhez az oldathoz hozzáadtunk 0,222 cm3 (1,6 mmol) NEt3–t. Az oldatot 119

Kísérleti rész szárazra pároltuk, majd levegőn, kevés éterrel és metanollal mostuk, ezt követően vákuumban szárítottuk. Hozam: 0,39 g (69 %). Op.: UV-VIS (λmax, dmf): -. IR (KBr): 3188, 3010, 2925, 1731, 1629, 1597, 1512, 1445, 1385, 1327, 1294, 1200, 1034, 905, 758, 618, 425. Elemanalízis (%): számított (C30H23N2O6Fe): C, 63,96; H, 4,12; N, 4,97; mért: C, 63,78; H, 4,17; N, 4,85. [MnII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2: Feloldottunk 1,017 g (2,803 mmol) MnII(ClO4)2

.

6H2O–ot és 1,224 g (5,60 mmol) indH-t 8 cm3 MeCN-ben argon atmoszféra alatt. Az oldatot két órán át kevertettük argon alatt. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, metanollal és éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk. Hozam: 1,19 g (67 %). Op.: 286-289 ˚C. UV-VIS (λmax, dmf): 411nm (log ε, 4,664). IR (KBr): 3330, 3083, 1657, 1626, 1607, 1596, 1553, 1520, 1477, 1428, 1370, 1333, 1259, 1202, 1111, 1097, 865, 783, 718, 627, 518 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C20H20O10N6MnCl2): C, 67,61; H, 4,02; N, 3,76; mért: C, 67,45; H, 4,05; N, 3,48. [MnII(6Me2indH)(H2O)2(MeCN](ClO4)2: Feloldottunk 1,030 g (2,85 mmol) MnII(ClO4)2

.

6H2O -ot és 0,931 g (2,85 mmol) 6Me2indH-t 5 cm3 MeCN-ben argon atmoszféra alatt. Az oldatot kevertettük 4 órán keresztül. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, acetonitrillel és éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk. Hozam: 1,43 g (76 %). Op.: 149-151 ˚C. UV-VIS (λmax, dmf): 370,5 nm (log ε, 4,41). IR (KBr): 3334, 3060, 2917, 1634, 1590, 1557, 1456, 1409, 1372, 1209, 1113, 1097, 1054, 1001, 931, 862, 804, 780, 694, 625 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C22H24O10N6MnCl2): C, 40,14; H, 3,67; N, 12,77; mért: C, 40,09; H, 3,72; N, 12,85. ESR (dmf): g = 2,0011, AMn = 94,14 G. [MnII(ind)2]: 0,181 g (0,5 mmol) MnII(ClO4)2. 6H2O-ot, 0,299 g (1 mmol) indH-t és feloldottuk 10 cm3 MeOH-ban argon atmoszféra alatt. Egy órán keresztül kevertettük, majd ehhez az oldathoz hozzáadtunk 0,139 cm3 (1 mmol) NEt3–t. Az oldatot négy órán át kevertettük argon alatt. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, metanollal és éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk. A kapott komplexet MeCN-MeOH elegyben feloldottuk és éter diffúzióval kristályosítottuk. Hozam: 0,28 g (85 %). Op.: 137-140 ˚C. UV-VIS (λmax, dmf): 310nm (log ε, 4,39), 424 nm (log ε, 4,52), 451 nm (log ε, 4,44). IR (KBr): 1630, 1594, 1569, 1548, 1526, 1440, 1426,

120

Kísérleti rész 1291, 1269, 1184, 1103, 1088, 1066, 1001, 997, 776, 718, 690, cm-1. Elemanalízis (%): számított (C36H24N10Mn): C, 66,36; H, 3,71; N, 21,5; mért: C, 65,91; H, 3,78; N, 21,32. [MnII(4’Me2ind)2]: Feloldottunk 0,3619 g (1 mmol) MnII(ClO4)2 . 6H2O -ot , 0,6543 g (2 mmol) 4’Me2IndH -t és kevertettük 10 cm3 MeOH-ban argon atmoszféra alatt. Egy órán keresztül, majd ehhez az oldathoz hozzáadtunk 0,28 cm3 (2 mmol) NEt3–t. Az oldatot négy órán át kevertettük argon alatt. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, metanollal és éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk. Hozam: 0,28 g (80 %). Op.: 161-164 ˚C. UV-VIS (λmax, dmf): 306 nm (log ε, 4,53), 332 nm (log ε, 4,45), 423,5 nm (log ε, 4,73), 450 nm (log ε, 4,65). IR (KBr): 1634, 1613, 1569, 1548, 1517, 1469, 1397, 1352, 1292, 1229, 1180, 1088, 1103, 1071, 1001, 931, 780, 711, cm-1. Elemanalízis (%): számított (C40H32N10Mn): C, 67,89; H, 4,56; N, 19,79; mért: C, 67,10; H, 4,71; N, 19,50. [FeII(indH)(H2O)2(MeCN)](ClO4)2: Feloldottunk 0,362 g (1 mmol) FeII(ClO4)2 . 6H2O–ot és 0,269 g (0,9 mmol) indH-t 20 cm3 MeCN-ben argon atmoszféra alatt. Az oldatot két órán át kevertettük. Az oldathoz étert adva, barna kristályos anyag formájában kivált a komplex. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk. Hozam: 0,35 g (70 %). Op.: 258-260 ˚C. UV-VIS (λmax, dmf): 239 nm (log ε, 4,73), 283 nm (log ε, 4,50), 332 nm (log ε, 4,52), 382 nm (log ε, 4,47) ), 571 nm (log ε, 2,39). IR (KBr): 3332, 3080, 1654, 1626, 1613, 1594, 1554, 1524, 1485, 1467, 1432, 1375, 1306, 1262, 1207, 1145, 1115, 1082, 864, 780, 712, 625 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C20H20N6O10FeCl2): C, 39,01; H, 2,36; N, 12,64; mért: C, 38,73; H, 2,41; N, 12,42. Mössbauer: δ = 1,096 mm/s; ΔEQ = 3,713 mm/s (szobahőmérsékleten), δ = 1,209 mm/s; ΔEQ = 3,922 mm/s (folyékony nitrogén hőmérsékleten). [FeII(1’Me2bim2ind)2]: Bemértünk 0,181 g (0,5 mmol) FeII(ClO4)2. 6H2O-ot, 0,406 g (1 mmol) 1’Me2bim2indH-t és feloldottuk 20 cm3 MeOH-ban argon atmoszféra alatt. Egy órán keresztül kevertettük, majd ehhez az oldathoz hozzáadtunk 0,139 cm3 (1 mmol) NEt3–t. Az oldatot négy órán át kevertettük argon alatt. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, metanollal és éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk.

