1 Onderstaand is een stukje peptide getoond dat deel uit maakt van een groter eiwit en de naam draagt van een lokaal beroemde biochemicus:
a. Geef de 1-lettercode van de 6 uitgeschreven aminozuren in de corresponderende volgorde. b. Geef de configuratie (R of S) van al deze aminozuren. c. Als het gehele eiwit gevouwen is blijkt dat dit peptide-segment onderdeel uitmaakt van een -helix. Geef met een tekening aan hoe de waterstofbruggen in de hoofdketen van dit -helicale peptide optreden. d. Een bepaalde ziekte is geassocieerd met een puntmutatie in het stukje peptide in bovenstaand eiwit. Hierbij is de cysteine in het peptide gemuteerd tot een serine. Deze mutatie lijdt ertoe dat het bovenstaande eiwit niet meer correct kan vouwen en zelfs in twee aparte peptideketens uiteen valt. Verklaart u dit resultaat. Hoe is het eiwit blijkbaar opgebouwd? e. Beschrijf een eiwitanalyse techniek om het onder 1d beschreven fenomeen te kunnen analyseren. Gaat u daarbij in op hoe de techniek werkt en welk resultaat u in uw analyse verwacht. f. Een gedeelte van het bovenstaande eiwit blijkt een zogenaamde leucine-rits (leucine-zipper) te vormen met een ander eiwit. Wat is een leucine-rits en hoe functioneert deze leucine-rits. Verduidelijk uw antwoord met behulp van een „helical-wheel“-diagram.
1 Onderstaand is een stukje peptide getoond dat deel uit maakt van een groter eiwit en de naam draagt van een lokaal beroemde biochemicus:
a. Geef de 1-lettercode van de 6 uitgeschreven aminozuren in de corresponderende volgorde. MARCEL b. Geef de configuratie (R of S) van al deze aminozuren. SSSRSS c. Als het gehele eiwit gevouwen is blijkt dat dit peptide-segment onderdeel uitmaakt van een -helix. Geef met een tekening aan hoe de waterstofbruggen in de hoofdketen van dit -helicale peptide optreden.
d. Een bepaalde ziekte is geassocieerd met een puntmutatie in het stukje peptide in bovenstaand eiwit. Hierbij is de cysteine in het peptide gemuteerd tot een serine. Deze mutatie lijdt ertoe dat het bovenstaande eiwit niet meer correct kan vouwen en zelfs in twee aparte peptideketens uiteen valt. Verklaart u dit resultaat. Hoe is het eiwit blijkbaar opgebouwd? e. Beschrijf een eiwitanalyse techniek om het onder 1d beschreven fenomeen te kunnen analyseren. Gaat u daarbij in op hoe de techniek werkt en welk resultaat u in uw analyse verwacht. f. Een gedeelte van het bovenstaande eiwit blijkt een zogenaamde leucine-rits (leucine-zipper) te vormen met een ander eiwit. Wat is een leucine-rits en hoe functioneert deze leucine-rits. Verduidelijk uw antwoord met behulp van een „helical-wheel“-diagram.
1 d. Een bepaalde ziekte is geassocieerd met een puntmutatie in het stukje peptide in bovenstaand eiwit. Hierbij is de cysteine in het peptide gemuteerd tot een serine. Deze mutatie lijdt ertoe dat het bovenstaande eiwit niet meer correct kan vouwen en zelfs in twee aparte peptideketens uiteen valt. Verklaart u dit resultaat. Hoe is het eiwit blijkbaar opgebouwd? De cysteine is blijkbaar in het eiwit aanwezig in disulfide vorm met een andere cysteine uit een andere peptideketen. Deze disulfide houdt de twee ketens bij elkaar. Mutatie van een van deze cysteines tot een serine leidt ertoe dat deze disulfide brug niet meer kan optreden en de twee ketens los van elkaar komen te zitten. e. Beschrijf een eiwitanalyse techniek om het onder 1d beschreven fenomeen te kunnen analyseren. Gaat u daarbij in op hoe de techniek werkt en welk resultaat u in uw analyse verwacht. U zou SDS-PAGE kunnen doen op het natuurlijke en gemuteerde sample: 1 keer in aanwezigheid van DTT (Dithiothreitol) of -mercaptoethanol en een keer in afwezigheid daarvan. Dit zou in het eerste geval leiden tot 2 banden voor beide eiwitten en in het tweede geval tot 1 band voor de normale en 2 banden voor de gemuteerde. f. Een gedeelte van het bovenstaande eiwit blijkt een zogenaamde leucine-rits (leucine-zipper) te vormen met een ander eiwit. Wat is een leucine-rits en hoe functioneert deze leucine-rits. Verduidelijk uw antwoord met behulp van een „helical-wheel“-diagram. Een leucine rits is een interactie van twee -helicale peptiden in een coiled-coil via een zevenvoudige repeterende eenheid waarbij om de zeven aminozuren een leucine voorkomt. De leucines op beide ketens ritsen in elkaar door hydrophobe interacties. Het helical-wheel diagram laat zien dat ieder zevende aminozuur exact boven de positie van zijn voorganger terecht komt. Hierdoor wordt een kant van de -helix bedekt met leucines en is hydrofoob (f in dit geval).
