Op zoek naar verstoorde O-glycosylatie van eiwitten in een modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer
Eline VAN COSTENOBLE
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. KRIS GEVAERT Begeleider: Dr. BART GHESQUIERE Vakgroep: Biochemie
Academiejaar 2011-2012
Op zoek naar verstoorde O-glycosylatie van eiwitten in een modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer
Eline VAN COSTENOBLE
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. KRIS GEVAERT Begeleider: Dr. BART GHESQUIERE Vakgroep: Biochemie
Academiejaar 2011-2012
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
21 mei 2012
Eline Van Costenoble
Prof. Dr. Kris Gevaert
Voorwoord
Deze masterproef was niet mogelijk geweest zonder de hulp en steun van een aantal mensen. Ik zou dan ook graag enkele mensen willen bedanken die meegeholpen hebben aan het tot stand komen van deze masterproef.
Eerst en vooral wil ik mijn promotor prof. dr. Kris Gevaert bedanken voor het ter beschikking stellen van het laboratorium en voor zijn advies en hulp bij het schrijven van dit werk. Verder gaat er ook heel veel dank uit naar mijn begeleider dr. Bart Ghesquière, die mij gedurende het hele academiejaar heeft bijgestaan. Zijn kennis over de gebruikte technieken en zijn uitleg om mij deze aan te leren, stel ik enorm op prijs. Daarnaast zou ik ook nog de mensen uit het labo willen bedanken, omdat ik met problemen en vragen ook altijd bij hen terecht kon.
Verder wil ik ook nog mijn medestudenten bedanken voor het ophelderen van algemene problemen, en in het bijzonder Steven, voor het uitwisselen van biomedische weetjes tijdens de ontspannende looptrainingen. Eveneens wil ik ook nog Evelyne bedanken voor de steun die ze mij gegeven heeft toen het wat moeilijker ging. Als laatste zou ik ook nog mijn ouders willen bedanken om mij de kans te geven om mijn eigen weg te gaan en me hierin te steunen, en mijn vriend om er altijd te zijn voor mij.
Eline Van Costenoble Gent, mei 2012
Inhoudstafel Samenvatting ........................................................................................................................... 1 1. Inleiding ................................................................................................................................ 2 1.1 Proteomics ....................................................................................................................... 2 1.2 Posttranslationele modificaties ........................................................................................ 5 1.2.1 O-glycosylatie ............................................................................................................ 6 1.2.2 Fosforylatie ................................................................................................................ 7 1.2.3 Reciproke interactie tussen O-glycosylatie en fosforylatie ....................................... 8 1.3 Ziekte van Alzheimer ....................................................................................................... 8 1.4 Verband tussen O-glycosylatie en de ziekte van Alzheimer ......................................... 11 1.5 Methoden om O-glycosylatie te bestuderen ................................................................... 13 2. Materialen en methoden ................................................................................................... 16 2.1 Optimalisatie van de reacties .......................................................................................... 16 2.1.1 Defosforylatie .......................................................................................................... 16 2.1.2 β-eliminatie .............................................................................................................. 17 2.2 Optimalisatie van de condities voor de inductie van AD in SH-SY5Y cellen ............... 18 2.2.1 Celcultuur................................................................................................................. 18 2.2.2 Behandeling SH-SY5Y cellen ................................................................................. 18 2.2.3 Cellyse .................................................................................................................... 19 2.2.4 Bepaling van de eiwitconcentratie ........................................................................... 20 2.2.5 Gelelektroforese ....................................................................................................... 20 2.2.6 Kleuring gel ............................................................................................................. 20 2.2.7 Western blot ............................................................................................................. 20 2.3 Identificatie van peptiden met hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie met COFRADIC ....... 21 2.3.1 SILAC markering .................................................................................................... 21 2.3.2 Voorbereidende stappen voor de COFRADIC analyse ........................................... 21 2.3.3 COFRADIC analyse ................................................................................................ 22 2.3.4 Massaspectrometrie.................................................................................................. 24 2.3.5 Identificatie van de fragmentatiespectra door Mascot ............................................. 24 2.4 Identificatie van de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden bij AD met COFRADIC ...... 25 2.4.1 SILAC markering .................................................................................................... 25 2.4.2 Voorbereidende stappen voor de COFRADIC analyse ........................................... 25
2.4.3 COFRADIC analyse ................................................................................................ 26 2.4.4 Massaspectrometrie.................................................................................................. 26 2.4.5 Identificatie van de fragmentatiespectra door Mascot ............................................ 26 3. Resultaten ........................................................................................................................... 27 3.1 Optimalisatie van de reacties .......................................................................................... 27 3.1.1 Defosforylatie .......................................................................................................... 27 3.1.2 β-eliminatie .............................................................................................................. 28 3.2 Optimalisatie van de condities voor de inductie van AD in SH-SY5Y cellen ............... 30 3.3 Identificatie van peptiden met hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie met COFRADIC ....... 33 3.3.1 Western blot ............................................................................................................. 34 3.3.2 COFRADIC analyse ............................................................................................... 34 3.3.3 Data-analyse............................................................................................................. 36 3.4 Identificatie van de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden bij AD met COFRADIC ...... 38 3.4.1 Western blot ............................................................................................................. 39 3.4.2 COFRADIC analyse ................................................................................................ 40 3.4.3 Data-analyse............................................................................................................. 40 4. Bespreking .......................................................................................................................... 42 5. Referenties .......................................................................................................................... 47
Samenvatting De ziekte van Alzheimer (AD) is een trage, progressieve neurodegeneratieve aandoening die gekarakteriseerd wordt door dementie. De hedendaagse behandelingen zijn vooral symptomatisch en hebben slechts een klein effect op het verbeteren van het ziektebeeld. Hierdoor is het noodzakelijk om de verschillende mechanismen en processen die kenmerkend zijn voor de ziekte te ontrafelen, zodat nieuwe behandelingen kunnen ontwikkeld worden. O-gelinkte β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is een dynamische posttranslationele modificatie, die sterke gelijkenissen vertoont met fosforylatie. Verschillende onderzoeken hebben reeds aangetoond dat er een verband bestaat tussen een verstoorde O-GlcNAcylatie en eiwitten die betrokken zijn bij AD. In eerste instantie werden SH-SY5Y neuroblastoma cellen behandeld met verschillende concentraties van PUGNAc, alloxaan, Aβ1-42 en Aβ25-35. Toevoeging van PUGNAc blijkt een goede behandeling te zijn om hyper-O-GlcNAcylatie te induceren, terwijl alloxaan geschikt is om hypo-O-GlcNAcylatie te bekomen. Aβ1-42 en Aβ25-35, die gebruikt werden om AD te induceren, hadden echter geen effect op de O-GlcNAcylatiegraad, noch op de inductie van apoptose. Dit maakte het gebruikte modelsysteem niet geschikt voor het onderzoek naar verstoorde O-GlcNAcylatie bij AD. In tweede instantie werd getracht om peptiden met hyperen hypo-O-GlcNAcylatie te identificeren met een COFRADIC-gebaseerde techniek. Deze techniek bestaat uit twee identieke, opeenvolgende RP-HPLC scheidingen met tussenin een modificatiereactie van O-GlcNAc-bevattende peptiden. Hierdoor konden de O-GlcNAcbevattende peptiden geïsoleerd worden, om vervolgens met massaspectrometrie te identificeren. Er kon slechts één O-GlcNAc-bevattend eiwit geïdentificeerd worden met een significante stijging in O-GlcNAcylatie, nl. SWI/SNF-related matrix-associated actindependent regulator of chromatin subfamily D member 2. Het hoofddoel van deze thesis was om zoveel mogelijk eiwitten met een verstoorde O-GlcNAcylatie te identificeren bij AD. Ook hiervoor werd de COFRADIC technologie gebruikt. Slechts één O-GlcNAc-bevattend eiwit werd gevonden met een significante verandering in O-GlcNAc, nl. Microtubule-actin crosslinking factor 1. Door het gebruik van butylamine als modificatie bij de COFRADIC technologie kon slechts een klein percentage van de peptiden geïdentificeerd worden. Dit, in combinatie met de ongeschiktheid van het gebruikte cellulair modelsysteem voor AD om OGlcNAcylatie te bestuderen, zorgde voor het lage aantal geïdentificeerde eiwitten die een OGlcNAc-modificatie dragen. Verder onderzoek is noodzakelijk om een geschikt modelsysteem te vinden om O-GlcNAcylatie bij AD te onderzoeken en om een geschikte methode te vinden om de O-GlcNAc-bevattende eiwitten te identificeren. 1
1. Inleiding 1.1 Proteomics Het menselijk genoom bevat ongeveer 22.000 genen. Door alternatieve splicing van mRNA, eiwitprocessing en posttranslationele modificaties kan het aantal verschillende eiwitten of eiwitvormen oplopen tot meer dan een miljoen [1]. “Proteomics”, de grootschalige analyse van eiwitten, is één van de belangrijkste disciplines geworden voor het identificeren van eiwitten en het bestuderen van hun expressie, functie en regulatie [2]. Proteomics kan gebruikt worden om het verschil in eiwitexpressie te bestuderen tussen een normale en een ziektetoestand, maar kan ook gebruikt worden om de structuur en functie van eiwitten te bepalen. De meest traditionele en wijdverspreide proteoomanalytische methode steunt op tweedimensionale polyacrylamide gelelektroforese (2D-PAGE) [3]. In een eerste dimensie worden hier de eiwitten gescheiden volgens hun isoëlektrisch punt, gevolgd door een tweede scheiding volgens hun moleculair gewicht. Na kleuring van het gel bevat elke spot één of meerdere eiwitten. Door de intensiteit van de verschillende spots te vergelijken, kan het verschil in expressie tussen verschillende proteomen bepaald worden. Een recentere en betere methode voor eiwitkwantificering, is differentiële gelelektroforese (DIGE) [3]. Hierbij worden verschillende fluoroforen gebruikt om de verschillende proteomen te onderscheiden van elkaar. Zulke gemerkte proteomen worden dan samengevoegd en op hetzelfde 2D-gel gescheiden. Vervolgens wordt het gel gescand bij de excitatie- en emissiegolflengte van de gebruikte fluoroforen om na te gaan of één van beide fluoroforen een sterker signaal geeft en zodoende wijst op eiwitregulatie. Eiwitten kunnen ook getransfereerd worden op een membraan (nitrocellulose of polyvinylideen fluoride) tijdens Western blotting. Het voordeel van deze techniek is dat de getransfereerde eiwitten kunnen gescreend worden met antilichamen, die specifieke eiwitten of eiwitmodificaties zoals glycosylatie en fosforylatie herkennen [3]. Identificatie van eiwitten gescheiden op een 2D-gel gebeurt aan de hand van massaspectrometrie (MS), waarbij Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDIMS) of Electrospray Ionization (ESI-MS) de meest gebruikte methodes zijn [3]. Een individuele eiwitspot van een 2D-gel wordt eerst in-gel gedigereerd door trypsine, en de resulterende peptiden worden daarna geanalyseerd door MALDI of ESI-MS. De lijst van peptidenmassa's wordt vervolgens ingevoerd in een databank zoekmachine zoals MASCOT [4], om eiwitten te identificeren.
2
Deze 2D-PAGE methoden hebben ook hun beperkingen [5]. Specifieke eiwitklassen worden vaak niet gedetecteerd: het gaat dan vooral over hydrofobe, integrale membraaneiwitten en laag-abundante eiwitten (vaak minder dan 1000 kopijen per cel). Een stijging in de intensiteit en accuraatheid van de massaspectrometers, samen met de beschikbaarheid
van
volledig
gesequeneerde
genomen,
leidde
tot
een
nieuw
onderzoeksgebied in proteomics: gelvrije of peptidengecentreerde proteomics [5]. De focus ligt hier op de analyse van peptiden in plaats van eiwitten. Peptiden worden bekomen door enzymatische digestie van eiwitten. Een veel gebruikt enzym voor de digestie (zie ook hierboven) is trypsine, dat C-terminaal knipt van arginine en lysine. De uitdaging van deze methode ligt in de enorme complexiteit van het peptidenmengsel: elk eiwit geeft namelijk aanleiding tot verschillende peptiden. Om de complexiteit van het mengsel te reduceren kunnen de peptiden voor de MS-analyse gescheiden worden door gebruik te maken van bvb. High-Performance
Liquid
Chromatography
(HPLC).
De
grote
complexiteit
van
peptidengecentreerde proteoomanalyses creëert het probleem van undersampling [5]. Hierbij worden er te veel peptiden afgeleverd aan de massaspectrometer waardoor ze niet allemaal kunnen
geanalyseerd
worden
en
eerder
lukraak
geselecteerd
worden
door
de
massaspectrometer. Peptidengecentreerde technologieën zijn dus genoodzaakt om zich te focussen op het reduceren van de complexiteit van het peptidenmengsel. Een voorbeeld van een dergelijke technologie is de multidimensionale eiwitidentificatie (MUDPIT) techniek [5]. Deze techniek bestaat uit twee opeenvolgende chromatografische scheidingen. De eerste is een sterke kationenuitwisseling waarbij de scheiding gebeurt op basis van de lading, gevolgd door omgekeerde fase HPLC (RP-HPLC) scheiding, op basis van hydrofobiciteit. Een andere peptidengecentreerde methode bestaat erin om een specifieke peptidenset te selecteren die nadien geanalyseerd wordt door de massaspectrometer. Een voorbeeld van een dergelijke techniek, is de COFRADIC techniek (gecombineerde fractionele diagonale chromatografie) [2,6], die tevens in deze thesis gebruikt wordt. De vereisten voor de selectie van de peptiden, zijn dat deze peptiden op zijn minst één functionele groep bevatten die de peptiden onderscheiden van alle andere peptiden, en dat deze functionele groep specifiek kan gemodificeerd worden door een chemische of enzymatische reactie. Daarnaast moet de geïntroduceerde modificatie een voldoende groot chromatografische verschuiving van de geaffecteerde peptiden introduceren. De techniek is reeds gebruikt voor het isoleren van methionyl, cysteïnyl, amino-terminale, gefosforyleerde en geglycosyleerde peptiden [2,6].
3
In COFRADIC worden er twee identieke, opeenvolgende RP-HPLC scheidingen uitgevoerd met daartussenin een modificatie van de geselecteerde peptiden. Deze modificatiereactie veroorzaakt een verandering in hydrofobiciteit waardoor de geselecteerde peptiden op een ander tijdstip zullen elueren dan tijdens de eerste scheiding. De ongemodificeerde peptiden zullen op hetzelfde tijdstip elueren waardoor er dus een scheiding optreedt tussen de gemodificeerde en ongemodificeerde peptiden (figuur 1). De gemodificeerde peptiden kunnen specifiek opgevangen worden voor verdere analyse.
Figuur 1: Algemeen principe van COFRADIC voor het isoleren van peptiden uit een complex mengsel. Tijdens de primaire scheiding wordt het peptidenmengsel gescheiden op een RP-HPLC kolom. De opgevangen fracties worden chemisch of enzymatisch gemodificeerd om de kolomretentie-eigenschappen van een specifieke klasse peptiden te veranderen. Tijdens de secundaire scheiding worden de gemodificeerde primaire fracties terug op de kolom geladen en gescheiden onder dezelfde condities als de primaire scheiding. De gemodificeerde peptiden ondergaan een hydrofobe (+δ) of hydrofiele (-δ) verschuiving waardoor ze geïsoleerd en verder geanalyseerd kunnen worden. AU: absorbantie eenheden. Aangepaste figuur uit [2].