121

Kísérleti rész Hozam: 0,28 g (65 %). UV-VIS (λmax, dmf): 349 nm (log ε, 4,55), 433 nm (log ε, 4,60), 454 nm (log ε, 4,62), 487 nm (log ε, 4,45). IR (KBr): 3056, 2933, 1622, 1552, 1483, 1471, 1434, 1386, 1325, 1287, 1186, 1099, 1074, 739 cm-1. Elemanalízis (%): számított (C48H35N14Fe): C, 66,67; H, 4,20; N, 22,68; mért: C, 66,51; H, 4,13; N, 22,72. Karboxilát koligandumok előállítása: A megfelelő karbonsavat és kálium-terc-butoxidot thf-ban argon atmoszféra alatt feloldottunk, 8 óra kevertetés után a sűrű szuszpenzióból a keletkező tercier-butanolt vákuummal eltávolítottuk, majd a szilárd anyagokat szárítottuk. A dioxigénezési reakciók kinetikai mérésének leírása A (flavonoláto)Fe(III)- és a (flavonoláto)Mn(II)-komplexek dioxigénnel való reakcióját N,N-dimetil-formamid oldószerben vizsgáltuk. A kísérleteket termosztálható reaktorban végeztük el. Első lépésként az oldószer hőmérsékletét a megfelelő értékre állítottuk be, majd hozzáadtuk a komplexet. Ezután 1,5 - 2 percenként történő mintavétellel UV-VIS spektroszkópiai módszer segítségével követtük nyomon az oxigénezési reakciókat. A termékeket, a komplexek elhidrolizálása, valamint észterezése utáni GC elemzéssel határoztuk meg. A kísérleti körülmények a 3.1.3., 3.1.4. és a 3.1.5. fejezetekben részletesen megtalálhatóak. A hőmérsékletet ± 0,5 ºC pontossággal állítottuk be. Aminosavak oxidációs reakcióinak vizsgálata Az aminosavak [FeIII(salen)Cl] komplex által katalizált reakcióit 25 ºC-on végeztük. Egy gumiszeptummal zárható 20 cm3 térfogatú üvegedényben, dmf/víz (3:1) arányú keverékében feloldottuk a szubsztrátumot, majd hozzáadtuk a komplexet. Az edényt lezártuk a szeptummal, ezt követően a hidrogén-peroxidot a szeptumon keresztül óvatosan a reakcióelegyhez csepegtettük. Ezután 5 percenként történő mintavétellel gázkromatográfiás módszer segítségével követtük nyomon az oxidációs reakciókat. Belső standardként acetonitrilt használtunk. A mintavételezés a gáztérből történt.

122

Kísérleti rész 3,5-Di-terc-butil-pirokatechin oxidációs reakcióinak reakciókinetikai vizsgálata Termosztálható kinetikai edénybe bemértünk 50 cm3 dbcatH2 ismert koncentrációjú törzsoldatát, majd a kívánt hőfokra temperáltuk a rendszert. Ezt követően csiszolatos bemérő kanál segítségével hozzáadtuk a megfelelő katalizátor kívánt mennyiségét. A reakció lefutását 1

3

-1

a keletkező dbq λmax = 400 nm-nél (ε = 1688 mol dm cm ) jelentkező abszorpciós sávjának intenzitás mérésével követtük (3.3.1. fejezet). A kataláz aktivitás mérése A [MnII(4’R2ind)2] komplexek kataláz-aktivitásának mérését 20 ºC-on N,N-dimetilformamid oldószerben termosztálható reaktorban végeztük. A reaktorba 30 cm3 oldószert mértünk be, majd hozzáadtunk adott mennyiségű komplexet és egy szeptumos feltéttel lezártuk. A szeptumon keresztül hidrogén-peroxidot adagoltunk különböző mennyiségben. A reaktort csatlakoztattuk egy olajjal töltött gázbürettához és mértük a keletkező dioxigén térfogatát. Az 99. ábrán a készülék vázlatos rajza látható. Ar, vákuum

O2 Reaktor Gázbüretta (O2)

99. ábra A gázvolumetriás mérésekhez használt berendezés vázlatos rajza Szuperoxid dizmutáz aktivitás mérése A SOD utánzó aktivitást a mangán komplexek esetében 298 K hőmérsékleten vizsgáltuk indirekt módszer alkalmazásával, melynek alapját a nitroblue tetrazolium (NBT) redukciója képezte. A szuperoxid gyök-anion a xantin/xantin oxidáz reakciójával keletkezett in situ. A reakciót a NBT diformazánná való átalakulásának segítségével spektrofotometriásan követtük nyomon 560 nm-en. A teszt reakciókat 0,01 M-os HEPES (N-2-hidroxietilpiperazinN-2’-etánszulfonsav) pufferben végeztük 7,5-ös pH-n. NBT (1,7×10-4 M), xantin (10-4 M) és kataláz enzim (~175 U/ 3 mL) összekevert oldatához megfelelő mennyiségű xantin oxidázt 123

Kísérleti rész adagolva indítottuk a reakciót, hogy létrehozzuk a ΔA560 = 0,024-0,028 min-1 feltételt. A NBT redukciójának mértékét a vizsgált SOD utánzó komplexek (0-20×10-6M) jelenlétében és hiányában mértük. A SOD utánzó komplexek a xantin oxidáz enzim inhibícióját okozhatják, a lehetséges inhibíciót kizártuk a húgysavképződés követésével 296 nm-en külön teszt reakciókban. Ezután a SOD aktivitást meghatároztuk az IC50 értékek megállapításával (μM, az a koncentráció, ahol a NBT redukciójának inhibíciója 50%-os) minden vegyületre. A reakció tehát UV-látható spektrofotométerrel nyomon követhető. A szóban forgó reakció sebességi egyenlete (73):

d O2 dt

k NBT NBT O2

(73)

ahol kNBT értéke ismert, ha pH = 7,6, akkor kNBT = 5,94×104 M-1 s-1 249, 250 . A szuperoxid gyök-anion és a SOD utánzó komplexek reakciójának sebességi egyenlete (74):

d O2 dt

k SOD SOD O2

(74)