2 Beschouw nogmaals bovenstaand peptide:
Beschouw nogmaals het peptide van opgave 1: a. U behandelt dit peptide met het enzym trypsine. Geef de producten van deze reactie, inclusief de juiste eindgroepen.
b.
c.
d.
Leg uit waarom het enzym trypsine selectief op bepaalde posities in peptideketens van eiwitten knipt en niet willekeurig op iedere positie. De S1 pocket van trypsin bevat een negatief geladen carboxylaat functie van een aminozuur zijstaart (aspartaat). Hierdoor selecteert trypsin peptide sequenties met dan wel een lysine, dan wel een arginine, door ionische interactie met de positief geladen zijstaarten en knipt/hydrolyseert direct na dit aminozuur. Bepaalde enzymen (zoals thrombine en factor Xa) hebben een nog hogere selectiviteit als het enzym trypsine; deze enzymen herkennen selectief peptide sequenties van meerdere aminozuren, zowel voor als na het actieve centrum. Hoe bewerkstelligen deze specifiekere enzymen de specifiekere herkenning van hun substraat? Deze enzymen hebben naast de S1 pocket nog meerdere pockets, zowel C-terminaal van de binding die gehydrolyseerd wordt (S1’, S2’, etc.) als N-terminaal (S2, S3, etc.). Hierdoor kunnen deze enzymen selectiever bepaalde aminozuur sequenties herkennen, op basis van een langere peptide sequentie, en de binding van andere peptide sequenties verhinderen. Trypsine is een serine protease welke amide bindingen hydrolyseert. Het actieve centrum van het protease bestaat uit een zogenaamde katalytische triade. Legt u aan de hand van het mechanisme van de katalytische reactie uit of trypsine in principe ook esters zou kunnen hydrolyseren. Gaat u daarbij op moleculair niveau in op de katalytische triade en de stabilisatie van de overgangstoestand.
O
O
O
2 e. De reactie genoemd onder 2a wordt doorgevoerd bij verschillende substraatconcentraties en de initiële snelheid van substraatomzetting wordt bij de verschillende substraatconcentraties bepaald (zie tabel). Bereken/bepaal KM en Vmax voor dit enzym. 1.0
Substraatconcentratie [S] (M)
Initiële snelheid (V0) (mol/minuut)
0.9
1
1.3
0.6
2
2.0
4
2.8
8
3.6
12
4.0
0.8 0.7
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.4
-0.2
-0.1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-0.2
-1/KM ~ -0.4 KM = 2.5 M
1/Vmax ~ 0.2 Vmax = 5 mol/min of via y = ax + b
f. Dit enzym wordt vervolgens geïnhibeerd met een non-competitieve inhibitor. Hoe verandert daardoor de turnover number van het enzym? Verklaar uw antwoord! Een niet competitieve inhibitor bindt tegelijkertijd met het substraat aan het enzym, maar op een andere plek. De affiniteit van het enzym voor het substraat blijft gelijk (en dus KM ook), maar doordat de concentratie functioneel enzym verlaagd wordt neemt Vmax af. Voor de turnover number geldt kcat = Vmax/[E]T. Deze neemt dus af.
3 Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit specifieke lipiden, voornamelijk phopsholipiden, glycolipiden en cholesterol. In membranen komen naast lipiden ook veel eiwitten voor. Deze kunnen op verschillende manieren in het membraan verankerd zijn. a. Beschrijf twee verschillende manieren hoe eiwitten aan of in membranen verankerd kunnen zijn. Maak hiervoor gebruik van een schematische tekening.
Via lipid functionaliteiten aan een specifieke kant aan het membraan verankerd. Transmembraaneiwitten, geintegreerd in het membraan. Perifere membraaneiwitten, zwak gebonden via elektrotatische interacties, dan wel gedeeltelijk in het membraan, dan wel aan een ander membraaneiwit.