Differentiële analyse van proteomen Kwantificering van peptiden, en dus analyse van eiwitexpressie, is ondermeer mogelijk door gebruik te maken van stabiele isotoopmarkering van aminozuren in celcultuur (SILAC) [7]. Dierlijke cellen kunnen een aantal aminozuren niet zelf synthetiseren. Deze essentiële aminozuren moeten dus toegevoegd worden aan het medium om celgroei te verkrijgen. Met SILAC worden de cellen gekweekt in een medium dat gedepleteerd is voor een essentieel aminozuur zoals bvb. lysine, en gesupplementeerd wordt met een niet-radioactieve (stabiele) isotopisch zwaardere vorm van dat aminozuur. Dit aminozuur wordt geïncorporeerd tijdens de synthese van de eiwitten en na een vijftal celdelingen zal het natuurlijke aminozuur volledig vervangen zijn door zijn zwaardere vorm. Voor eiwitkwantificering worden cellen enerzijds gekweekt in licht medium met bvb. lysine en anderzijds in zwaar medium met
13
C6-lysine. Metabolische incorporatie van
12
C6 -
13
C6 -
lysine resulteert in een massaverschuiving van 6 Dalton van het overeenkomstig peptide. Deze massaverschuiving wordt gedetecteerd door de massaspectrometer. Bij combinatie van 4
de lichte en zware stalen reflecteert de ratio van de piekintensiteiten van het peptidenpaar in het massaspectrum de relatieve eiwitabundantie. Het principe wordt geïllustreerd in figuur 2.
Figuur 2: Schematische voorstelling van de SILAC methode. Cellen worden gekweekt in licht of zwaar medium dat respectievelijk 12C6-lysine en 13C6-lysine bevat. Na cellyse kunnen de eiwitten opgezuiverd worden en in een gelijke hoeveelheid worden samengevoegd. Na digest worden de peptiden geanalyseerd met de massaspectrometer. Een peptide dat 13C6-lysine geïncorporeerd heeft, zal een massaverschuiving ondergaan van 6 Dalton (Da). Rel. Int.: Relatieve Intensiteit, m/z: massa-op-lading verhouding. Aangepaste figuur uit [7].
1.2 Posttranslationele modificaties Een posttranslationele modificatie (PTM) is een modificatie die plaatsgrijpt wanneer het DNA reeds is overgeschreven in RNA en vertaald is in eiwitten [8]. PTM's hebben een grote bijdrage in de complexiteit van een proteoom en veranderen de eigenschappen van een eiwit door processing (proteases), additie van een modificerende groep op één of meerdere aminozuren of het verwijderen van een groep. Belangrijke eiwitmodificaties zijn o.a. fosforylatie, glycosylatie, acetylatie, methylatie, ubiquitinatie en processing. PTM's spelen een belangrijke rol in de activiteit, cellulaire lokalisatie, functie en levensduur van de eiwitten, maar ook in de interactie met andere eiwitten en in signaalcascades. Zo worden eiwitten bvb. geactiveerd en gedeactiveerd door de additie of het verwijderen van fosfaatgroepen aan serine, threonine en tyrosine [8]. Een verstoring van PTM's kan aanleiding geven tot een verstoorde functie of verlies van een eiwit en kan dus aanleiding geven tot een ziektetoestand. Omdat in deze thesis de focus lag op de studie van O-GlcNAc-modificaties en de wisselwerking met fosforylatie, volgt hieronder een korte beschrijving van O-glycosylatie en fosforylatie. 5
1.2.1 O-glycosylatie De drie voornaamste vormen van glycosylatie zijn C-glycosylatie, N-glycosylatie en Oglycosylatie [8]. C-glycosylatie, of meer specifiek de mannosylatie van C2 van de indolring van tryptofaan is zeer zeldzaam. Wanneer er een complexe suikerboom, bestaande uit verschillende suikermoleculen, op asparagine wordt geplaatst, dan spreken we van Nglycosylatie. Deze twee vormen zullen verder niet besproken worden. O-glycosylatie, en meer specifiek de O-GlcNAc (O-gelinkte β-N-acetylglucosamine) modificatie van serines en threonines, is een zeer dynamische posttranslationele modificatie die analoog is aan fosforylatie [9,10,11]. O-GlcNAcylatie verschilt van de klassieke Oglycosylatie doordat er slechts één enkele suikermolecule op het eiwit wordt geplaatst in plaats van een complexe structuur. Het merendeel van de cellulaire glucose wordt gebruikt voor het genereren van adenosinetrifosfaat (ATP). De overige 2 tot 5% wordt via de hexosamine biosynthese gebruikt voor de productie van uridine difosfaat N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc). Deze molecule vormt het donorsubstraat voor O-GlcNAcylatie. Transfer van N-acetylglucosamine (figuur 3) van UDP-GlcNAc naar serine of threonine gebeurt door het O-GlcNAc transferase (OGT), terwijl afsplitsing gebeurt door het β-N-acetylglucosaminidase (O-GlcNAcase) (Figuur 4). Deze twee enzymen zijn zeer specifiek voor O-GlcNAcylatie en komen zowel voor in het cytoplasma als in de nucleus van alle cellen [11,12]. Bovendien is de analogie met kinasen en fosfatasen treffend. De activiteit van OGT wordt deels gereguleerd door de aanwezigheid van UDP-GlcNAc, dat proportioneel is met de hoeveelheid nutriënten aanwezig in de cel. OGlcNAcylatie van substraten is dus een soort metabolische sensor die de eiwitfunctie aanpast volgens de nutritionele status van de cel [10]. OGT bestaat in drie isovormen [13]. De langste en kortste vorm, respectievelijk ncOGT (nucleocytoplasmatisch) en sOGT (short) komen voor in de nucleus en het cytoplasma. De andere vorm, mOGT (mitochondriaal), heeft een mitochondriaal lokalisatiesignaal en komt dus voor in de mitochondriën. Elke isovorm heeft zijn eigen substraatspecificiteit.
Figuur 3: N-acetylglucosamine
6
Figuur 4: Cyclus van O-GlcNAcylatie. O-GlcNAc wordt op serine of threonine geplaatst van zowel nucleaire als cytoplasmatische eiwitten. Deze dynamische werking wordt gecontroleerd door twee specifieke enzymen: het O-GlcNAc transferase (OGT) en het β-N-acetylglucosaminidase (O-GlcNAcase). Aangepaste figuur uit [11].
O-GlcNAcylatie reguleert de stabiliteit, activiteit en subcellulaire lokalisatie van eiwitten en is afhankelijk van de hoeveelheid glucose in de cel. Cytoplasmatische O-GlcNAcylatie speelt een belangrijke rol in de transductie van signaal cascades, terwijl nucleaire O-GlcNAcylatie belangrijk is bij de regulatie van de activiteit van verschillende transcriptiefactoren [10].
1.2.2 Fosforylatie Eiwitfosforylatie is één van de meest bestudeerde posttranslationele modificaties en is betrokken in veel verschillende regulatorische functies zoals celcyclus receptorgemediëerde
signaaltransductie,
differentiatie,
proliferatie,
controle,
transformatie
en
metabolisme. De wisselwerking tussen twee types enzymen, eiwitkinasen en fosfatasen, controleert continu deze substraatmodificatie door reversibele fosforylatie (kinasen) en defosforylatie (fosfatasen) [14]. Fosforylatie grijpt in 90% van de gevallen plaats op serine of threonine en in 10% van de gevallen op tyrosine [8]. In de overgrote meerderheid van de gevallen is ATP de donor van de fosfaatgroep. Een overzicht van het mechanisme wordt weergegeven in figuur 5. Er wordt geschat dat minstens een derde van alle cellulaire eiwitten gefosforyleerd zijn, waarbij het niveau van fosforylatie kan variëren van minder dan 1% tot meer dan 90% [14]. In tegenstelling tot de enzymen die de O-glycosylatie regelen (OGT en O-GlcNAcase) codeert het menselijk genoom voor meer dan 500 kinasen en 150 fosfatasen [15].
7
Figuur 5: Fosforylatie. Fosforylatie grijpt plaats op de hydroxylgroep van serine, threonine of tyrosine. Het donorsubstraat is adenosinetrifosfaat (ATP) en transfer gebeurt door een kinase. Afsplitsing van de fosfaatgroep gebeurt door een fosfatase. Aangepaste figuur uit [16].
1.2.3 Reciproke interactie tussen O-glycosylatie en fosforylatie O-GlcNAcylatie is verwant aan fosforylatie: ze grijpen beide plaats op serines of threonines en hebben een snelle cyclus afhankelijk van de cellulaire activiteit. Beide PTM's vertonen een complexe interactie met elkaar [10]. Ze kunnen ofwel een competitieve interactie aangaan op eenzelfde site of op nabijgelegen sites, ofwel een niet-competitieve interactie op verschillende plaatsen in het substraat. Een substraat kan dus op verschillende plaatsen geglycosyleerd en gefosforyleerd zijn. Door de combinatie van verschillende PTM's bestaat er dus een grote variabiliteit in de verschillende vormen van een bepaald eiwit. Fosforylatie reguleert de enzymen die verantwoordelijk zijn voor de O-GlcNAc cyclus, en omgekeerd reguleert OGlcNAcylatie ook de enzymen betrokken bij de fosfaatcyclus. Beide modificaties reguleren elkaar dus op een reciproke manier. Hierbij worden grote functionele complexen gevormd bestaande uit OGT, O-GlcNAcase, kinasen en fosfatasen. Deze complexen kunnen op een snelle manier een doelsubstraat modificeren op een gestructureerde manier: bvb. eerst defosforylatie van het substraat voor er O-GlcNAcylatie kan optreden. De continue wisselwerking tussen fosforylatie en O-GlcNAcylatie bleek essentieel voor de controle van vitale cellulaire processen [10].
1.3 Ziekte van Alzheimer De ziekte van Alzheimer (AD) [17,18,19] is een trage, progressieve neurodegeneratieve aandoening. Het is een veel voorkomende ziekte waarbij de prevalentie stijgt met de leeftijd en door de steeds stijgende levensverwachting dus een groot gezondheidsprobleem vormt. AD is de meest voorkomende vorm van dementie en wordt gekarakteriseerd door inprentingstoornissen, confabulatie, desoriëntatie en decorumverlies. De ziekte start meestal met een subtiel en moeilijk herkenbaar geheugenverlies. Patiënten sterven vaak door 8
verwaarlozing, een slechte voeding of longontsteking en dit meestal 8 tot 10 jaar na het ontstaan van de symptomen. 25% van de gevallen zijn familiaal, waarbij slechts 2% een vroege aanvang vertonen (symptomen voor de leeftijd van 65 jaar). Overerving gebeurt op een autosomaal dominante manier. Een vroege ontwikkeling van AD wordt veroorzaakt door mutaties in het amyloid precursorproteïne gen (APP), preseniline 1 gen of preseniline 2 gen. Deze drie genen spelen een directe rol in het amyloid-bèta (Aβ) metabolisme. De sporadische vorm van AD treft wereldwijd meer dan 20 miljoen mensen. De oorzaak van de sporadische vorm is nog steeds ongekend. Dit omdat het een heterogene aandoening is waarbij de interactie van zowel genetische factoren en omgevingsfactoren een belangrijke rol spelen. De belangrijkste risicofactor is de oudere leeftijd. Daarnaast spelen ook een lage educatie, verminderde mentale capaciteit, hoofdtrauma en vasculaire aandoeningen een belangrijke rol. De voornaamste kenmerken van AD zijn de extracellulaire vorming van amyloide plaques, die vooral bestaan uit het amyloid-β-peptide en de intracellulaire vorming van neurofibrillaire tangels, bestaande uit hypergefosforyleerd tau-eiwit (figuur 6A). In het beginstadium wordt vooral de entorhinale cortex aangetast. Naarmate de ziekte vordert, zal er degeneratie van de hippocampus en de cortex optreden en zullen de ventrikels groter worden (figuur 6B).
Figuur 6: Kenmerken van de ziekte van Alzheimer (AD). (A) De extracellulaire amyloide plaques bestaan uit een neerslag van het Aβ-peptide, de intracellulaire tangels zijn samengesteld uit hypergefosforyleerd tau-eiwit. Aangepaste figuur uit [17]. (B) Vergelijking tussen gezonde hersenen en hersenen bij een patiënt met AD. In een vergevorderd stadium treedt er degeneratie op van de cerebrale cortex en de hippocampus waarbij ook de ventrikels groter worden door het verlies van neuronen. Aangepaste figuur uit [19].
De centrale hypothese voor de oorzaak van AD is de amyloidcascade hypothese [17,19]. Een verstoring van het evenwicht tussen productie en verwijdering van Aβ zou de oorzaak kunnen zijn en leiden tot neurodegeneratie en dementie. Het APP is een transmembranair eiwit dat in
9
normale omstandigheden verknipt wordt door secretasen. Verknipping door het α- en γsecretase, waar preseniline 1 en 2 een onderdeel van uitmaken, is een veilige verknipping omdat het α-secretase in het Aβ-peptide knipt. Verknipping door het β- en γ-secretase geeft aanleiding tot ofwel een peptide van 40 aminozuren, ofwel het toxische peptide van 42 aminozuren. Bij AD is het evenwicht verstoord met een verhoogde productie van het toxische Aβ-peptide. Dit peptide ondergaat een conformationele verandering waardoor het vatbaar is voor aggregatie en grote onoplosbare plaques zal vormen (figuur 7).
Figuur 7: Verknipping van het APP door secretasen. Het amyloid precursorproteïne (APP) is een transmembranair eiwit dat op twee manieren kan verknipt worden. Verknipping door het α- en γ-secretase is een veilige verknipping, tegenover de verknipping door het β- en γ-secretase die aanleiding geeft tot het toxische amyloid-bèta peptide. Dit peptide is vatbaar voor aggregatie en zal aanleiding geven tot plaquevorming. AICD: APP intracellulair domein. Aangepaste figuur uit [19].
De amyloide plaques zorgen voor de aantrekking van microglia en geven aanleiding tot een inflammatoire respons met de vrijstelling van neurotoxische cytokines. Eveneens zorgen ze voor de vrijstelling van glutamaat uit gliale cellen waardoor er schade optreedt ten gevolge van excitotoxiciteit. Verstoring van het axonaal en dendritisch transport, synaptische dysfunctie, vrijstelling van vrije radicalen en oxidatieve stress als gevolg van mitochondriale dysfunctie dragen verder bij tot neurodegeneratie [19]. Tau is een mictrotubuligeassocieerd eiwit dat in normale omstandigheden zorgt voor de stabiliteit van microtubuli [17,19]. Hyperfosforylatie van tau zorgt ervoor dat tau niet meer kan binden op microtubuli waardoor ze hun stabiliteit verliezen en uit elkaar vallen. Dit leidt tot de verstoring van het axonaal transport, neuronale en synaptische dysfunctie. Hypergefosforyleerd tau is vatbaar voor aggregatie en zal aanleiding geven tot de vorming van fibrillen. Of tau hyperfosforylatie en fibrilvorming een oorzaak of gevolg zijn van de ziekte is nog steeds ongekend. 10
De hedendaagse behandelingen zijn vooral symptomatisch en hebben slechts een klein effect op het verbeteren van het ziektebeeld. Acetylcholinesterase inhibitoren zijn zo'n symptomatische behandeling [17,19]. Bij AD zijn vooral de cholinerge neuronen aangetast en inhibitie van het acetylcholinesterase zorgt ervoor dat het acetylcholine niet wordt afgebroken en er een langer effect in de synaptische spleet mogelijk is. Verder onderzoek is echter noodzakelijk om een therapie te vinden die de ziekte van Alzheimer tegengaat.