Az alkalmazott módszer lényege, hogy mérjük a NBT redukciója során keletkezett diformazán abszorbancia-változását 560 nm-en SOD utánzó komplex koncentrációk mellett. Az abszorbancia-változás (ΔA560), ami mérhető, arányos a szuperoxid gyök-anion koncentráció-változásával (75):

d O2 dt

d NBT dt

d

A 560 ε 560l dt

(75)

ahol ε560 a diformazán moláris elnyelési együtthatója, l pedig az alkalmazott küvetta úthossza. Ha a rendszerben nincs SOD utánzó vegyület, akkor a (73) sebességi egyenlet érvényes, ha azonban SOD utánzó vegyület is jelen van, akkor megindul a kompetitív reakció, ami szintén a szuperoxid gyök-anion koncentrációjának csökkenését okozza, így a sebességi egyenlet módosul (76):

d O2 dt

k NBT NBT O2

124

k SOD SOD O2

(76)

Kísérleti rész Ha a kompetitív reakciók azonos mennyiségű szuperoxidot fogyasztanak, akkor a (77) egyenlet érvényes:

k SOD

k NBT NBT IC50

(77)

ahol az IC50 érték az a SOD utánzó komplex koncentráció, amely a NBT redukciójának 50%os inhibícióját okozza. Az inhibíció értékét a következő két módszerrel számolhatjuk ki:

I(%)

I

ΔAo ΔAx .100 ΔAo

(78)

ΔA0 ΔAx ΔAx

(79)

A (78) és (79) egyenletekben ΔAo a komplexet nem tartalmazó rendszer abszorbancia növekménye, a ΔAx érték pedig mindig az adott mennyiségű komplex hozzáadása után mért abszorbancia különbség. A gyakorlatban az abszorbancia változását mérjük növekvő komplex koncentrációt alkalmazva, az IC50 értékeket leolvassuk az I(%) vs. [komplex] görbéről. Alkoholok oxidációs reakcióinak vizsgálata A benzil-alkohol és származékainak oxidációs reakcióit acetonitril oldószerben, argon atmoszférában, 25 ºC-on végeztük. A reakciókhoz 20 cm3 térfogatú, termosztálható reaktoredényt használtunk. Az alkohol acetonitriles oldatához lassan adagoltuk a hidrogénperoxidot, majd 15 perc keverés után ciklopentanon belső standardot adtunk az oldathoz és gázkromatográfiás módszer segítségével meghatároztuk a termékek mennyiségét. A termékek szerkezetének meghatározása GC-MS módszerrel történt.

125

Theses of the Ph.D. dissertation

6. IRODALOMJEGYZÉK [1]

R. W. Hay, Bio-Inorganic Chemistry, Ellis Harwood Ltd., Chiester (1984).

[2]

E. Fischer, Ber. Dt. Chem. Ges., 27, 2985 (1894).

[3]

D. Koshlund, PNAS, 44, 98 (1958).

[4]

Kőrös E., Bioszervetlen kémia, Gondolat Kiadó, Budapest (1980).

[5]

S. J. Benkovic, A. Ballesteros, TIBTECH, 15, 385 (1997).

[6]

M. Wegman, M. Janssen, F. van Rantwijk, Adv. Synth. Catal., 343, 559 (2001).

[7]

R. Chen, TIBTECH, 19, 13 (2001).

[8]

N. Declerck, M. Machius, P. Joyet, Prot. Eng., 16, 287 (2003).

[9]

A. S. Bommarius, J. M. Broering, Biocatal. Biotransfor., 23, 125 (2005).

[10]

J. Sylvestre, H. Chautard, F. Cedrone, Org. Proc. Res. Dev., 10, 562 (2006).

[11]

M. Leisola, O. Turunen, Appl. Microbiol. Biotechnol., 75, 1225 (2007).

[12]

L. Que, Bioinorganic Catalysis, Second ed., Marcel Dekker, Inc, New York, (1999).

[13]

D. M. Arciero, J. D. Lipscomb, B. H. Huynh, T. A. Kent, E. Münck, J. Biol. Chem., 258, 4981 (1983).

[14]

Y. Z. Wang, J. D. Lipscomb, Protein Expr. Purif., 10, 1 (1997).

[15]

Y. R. Boldt, M. J. Sadowsky, L. B. M. Ellis, L. Que, Jr., L. P. Wackett, J. Bacteriol., 177, 1225 (1995).

[16]

A. Gibello, E. Ferrer, M. Martin A. Garridopertierra, Biochem. J., 301, 145 (1994).

[17]

T. Oka, F. J. Simpson, Biochem. Biophys. Res. Commun., 43, 1 (1971).

[18]

B. G. Malmström, Annu. Rev. Biochem., 51, 21 (1982).

[19]

I. Fridovich, Acc. Chem. Res., 5, 321 (1972).

[20]

W. Adam, Chem. Ztg., 99, 142 (1975).

[21]

D. R. Kearns, Chem. Rev., 71, 395 (1971).

[22]

G. Speier, Magy. Kém. Lapja, 32, 381 (1977).

[23]

D. T. Sawyer, J. S. Valentine, Acc. Chem. Res., 14, 393 (1981).

[24]

L. Que, Jr., J. Biol. Inorg. Chem., 9, 684 (2004).

[25]

L. Que, Jr., J. Biol. Inorg. Chem., 9, 922 (2004).

[26]

M. J. Ryle, R. P. Hausinger, Curr. Opin. Chem. Biol., 6, 193 (2002).

[27]

C. He, Y. Mishina, Curr. Opin. Chem. Biol., 8, 201 (2004).

[28]

E. A. Lewis, W. B. Tolman, Chem. Rev., 104, 1047 (2004).

[29]

B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press (1989). 126

Theses of the Ph.D. dissertation [30]

L. Bravo, Nut. Rev., 56, 317 (1998).

[31]

J. B. Harborne, Prog. Clin. Biol. Res., 213, 15 (1986).

[32]

K. Herrman, J. Food Technol., 11, 433 (1976).

[33]

S. Rusznyák, A. Szent-Györgyi, Nature, 138, 798 (1936).

[34]

I. Bauer, N. Max, S. Fetzner, F. Lingens, Eur. J. Biochem., 240, 576 (1996).

[35]

H. K. Hund, A. Debeyer, F. Lingens, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, 1005 (1990).

[36]

G. Bott, M. Schmidt, T. O. Rommel, F. Lingens, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, 999 (1990).

[37]

J. W. Wray, R. H. Abeles, J. Biol. Chem., 268, 21466 (1993).

[38]

F. J. Simpson, D. W. S. Westlake, Can. J. Microbiol., 9, 15 (1963).

[39]

F. J. Simpson, G. Talbot, D. W. S. Westlake, Biochem. Biophys. Res. Commun., 15 (1960).

[40]

J. P. Haluk, M. Metche, Bull. Soc. Chim. Biol., 52, 667 (1970).

[41]

H. K. Hund, J. Breuer, F. Lingens, J. Huttermann, R. Kappl, S. Fetzner, Eur. J. Biochem., 263, 871 (1999).

[42]

T. Oka, F. J. Simpson, J. J. Child, C. Mills, Can. J. Microbiol., 17, 111 (1971).

[43]

R. A. Steiner, I. M. Kooter, B. W. Dijkstra, Biochemistry, 41, 7955 (2002).

[44]

F. Fusetti, K. H, Schroter, R. A. Steiner, P. I. van Noort, T. Pijning, H. J. Rozeboom, K. H. Kalk, M. R. Egmond, B. W. Dijkstra, Structure, 10, 259 (2002).

[45]

T. Oka, H. G. Krishnamurty and F. J. Simpson, Can. J. Microbiol., 18, 893 (1972).

[46]

R. A. Steiner, K. H. Kalk, B. W. Dijkstra, PNAS, 99, 16625 (2002).

[47]

A. Nishinaga, T. Tojo, T. Matsuura, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 896 (1974).

[48]

A. Nishinaga, T. Kuwashige, K. Maruyama, T. Mashino, J. Inorg. Biochem., 51, 254 (1993).

[49]

W. Hiller, A. Nishinaga, A. Z. Rieker, Naturforsch., 47b, 1185 (1992).

[50]

A. Nishinaga, H. Tomita, J. Mol. Catal., 7, 128 (1980).

[51]

E. Eichorn, A. Rieker, B. Speiser, H. Stahl, Inorg. Chem., 36, 3307 (1997).

[52]

A. Nishinaga, T. Kuwashige, T. Tsutsui, T. Mashino, K. J. Maruyama, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 805 (1994).

[53]

A. Nishinaga, T. Tojo, H. Tomita, T. Matsuura, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I., 2511 (1979).

[54]

C. W. Jefford, P. A. Cadby, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, 40, 191 (1981).

127


A. Nishinaga, Protein, Nucleic Acid, and Enzyme, Special Issue, (Eds. M. Kimura, A. Hanak, T. Nakajima), Kyoritsu Shuppan Co., Tokyo, 214 (1983).

[56]

M. Utaka, M. Hojo, Y. Fujii and A. Takeda, Chem. Lett., 635 (1984).

[57]

É. Balogh-Hergovich, J. Kaizer, J. Pap, G. Speier, G. Huttner, L. Zsolnai, Eur. J. Inorg. Chem., 2287 (2002).

[58]

É. Balogh-Hergovich, J. Kaizer, G. Speier, V. Fülöp, L. Párkányi, Inorg. Chem., 38, 3787 (1999).

[59]

É. Balogh-Hergovich, J. Kaizer, G. Speier, G. Huttner, L. Zsolnai, Inorg. Chim. Acta, 304, 72 (2000).

[60]

É. Balogh-Hergovich, J. Kaizer, G. Speier, Inorg. Chim. Acta, 256, 9 (1997).

[61]

É. Balogh-Hergovich, J. Kaizer, G. Speier, G. Huttner, A. Jacobi, Inorg. Chem., 39, 4224 (2000).

[62]

L. Bowater, S. A. Fairhurst, V. J. Just, S. Bornemann, FEBS Lett., 557, 45 (2004).

[63]

B. M. Barney, M. R. Schaab, R. LoBrutto, W. A. Francisco, Protein Expr. Purif., 35, 131 (2004).

[64]

B. Gopal, L. L. Madan, S. F. Betz, A. A. Kossiakoff, Biochemistry, 44, 193 (2005).

[65]

M. R. Schaab, B. M. Barney, W. A. Francisco, Biochemistry, 45, 1009 (2006).

[66]

H. Merkens, R. Kappl, R. P. Jakob, F. X. Schmid, S. Fetzner, Biochemistry, 47, 12185 (2008).

[67]

H. Merkens, S. Sielker, K. Rose, S. Fetzner, Arch. Microbiol., 187, 475 (2007).

[68]

K. Grubel, K. Rudzka, A. M. Arif, K. L. Klotz, J. A. Halfen, L. M. Berreau, Inorg. Chem., 49, 82 (2010).

[69]

A. G. Prescott, M. D. Lloyd, Nat. Prod. Rep., 17, 367 (2000).

[70]

E. L. Hegg, L. Que, Jr., Eur. J. Biochem., 250, 625 (1997).

[71]

E. I. Solomon, T. C. Brunold, M. I. Davis, J. N. Kemsley, S.-K. Lee, N. Lehnert, F. Neese, A. J. Skulan, Y.-S. Yang, J. Zhou, Chem. Rev., 100, 235 (2000).

[72]

C.-K. Liu, C.-A. Hsu, M. T. Abbott, Arch. Biochem. Biophys., 159, 180 (1973).

[73]

M. J. Ryle, R. Padamkumar, R. P. Hausinger, Biochemistry, 38, 15278 (1999).

[74]

K. I. Kirivikko, T. Pihlajaniemi, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., D. L. Purich, Ed., Wiley Interscience, 72, 325 (1998).

[75]

B. Lindblad, G. Lindstedt, S. Lindstedt, M. Rundgren, J. Biol. Chem., 252, 5073 (1977).

[76]

E. L. Hegg, R. Y. N. Ho, L. Que Jr., J. Am. Chem. Soc., 121, 1972 (1999).

[77]

E. H. Ha, R. Y. N. Ho, J. F. Kiesel, J. S. Valentine, Inorg. Chem., 34, 2265 (1995). 128


Y.-M. Chion, L. Que Jr., J. Am. Chem. Soc., 117, 3999 (1995).