1.4 Verband tussen O-glycosylatie en de ziekte van Alzheimer De menselijke hersenen metaboliseren ongeveer 50% van de totale hoeveelheid glucose aanwezig in het lichaam. De reden voor het verbruik van deze grote hoeveelheid glucose is de beperkte capaciteit van de hersenen om energie op te slaan en om andere energiebronnen te gebruiken. Een continue aanvoer van glucose is essentieel om de normale hersenfuncties te onderhouden. Met een toenemende leeftijd daalt het glucosemetabolisme en deze daling is zelfs versneld bij de ziekte van Alzheimer. Een daling in het glucosemetabolisme is reeds aanwezig voor het ontstaan van de klinische symptomen wat suggereert dat een verstoring van het glucosemetabolisme eerder een oorzaak is dan een gevolg van de ziekte van Alzheimer [20,21]. Het onderliggend mechanisme is echter nog niet gekend, maar een gedaalde cerebrale bloeddoorstroming,
deficiënte
insulinesignalering,
deficiënte
glucosetransporters
en
oxidatieve stress zouden een belangrijke rol kunnen spelen [22]. Zoals eerder aangegeven is de O-GlcNAcylatiegraad afhankelijk van de hoeveelheid beschikbare glucose in de cellen. Een daling van het glucosemetabolisme leidt tot een daling van de O-glycosylatiegraad en door de reciproke interactie tussen O-glycosylatie en fosforylatie leidt dit tot een abnormale hyperfosforylatie van eiwitten [20]. Verschillende onderzoeken hebben reeds aangetoond dat er een verband bestaat tussen een verstoorde O-glycosylatie en eiwitten die betrokken zijn bij de ziekte van Alzheimer [23,24,25,26,27]. Bijna alle eiwitten betrokken bij AD hebben O-GlcNAc-modificaties, inclusief tau, neurofilamenten, amyloid precursorproteïne, microtubuli regulatorische eiwitten en synaptosomale eiwitten [12]. Een daling in O-glycosylatie zorgt ondermeer voor hyperfosforylatie van tau [23,24]. Het verband wordt geïllustreerd in figuur 8. Hetzelfde geldt voor het neurofilament-M eiwit. Fosforylatie speelt een belangrijke rol in het reguleren van de translocatie, filament vorming en functie van het neurofilament M, terwijl hyperfosforylatie echter bijdraagt tot neurodegeneratie [25]. Het verlies van geglycosyleerd assembly protein 3 (AP-3) wordt in verband gebracht met een gedaalde modificatie van het eiwit met O-GlcNAc. Dit zou een 11
vroege gebeurtenis zijn in de pathologische cascade van het synaptisch verlies in AD [26]. De activiteit van inositol 1,4,5-trisfosfaat receptor type I (InsP3R-I) wordt deels gereguleerd door de O-GlcNAc-modificatiegraad. InsP3R-I is een belangrijk kanaal voor de regulatie van de intracellulaire Ca2+ concentratie waarbij een daling van de O-GlcNAc-modificatiegraad zorgt voor een stijging in de kanaalactiviteit. Verstoring van de InsP3R-I leidt tot verstoring van de regulatie van neuronale functies zoals lange termijn potentiatie en depressie [27].
Figuur 8: Voorgesteld mechanisme waarbij gedaald glucosemetabolisme in de hersenen bijdraagt tot de vorming van neurofibrillaire tangels in AD. Een daling in het glucosemetabolisme door een deficiënte GLUT1/3 transporter leidt tot een daling van de productie van UDP-GlcNAc. Dit resulteert in een daling van tau O-GlcNAcylatie. Door de reciproke interactie tussen O-GlcNAcylatie en fosforylatie leidt dit tot een abnormale hyperfosforylatie van tau, met vorming van neurofibrillaire tangels (NFT) en neurodegeneratie tot gevolg. HBP: hexosaminebiosynthese pathway, TCA: tricarbonzuurcyclus, PP2A: eiwitfosfatase 2A, GFAT: glutamine:fructose-6-fosfaat amidotransferase, OGT: O-GlcNAc transferase [20].
Stimulatie van O-GlcNAcylatie zou dus een mogelijke therapie kunnen zijn voor de ziekte van Alzheimer. Onderzoek heeft reeds aangetoond dat het herstellen van de OGlcNAcylatiegraad van het APP aanleiding geeft tot een daling van de vorming van het toxische Aβ-peptide [28]. Verder zou ook de inhibitie van het O-GlcNAcase door Thiamet-G hyperfosforylatie van tau tegengaan, wat de vorming van neurofibrillaire tangels vermindert [29].
12
1.5 Methoden om O-glycosylatie te bestuderen De eerste methode die gebruikt werd voor de detectie en karakterisering van O-GlcNAc was de in vitro enzymatische markering van O-GlcNAc met UDP[3H]Galactose door het galactosyltransferase [30,31]. Deze methode heeft aangetoond dat eiwitten gemodificeerd kunnen zijn met een enkel O-gelinkte N-acetylglucosamine residu. Hierbij wordt Peptide:NGlycosidase F (PNGase F) gebruikt voor de specifieke afsplitsing van N-gebonden oligosacchariden die niet specifiek gemerkt zijn met UDP[3H]Galactose. De O-binding van GlcNAc aan het eiwit is resistent voor PNGase F, waardoor enkel de O-gebonden suikergroepen gedetecteerd worden met SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). O-GlcNAc is tevens een zeer dynamische posttranslationele modificatie waardoor de suikergroep al kan afgesplitst zijn voor hij kan gedetecteerd worden. Hiervoor is het belangrijk om het endogene O-GlcNAcase te inhiberen met PUGNAc (O(2-acetamido-2deoxy-D-glucopyranosylideen)amino-N-fenylcarbamaat). De ontwikkeling van O-GlcNAc-antilichamen zoals CTD 110.6, zorgde voor een efficiëntere identificatie van O-GlcNAc-gemodificeerde eiwitten [30]. Het CTD 110.6 antilichaam is opgewekt tegen een O-GlcNAc-gemodificeerd peptide van de grote subeenheid van het RNA polymerase II carboxyterminaal domein. Dit antilichaam heeft de breedste immunoreactiviteit tegen O-GlcNAc-modificaties. Plaatsspecifieke antilichamen kunnen eveneens opgewekt worden. Hiermee kan onder andere de reciproke interactie worden nagegaan tussen glycosylatie en fosforylatie van een bepaald aminozuur met respectievelijk plaatsspecifieke O-GlcNAc-antilichamen en fosfoserine, fosfothreonine of fosfotyrosine antilichamen. Kwalitatieve detectie kan gebeuren aan de hand van Western blot of met een immunofluorescentiemicroscoop. Voor een snelle semikwantitatieve benadering wordt gebruik gemaakt van flow cytometrie [32]. Een andere methode voor het verrijken en identificeren van O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden, maakt gebruik van zwakke lectine affiniteitchromatografie (LWAC, Lectine Weak Affinity Chromatography) gevolgd door massaspectrometrie [30,33]. Wheat germ agglutinine (WGA) is een lectine met bindingsspecificiteit voor GlcNAc. WGA heeft hoge affiniteit interacties met complexe koolhydraten door de simultane binding van meerdere suikermoleculen. De enkele N-acetylglucosamine molecule heeft een lagere affiniteit voor WGA waardoor de techniek omgedoopt werd tot LWAC. Het principe voor verrijking is dat O-GlcNAc-gemodificeerde
peptiden
trager
door
een
WGA
kolom
elueren
dan
ongemodificeerde peptiden en sneller dan peptiden met complexere suikerketens. Door deze
13
specifieke fracties op te vangen, kunnen de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden geïsoleerd worden en nadien geïdentificeerd worden met massaspectrometrie. Identificatie van de O-GlcNAc-modificatieplaatsen is mogelijk door een methode die gebaseerd is op een milde β-eliminatie gevolgd door een Michaël-additie met dithiothreitol (BEMAD) [30,34,35]. Door de β-eliminatie wordt de O-GlcNAc-groep afgesplitst en via een Michaël-additie wordt dithiothreitol (DTT) op het gedeglycosyleerde residu geplaatst (figuur 9). Dit resulteert in een gemodificeerd aminozuur met een uniek moleculair gewicht. Gemodificeerde peptiden kunnen verrijkt worden door affiniteitchromatografie en de plaatsen kunnen bepaald worden door tandem massaspectrometrie. Elke modificatie van een serine of threonine die gevoelig is voor β-eliminatie, kan getroffen worden door deze methode, alsook gealkyleerde
cysteïnes
en
methionines.
O-GlcNAc
is
echter
gevoeliger
voor
alkaligeïnduceerde β-eliminatie dan O-fosfaat. Defosforylatie verhoogt verder de specificiteit van de reactie. De BEMAD methode kan dus aangepast worden om O-GlcNAc-peptiden en fosfopeptiden te identificeren.
Figuur 9: β-eliminatie van O-GlcNAc gevolgd door Michaël-additie met DTT. Door de β-eliminatie wordt de O-GlcNAc-groep afgesplitst en via een Michaël-additie wordt dithiothreitol (DTT) op het gedeglycosyleerde residu geplaatst. Aangepaste figuur uit [34].
Eiwitten bekomen uit een cellysaat kunnen ook specifiek gemerkt worden met een ketonbiotine tag [36]. Hierbij wordt gebruik gemaakt van het β-1,4-galactosyltransferase dat de specifieke transfer katalyseert van een ketonbevattend galactose-analoog naar de C4 hydroxylgroep van GlcNAc. Eens de transfer voltooid is, gaat het keton reageren met een aminooxybiotine nucleofiel. Nadien worden de eiwitten gedigereerd en worden de glycopeptiden verrijkt door gebruik te maken van avidine affiniteitchromatografie. 14
Massaspectrometrische analyse van de verrijkte glycopeptiden laat toe om de geglycosyleerde eiwitten te identificeren en om de modificatie te koppelen aan een specifiek functioneel domein binnen het eiwit. Deze methode kan ook gekoppeld worden aan β-eliminatie om zo de specifieke plaatsen van modificatie te bepalen [36]. Een laatste methode, tevens de methode die in dit onderzoek gebruikt wordt, is gebaseerd op de COFRADIC technologie (zie 1.1) [2,6]. Om de peptiden met een O-GlcNAc-modificatie te selecteren wordt een β-eliminatie uitgevoerd tussen de primaire en secundaire RP-HPLC scheidingen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van het zeer basische butylamine. Door het basische milieu wordt de glucosegroep afgesplitst (β-eliminatie) en via een Michaël-additie wordt butylamine op het gedeglycosyleerde residu geplaatst. Deze modificatie resulteert in een hydrofobe verschuiving van de peptiden die oorspronkelijk een O-GlcNAc-modificatie bevatten waardoor ze later zullen elueren tijdens de secundaire RP-HPLC scheidingen. Na de secundaire scheiding worden de peptiden op de massaspectrometer geladen voor identificatie.
15
2. Materialen en methoden 2.1 Optimalisatie van de reacties 2.1.1 Defosforylatie Defosforylatie met het alkalisch fosfatase De optimalisatie van de werking van het alkalisch fosfatase werd uitgevoerd met de synthetische
fosfopeptiden
P1697
(ADLT
AHQGVEANR)
en
P1698
(ADLSAHQGVEANR) die gesynthetiseerd werden in het labo en die N-terminaal een fluorescente groep (rhodamine) dragen. In het finale protocol wordt de defosforylatie uitgevoerd na digest, daarom werd 1 nmol van beide fosfopeptiden toegevoegd aan 200 µg van een trypsine digest van het proteoom van SH-SY5Y cellen (ATCC, Teddington, UK) en gedefosforyleerd met 0,48 units alkalisch fosfatase (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland). Daarnaast werd 1 nmol van beide fosfopeptiden aangelengd met 100 µl 50 mM Tris.HCl pH 8,7 (digestiebuffer) en gedefosforyleerd met 0,48 units alkalisch fosfatase (positieve controle). Als negatieve controle werd 1 nmol van beide fosfopeptiden opgelost in 100 µl digestiebuffer zonder toevoeging van het alkalisch fosfatase. De reactie vond plaats gedurende twee uur in een thermomixer bij 37°C. Na de reactie werd het mengsel aangezuurd tot een 1% finale TFA concentratie (trifluoroazijnzuur, Sigma-Aldrich). Vervolgens werden de stalen op de RPHPLC kolom met 2,1 mm interne diameter x 150 mm lengte 300SB-C18 (Zorbax, Agilent, Waldbronn, Duitsland) gebracht. Deze kolom is gekoppeld aan een Agilent 1100 Series HPLC systeem. Eerst werd solvent A (0,1% TFA) doorheen de kolom gepompt. Nadien werd een gradiëntelutie bekomen door de polariteit van de mobiele fase te laten dalen naarmate de scheiding vorderde. Dit gebeurde met het organische solvent B (100% acetonitrile (Biosolve, Valkenswaard, Nederland) met 0,1% TFA). Het signaal werd gemeten door absorbantie bij de golflengtes van 214 en 550 nm. Invloed van de buffers op defosforylatie met het alkalisch fosfatase In dit experiment werd nagegaan wat de meest optimale buffer voor de werking van het alkalisch fosfatase is. Drie buffers met een verschillende pH werden hiervoor gebruikt, nl. 100 mM Na2HPO4 pH 9,2, 100 mM Tris.HCl pH 11 en 100 mM boraat-NaOH met een pH van 12,2. In elke opstelling werd 1 nmol van beide fosfopeptiden P1697 en P1698 gebruikt, opgelost in 95 µl van de buffer en 0,48 units van het alkalisch fosfatase. Als negatieve controle werd 1 nmol van beide fosfopeptiden opgelost in 105 µl 0,1% TFA. De stalen werden een uur in een thermomixer geplaatst bij 37°C waarna ze werden aangezuurd tot een 1% finale TFA concentratie voor analyse via RP-HPLC. 16
Defosforylatie van fosfopeptiden met het faag λ-fosfatase Voor de defosforylatie met het faag λ-fosfatase, werd gebruik gemaakt van de 10x λfosfatase buffer, bestaande uit 500 mM Tris.HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA (dinatrium ethyleendiaminetetra-azijnzuur, Sigma-Aldrich) en 50 mM dithiotreitol (Fluka BioChemika, Buchs, Zwitserland), en de 10x MnCl2 oplossing, bestaande uit 20 mM MnCl2 (SigmaAldrich). De reactie bestond uit 40 µl van beide buffers, aangelengd met 320 µl milli-Q water, 4 nmol van beide fosfopeptiden P1697 en P1698 en 400 units van het faag λ-fosfatase (Sigma-Aldrich). Het staal werd in een thermomixer geplaatst bij 30°C en na 30, 60, 90 en 120 min werd telkens 100 µl overgebracht in een buisje voor RP-HPLC analyse. Als negatieve controle werd 1 nmol van beide fosfopeptiden opgelost in 105 µl 0,1% TFA. Alle stalen werden nadien aangezuurd tot een 1% finale TFA concentratie en via RP-HPLC geanalyseerd. Defosforylatie van een proteoomdigest met het faag λ-fosfatase Aan 400 µg van een trypsine digest van een proteoom van SH-SY5Y cellen, werd 1 nmol van beide fosfopeptiden P1697 en P1698, 200 units van het faag λ-fosfatase, de λ-fosfatase buffer en de MnCl2 oplossing toegevoegd. Het controlestaal bestond uit 400 µg digest en 1 nmol van beide fosfopeptiden. Het effect van de buffers werd eveneens nagegaan. Een derde staal bestond uit 1 nmol van beide fosfopeptiden, 200 units van het faag λ-fosfatase, de λ-fosfatase buffer en de MnCl2 oplossing. Dit staal werd aangelengd tot 100 µl met 25 mM Tris.HCl pH 7,6. Staal vier heeft dezelfde samenstelling als staal drie, maar nu werd het staal aangelengd tot 100 µl met 50 mM TEAB (triethylammonium bicarbonaat buffer, Sigma-Aldrich) in plaats van 25 mM Tris.HCl pH 7,6. Als controle werd 1 nmol van beide fosfopeptiden opgelost in 0,1% TFA. Alle stalen werden een uur in een thermomixer geplaatst bij 30°C. Nadien werden de stalen aangezuurd tot een 1% finale TFA concentratie en via RP-HPLC geanalyseerd. 2.1.2 β-eliminatie Efficiëntie van de β-eliminatie Om de β-eliminatie te optimaliseren werd het glycopeptide TAPTSTIAPG (Invitrogen, Paisley, UK) gebruikt. Als negatieve controle werd 1 nmol van het peptide opgelost in 100 µl milli-Q water. Voor de reactie werd 1 nmol van het peptide opgelost in 5% butylamine (Sigma-Aldrich). De stalen werden twee uur bij 50°C in een thermomixer geplaatst, waarna ze werden gedroogd in een vacuüm centrifugator. Extra zuivering voor de 17
MALDI kristallisatie gebeurde met een ZipTip C18 (Agilent). Als wasvloeistof werd 0,1% TFA gebruikt en als equilibratie- en elutievloeistof werd gebruik gemaakt van 0,1% TFA met 50% acetonitrile. Nadien werd het reactiemengsel geanalyseerd via MALDI-MS. Effect β-eliminatie met RP-HPLC De uitgevoerde reactie is identiek aan deze hierboven beschreven, maar na het drogen van de stalen werden ze heropgelost in 105 µl 0,1% TFA. De stalen werden vervolgens op de RPHPLC kolom gebracht voor analyse.