[79]

M. P. Mehn, K. Fujisawa, E. L. Hegg, L. Que Jr., J. Am. Chem. Soc., 125, 7828 (2003).

[80]

S. Hong, S. Huber, L. Gagliardi, C. C. Cramer, W. B. Tolman, J. Am. Chem. Soc., 129, 14190 (2007).

[81]

D. O. Adam, S. F. Yang, PNAS, 76, 170 (1979).

[82]

J. G. Dong, J. C. Fernandez-Maculet, S. F. Yang, PNAS, 89, 9789 (1992).

[83]

G. D. Peiser, T. T. Wang, N. E. Hoffman, S. F. Yang, H.W. Liu, C. T. Walsh, PNAS, 81, 3059 (1984).

[84]

M. Costas, M. P. Mehn, M. P. Jensen, L. Que Jr., Chem. Rev., 104, 939 (2004).

[85]

Z. Zhang, J. S. Ren, I. J. Clifton, C. J. Schofield, Chem. Biol., 11, 1383 (2004).

[86]

D. G. Mcrae, J. A. Coker, R. L. Legge, J. E. Thompson, Plant Physiol., 73, 784 (1983).

[87]

J. J. Smith, P. John, Phytochemistry, 32, 1381 (1993).

[88]

J. C. Fernandez-Maculet, J. G. Dong, S. F. Yang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 193, 1168 (1993).

[89]

A. M. Rocklin, PNAS, 96, 7905 (1999).

[90]

N. M. W. Brunhuber, J. L. Mort, R. E. Christoffersen, N. O. Reich, Biochemistry, 39, 10730, (2000).

[91]

J. S. Thrower, R. Blalock, J. P. Klinman, Biochemistry, 40, 9717 (2001).

[92]

A. M. Rocklin, K. Kato, H. W. Liu, L. Que Jr., J. D. Lipscomb, J. Biol. Inorg. Chem., 9, 171 (2004).

[93]

D. L. Tierney, A. M. Rocklin, J. D. Lipscomb, L. Que Jr., B. M. Hoffman, J. Am. Chem. Soc., 127, 7005 (2005).

[94]

J. Zhou, A. M. Rocklin, J. D. Lipscomb, L. Que Jr., E. I. Solomon, J. Am. Chem. Soc., 124, 4602 (2002).

[95]

J. Thrower, L. M. Mirica, K. P. McCusker, J. P. Klinman, Biochemistry, 45, 13108, (2006).

[96]

J. E. Baldwin, D. A. Jackson, R. M. Adlington, B. J. Rawlings, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 206 (1985).

[97]

Y. Nishida, T. Akamatsu, T. Ishii, Y. Oda, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 496 (1992).

[98]

T. Kobayashi, Y. Sasaki, T. Akamatsu, T. Ishii, Y. Oda, H. Masuda, H. Einaga, Y. Z. Nishida, Naturforsch. C: J. Biosci., 54, 534 (1999). 129


W. Ghattas, C. Gaudin, M. Giorgi, A. Rockenbauer, A. J. Simaan, M. Réglier, Chem. Commun., 1027 (2006).

[100] W. Ghattas, M. Giorgi, C. Gaudin, A. Rockenbauer, M. Réglier, A. J. Simaan, Biinorg. Chem. Appl., 43424 (2007). [101] W. Ghattas, M. Giorgi, Y. Mekmouche, T. Tanaka, A. Rockenbauer, M. Réglier, Y. Hitomi, A. J. Simaan, Inorg. Chem., 47, 4627 (2008). [102] W. Ghattas, Z. Serhan, N. El Bakkali-Taheri, M. Réglier, M. Kodera, Y. Hitomi, A. J. Simaan, Inorg. Chem., 48, 3910 (2009). [103] K. Lerch, Mol. Cell. Biochem., 52, 125 (1983). [104] A. M. Mayer, E. Harel, Phytochemistry, 18, 193 (1979). [105] Y. M. Jiang, J. R. Fu, G. Zauberman, Y. Fuchs, J. Sci. Food Agric., 79, 950 (1999). [106] T. Klabunde, C. Eicken, J. C. Sacchettini, B. Krebs, Nat. Struct. Biol., 5, 1084 (1998). [107] A. Neves, L. M. Rossi, A. J. Bortoluzzi, B. Szpoganicz, C. Wiezbicki, E. Schwingel, W. Haase, S. Ostrovsky, Inorg. Chem., 41, 1788 (2002). [108] K. Selmeczi, M. Réglier, M. Giorgi, G. Speier, Coord. Chem. Rev., 245, 191 (2003). [109] S. Torelli, C. Belle, I. Gautier-Luneau, J. L. Pierre, E. Saint-Aman, J. M. Latour, L. Le Pape, D. Luneau, Inorg. Chem., 39, 3526 (2000). [110] J. Ackerman, F. Meyer, E. Kaifer, H. Pritzkow, Chem. Eur. J., 8, 247 (2002). [111] J. Reim, B. Krebs, J. Chem. Soc. Dalton Trans., 3793 (1997). [112] J. Mukherjee, R. Mukherjee, Inorg. Chim. Acta, 337, 429 (2002). [113] N. Oishi, Y. Nishida, K. Ida, S. Kida, Bull. Chem. Soc. Jpn., 53, 2847 (1980). [114] U. Casellato, S. Tamburini, P.A. Vigato, A. de Stefani, M. Vidali, D.E. Fenton, Inorg. Chim. Acta, 69, 45 (1983). [115] M. R. Malachowski, M. G. Davidson, Inorg. Chim. Acta, 162, 199 (1989). [116] M. R. Malachowski, H. B. Huynh, L. J. Tomlinson, R. S. Kelly, J. W. Furbee, J. Chem. Soc. Dalton Trans., 31, (1995). [117] I. C. Szigyárto, L. I. Simándi, L. Párkányi, L. Korecz, G. Schlosser, Inorg. Chem., 45, 7480 (2006). [118] K. W. Wellington, P. T. Kaye, G. M. Watkins, Arkivoc, 248 (2008). [119] K. W. Wellington, P. T. Kaye, G. M. Watkins, Arkivoc, 301 (2009). [120] J. M. McCord, I. Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969). [121] J. V. Bannister, W. H. Bannister, G. Rotilio, CRC Crit. Rev. Biochem. 22, 111 (1987). [122] D. J. Kliebenstein, R. A. Monde, R. L. Last, Plant Physiol., 118, 637 (1998). 130

Theses of the Ph.D. dissertation [123] I. G. Munoz, J. F. Moran, M. Becana, G. Montoya, Protein Sci., 14, 387 (2005). [124] S. Kanematsu, K. Asada, Free Radic. Res. Commun., 12-13, 383 (1991). [125] I. Fridovich, Annu. Rev. Biochem., 64, 97 (1995). [126] W. C. Stallings, K. A. Pattridge, R. K. Strong and M. L. Ludwig, J. Biol. Chem., 259, 10695 (1987). [127] J. A. Tainer, E. D. Getzoff, K. M. Beem, J. S. Richardson, D. C. Richardson., J. Mol. Biol., 160, 181 (1982). [128] A. E. G. Cass, Superoxide Dismutases, in Metalloproteins, (Ed. P. M. Harrison), Verlag Chemie, Basel, vol. 1, ch. 4, 121-156 (1985). [129] D. P. Riley, Chem. Rev., 99, 2573 (1999). [130] G. F. Liu, M. Filipovic, F. W. Heinemann, I. Ivanovic-Burmazovic, Inorg. Chem., 46, 8825 (2007). [131] Z. L. You, L. L. Ni, H. Peng, J. C. Zhang, W. Che, J. Coord. Chem., 63, 515 (2010). [132] N. I. Jakab, A. Jancsó, T. Gajda, B. Gyurcsik, A. Rockenbauer, J. Inorg. Biochem., 102, 1438 (2008). [133] R. Herchel, Z. Sindelar, Z. Travnicek, R. Zboril, J. Vanco, Dalton Trans., 9870 (2009). [134] K. Jitsukawa, M. Harata, H. Arii, H. Sakurai, H. Masuda, Inorg. Chim. Acta., 324, 108 (2001). [135] Q. X. Li, Q. H. Luo, Y. Z. Li, Z. Q. Pan, M. C. Shen, Eur. J. Inorg. Chem., 4447 (2004). [136] M. J. Burkitt and B. C. Gilbert, Free Radical Res. Commun., 10, 265 (1990). [137] D. Salvemini, Z.-Q. Wang, J. Zweier, A. Samouilov, H. Macarthur, T. Misko, M. Currie, S. Cuzzocrea, J. Sikorski and D. P. Riley, Science, 286, 304 (1999). [138] S. Melov, J. Ravenscroft, S. Malik, M. S. Gill, D. W: Walker, P. E. Clayton D. C. Wallace. B. Malfroy, S. R. Doctrow and G. J. Lithgow, Science, 289, 1567 (2000). [139] I. Batinic-Haberle, I. Spasojevic, P. Hambright, L. Benov, A. L. Crumbliss and I. Fridovich, Inorg. Chem., 38, 4011 (1999). [140] B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge, In Methods of Enzymology, L. Packer, A. N. Glazer, Eds.; Academic Press: San Diego (1990). [141] E. R. Stadtman, P. B. Berlett, P. B. Chock, PNAS, 87, 384 (1990). [142] M. J. Mate, M. Zamocky, L. M. Nykyri, C. Herzog, P. M. Alzari, C Betzel, F. Koller, and I. Fita: J. Mol. Biol., 286, 135 (1999). [143] S. Otsuka, T. Yamanka, Metalloproteins, Kodansha Ltd., Tokyo (1988). 131

Theses of the Ph.D. dissertation [144] W. C. Bray, M. H. Gorin, J. Am. Chem. Soc., 54, 2124 (1932). [145] W. G. Barb, J. H. Baxendale, P. George, K. R. Hargrave, Trans. Faraday Soc., 47, 591 (1957). [146] M. L. Kremer, Int. J. Chem. Kinet., 9, 179 (1977). [147] D. H. R. Barton, Tetrahedron, 54, 5805 (1998). [148] V. V Barynin, P. D. Hempstead, A. A. Vagin, S. V. Lamzin, P. M. Harrison, P. J. Artymyuk, J. Inorg. Biochem., 67, 196 (1997). [149] Y. Kono, I. Fridovich, J. Biol. Chem., 258, 6015 (1983). [150] W. F. Beyer, Jr., I. Fridovich, Biochemistry, 24, 6460 (1985). [151] G. S. Allgood, J. J. Perry, J. Bacteriol., 168, 563 (1986). [152] M. M. Whittaker, V. V. Barynin, T. Igarashi, J. W. Whittaker, Eur. J. Biochem., 270, 1102 (2003). [153] S. V. Khangulov, V. V. Barynin, V. R. Melik-Adamyan, A. I. Grebenko, N. V. Voevodskay, S. N. Dobrykov, V. B. Il’ysova, Bioorgan. Khim., 12, 741 (Russian), (1986). [154] S. V. Khangulov, V. V. Barynin, N. V. Voevodskaya, A. I. Grebenko, Biochim. Biophys. Acta, 1020, 305 (1990). [155] R. M. Fronko, J. E. Penner-Hahn, C. J. Bender, J. Am. Chem. Soc., 110, 7554 (1988). [156] S. V. Khangulov, P. J. Pessiki, V. V. Barynin, D. E. Ash, G. C. Dismukes, Biochemistry, 34, 2015 (1995). [157] G. S. Waldo, S. Yu, J. E. Penner-Hahn, J. Am. Chem. Soc., 114, 5869 (1992). [158] G. C. Dismukes, Bioinorganic Catalysis, Marcel Dekker, Amsterdam, (1992). [159] J. E. Penner-Hahn, In Manganase Redox Enzymes; V. L. Pecoraro, Ed.; Verlag Chemie: New York (1992). [160] G. C. Dismukes, Chem. Rev., 96, 2909 (1996). [161] A. E. Meier, M. M. Whitaker, J. W. Whitaker, Biochemistry, 35, 348 (1996). [162] Y. Naruta, K. Maruyama, J. Am. Chem. Soc., 113, 3595 (1991). [163] A. C. Rosenzweig, C. A. Frederick, S. J. Lippard, P. Nordlund, Nature, 366, 537 (1993). [164] E. J. Larson, V. L. Pecoraro, J. Am. Chem. Soc., 113, 7809 (1991). [165] M. U. Triller, W. Y. Hsieh, V. L. Pecoraro, A. Rompel, B. Krebs, Inorg. Chem., 41, 5544 (2002). [166] M. L. Pires dos Santos, A. Faljoni-Alário, A. S. Mangrich, A. M. da Costa Ferreira, J. Inorg. Biochem., 71, 71 (1998). 132