2.2 Optimalisatie van de condities voor de inductie van AD in SH-SY5Y cellen 2.2.1 Celcultuur In dit onderzoek werden SH-SY5Y neuroblastoma cellen gebruikt als cellulair modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer. De SH-SY5Y cellen werden gekweekt in DMEM (Dulbecco's Modified Essential Medium, Invitrogen), gesupplementeerd met foetaal kalfserum (Invitrogen) (10% finale concentratie) en penicilline/streptomycine (Invitrogen) (50 units/ml). Incubatie van de cellen gebeurde bij 37°C en 5% CO2. Voor het splitsen van de cellen werden de cellen eerst gewassen met DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Invitrogen) en nadien losgemaakt met 5 ml trypsine (Invitrogen). 20 ml vers medium werd toegevoegd om het trypsine te neutraliseren en vervolgens konden de cellen uitgesplitst worden volgens de gewenste verhouding.
2.2.2 Behandeling SH-SY5Y cellen Om de inductie van O-GlcNAcylatie in SH-SY5Y cellen te optimaliseren en te onderzoeken, werden deze cellen behandeld met verschillende concentraties en combinaties van PUGNAc (Sigma-Aldrich), glucosamine (Sigma-Aldrich), alloxaan (Sigma-Aldrich), Aβ1-42 en Aβ25-35 (beide in het labo gesynthetiseerd), en dit voor verschillende incubatietijden. Deze producten werden opgelost in DPBS, SILAC DMEM (Invitrogen) of 0,1% DMSO (dimethylsulfoxide, Sigma-Aldrich) (zie tabel 1) en steriel gemaakt door passage in een filter met een poriediameter van 0,22 µm (Millex-GV, Millipore, Carrigtwohill, Ierland). Een overzicht van de verschillende combinaties wordt weergegeven in tabel 1.
18
Tabel 1: Behandeling SH-SY5Y cellen. Behandeling van de cellen met verschillende concentraties en combinaties van PUGNAc, glucosamine, alloxaan, Aβ1-42 en Aβ25-35 voor verschillende incubatietijden. Experiment 1 Behandeling
opgelost in
tijd
1. Controle 1
/
24h
2. Controle 2
/
48h 48h
3. 200 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine
DPBS/DPBS
4. 50 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine
DPBS/DPBS
48h
5. 5 mM alloxaan
DPBS
48h
6. 1 mM alloxaan
DPBS
48h
7. 0,2 mM alloxaan
DPBS
48h
8. 50 µM Aβ1-42
SILAC DMEM
24h
9. 5 µM Aβ1-42
SILAC DMEM
24h
10. 0,5 µM Aβ1-42
SILAC DMEM
24h
0,1% DMSO
48h
DPBS
48h
3. 25 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine
DPBS/DPBS
24h
4. 25 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine
DPBS/DPBS
48h
5. 25 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine
DPBS/DPBS
120h
6. 50 µM Aβ25-35
0,1% DMSO
48h
0,1% DMSO/DPBS/DPBS
48h
0,1% DMSO/DPBS
48h
/
72h
DPBS/DPBS
72h
DPBS
72h
0,1% DMSO
72h
0,1% DMSO/DPBS/DPBS
72h
0,1% DMSO
72h
0,1% DMSO/DPBS/DPBS
72h
0,1% DMSO
72h
Experiment 2 1. Controle 2. 5 mM alloxaan
7. 50 µM Aβ25-35 + 25 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine 8. 50 µM Aβ25-35 + 5 mM alloxaan Experiment 3 1. Controle 2. 50 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine 3. 5 mM alloxaan 4. 50 µM Aβ1-42 5. 50 µM Aβ1-42 + 50 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine 6. 50 µM Aβ25-35 7. 50 µM Aβ25-35 + 50 µM PUGNAc + 7,5 mM glucosamine 8. Controle
2.2.3 Cellyse Na de behandeling werden de cellen gelyseerd. De lysisbuffer was samengesteld uit 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 5 µM PUGNAc, 150 mM NaCl (Merck-Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Duitsland), 50 mM Tris.HCl (pH 8,7), 0,5 mM EDTA (Sigma-Aldrich) en een halve protease inhibitor tablet (Roche, Basel, Zwitserland). De cellen werden eerst gewassen met DPBS (met CaCl2 en MgCl2) en nadien werd 500 µl van de lysisbuffer toegevoegd aan 2 tot 3x106 cellen. Het lysaat werd overgebracht in een Eppendorf tube en gecentrifugeerd aan 16x103 rcf (relative centrifugal force) voor 15 min bij 4°C om het cellulair debris te verwijderen. 19
2.2.4 Bepaling van de eiwitconcentratie Voor de bepaling van de eiwitconcentratie werd het Bradford reagens (BioRad Laboratories, München, Duitsland) gebruikt. Praktisch werd er 5 µl van het eiwitstaal samen met 1,5 ml van een 1x Bradford reagens oplossing in een cuvetje gebracht, waarna de absorbantie gemeten werd bij 595 nm met een spectrofotometer (Jasco V550, Tokyo, Japan). Als referentie werd 5 µl lysisbuffer in plaats van het eiwitstaal gebruikt. Aan de hand van deze absorbantiewaarde kon de eiwitconcentratie bepaald worden met de volgende formule: concentratie (µg/ml) = absorbantie x 20,36 x verdunning. 2.2.5 Gelelektroforese 70 µl van het staal werd gemengd met 25 µl ladingsbuffer (4x XT Sample Buffer, BioRad) en 5 µl XT reducing agent (20x, BioRad). Als moleculaire gewichtsmerker werd Precision Plus Protein All Blue (BioRad) gebruikt. Van elke opstelling werd er 20 µg eiwit op het gel (12% bis-tris, BioRad) geladen. Als buffer werd gebruik gemaakt van de Tris/Tricine/SDS buffer (XT-MOPS, BioRad). Gelelektroforese gebeurde aan 120V gedurende 90 min. 2.2.6 Kleuring gel Het gel werd overnacht gekleurd met Coomassie blauw (Simply Blue Safestain, Invitrogen) en nadien gewassen met milli-Q water. 2.2.7 Western blot De eiwitten werden getransfereerd naar een PVDF membraan en dit gebeurde overnacht aan een laag voltage (15 V). De blotbuffer was samengesteld uit 50 mM Tris en 50 mM boorzuur. De volgende morgen werd het membraan gewassen met 40 ml TBS (Tris buffered saline) met 0,05% Tween-20. Blokkering van de vrije plaatsen gebeurde met een blokbuffer: hiervoor werd het membraan ondergedompeld in 25 ml TBS en 25 ml Odyssey blokbuffer (LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska VSA). De incubatie duurde 60 min en nadien werd het primair antilichaam in een 1/1000 (v/v) verhouding toegevoegd (O-GlcNAc monoclonaal antilichaam CTD 110.6, Covance, Princeton, VSA) en terug 60 min geïncubeerd bij 25°C. Vervolgens werd het membraan 3x 10 min gewassen met 40 ml TBS. Na de wasstappen werd het membraan opnieuw ondergedompeld in 25 ml TBS en 25 ml blokbuffer en werd het secundair antilichaam in een 1/5000 (v/v) verhouding toegevoegd (geit-anti-muis, LI-COR Biosciences). Het membraan werd opnieuw voor 60 min geïncubeerd, en nadien nog 3x 10 min gewassen met TBS. De blot werd nadien gevisualiseerd met het Odyssey Infrared Imaging System. 20
2.3 Identificatie van peptiden met hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie met COFRADIC 2.3.1 SILAC markering Om een onderscheid te kunnen maken tussen de eiwitten bekomen uit de verschillende behandelingen werd gebruik gemaakt van SILAC [7]. Hierbij werden de cellen gekweekt in een medium dat gedepleteerd is voor lysine en nadien gesupplementeerd werd met de 12C6- of 13
C6-isotopische vorm. In praktijk was het zware medium samengesteld uit SILAC medium,
gedialyseerd foetaal kalfserum (10% finale concentratie) (Invitrogen), 50 units/ml penicilline/streptomycine en 146 µg/ml
13
C6-lysine (Cambridge Isotope Laboratories,
Andover, VSA). Het lichte medium heeft dezelfde samenstelling, maar er werd 146 µg/ml 12
C6-lysine (Cambridge Isotope Laboratories) toegevoegd i.p.v. 13C6-lysine.
De SH-SY5Y cellen werden zeven dagen gekweekt in SILAC medium, waarbij de behandeling gestart werd op de vierde dag. De cellen werden gekweekt in zes grote Falconflessen, waarvan drie met licht medium (L1, L2 en L3) en drie met zwaar medium (H1, H2 en H3). L1, L2 en H3 werden behandeld met 50 µM PUGNAc en 7,5 mM glucosamine. H1, H2 en L3 werden daarentegen behandeld met 5 mM alloxaan.
2.3.2 Voorbereidende stappen voor de COFRADIC analyse Cellyse Na de isotopische markering en behandeling werden de cellen gelyseerd. Hiervoor werden ze eerst gewassen met DPBS en nadien werd 12 ml celdissociatiebuffer (Invitrogen) toegevoegd. De losgemaakte cellen werden 5 min gecentrifugeerd aan 1250 rcf bij 19°C. De celpellet werd vervolgens gelyseerd met 500 µl lysisbuffer, bestaande uit 0,8% CHAPS (gewicht/gewicht) (Sigma-Aldrich), 5 µM PUGNAc, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris.HCl (pH 8,7) en een halve protease inhibitor tablet. Lyse gebeurde gedurende 10 min op ijs waarna het cellysaat 15 min werd gecentrifugeerd aan 16000 rcf bij 4°C. Het supernatans werd behouden.
Mengen van de cellysaten Het meten van de eiwitconcentratie is cruciaal voor het correct mengen van gelijke hoeveelheden van de cellysaten. Hiervoor werd het Bradford reagens gebruikt (zie 2.2.4). De licht en zwaar gemarkeerde stalen werden vervolgens in een 1/1 gewichtsverhouding samengevoegd (L1+H1, L2+H2, L3+H3). Van elk staal werd 1 mg genomen en dit werd aangelengd met 100 mM Tris.HCl (pH 8,7) tot 1 ml. Gelelektroforese van de afzonderlijke stalen werd eveneens uitgevoerd, gevolgd door een Western blot (zie 2.2.5 en 2.2.7).
21
Cysteïne alkylatie Een alkylatiestap werd ingevoerd om de vorming van disulfidebruggen te voorkomen. Hiervoor werd 5 mM TCEP (triscarboxyethylfosfine, Pierce, Rockford, VSA) en 10 mM joodacetamide (Sigma-Aldrich) gebruikt. De reactie werd uitgevoerd gedurende 20 min bij 37°C in een thermomixer, afgedekt met aluminiumfolie. Nadien werd het overtollige reagens verwijderd door middel van een ontzoutingstap op een NAP-10 kolom (Amersham Biosciences, Uppsala, Zweden). Hierbij werd 1 ml van het staal op de kolom gebracht, elutie gebeurde in 1,5 ml 50 mM TEAB (pH 8,4). De concentratie werd vervolgens nogmaals gemeten met het Bradford reagens.
Digest De stalen werden 10 min verwarmd bij 95°C en vervolgens gedurende 5 min op ijs geplaatst om de eiwitten te denatureren. Afhankelijk van de gemeten eiwitconcentratie werd endoproteïnase LysC (Roche) in een 1/200 enzym/substraat (gewicht/gewicht) verhouding toegevoegd en overnacht in een thermomixer bij 37°C geplaatst.
Defosforylatie De stalen werden 10 min verwarmd bij 95°C en nadien 5 min op ijs geplaatst. Voor de defosforylatie werd aan het digest 200 units faag λ-fosfatase, de MnCl2 oplossing en de λfosfatase buffer toegevoegd (samenstelling zie 2.1.1). Als positieve controle werd een 100 µl oplossing gemaakt met 50 mM TEAB, 1 nmol van beide fosfopeptiden P1697 en P1698, 200 units faag λ-fosfatase, de MnCl2 oplossing en de λ-fosfatase buffer. De negatieve controle bestond uit 1 nmol van beide fosfopeptiden, aangelengd tot 100 µl met 0,1% TFA. Defosforylatie gebeurde gedurende 2 uur bij 30°C in een thermomixer. Alle stalen werden nadien aangezuurd met 10% TFA tot een 1% finale TFA concentratie.
2.3.3 COFRADIC analyse Om de peptiden met een O-GlcNAc-modificatie te isoleren werd de COFRADIC technologie gebruikt. Vooraleer de stalen op de RP-HPLC kolom te laden, werden de methionines geoxideerd om een spontane oxidatie en hydrofiele verschuiving tijdens de secundaire scheidingen te voorkomen. Dit gebeurde in 0,5% H2O2 (Sigma-Aldrich). De reactie werd 30 min uitgevoerd bij 30°C in een thermomixer en na de reactie werden de peptiden onmiddellijk op de RP-HPLC kolom geladen.
22
Primaire scheiding Voor de eerste scheiding werd het equivalent van 300 µg gedigereerd eiwitmateriaal op de RP-HPLC kolom gebracht. Gradiëntelutie werd bekomen door de polariteit van de mobiele fase te laten dalen naarmate de scheiding vorderde. Dit gebeurde volgens het schema weergegeven in tabel 2. Als solvent A werd 0,1% TFA gebruikt en als solvent B werd gebruik gemaakt van 100% acetonitrile met 0,1% TFA.
Tabel 2: Schema voor het bekomen van een gradiëntelutie tijdens de RP-HPLC scheiding. Tijd (min)
%B
%A
1
0
0
100
2
60
60
40
3
61
95
5
4
62
95
5
5
62,10
0
100
6
72
0
100
Alle peptiden die elueerden tussen 5 en 65 min werden opgevangen in 60 fracties van telkens 1 min (80 µl/fractie). De primaire fracties die 15 min van elkaar gescheiden waren, werden gecombineerd en gedroogd in de vacuüm centrifugator en dit resulteerde in 15 fracties. β-eliminatie en Michaël-additie De gedroogde stalen werden heropgelost in 150 µl 5% butylamine. De reactie werd 90 min uitgevoerd bij 50°C in een thermomixer. Nadien werden de stalen terug gedroogd in de vacuüm centrifugator en heropgelost in 105 µl 0,1% TFA.