Theses of the Ph.D. dissertation [167] J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier, J. Mol. Catal. A: Chem., 236, 12 (2005). [168] J. Kaizer, T. Csay, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier, Inorg. Chem. Commun., 9, 1037 (2006). [169] A. Horn, G. L. Panilha, K. V. Melo, C. Fernandes, M. Horner, L. C. Visentin, J. A. S. Santos, M. S. Santos, E. C. A. Elutheris, M. D. Pereira, Inorg. Chem., 49, 1274 (2010). [170] S. Signorella, A. Rompel, K. Buldt-Karentsopoulos, B. Krebs, V. L. Pecoraro, J. P. Tuchagues, Inorg. Chem., 46, 10864 (2007). [171] Y. G. Abashkin, S. K. Burt, Inorg. Chem., 44, 425 (2005). [172] W. Sicking, H. G. Korth, G. Jansen, H. de Groot, R. Sustmann, Chem. Eur. J., 13, 4230 (2007). [173] L. M. Bellamy, Ultrarot-Spektrum und chemische Konstitution, Dr. Dietrich Steinkopff Verlag, Darmstadt, 12 (1966). [174] K. Schwetlick, Reakciómechanizmusok kinetikai vizsgálata, Műszaki Tankönyvkiadó, Budapest, 1978. [175] É. Balogh-Hergovich, J. Kaizer, G. Speier, G. Argay, L. Párkányi, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 3847 (1999). [176] S. Routier, H. Vezin, E. Lamour, J. L. Bernier, J. P. Catteau, C. Bailly, Nucl. Acids Res., 27, 4160 (1999). [177] K. C. Gupta, A. K. Sutar, C. C. Lin, Coord. Chem. Rev., 254, 1926 (2009). [178] J. Woltinger, J. E. Bäckvall, A. Zsigmond, Chem. Eur. Jr., 5, 1460 (1999). [179] B. Fan, H. Li, W. Fan, C. Jin, R. Li, Appl. Catal., A: G., 340, 67 (2008). [180] A. M. Jayaseeli, S. Rajagopal, J. Mol. Catal. A: Chem., 309, 103 (2009). [181] N. Hessenauer-Ilicheva, D. Meyer, W. D. Woggon, R. van Eldik, J. Am. Chem. Soc., 129, 12473 (2007). [182] J. Kaizer, E. J. Klinker, N. Y. Oh, J.-U. Rohde, W. J. Song, A. Stubna, J. Kim, E. Münck, W. Nam, L. Que, Jr., J. Am. Chem. Soc., 126, 472 (2004). [183] J. Kaizer, M. Costas, L. Que, Jr., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 42, 3671 (2003). [184] E. J. Klinker, J. Kaizer, W. W. Brennessel, N. L. Woodrum, C. J. Cramer, L. Que, Jr., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 44, 3690 (2005). [185] J.-U. Rohde, S. Torelli, X. Shan, M. H. Lim, E. J. Klinker, J. Kaizer, K. Chen, W. Nam, L. Que, Jr., J. Am. Chem. Soc., 126, 16750 (2004).

133

Theses of the Ph.D. dissertation [186] M. P. Jensen, M. Costas, R. Y. N. Ho, J. Kaizer, A. Mairata I Payeras, E. Münck, L. Que, Jr., J.-U. Rohde, A. Stubna, J. Am. Chem. Soc., 127, 10512 (2005). [187] T. K. Paine, M. Costa, J. Kaizer, J. Biol. Inorg. Chem., 11, 272 (2006). [188] R. R. Gagné, D. N. Marks, Inorg. Chem., 23, 65 (1984). [189] C. A. Tolman, J. D. Druliner, P. J. Krusic, M. J. Nappa, W. C. Seidel, I. D. Williams and S. D. Ittel, J. Mol. Catal., 48, 129 (1988). [190] M. Pascaly, M. Duda, F. Schweppe, K. Zurlinden, F. K. Müller, B. Krebs, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 828 (2001). [191] J. Kaizer, J. Pap, G. Speier, L. Párkányi, L. Korecz, A. Rockenbauer, J. Inorg. Biochem., 91, 190 (2002). [192] D. Nematollahi, H. Shayani-Jam, Electrochim. Acta, 51, 6384 (2006). [193] C. Eicken, F. Zippel, K. Buldt-Karentzopoulos, B. Krebs, FEBS Lett., 436, 293 (1998). [194] S. J. Smith, C. J. Noble, R. C. Palmer, G. R. Hanson, G. Schenk, L. R. Gahan, M. J. Riley, J. Biol. Inorg. Chem., 13, 499 (2008). [195] P. Gentschev, M. Luken, N. Moller, A. Rompel, B. Krebs, Inorg. Chem. Commun., 4, 753 (2001). [196] K. Born, P. Comba, A. Daubinet, A. Fuchs, H. Wadepohl, J. Biol. Inorg. Chem., 12, 36 (2007). [197] Á. Kupán, J. Kaizer, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier, F. Pollreisz, J. Inorg. Biochem., 103, 389 (2009). [198] T. Csay, B. Kripli, M. Giorgi, J. Kaizer, G. Speier, Inorg. Chem. Commun., 13, 227 (2010). [199] Y. Hitomi, A. Ando, H. Matsui, T. Ito, T. Tanaka, S. Ogo, T. Funabiki, Inorg. Chem., 44, 3473 (2005). [200] J. Kaizer, T. Csay, P. Kővári, G. Speier, L. Párkányi, J. Mol. Catal. A: Chem., 280, 203 (2008). [201] F. Fucassi, J. E. Lowe, K. D. Pavey, S. Shah, R. G. A. Faragher, M. H. L. Green, F. Paul, D. O’Hare, P. J. Cragg, J. Inorg. Biochem., 101, 225 (2007). [202] M. Shank, V. Barynin, G. C. Dismukes, Biochem., 33, 15433 (1994). [203]

J. Penner-Hahn, In Manganese Redox enzymes: V. L. Pecoraro, Ed.; VCH Publishers: New York, 29 (1992).

[204] A. Gelasco, S. Bensiek, V. L. Pecoraro, Inorg. Chem., 37, 3301 (1998). [205] A. Gelasco, V. L. Pecoraro, J. Am. Chem. Soc., 115, 7928 (1993). 134

Theses of the Ph.D. dissertation [206] U. Bossek, M. Saher, T. Weyhermüller, K. J. Wieghardt, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1780 (1992). [207] A. E. M. Boelrijk, G. C. Dismukes, Inorg. Chem., 39, 3020 (2000). [208] P. Mathur, M. Crowder, G. C. Dismukes, J. Am. Chem. Soc., 109, 5227 (1987). [209] P. J. Pessiki, S. V. Khangulov, D. M. Ho, G. C. Dismukes, J. Am. Chem. Soc., 116, 891 (1994). [210] P. J. Pessiki, G. C. Dismukes, J. Am. Chem. Soc., 116, 898 (1994). [211] C. Palopoli, B. Chansou, J. P. Tuchagues, S. Signorella, Inorg. Chem., 39, 1458 (2000). [212] Horváth B., Szakdolgozat: Mangántartalmú kataláz enzimmodellek előállítása és reakciókinetikájának vizsgálata, Pannon Egyetem, Veszprém (2010). [213] J. M. McCord, I. Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969). [214] C. Beauchamp, I. Fridovich, Anal. Biochem., 44, 276 (1971). [215] W. B. Greenleaf, D. N. Silverman, J. Biol. Chem., 277, 49282 (2002). [216] J. L. Hsu, Y. Hsieh, C. Tu, D. O’Connor, H. S. Nick, D. N. Silverman, J. Biol. Chem., 271, 17687 (1996). [217] N. Kitajima, M. Osawa, N. Tamura, Y. Moro-Oka, T. Hirano, M. Hirobe, T. Nagano, Inorg. Chem., 32, 1879 (1993). [218] K. S. Yamaguchi, L. Spencer, D. T. Sawyer, FEBS Lett., 197, 249 (1986). [219] A. Deroche, I. Morgenstern-Badarau, M. Cesario, J. Guilhem, B. Keita, L. Nadjo, C. Houée-Levin, J. Am. Chem. Soc., 118, 4567 (1996). [220] D. F. Xiang, C. Y. Duan, X. S. Tan, Q. W. Hang, W. X. Tang, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1201 (1998). [221] D. F. Xiang, X. S. Tan, Q. W. Hang, W. X. Tang, B. M. Wu, T. C. W. Mak, Inorg. Chim. Acta, 277, 21 (1998). [222] M. Tamura, Y. Urano, K. Kikuchi, T. Higuchi, M. Hirobe, T. Nagano, Chem. Pharm. Bull., 48, 1514 (2000). [223] B. Betzemeier, M. Cavazzini, S. Quici, P. Knochel, Tetrahedron Lett., 41, 4343 (2000). [224] B. Karimi, A. Zamani, J. H. Clark, Organomet., 24, 4695 (2005). [225] Y.Wang, J. L. DuBois, B. Hedman, K. O. Hodgson, T. D. P. Stack, Science, 279, 537 (1998). [226] G. Karthikeyan, P. T. Perumal, Synlett., 4, 2249 (2003). [227] A. Thottumkara, T. Vinod, Tetrahedron Lett., 43, 569 (2002). 135

Theses of the Ph.D. dissertation [228] A. Miyata, M. Murakami, R. Irie, T. Katsuki, Tetrahedron Lett., 42, 7067 (2001). [229] B. Zhan, M. A.White, T. K. Sham, J. A. Pincock, R. Doucet, K. V. Rao, K. N.Robertson, T. S. Cameron, J. Am. Chem. Soc., 125, 2195 (2003). [230] V. Sivamurugan, G. A. Rajkumar, B. Arabindoo, V. Murugesan, Indian J. Chem. Sec. B., 44, 144 (2005). [231] J. Kropp, G. W. Breton, J. D. Fields, J. C. Tung, B. R. Loomis, J. Am. Chem. Soc., 122, 4280 (2000). [232] P. Gogoi, D. Konwar, Org. Biomol. Chem., 3, 3473 (2005). [233] J. N. Moorthy, N. I. Singhal, P. Venkatakrishnan, Tetrahedron Lett., 45, 5419 (2004). [234] H. R. Mardani, H. Golchoubian, Tetrahedron Lett., 47, 2349 (2006). [235] R. A. Sheldon, I. W. C. E. Arends, A. Dijksman, Catal. Today, 57, 157 (2000). [236] M. Musawir, P. N. Davey, G. Kelly, I. V. Kozhenikov, Chem. Commun., 1414 (2003). [237] M. Costas, K. Chen, L. Que, Jr., Coord. Chem. Rev., 200-202, 517 (2000). [238] K. Chen, M. Costas, L. Que, Jr., J. Chem. Soc. Dalton Trans., 672 (2002). [239] A. G. J. Ligtenbarg, P. Oosting, G. Roelfes, R. M. La Crois, M. Lutz, A. L. Spek, R. Hage, B. L. Feringa, Chem. Commun., 385 (2001). [240] W. Nam, Acc. Chem. Res., 40, 522 (2007). [241] A. T. Fiedler, X. Shan, M. P. Mehn, J. Kaizer, S. Torelli, J. R. Firsch, M. Kodera, L. Que, Jr., J. Phys. Chem. A., 112, 13037 (2008). [242] S. V. Kryatov, S. Taktak, I. V. Korendovych, E. V. Rybak-Akimova, J. Kaizer, S. Torelli, X. Shan, S. Mandal, V. MacMurdo, A. Mairata i Payeras, L. Que, Jr., Inorg. Chem., 44, 85 (2005). [243] B. E. Sturgeon, D. Burdi, S. Chen, B. H. Huynh, D. E. Edmondson, J. Stubbe, B. M. Hoffman, J. Am. Chem. Soc., 118, 7551 (1996). [244] P. J. Riggs-Gelasco, L. Shu, S. Chen, D. Burdi, B. H. Huynh, L. Que, Jr., J. Stubbe, J. Am. Chem. Soc., 120, 849 (1998). [245] N. Y. Oh, Y. Suh, M. J. Park, M. S. Seo, J. Kim, W. Nam, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 44, 4235 (2005). [246] W. O. Siegl, J. Org. Chem., 44, 1872 (1977). [247] H. Vollman, H. Leister, Lajstromszám: US3499908 (1970). [248] Pap J. S., Doktori értekezés: Néhány szabad gyök, illetve átmenetifém-komplex enzimutánzó reakciója, Veszprémi Egyetem, Veszprém (2004). [249] S. Durot, C. Policar, F. Cisnetti, F. Lambert, J. P. Renault, G. Pelosi, G. Blain, H. Korri-Youssoufi, J. P. Mahy, Eur. J. Inorg. Chem., 3513 (2005). 136

Theses of the Ph.D. dissertation [250] Z. R. Liao, X. F. Zheng, B. S. Luo, L. R. Shen, D. F. Li, H. L. Liu, W. Zhao, Polyhedron, 20, 2813 (2001).

137

OXIDOREDUKTÁZ ENZIMEK MODELLREAKCIÓINAK VIZSGÁLATA

Recommend Documents