Secundaire scheiding In deze scheiding werden de samengevoegde en behandelde primaire fracties (15 in totaal) terug op de RP-HPLC kolom gebracht en gescheiden onder exact dezelfde condities als tijdens de eerste scheiding. Alle peptiden die elueerden tussen 10 en 70 min werden opgevangen in 48 fracties. Aan de hand van het bekomen chromatogram en de gekende retentietijden uit de primaire scheiding, werden de fracties die de gemodificeerde peptiden bevatten, en dus een hydrofobe verschuiving ondergingen, geselecteerd. Deze fracties werden opnieuw samengevoegd, gedroogd en heropgelost in 20 µl 2% acetonitrile.
23
2.3.4 Massaspectrometrie 6 µl van de opgeloste peptiden werd op de Orbitrap massaspectrometer [37] geladen (LTQ Orbitrap XL, Thermo Electron, Bremen, Duitsland) via een Ultimate 3000 HPLC systeem (Dionex, Amsterdam, Nederland) gekoppeld aan de massaspectrometer. De peptiden werden eerst weerhouden op een trapping kolom (Reprosil-Pur basic-C18-HD 5 µm (Dr Maisch, Ammerbuch, Duitsland), 100 µm (interne diameter) x 20 mm, aangemaakt in het labo), gevolgd door forward flushing van de trapping kolom. Het trapping solvent bestond uit 98% water, 2% acetonitrile en 0,1% TFA. Het staal werd vervolgens geladen op een 75 µm (interne diameter) x 150 mm RP-kolom (Reprosil-Pur basic-C18-HD 3 µm (Dr Maisch), aangemaakt in het labo). De peptiden werden geëlueerd met een lineaire gradiënt van 1,8% solvent B' (0,05% mierenzuur in water/acetronitrile (2/8, v/v)) (Biosolve, Valkenswaard, Nederland) stijging per minuut, aan een constante flow rate van 300 nl/min. Solvent A' bestond uit water met 0,05% mierenzuur. De massaspectrometer functioneerde in een dataafhankelijke modus, met het automatisch omschakelen tussen MS en MS/MS-opnamen voor de vijf meest abundante ionenpieken per MS-spectrum. MS-spectra werden verkregen met een doelwaarde van 106 en een resolutie van 60000. De vijf meest intense ionen werden vervolgens geïsoleerd voor fragmentatie in de lineaire ionentrap met een dynamische exclusietijd van 60 s. Na het vullen van de ionentrap met een maximale ionentijd van 10 ms en een maximum van 104 ionen, werden de peptiden gefragmenteerd. Van de MS/MS-data uit elke chromatografische scheiding werden Mascot generic files gecreëerd met de Mascot Distiller software (versie 2.3.2.0, Matrix Science Ltd., Londen, Verenigd Koninkrijk). Wanneer deze pieklijsten gegenereerd werden, werd groepering van de spectra uitgevoerd met een maximale retentietijd van 30 s en een maximum van 5 spectra per groep. Groepering werd uitgevoerd met 0,005 Da tolerantie op het precursorion. Een pieklijst werd enkel gegenereerd wanneer het MS/MS-spectrum meer dan 10 pieken bevatte. Deïsotopering werd niet uitgevoerd en de relatieve signaal over ruis verhouding (S/N) limiet werd ingesteld op 2. Deze pieklijsten werden vervolgens geïdentificeerd met Mascot, gebruikmakend van de Mascot Daemon software (versie 2.3, Matrix Science Ltd.).
2.3.5 Identificatie van de fragmentatiespectra door Mascot Mascot (www.matrixscience.com) is een zoekmachine die massaspectrometrische data gebruikt voor de identificatie van peptiden. Bij de parameters werd de Swiss-Prot databank geselecteerd en als taxonomie werd humaan (Homo sapiens) ingesteld. Als variabele modificaties werden acetylatie van de N-terminus van het eiwit, butinylatie van serine en 24
threonine, carbamidomethylatie en carbamidomethyloxide van cysteïne, vorming van pyroglutamaat uit N-terminaal glutamine en
13
C6-lysine geselecteerd. Als vaste modificatie
werd de oxidatie van methionine ingesteld. Lys-C/P werd geselecteerd als protease en het maximum aan gemiste knipplaatsen werd ingesteld op 1. De peptidenlading werd ingesteld op 1+, 2+ en 3+. Als massatolerantie van de peptiden werd 10 ppm (parts per million) ingesteld en voor de gefragmenteerde peptiden 0,5 Dalton. De
13
C6 optie werd ingesteld op 1. Bij de
kwantificering werd SILAC Lys +6 ingesteld. Kwantificering van de geïdentificeerde peptiden gebeurde met de Mascot Distiller Quantification Toolbox. De bekomen data werd nadien verzameld in het ms_lims systeem (mass spectrometry based proteomics information management system) [38] voor verdere analyse.
2.4 Identificatie van de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden bij AD met COFRADIC 2.4.1 SILAC markering De SILAC markering gebeurde identiek als hierboven beschreven in 2.3.1. De SH-SY5Y cellen werden gekweekt in vier grote Falconflessen, waarvan twee met licht medium (L1 en L2) en twee met zwaar medium (H1 en H2). Behandeling van de cellen gebeurde gedurende drie dagen. L1 en H2 werden behandeld met 128,6 µM Aβ25-35. Door de slechte oplosbaarheid van het peptide in PBS, kon het peptide niet gefilterd worden. Als oplossing werd 2,5 ml penicilline/streptomycine (50 units/ml) toegevoegd aan het medium om elke vorm van contaminatie (bacterieel, fungaal) te voorkomen. L2 en H1 dienden als controle en hieraan werd niets extra toegevoegd.
2.4.2 Voorbereidende stappen voor de COFRADIC analyse Cellyse De cellen werden eerst losgemaakt met 12 ml celdissociatiebuffer, en nadien gelyseerd met 500 µl lysisbuffer zoals beschreven in 2.3.2.
Mengen van de cellysaten De eiwitconcentratie werd bepaald met het Bradford reagens (zie 2.2.4). De licht en zwaar gemarkeerde stalen werden in een 1/1 gewichtsverhouding samengevoegd (L1+H1 en L2+H2). Van elk staal werd 1,5 mg genomen en dit werd aangelengd met 100 mM Tris.HCl pH 8,7 tot 500 µl. Gelelektroforese van de afzonderlijke stalen werd eveneens uitgevoerd, gevolgd door een transfer van de eiwitten naar een PVDF membraan. De werkwijze is identiek als beschreven in 2.2.5 en 2.2.7. Er werd een tweede Western blot gemaakt met het 25
anti-caspase 3 antilichaam (1/5000 (v/v), konijn, polyclonaal, Stressgen Bioreagents corp., Victoria, Canada) als primair antilichaam om apoptose na te gaan. Als secundair antilichaam werd het geit-anti-konijn (LI-COR Biosciences) in een 1/5000 (v/v) verhouding gebruikt.
De
volgende
stappen,
nl.
alkylatie,
digest,
defosforylatie,
COFRADIC
analyse,
massaspectrometrie en identificatie van de fragmentatiespectra door Mascot werden uitgevoerd zoals beschreven in 2.3.
26
3. Resultaten 3.1 Optimalisatie van de reacties 3.1.1 Defosforylatie Naast O-GlcNAc vormt O-fosfaat ook een substraat voor de β-eliminatie die centraal staat in het sorteringmechanisme van COFRADIC. Hierdoor is het van belang dat de peptiden vooraf gedefosforyleerd worden zodat de β-eliminatie enkel plaatsgrijpt op de peptiden die een OGlcNAc-modificatie dragen en enkel deze peptiden een hydrofobe verschuiving ondergaan. Behandeling met fosfatasen biedt hier een aantrekkelijke oplossing en zodoende werd de defosforylatie geoptimaliseerd met fosfatasen. Er werden twee fosfatasen vergeleken: het alkalisch fosfatase en het faag λ-fosfatase. In een eerste experiment toonde het chromatogram met het alkalisch fosfatase geen verschil met de negatieve controle. Bij een goede werking van het fosfatase splitst de fosfaatgroep af, waardoor het peptide hydrofober wordt en later elueert dan zijn gefosforyleerde vorm. Dit was in dit experiment echter niet het geval. Vervolgens werd het effect van de buffer op de werking van het alkalisch fosfatase nagegaan. Ook hier was er geen verschil in tijdstip van elutie van de fosfopeptiden waar te nemen tussen de controle en het alkalisch fosfatase met de verschillende buffers. In een ander experiment werden de fosfopeptiden P1697 en P1698 gedefosforyleerd met het faag λ-fosfatase. De reactie werd uitgevoerd gedurende 30, 60, 90 en 120 min en nadien geanalyseerd met RP-HPLC. Voor elk van deze reacties werd een hydrofobe verschuiving van de gedefosforyleerde peptiden waargenomen ten opzichte van de controle (figuur 10). Door de slechte werking van het alkalisch fosfatase en de succesvolle defosforylatie met het faag λ-fosfatase, werd beslist om verder te gaan met het faag λ-fosfatase.
27
Figuur 10: Defosforylatie van de fosfopeptiden P1697 en P1698 met het faag λ-fosfatase. Defosforylatie van de fosfopeptiden door het faag λ-fosfatase (rood) geeft aanleiding tot een hydrofobe verschuiving waardoor de twee fosfopeptiden later elueren in vergelijking met de controle (blauw). Absorptie van de fosfopeptiden gebeurde bij 550 nm.
3.1.2 β-eliminatie Om de peptiden met een O-GlcNAc-modificatie te selecteren wordt een β-eliminatie (zie 1.5) uitgevoerd tussen de primaire en secundaire RP-HPLC scheiding. Door de modificatie zullen de peptiden die oorspronkelijk een O-GlcNAc-modificatie bevatten, op een ander tijdstip elueren dan tijdens de primaire scheiding. Deze peptiden kunnen nadien geselecteerd worden voor verdere analyse. In een eerste experiment werd de β-eliminatie van het glycopeptide TAPTSTIAPG geanalyseerd met MALDI-MS (figuur 11). De meest intense piek van het controle massaspectrum is afkomstig van het ongemodificeerde glycopeptide (1118 Da) met een natriumadduct (+23 Da -1 proton). Verder is ook het kaliumzout waar te nemen met een piek van 1156 Da (1118 Da +39 Da -1 proton). Door het beschieten van de matrix met een laser ontstaan eveneens fragmentionen die o.a. aanleiding geven tot de piek van 995 Da. Als we het massaspectrum van het controlestaal vergelijken met het massaspectrum van de β-eliminatie, is er een duidelijke verandering in massa van het glycopeptide waar te nemen. Door de β-eliminatie wordt de O-GlcNAc-groep afgesplitst (-203 Da) en wordt butylamine op het gedeglycosyleerde residu geplaatst (+55 Da). Deze massa (970 Da) komt overeen met de meest intense piek in het massaspectrum van de β-eliminatie. Bijkomend is ook het natriumadduct (992 Da) en het kaliumzout (1008 Da) zichtbaar.
28
Figuur 11: Massaspectrum β-eliminatie met 5% butylamine. Tijdens de β-eliminatie wordt de O-GlcNAcgroep afgesplitst (-203 Da) en wordt butylamine (+ 55 Da) op het gedeglycosyleerde residu geplaatst. Dit resulteert in een massaverschuiving die waarneembaar is in het massaspectrum.
In een tweede experiment werd het effect van de β-eliminatie geanalyseerd met RP-HPLC. Op het chromatogram, weergegeven in figuur 12, is een hydrofobe verschuiving van het glycopeptide waar te nemen. Dit komt overeen met het afsplitsen van de O-GlcNAc-groep en modificatie met butylamine. De kleine piek met een retentietijd van 21 min, toont aan dat meer dan 90% van het glycopeptide in het gewenste product is omgezet.
29
Figuur 12: Chromatogram β-eliminatie van het glycopeptide met 5% butylamine. Door de β-eliminatie wordt de O-GlcNAc-groep afgesplitst en via een Michaël-additie wordt butylamine op het gedeglycosyleerde residu geplaatst. Dit resulteert in een hydrofobe verschuiving van het glycopeptide.
3.2 Optimalisatie van de condities voor de inductie van AD in SH-SY5Y cellen In deze thesis was het de bedoeling om zoveel mogelijk O-GlcNAc-gemodificeerde eiwitten te identificeren en in verband te brengen met de ziekte van Alzheimer. Als cellulair modelsysteem werden SH-SY5Y neuroblastoma cellen gebruikt. Voor de optimalisatie van de condities voor de inductie van O-GlcNAcylatie en AD, werden de cellen gekweekt in verschillende concentraties en combinaties van PUGNAc, glucosamine, alloxaan, Aβ1-42 en Aβ25-35. Beoordeling van het model gebeurde aan de hand van Western blot om zo ideale condities voor de studie van O-GlcNAc aan te tonen.
In het eerste experiment werd de O-GlcNAc-graad nagegaan bij een hyper- en hypo-OGlcNAcylatie toestand. Hyper-O-GlcNAcylatie werd bekomen door behandeling van de cellen met PUGNAc, een inhibitor van het O-GlcNAcase waardoor het afsplitsen van de OGlcNAc-groep verhinderd wordt. Bijkomend werd glucosamine toegevoegd aan het medium, dat een substraat vormt voor de aanmaak van UDP-GlcNAc. Hypo-O-GlcNAcylatie werd bekomen door de cellen te behandelen met alloxaan. Alloxaan inhibeert het O-GlcNAc transferase en voorkomt dus dat O-GlcNAc op serines of threonines wordt geplaatst. Het resultaat wordt weergegeven in figuur 13.
30
Figuur 13: Western blot experiment 1 met het anti-O-GlcNAc-antilichaam
In de hyper-O-GlcNAcylatie toestand (lanen 4 en 5) zien we een sterke kleuring, wat wijst op een hogere graad van O-GlcNAc-modificaties. Lanen 6, 7 en 8 daarentegen vertonen een lichtere kleuring in vergelijking met de controle (laan 3), wijzend op weinig O-GlcNAc modificaties. Dit komt overeen met wat verwacht werd. Hoe hoger de concentratie van PUGNAc of alloxaan, hoe meer of minder O-GlcNAcylatie respectievelijk. Uit lanen 2, 9, 10 en 11 kan geen conclusie getrokken worden. Door de lage concentratie van deze stalen werden ze gedroogd in de vacuüm centrifugator. Dit leverde echter geen resultaten op bij de Western blot. Bij de behandeling met 50 µM Aβ1-42 waren er met de lichtmicroscoop wel aggregaten van het Aβ-peptide zichtbaar. Dit was niet het geval bij de lagere concentraties.
In het tweede experiment werd het effect van de behandelingsduur met PUGNAc nagegaan en het effect van Aβ25-35 op de O-GlcNAc-graad in zowel een hyper- als hypo-O-GlcNAcylatie toestand. Het resultaat is weergegeven in figuur 14.
31
Figuur 14: Western blot experiment 2 met het anti-O-GlcNAc-antilichaam
Controles 1 en 2 zijn afkomstig van onbehandelde cellen uit het eerste experiment. Het controlestaal in laan 4 werd behandeld met 0,1% DMSO. DMSO is toxisch voor de cellen, maar bij een concentratie van 0,1% zijn de cellen nog leefbaar. Toch is er hier een duidelijk verschil waar te nemen tussen lanen 3 en 4, waarbij de DMSO-behandelde controle een veel lagere O-GlcNAcylatiegraad heeft dan de onbehandelde controle. Dit is een vreemde vaststelling aangezien 0,1% DMSO normaal geen effect heeft op de cellen. Ook bij experiment 3 (zie verder) is er geen verschil waar te nemen tussen de onbehandelde en DMSO-behandelde controle. Laan 5 toont een lichtere kleuring dan de onbehandelde controle (laan 3). Dit is overeenkomstig met de bevindingen uit het eerste experiment waarbij de alloxaanbehandelde cellen een lagere O-GlcNAcylatiegraad vertonen. Hyper-O-GlcNAcylatie werd bekomen in lanen 6, 7 en 8 waarbij er een sterkere kleuring waar te nemen is. Hoe langer de cellen behandeld werden, hoe minder sterk het effect, waarbij de OGlcNAcylatiegraad afnam. Dit is mogelijk te wijten aan een daling in activiteit of afbraak van PUGNAc. Het effect van Aβ25-35, vergeleken met de DMSO-behandelde controle, is echter niet duidelijk op de blot. Bijkomende behandeling met PUGNAc + glucosamine en alloxaan geven wel het gewenste resultaat, respectievelijk hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie. In een derde experiment werd het effect van Aβ1-42 en Aβ25-35 nagegaan en werd een vergelijking gemaakt tussen beide. Het resultaat is weergegeven in figuur 15.
32
Figuur 15: Western blot experiment 3 met het anti-O-GlcNAc-antilichaam
In het derde experiment vertoont de onbehandelde controle geen verschil met de DMSObehandelde controle. DMSO zou hier geen effect hebben op de cellen. Lanen 4 en 5 tonen respectievelijk hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie, wat overeenstemt met de verwachte resultaten. De behandeling met zowel Aβ1-42 (laan 6) en Aβ25-35 (laan 8) tonen echter geen verschil met beide controles en met elkaar. Bijkomende behandeling met PUGNAc en glucosamine geeft wel een stijging in O-GlcNAcylatiegraad, vergelijkbaar met laan 4.
Uit deze drie experimenten kunnen we besluiten dat behandeling met PUGNAc en glucosamine aanleiding geeft tot een stijging in O-GlcNAcylatie. Hoe hoger de concentratie, hoe meer O-GlcNAcylatie. De duur van de behandeling heeft echter een omgekeerde invloed waarbij de O-GlcNAcylatie daalt naarmate de behandeling langer duurt. Behandeling met alloxaan geeft aanleiding tot een daling van de O-GlcNAcylatiegraad. Ook hier is er een sterker effect en grotere daling van O-GlcNAcylatie bij een hogere concentratie. Verder kunnen we vaststellen dat zowel Aβ1-42 en Aβ25-35 geen waarneembaar effect hebben via Western blot.
3.3 Identificatie van peptiden met hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie met COFRADIC De cellen werden gekweekt in licht medium (12C6-lysine) ofwel in zwaar medium (13C6lysine) en nadien behandeld met PUGNAc en glucosamine (L1,L2, H3) om hyper-OGlcNAcylatie van de peptiden te bekomen en met alloxaan (H1, H2, L3) voor het verkrijgen van peptiden met hypo-O-GlcNAcylatie. 33
3.3.1 Western blot Om de O-GlcNAcylatiegraad na te gaan, werd van elk gelyseerd staal 20 µg gescheiden via SDS-PAGE. Transfer van de eiwitten naar een PVDF membraan en het gebruik van antilichamen maakte het mogelijk om de eiwitten met een O-GlcNAc-modificatie te visualiseren. Het resultaat is weergegeven in figuur 16.
Figuur 16: Western blot hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie met het anti-O-GlcNAc-antilichaam
Het controlestaal was afkomstig uit een vorig experiment (zie 3.2 experiment 3) en kleurt op deze blot zeer licht. Lanen 5, 6 en 7 tonen zoals verwacht een stijging in O-GlcNAcylatie in vergelijking met de controle en de alloxaanbehandelde cellen (lanen 3, 4 en 8). De controle kleurt echter lichter dan de alloxaanbehandelde cellen, wat tegen de verwachtingen in is. De verklaring ligt waarschijnlijk bij de endogene activiteit van het O-GlcNAcase dat tijdens het bewaren zorgt voor de verdere afsplitsing van O-GlcNAc en er op wijst dat een directe aanpak (niet invriezen van de staaltjes) in de staalvoorbereiding aan te raden is.
3.3.2 COFRADIC analyse Om de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden te isoleren uit een complex mengsel, werd de COFRADIC technologie gebruikt. De modificatiereactie werd uitgevoerd met butylamine. Door het basisch milieu wordt de O-GlcNAc-groep afgesplitst en via een Michaël-additie wordt butylamine op het gedeglycosyleerde residu geplaatst. Deze reactie zorgt ervoor dat de gemodificeerde peptiden op een ander tijdstip elueren dan tijdens de eerste scheiding, en nadien kunnen geselecteerd worden voor verdere analyse. 34
Primaire scheiding In de eerste scheiding werden de peptiden die elueerden tussen 5 en 65 min opgevangen in 60 fracties van telkens 1 min. De primaire fracties die 15 min van elkaar gescheiden zijn, werden vervolgens gecombineerd en gedroogd, beginnend bij de zesde fractie (elutietijd 10 min). Nadien werd een β-eliminatie uitgevoerd met butylamine. Het chromatogram van de primaire scheiding is weergegeven in figuur 17.
Figuur 17: Primaire RP-HPLC scheiding
Secundaire scheiding Tijdens de secundaire scheiding werden de samengevoegde en behandelde primaire fracties terug op de RP-HPLC kolom gebracht onder exact dezelfde condities als tijdens de primaire scheiding. De peptiden die elueerden tussen 10 en 70 min werden opgevangen in 48 fracties. Door de modificatiereactie ondergaan de peptiden, die oorspronkelijk een O-GlcNAc modificatie bevatten, een hydrofobe verschuiving. Aan de hand van het chromatogram en de gekende elutietijd vanuit de primaire scheiding, kunnen de gemodificeerde peptiden specifiek geselecteerd worden voor verdere analyse. Een voorbeeld van een chromatogram van een secundaire scheiding is weergegeven in figuur 18, waarbij de geselecteerde fracties in het blauw zijn aangeduid.
35
Figuur 18: Secundaire RP-HPLC scheiding. De geselecteerde fracties zijn weergegeven in het blauw.
3.3.3 Data-analyse De geselecteerde peptiden werden vervolgens op de Orbitrap massaspectrometer geladen voor LC-MS/MS analyse. Identificatie en kwantificering van de peptiden gebeurde met Mascot en Mascot Distiller. In normale omstandigheden kan 5 tot 10% van de gegenereerde massaspectra geïdentificeerd worden door Mascot. In dit onderzoek was dit echter niet het geval en werd slechts 2 à 3% geïdentificeerd (tabel 3). Tabel 3: Percentage geïdentificeerde massaspectra uit de 3 experimenten. aantal bekomen
aantal massaspectra
massaspectra
geïdentificeerd
experiment 1 (L1+H1)
20989
675
3,2
experiment 2 (L2+H2)
22601
643
2,8
experiment 3 (L3+H3)
23859
633
2,7
%
Om na te gaan wat de oorzaak van de lage identificatie was, werden eerst de parameters van de zoekalgoritmes gecontroleerd. Deze bleken allemaal goed ingesteld te zijn. Vervolgens werd een False Discovery Rate onderzoek uitgevoerd. Hierbij werd een 'decoy' databank gebruikt die geconcateneerd werd aan de humane Swiss-Prot databank. Het percentage van geïdentificeerde peptiden mag niet hoger zijn dan 5%, maar in dit onderzoek was dit echter 10%. De generatie van de massaspectra werd eveneens gecontroleerd. Eerst werd er nagegaan of er voldoende materiaal geladen werd op de massaspectrometer. Aan de hand van TIC (Total Ion Current) werd de intensiteit nagegaan, die normaal een hoeveelheid van 108-109 ionen weergeeft. TIC toonde een intensiteit van 5x108-3x109 ionen, wat dus voldoende is. 36
Vervolgens werd de kwaliteit van de MS en MS/MS-spectra bekeken. De MS-spectra toonden een goed resultaat (voldoende intensiteit), in tegenstelling tot de fragmentatiespectra. Hieruit werd afgeleid dat er mogelijk een slechte fragmentatie van de peptiden gebeurde, die op zijn beurt te wijten kan zijn aan een slechte fragmentatie door te weinig botsingsgas (helium) of invloed van butylamine op het fragmentatiegedrag van de peptiden. Wanneer alle drie de experimenten worden samengenomen, zijn er van de 1951 geïdentificeerde peptiden, 127 die oorspronkelijk een O-GlcNAc-modificatie hadden. Dit aantal kan gereduceerd worden tot een totaal van 15 verschillende eiwitten, waarvan er slechts drie in alle drie de experimenten terug te vinden zijn. Tabel 4 geeft de verschillende peptiden weer uit de drie experimenten die oorspronkelijk een O-GlcNAc-modificatie droegen. Tabel 4: De geïdentificeerde peptiden die oorspronkelijk een O-GlcNAc-modificatie droegen Experiment 1 (L1+H1) Ratio L/H
SwissProt accessie nr.
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
0,936
P16403
Histone H1.2
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
0,936
P16403
Histone H1.5
Ace-S<But>ETAPAETATPAPVEK-COOH
1,247
P16401
Histone H1.5
Ace-S<But>ETAPAETATPAPVEK-COOH
1,247
P16401
Olfactomedin-like protein 2B
NH2-LHSVTT<But>K-COOH
0,899
Q68BL8
Prothymosin alpha
Ace-S<But>DAAVDTSSEITTK-COOH
0,812
P06454
Prothymosin alpha
Ace-S<But>DAAVDTSSEITTK-COOH
0,812
P06454
Prothymosin alpha
Ace-SDAAVDTSS<But>EITTK-COOH
0,908
P06454
Prothymosin alpha
Ace-SDAAVDTSS<But>EITTK-COOH
0,908
P06454
Uncharacterized protein C17orf51
NH2-IIQS<But>LK-COOH
1,145
A8MQB3
Proteasome subunit alpha type-3
NH2-ESLKEEDES<But>DDDNM<Mox*>-COOH
1,097
P25788
Actin, cytoplasmic 1
NH2-DS<But>YVGDEAQSK-COOH
0,990
P60709
Actin, cytoplasmic 1
NH2-DS<But>YVGDEAQSK-COOH
0,990
P60709
Eiwit
Geïdentificeerd peptide
Histone H1.2
Experiment 2 (L2+H2) Histone H1.2
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
0,751
P16403
Histone H1.2
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
0,751
P16403
Histone H1.5
Ace-S<But>ETAPAETATPAPVEK-COOH
1,141
P16401
Histone H1.5
Ace-S<But>ETAPAETATPAPVEK-COOH
0,853
P16401
Prothymosin alpha
Ace-S<But>DAAVDTSSEITTK-COOH
0,865
P06454
Prothymosin alpha
Ace-SDAAVDTS<But>SEITTK-COOH
0,865
P06454
Prothymosin alpha
Ace-SDAAVDTSS<But>EITTK-COOH
0,865
P06454
Cofilin-1
Ace-ASGVAVS<But>DGVIK-COOH
0,908
P23528
Host cell factor 1
NH2-TIPM<Mox*>SAIIT<But>QAGATGVTSSPGIK-COOH
0,899
P51610
Phosphatidylethanolamine-BP1
NH2-GNDIS<But>SGTVLSDYVGSGPPK-COOH
0,906
P30086
Phosphatidylethanolamine-BP1
NH2-GNDIS<But>SGTVLSDYVGSGPPK-COOH
0,906
P30086
Actin, cytoplasmic 1
NH2-DS<But>YVGDEAQSK-COOH
0,951
P60709
Actin, cytoplasmic 1
NH2-DS<But>YVGDEAQSK-COOH
0,951
P60709
37
Experiment 3 (L3+H3) SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily D member 2
NH2-KPLT<But>QK-COOH
Histone H1.2
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
1,106
P16403
Histone H1.2
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
1,106
P16403
Prothymosin alpha
Ace-SDAAVDTS<But>SEITTK-COOH
0,970
P06454
Calponin-3
NH2-AGQS<But>VIGLQM<Mox*>GTNK-COOH
1,096
Q15417
Calponin-3
NH2-AGQS<But>VIGLQM<Mox*>GTNK-COOH
1,096
Q15417
GTP-binding nuclear protein Ran
NH2-LVLVGDGGT<But>GK-COOH
1,050
P62826
Cofilin-1
Ace-AS<But>GVAVSDGVIK-COOH
0,980
P23528
Cofilin-1
Ace-AS<But>GVAVSDGVIK-COOH
0,980
P23528
Gamma-enolase
NH2-VNQIGSVT<But>EAIQACK-COOH
1,188
P09104
Proteasome subunit alpha type-3
NH2-ESLKEEDES<But>DDDNM<Mox*>-COOH
1,005
P25788
Actin, cytoplasmic 1
NH2-DS<But>YVGDEAQSK-COOH
1,062
P60709
0,200
Q92925
In dit onderzoek is het belangrijk om na te gaan of er een verschil in O-GlcNAcylatiegraad is tussen de licht en zwaar gemarkeerde peptiden. Dit werd nagegaan via de licht over zwaar verhouding (L/H-verhouding) van het peptide. Wanneer de waarde buiten het 95% betrouwbaarheidsinterval lag, bekomen via het Rover algoritme [39], werd de ratio als significant beschouwd. In dit experiment was er slechts 1 peptide met een significante L/Hverhouding, gerelateerd aan het SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily D member 2 eiwit (SMRD2). De L/H-verhouding van 0,2 toont een significante stijging in O-GlcNAcylatie van het eiwit bij behandeling met PUGNAc en glucosamine. Van alle gevonden O-GlcNAcylatieplaatsen was er geen enkele terug te vinden in de literatuur. Actine [40], host cell factor 1 [41] en gamma-enolase [42] zijn wel reeds beschreven als eiwitten met O-GlcNAc-modificaties, maar een specifieke plaats werd in het onderzoek niet bepaald.
3.4 Identificatie van de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden bij AD met COFRADIC In dit experiment werd eveneens de SILAC methode gebruikt om een onderscheid te kunnen maken tussen de peptiden bekomen uit de behandelde celcultuur en de controle celcultuur. De cellen werden hierbij gekweekt in licht medium (12C6-lysine) ofwel in zwaar medium (13C6lysine). L1 en H2 werden behandeld met 128,6 µM Aβ25-35, L2 en H1 werden niet behandeld en dienden als controle.
38
3.4.1 Western blot Een Western blot met het anti-O-GlcNAc-antilichaam werd uitgevoerd om het verschil in OGlcNAcylatiegraad na te gaan. Het resultaat is weergegeven in figuur 19.
Figuur 19: Western blot met het anti-O-GlcNAc-antilichaam
Op de Western blot is er geen verschil in kleuring waar te nemen tussen de eiwitten bekomen uit de behandelde celcultuur en de controle celcultuur. Dit wijst erop dat er geen zichtbaar effect is van het Aβ25-35 op de O-GlcNAcylatiegraad van de cellen. Door de swapped labeling kan het effect van het SILAC medium nagegaan worden. L1 en H2 tonen geen verschil in kleuring, net als L2 en H1, wat het effect van het medium uitsluit. De Jurkat stalen werden gebruikt om apoptose na te gaan (zie figuur 20). De kleuring van O-GlcNAc bij de Jurkat cellen met geïnduceerde apoptose (laan 7), toont een licht verschillend kleuringspatroon dan de behandelde en onbehandelde SH-SY5Y cellen. Dit komt omdat het andere cellen zijn (Tcel lymfoma cellen) en er dus andere genen tot expressie komen, maar waarschijnlijk ook door het proces van apoptose. Het gewone Jurkat cellysaat toont een zeer lichte kleuring, waarschijnlijk het gevolg van het laden van een lagere hoeveelheid cellysaat, zoals ook te zien is in figuur 20.
Om apoptose aan te tonen werd het anti-caspase 3 antilichaam gebruikt. Caspasen spelen een essentiële rol bij apoptose [43]. Capsase 3 is in normale omstandigheden als een niet-actieve precursor terug te vinden in de cel. Verknipping door initiator caspasen leidt tot activering van caspase 3. Het anti-caspase 3 antilichaam kleurt zowel de precursor als de verknipte actieve vorm. Het resultaat wordt weergegeven in figuur 20.
39
Figuur 20: Western blot met het anti-caspase 3 antilichaam
De sterke kleuring op de blot toont de precursor van het caspase 3 eiwit aan. De lichtere kleuring van laan 6 wijst er waarschijnlijk op dat er minder materiaal op het gel geladen werd. Als positieve controle werd een Jurkat cellysaat gebruikt waarbij apoptose werd geïnduceerd. Deze is terug te vinden in laan 7. Onder de precursor is de verknipte vorm van het caspase 3 te zien, wat wijst op apoptose. De actieve vorm van het caspase 3 is zeer licht te zien in de andere laantjes, buiten in laan 6. Laan 6 is een negatieve controle waar er geen apoptose mag te zien zijn. De afwezigheid van de kleuring kan ook te wijten zijn aan een te kleine hoeveelheid materiaal. De kleuring van de actieve vorm in de andere laantjes, wijst op een kleine hoeveelheid apoptose van de cellen, aangezien deze niet te zien is in laan 6. Er is echter geen verschil tussen de cellen die behandeld werden met Aβ25-35 en de controlecellen. De bekomen apoptose is dus niet het gevolg van de behandeling, maar eerder te wijten aan een te hoge densiteit van de cellen in celcultuur.
3.4.2 COFRADIC analyse De O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden werden geïsoleerd aan de hand van de COFRADIC technologie, zoals weergegeven in 3.3.2. Door tijdsgebrek werd enkel het eerste staal (L1+H1) geanalyseerd.
3.4.3 Data-analyse De geselecteerde peptiden werden via LC-MS/MS op een Orbitrap massaspectrometer geanalyseerd. Er werden 20830 spectra gegenereerd, waarvan er 881 door Mascot werden geïdentificeerd (4,2%). Van deze spectra waren er 21 verschillende peptiden die oorspronkelijk een O-GlcNAc-modificatie hadden (tabel 5), gekoppeld aan 14 verschillende eiwitten. 40
Tabel 5: De geïdentificeerde peptiden die oorspronkelijk een O-GlcNAc-modificatie droegen Eiwit
Geïdentificeerd peptide
Ratio (L/H)
SwissProt accessie nr.
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K
NH2-ELRENT<But>QTTIK-COOH
1,057
P61978
Histone H1.2
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
0,705
P16403
Histone H1.2
Ace-S<But>ETAPAAPAAAPPAEK-COOH
0,705
P16403
Histone H1.5
Ace-S<But>ETAPAETATPAPVEK-COOH
0,733
P16401
Histone H1.5
Ace-S<But>ETAPAETATPAPVEK-COOH
0,733
P16401
Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial
NH2-IIAEGANGPT<But>TPEADK-COOH
1,103
P00367
Protein disulfide-isomerase A3
NH2-SEPIPES<But>NDGPVK-COOH
1,041
P30101
Hepatoma-derived growth factor
NH2-S<But>CVEEPEPEPEAAEGDGDK-COOH
1,224
P51858
Hepatoma-derived growth factor
NH2-S<But>CVEEPEPEPEAAEGDGDK-COOH
1,224
P51858
Glutaminase kidney isoform, mitochondrial
NH2-DGPGETDAFGNS<But>EGK-COOH
1,140
O94925
Microtubule-actin cross-linking factor 1
NH2-QIS<But>EQLNALNK-COOH
14,685
Q9UPN3
Cofilin-1
Ace-AS<But>GVAVSDGVIK-COOH
0,967
P23528
Cofilin-1
Ace-AS<But>GVAVSDGVIK-COOH
0,887
P23528
Adenosylhomocysteinase
NH2-VPAINVNDSVT<But>K-COOH
0,831
P23526
Adenosylhomocysteinase
NH2-VPAINVNDSVT<But>K-COOH
0,831
P23526
T-complex protein 1 subunit eta
NH2-ATIS<But>NDGATILK-COOH
0,826
Q99832
Heat shock cognate
NH2-NS<But>LESYAFNM<Mox*>K-COOH
1,024
P11142
Heat shock cognate
NH2-NS<But>LESYAFNM<Mox*>K-COOH
1,024
P11142
Actin, cytoplasmic 1
NH2-DS<But>YVGDEAQSK-COOH
1,020
P60709
Actin, cytoplasmic 1
NH2-DS<But>YVGDEAQSK-COOH
1,020
P60709
Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate
NH2-EELQANGS<But>APAADK-COOH
0,586
P29966
Na validatie van de L/H-verhouding, bleef er slechts één eiwit over waarvan de L/Hverhouding buiten het 95% betrouwbaarheidsinterval viel, nl. het Microtubule-actin crosslinking factor 1 (MACF1) eiwit. De cellen bekomen uit L1 waren behandeld met Aβ, terwijl H1 de controlecellen waren. Een L/H-verhouding van 14,685 wijst erop dat er meer OGlcNAcylatie van het eiwit terug te vinden is bij de cellen behandeld met Aβ. Om uit te sluiten dat de stijging te wijten is aan een opregulatie van het eiwit, werd gezocht naar ongemodificeerde peptiden van dit eiwit. Deze werden helaas niet gevonden waardoor een opregulatie van het eiwit niet uit te sluiten is. Ook in dit experiment was er geen enkele gevonden O-GlcNAcylatieplaats reeds beschreven in de literatuur. Enkel actine is reeds gekend als een eiwit met O-GlcNAc-modificaties [40].
41
4. Bespreking In deze thesis was het de bedoeling om zoveel mogelijk eiwitten met een verstoorde OGlcNAcylatie te identificeren bij de ziekte van Alzheimer. Als cellulair modelsysteem voor de ziekte, werden SH-SY5Y cellen gebruikt, die behandeld werden met het amyloid-β peptide. Om de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden te isoleren, werd gebruik gemaakt van de COFRADIC
technologie.
De
geselecteerde
peptiden
werden
vervolgens
op
de
massaspectrometer geladen, waarna ze geïdentificeerd en gekwantificeerd werden aan de hand van Mascot.
In een eerste fase werden de reacties, die nodig zijn voor een efficiënte COFRADIC analyse, geoptimaliseerd. O-fosfaat vormt naast O-GlcNAc ook een substraat voor de β-eliminatie, die centraal staat in het sorteringmechanisme van COFRADIC. Hierdoor is het van belang dat de peptiden vooraf gedefosforyleerd worden, zodat de β-eliminatie enkel plaatsgrijpt op de peptiden die een O-GlcNAc-modificatie dragen. Defosforylatie met het alkalisch fosfatase leverde geen goed resultaat op, omdat de peptiden niet gedefosforyleerd werden. Dit kan te wijten zijn aan een slechte stockoplossing met een inactief fosfatase of door het niet bereiken van de optimale condities voor de werking van het alkalisch fosfatase. Het faag λ-fosfatase daarentegen zorgde wel voor een goede defosforylatie van de peptiden. Dit fosfatase werd dan ook gebruikt in het finale protocol. Naast de defosforylatie werd ook de β-eliminatie geoptimaliseerd. 5% butylamine bleek een goede concentratie te zijn om de O-GlcNAc-groep af te splitsen en te vervangen door butylamine. Hierdoor ondergingen de peptiden een hydrofobe verschuiving waardoor ze nadien geselecteerd konden worden. Een concentratie van 5% werd dan ook gebruikt in het finale protocol.
SH-SY5Y cellen werden gebruikt om een cellulair modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer te ontwikkelen. PUGNAc in combinatie met glucosamine, blijkt een goede behandeling te zijn om hyper-O-GlcNAcylatie te induceren. PUGNAc is een inhibitor van het O-GlcNAcase en voorkomt dus dat de O-GlcNAc-groep afgesplitst wordt. Alloxaan, een inhibitor van het O-GlcNAc transferase, blijkt dan weer geschikt te zijn om hypo-OGlcNAcylatie te induceren. Om een cellulair modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer te bekomen, werden SH-SY5Y cellen behandeld met het amyloid-β peptide (Aβ). Dit peptide zou neurotoxisch zijn, oxidatieve stress induceren, een inflammatoire respons veroorzaken en
42
de calciumhomeostase verstoren door interactie van de Aβ-aggregaten met cellulaire membranen of door binding van Aβ met microgliale en neuronale cellulaire receptoren [44]. Aβ25-35 is het functionele domein van het amyloid-β peptide en is verantwoordelijk voor de neurotoxische eigenschappen. Door de betere oplosbaarheid van dit peptide, werd ervoor gekozen om in het finale protocol de SH-SY5Y cellen te behandelen met Aβ25-35. Het peptide zou eveneens in staat zijn om aggregaten te vormen en de toxiciteit van het volledige amyloid-β peptide (Aβ1-42) te behouden [44]. De bekomen resultaten met Aβ1-42 en Aβ25-35 toonden echter geen verandering in O-GlcNAcylatiegraad. Bij de Aβ25-35 behandelde cellen, kon eveneens geen stijging in apoptose worden aangetoond. Behandeling van SH-SY5Y cellen met Aβ1-42 of Aβ25-35 blijkt dus geen geschikt cellulair modelsysteem te zijn om de OGlcNAcylatiegraad bij de ziekte van Alzheimer te onderzoeken. Uit literatuurstudie blijkt dat er nog geen uniform cellulair modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer bestaat. Onderzoek heeft aangetoond dat er in de amyloide plaques ook metaalionen aanwezig zijn [45,46]. Behandeling met het Aβ-aluminium complex zou een sterkere aggregatie vertonen en een stijging in neurotoxiciteit door het veranderen van de eigenschappen van het Aβ-peptide. Verder zou een mutante vorm van het amyloid-β peptide (E22Q) eveneens een grotere toxiciteit induceren dan het normale amyloid-β peptide [47]. Een ander onderzoek heeft aangetoond dat de natuurlijk gesecreteerde vorm van het amyloidβ peptide schadelijker is dan de gesynthetiseerde peptiden [48]. Hierbij werd gebruik gemaakt van een virale vector voor de inductie van AD in neuronale cellen. Verder zou Aβ ook minder vatbaar zijn voor aggregatie in serum, waardoor de cellen net voor de behandeling gekweekt werden in serumvrij medium [49]. Al deze bevindingen kunnen verder onderzocht worden om een goed cellulair modelsysteem voor AD te bekomen.
Een eerste experiment werd opgezet om peptiden met hyper- en hypo-O-GlcNAcylatie te identificeren met COFRADIC. Hierbij werden de cellen behandeld met ofwel PUGNAc en glucosamine (hyper-O-GlcNAcylatie), ofwel met alloxaan (hypo-O-GlcNAcylatie). Op Western blots was er een duidelijk verschil te zien in O-GlcNAcylatiegraad tussen de verschillende behandelingen. De eiwitten bekomen uit de PUGNAc-behandelde celcultuur kleurden sterker dan de eiwitten bekomen uit de alloxaanbehandelde celcultuur. Voor identificatie van O-GlcNAc-bevattende eiwitten, werden de peptiden eerst geïsoleerd met de COFRADIC technologie. Enkel de fracties met de peptiden die oorspronkelijk een OGlcNAc-modificatie droegen, werden op de massaspectrometer geladen voor analyse.
43
Het kan ook interessant zijn om de fracties met de ongemodificeerde peptiden te bekijken. Een eiwit bestaat namelijk uit verschillende peptiden, waarbij het ene peptide een modificatie draagt en het andere niet. Door de L/H-verhouding van een ongemodificeerd peptide van de twee behandelingen te vergelijken met elkaar, kan men nagaan of er op- of neerregulatie is van het eiwit. Hierdoor kan men nagaan of de L/H-verhouding van het gemodificeerde peptide van de twee behandelingen relevant is en de stijging of daling in O-GlcNAc niet te wijten is aan op- of neerregulatie van het eiwit. De ongemodificeerde peptiden werden in dit onderzoek echter niet geanalyseerd om de bezetting van de massaspectrometers te minimaliseren.
Van de bekomen massaspectra kon slechts 2 à 3% geïdentificeerd worden. In normale omstandigheden is dit 5 à 10%. De oorzaak van dit lage aantal, ligt bij de slechte generatie van de fragmentatiespectra. Omdat het identificatiepercentage eveneens zo laag ligt in het andere experiment, is dit waarschijnlijk niet te wijten aan te weinig botsingsgas, maar eerder aan een onderdrukking van butylamine op het fragmentatieproces. Met het gebruikte protocol werd slechts één peptide met een significante L/H-verhouding teruggevonden, gerelateerd aan het SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily D member 2 eiwit (SMRD2). Dit eiwit toonde een hogere O-GlcNAcylatiegraad bij behandeling met PUGNAc. SMRD2 is een onderdeel van het SWI/SNF-complex en speelt een rol in de regulatie van transcriptie door chromatineherstructurering [50]. De gevonden O-GlcNAc-modificatieplaats is in Swiss-Prot niet gekend als fosforylatieplaats. Het eiwit is wel een gekend fosfoproteïne waardoor een reciproke interactie tussen beide PTM's wel mogelijk is.
Validatie van de resultaten werd voorlopig niet uitgevoerd. In een eerste instantie zou men het geïdentificeerde eiwit kunnen valideren via Western blots. Hierbij wordt een antilichaam gebruikt tegen het eiwit en een tweede antilichaam tegen O-GlcNAc. Indien kleuring op dezelfde plaats gebeurt, weet men dat het geïdentificeerde eiwit een O-GlcNAc-modificatie draagt. Een tweede validatiemethode is Selected/Multiple Reaction Monitoring. Hierbij wordt van het geïdentificeerde glycopeptide een synthetisch glycopeptide met een
13
C6-lysine aangemaakt.
Dit peptide wordt vervolgens geanalyseerd met triple quadrupool MS. Om de kwantificering te valideren, wordt het synthetisch glycopeptide toegevoegd aan het digest. Analyse gebeurt terug met triple quadrupool MS bij de gekende m/z-verhouding. Aan de hand van de gekende 44
hoeveelheid van het synthetisch glycopeptide (13C6-lysine) kan men de hoeveelheid van het peptide uit het digest (12C6-lysine) nagaan. Hetzelfde proces kan worden uitgevoerd met het ongemodificeerde peptide. Verder zou men ook nog het aminozuur dat de O-GlcNAc-modificatie draagt kunnen muteren. Cellen kunnen vervolgens getransfecteerd worden met het mutante gen. Na behandeling zou men het effect van O-GlcNAc van dat specifiek eiwit kunnen nagaan, of kijken in welk proces het eiwit betrokken is.
Het hoofddoel van deze thesis was om zoveel mogelijk eiwitten met een verstoorde OGlcNAcylatie te identificeren bij de ziekte van Alzheimer. Ook hier werd slechts 4,2% van de bekomen massaspectra geïdentificeerd, waarvan één eiwit een verandering in O-GlcNAcylatie toonde. Het lage aantal is te wijten aan slechte fragmentatiespectra en een ongeschikt modelsysteem voor AD, waarbij er geen verschil in O-GlcNAcylatiegraad te zien was op Western blot bij de behandelde cellen en de controlecellen. Het Microtubule-actin cross linking factor 1 eiwit (MACF1) toonde een stijging in O-GlcNAcylatie bij de cellen behandeld met Aβ. Dit eiwit heeft een massa van ongeveer 620 kDa en kan dus niet teruggevonden worden op de blot, waardoor de verhouding niet kon worden nagegaan. Verdere validatie van de resultaten werd hier eveneens niet uitgevoerd. MACF1 zorgt voor cross-linkage tussen actine en andere cytoskeletale eiwitten en is belangrijk voor het onderhouden van de weefselintegriteit. Het eiwit speelt o.a. ook een belangrijke rol in de stabilisatie van microtubuli en is een positieve regulator van de Wnt receptor signalering [51]. De gevonden O-GlcNAc-modificatieplaats is in Swiss-Prot niet gekend als fosforylatieplaats, maar het eiwit is wel een gekend fosfoproteïne, waarbij fosforylatie de microtubuli-binding inhibeert. Een reciproke interactie tussen beide PTM's is hier dus ook mogelijk. De ziekte van Alzheimer wordt gekenmerkt door een deficiënt glucosemetabolisme. Hierdoor zou men verwachten dat er een daling in O-GlcNAcylatiegraad optreedt bij behandeling met Aβ, maar MACF1 toonde echter een stijging in O-GlcNAcylatie. Onderzoek heeft aangetoond dat stressgeïnduceerde cellen (hier veroorzaakt door de amyloide plaques) een stijging in OGlcNAcylatie vertonen [52]. Deze stijging zou een positief effect hebben op de celoverleving door het moduleren van stress-respons pathways. Bij de ziekte van Alzheimer zijn de cellen minder stressbestendig, omdat er geen sterke stijging in O-GlcNAcylatie mogelijk is. Dit wijst nogmaals op het belang van een goed modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer.
45
In de toekomst zou men eerst kunnen nagaan of de modificatie met butylamine daadwerkelijk een invloed heeft op de identificatiegraad. Wanneer dit bevestigd wordt, zou men dit onderzoek kunnen optimaliseren door gebruik te maken van een andere methode om de OGlcNAc-gemodificeerde peptiden te isoleren, of door niet meer te werken met butylamine. Andere methoden om de O-GlcNAc-gemodificeerde peptiden te isoleren zijn o.a. zwakke lectine affiniteitchromatografie, BEMAD of het merken van de eiwitten met een keton-biotine tag, zoals beschreven staat in 1.5. Naast butylamine kan ook dithiothreitol (DTT) of biotinepentylamine (BAP) gebruikt worden voor de β-eliminatie [34]. DTT heeft echter het nadeel dat elke modificatie van een serine of threonine getroffen kan worden, alsook gealkyleerde cysteïnes en methionines. De gemodificeerde peptiden kunnen vervolgens verrijkt worden met een thiolsepharose kolom (voor modificatie met DTT) of een monoavidine kolom (voor modificatie met BAP). Massaspectrometrische analyse van de gemodificeerde peptiden zou echter beter gaan met DTT dan met BAP. BAP zou fragmenteren tijdens het proces waardoor de analyse van de resultaten moeilijker wordt. Het recombinant O-GlcNAcase zou eventueel ook kunnen gebruikt worden. Dit enzym zorgt specifiek voor de afsplitsing van O-GlcNAc. Het probleem hierbij is het opplaatsen van een specifieke groep om de O-GlcNAc-modificatieplaats aan te duiden. Verder onderzoek is noodzakelijk om een goede methode te vinden om de O-GlcNAc-gemodificeerde eiwitten te identificeren. Verder kan het ook interessant zijn om naast de O-GlcNAcylatie, ook de fosforylatie te bekijken. Zo kan nagegaan worden of er een reciproke interactie bestaat tussen beide posttranslationele modificaties. Eveneens kan het effect van een verstoorde fosforylatie onderzocht worden.
Als conclusie stellen we dat er verder onderzoek nodig is om een goed cellulair modelsysteem voor de ziekte van Alzheimer te ontwikkelen. In dit onderzoek had het amyloid-β peptide echter geen effect op de O-GlcNAcylatiegraad, noch op de inductie van apoptose in de SHSY5Y cellen. De gebruikte COFRADIC technologie met butylamine blijkt ook niet zo geschikt te zijn om peptiden met een O-GlcNAc-modificatie te onderzoeken. Slechts een klein percentage van de massaspectra kon worden geïdentificeerd door Mascot, waarschijnlijk door de onderdrukking van de fragmentatiespectra door butylamine. Het gebruik van andere scheidingsmethoden of een modificatiereactie met een andere stof, kunnen mogelijk een oplossing bieden voor dit probleem.
46
5. Referenties 1.Southan C (2004). Has the yo-yo stopped? An assessment of human protein-coding gene number. Proteomics 4:1712-1726. 2.Gevaert K, Vandekerckhove J (2004). COFRADICTM: the Hubble telescope of proteomics. Targets 3(2 Suppl): 16S-22S. 3.Sowell R, Owen J, Butterfield D (2009). Proteomics in animal models of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Ageing Res Rev. 8:1-17 4.Perkings D, Pappin D, Creasy D, Cottrell J (1999). Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567. 5.Gevaert K, Van Damme P, Ghesquière B, Impens F, Martens L, Helsens K, Vandekerckhove J (2007). A la carte proteomics with an emphasis on gel-free techniques. Proteomics 7:2698-2718. 6.Gevaert K, Van Damme P, Ghesquière B, Vandekerckhove J (2006). Protein processing and other modifications analyzed by diagonal peptide chromatography. Biochimica et Biophysica Acta 1764:1801-1810. 7.Ong S, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen D, Steen H, Pandey A, Mann M (2002). Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics 1:376-386. 8.Walsh C, Garneau-Tsodikova S, Gatto G (2005). Protein posttranslational modifications: The chemistry of proteome diversifications. Angewandte Chemie International Edition 44:7342-7372. 9.Issad T (2010). O-GlcNAc glycosylation et régulation de la signalisation cellulaire. Medecine Sciences 26:753-759 10.Zeidan Q, Hart G (2010). The intersections between O-GlcNAcylation and phosphorylation: implications for multiple signaling pathways. Journal of Cell Science 123:13-22. 11.Hart G, Housley M, Slawson C (2007). Cycling of O-linked β-N-acetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins. Nature 446:1017-1022. 12.Dias W, Hart G (2007). O-GlcNAc modification in diabetes and Alzheimer's disease. Molecular BioSystems 3:766-772. 13.Lazarus B, Love D, Hanover J (2006). Recombinant O-GlcNAc transferase isoforms: identification of OGlcNAcase, yes tyrosine kinase, and tau as isoform-specific substrates. Glycobiology 16:415-421 14.Macek B, Mann M, Olsen J (2009). Global and site-specific quantitative phosphoproteomics: principles and applications. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 49:199-221. 15.Manning G, Whyte DB, Martinez R, Hunter T, Sudarsanam S (2002). The protein kinase complement of the human genome. Science 298:1912-1934. 16.Lee T, Tseng S, Wu L, Horng J, Tsou A (2005). Incorporating hidden Markov model for identifying protein kinase-specific phosphorylation sites. Journal of computational chemistry 26:1032-1041. 17.Blennow K, de Leon M, Zetterberg H (2006). Alzheimer's disease. The Lancet 368:387-403. 18.Korolainen M, Nyman T, Aittokallio T, Pirttila T (2010). An update on clinical proteomics in Alzheimer's research. Journal of Neurochemistry 112:1386-1414. 19.Menten B (2011). Neurodegeneratieve aandoeningen in Neurogenetica, cursus 2e Master Biomedische Wetenschappen, UGent. 20.Liu F, Shi J, Tanimukai H, Gu J, Gu J, Grundke-Iqbal I, Iqbal K, Gong C (2009). Reduced O-GlcNAcylation links lower brain glucose metabolism and tau pathology in Alzheimer's disease. Brain 132:1820-1832. 21.Costantini L, Barr L, Vogel J, Henderson S (2008). Hypometabolism as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Neuroscience 9 (Suppl 2):S16. 22.Gong C, Iqbal K (2008). Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Current Medicinal Chemistry 15:2321-2328. 23.Robertson LA, Moya KL, Breen KC (2004). The potential role of tau protein O-glycosylation in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease 6:489-495. 24.Li X, Lu F, Wang J, Gong C (2006). Concurrent alterations of O-GlcNAcylation and phosphorylation of tau in mouse brains during fasting. European Journal of Neuroscience 23:2078-2086. 25.Deng Y, Li B, Liu F, Iqbal K, Grundke-Iqbal I, Brandt R, Gong CX (2008). Regulation between OGlcNAcylation and phosphorylation of neurofilament-M and their dysregulation in Alzheimer disease. FASEB Journal 22:138-145. 26.Yao PJ, Coleman PD (1998). Reduction of O-linked N-Acetylglucosamine-modified assembly protein-3 in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience 18(7):2399-2411. 27.Rengifo J, Gibson C, Winkler E, Collin T, Ehrlich B (2007). Regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type I by O-GlcNAc glycosylation. The Journal of Neuroscience 27:13813-13821.
47
28.Jacobsen KT, Iverfeldt K (2011). O-GlcNAcylation increases non-amyloidogenic processing of the amyloid-β precursor protein (APP). Biochemical and Biophysical Research communications 404:880-886. 29.Yuzwa SA, Macauley MS, Heinonen JE, Shan X, Dennis RJ, He Y, Whitworth GE, Stubbs KA, McEachern EJ, Davies GJ, Vocadlo DJ (2008). A potent mechanism-inspired O-GlcNAcase inhibitor that blocks phosphorylation of tau in vivo. Nature Chemical Biology 4:483-490. 30.Whelan S, Hart G (2003). Proteomic approaches to analyze the dynamic relationships between nucleocytoplasmic protein glycosylation and phosphorylation. Circulation Research 93:1047-1058. 31.Torres C, Hart G (1984). Topography and Polypeptide Distribution of Terminal N-Acetylglucosamine Residues on the Surfaces of Intact Lymphocytes: Evidence for O-linked GlcNAc. The Journal of Biological Chemistry 259:3308-3317. 32.Madsen-Bouterse S, Petty H, Romero R (2008). Quantification of O-GlcNAc protein modification in neutrophils by flow cytometry. Cytometry Part A 73:667-672. 33.Vosseller K, Trinidad J, Chalkley R, Specht C, Thalhammer A, Lynn A, Snedecor J, Guan S, Medzihradszky K, Maltby D, Schoepfer R, Burlingame L (2006). O-linked N-Acetylglucosamine proteomics of postsynaptic density preparations using lectin weak affinity chromatography and mass spectrometry. Molecular and Cellular Proteomics 5:923-934. 34.Wells L, Vosseller K, Cole R, Cronshaw J, Matunis M, Hart G (2002). Mapping sites of O-GlcNAc modification affinity tags for serine and threonine post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics 1:791-804. 35.Vosseller K, Hansen K, Chalkley R, Trinidad J, Wells L, Hart G, Burlingame A (2005). Quantitative analysis of both protein expression and serine/threonine post-translational modifications through stable isotope labeling with dithiothreitol. Proteomics 5:388-398. 36.Khidekel N, Ficarro S, Peters E, Hsieh-Wilson L (2004). Exploring the O-GlcNAc proteome: Direct identification of O-GlcNAc-modified proteins from the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences 101:13132-13137. 37.Han X, Aslanian A, Yates J (2008). Mass spectrometry for proteomics. Current Opinion in Chemical Biology 12(5):483-490. 38.Helsens K, Colaert N, Barsnes H, Muth T, Flikka K, Staes A, Timmerman E, Wortelkamp S, Sickmann A, Vanderkerckhove J, Gevaert K, Martens L (2010). ms_lims, a simple yet powerful open source laboratory information management system for MS-driven proteomics. Proteomics 10(13):2560. 39.Colaert N, Helsens K, Impens F, Vandekerckhove J, Gevaert K (2010). Rover: A tool to visualize and validate quantitative proteomics data from different sources. Proteomics 10: 1226-1229. 40.Ramirez-Correa GA, Jin W, Wang A, Zhong X, Gao WD, Dias WB, Vecoli C, Hart GW, Murphy AM (2008). O-linked GlcNAc modification of cardiac myofilament proteins: a novel regulator of myocardial contractile function. Circulation Research 103:1354-1358. 41.Capotosti F, Guernier S, Lammers F, Waridel P, Cai Y, Jin J, Conaway JW, Conaway RC, Herr W (2011). OGlcNAc transferase catalyzes site-specific proteolysis of HCF-1. Cell 144:376-388. 42.Di Domenico F, Owen JB, Sultana R, Sowell RA, Perluigi M, Cini C, Cai J, Pierce WM, Butterfield DA (2010). The wheat germ agglutinin-fractionated proteome of subjects with Alzheimer's disease and mild cognitive impairment hippocampus and inferior parietal lobule: implications for disease pathogenesis and progression. Journal of Neuroscience Research 88:3566-3577. 43.Boatright KM, Salvesen GS (2003). Mechanisms of caspase activation. Current Opinion in Cell Biology 15:725-731 44.Millucci L, Ghezzi L, Bernardini G, Santucci A (2010). Conformations and biological activities of amyloid beta peptide 25-35. Current Protein and Peptide Science 11:54-67. 45.Gatta V, Drago D, Fincati K, Valenti MT, Dalle Carbonare L, Sensi S, Zatta P (2011). Microarray analysis on human neuroblastoma cells exposed to aluminium, β1-42-amyloid or the β1-42-amyloid aluminum complex. PLoS ONE 6(1):e15965. 46.Drago D, Bettella M, Bolognin S, Cendron L, Scancar J, Milacic R, Ricchelli F, Casini A, Messori L, Tognon G, Zatta P (2008). Potential pathogenic role of β-amyloid1-42-aluminum complex in Alzheimer's disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 40:731-746. 47.Dahlgren K, Manelli A, Stine W, Baker L, Krafft G, LaDu M (2002). Oligomeric and fibrillar species of amyloid-β peptides differentially affect neuronal viability. The Journal of Biological Chemistry 277:3204632053. 48.Stoppelkamp S, Bell H, Palacios-Filardo J, Shewan D, Riedel G, Platt B (2011). In vitro modelling of Alzheimer's disease: Degeneration and cell death induced by viral delivery of amyloid and tau. Experimental Neurology 229:226-237. 49.Biere A, Ostaszewski B, Stimson E, Hyman B, Maggio J, Selkoe D (1996). Amyloid β-peptide is transported on lipoproteins and albumin in human plasma. The Journal of Biological Chemistry 271:32916-32922.
48
50.Wang W, Xue Y, Zhou S, Kuo A, Cairns B, Crabtree G (1996). Diversity and specialization of mammalian SWI/SNF complexes. Genes & Development 10:2117-2130. 51.Chen H, Lin CM, Lin CS, Perez-Olle R, Leung C, Liem R (2006). The role of microtubule actin cross-linking factor 1 (MACF1) in the Wnt signaling pathway. Genes & Development 20:1933-1945. 52.Zachara N, Hart G (2004). O-GlcNAc a sensor of cellular state: the role of nucleocytoplasmic glycosylation in modulating cellular function in response to nutrition and stress. Biochimica et Biophysica Acta 1673:1328.
49