3 b. Bepaalde membraaneiwitten zorgen voor transport van ionen en organische verbindingen over/door membranen. Hier onderscheidt men zogenaamde pompen en kanalen. Beschrijf kort hoe beide type eiwitten functioneren en duidt daarbij de essentiële verschillen aan. Transmembraanpompen gebruiken energie (in de vorm van de hydrolyse van ATP) om konformatieveranderingen te induceren. De verschillende konformaties die daarbij voorkomen hebben verschillende bindingsaffiniteiten voor ionen of moleculen en presenteren hun bindingsite specifiek naar dan wel de buiten- dan wel de binnenkant van het membraan. Hierdoor kunnen pompen ionen/moleculen sterk binden aan de ene kant van het membraan en laten het los aan de andere kant van het membraan na de conformatie verandering. Energie gedreven transport van moleculen via pompen gaat dus normaal gesproken slecht in een richting en kan tegen de concentratiegradient in gebeuren. Transport over transmembraankanalen wordt gestuurd door een concentratieverschil over het membraan (is de drijvende kracht en kost dus geen chemische energie), gaat altijd met de concentratiegradient mee en kan in principe beide kanten oplopen, afhankelijk van de concentratie verschil. Transport door kanalen is veel sneller dan door pompen. c. Membranen zijn een fysische barrière. Voor gentherapie of voor de moleculaire biologie is het echter soms nodig om DNA in eukaryotische cellen naar binnen te brengen (DNA transfectie). Hiervoor worden veelal kationische lipiden of ook kationische polymeren gebruikt. Deze worden gemengd met het DNA en het mengsel wordt aan de cellen gegeven. Verklaart u het gebruik van de kationische lipiden en polymeren. Kationische transfectie reagentie gaan een interactie aan met het negatief geladen DNA. Dit leidt tot het compacteren van het DNA (de afstotende negatieve ladingen worden geneutraliseerd) en een hydrofobere structuur (dor de lipidstaarten). De hierdoor ontstane compacte positief geladen deeltjes gaan makkelijker door het membraan (negatief geladen en hydrofoob).
4 a. Teken een RNA basenpaar en geef daarbij ook aan waar de base aan de suiker verbonden zit. U mag zelf bepalen welk RNA basenpaar u neemt.
b. DNA replicatie kan eenvoudig in een reageerbuis in een biochemisch lab gedaan worden met behulp van de zogenaamde polymerase chain reaction (PCR). Welke moleculaire componenten (reagentia, katalysator, etc.) heeft u nodig om deze reactie te kunnen doorvoeren. DNA (dubbelstrengs, maar kan eventueel ook enkelstrengs zijn), 2 DNA primers, alle vier de deoxyribonucleoside triphosphaten: dATP, dCTP, dGTP, (d)TTP, en een warmte stabiele DNA polymerase. c. Beschrijf het principe van de PCR aan de hand van de amplificatie van een specifiek stukje dubbelstrengs DNA tijdens de eerste cyclus. Geef hierbij de karakteristieken van iedere stap aan (wat gebeurt er, wat reageert er, en waarom wordt een bepaalde temperatuur gekozen). Zie volgende pagina d. Wat was het innovatieve idee achter de PCR, welke het keer op keer uitvoeren van deze reactie, zonder reinigingsstappen, mogelijk maakte? (bonusvraag, max. 5 extra punten mogelijk) PCR baseert zich erop dat alle reactiestappen (ca. 30 keer 3) in hetzelfde potje plaats vinden en bij hoge temperaturen. Deze hoge temperaturen zijn in eerste instantie nodig om het DNA te smelten. Echter hierdoor zouden normale DNA polymerasen denaturen (ontvouwen en aggregeren). Het innovatieve idee achter de PCR was om een hitte stabiele DNA polymerase te gebruiken uit bacterien uit hete geisers. Deze polymerase functioneert optimaal bij hoge temperaturen en ontvouwd niet bij de 95 °C die nodig zijn om het DNA te smelten.
3' 5'
5' 3'
41 2
Original DNA
T= 95°C 3'
5'
1
5'
3'
2
5'
1
3'
2
3' 5'
2´ 1
Primer 3'
5'-Primer-3' +
5'
3'-Primer-5' T = 55°C
T= 72°C
dNTPs, DNA-Polymerase
5'-Primer 3'
Principe: 1) DNA Duplex wordt gescheiden door verwarmen (ca. 95 °C). 2) Twee primers worden toegevoegd (synthetische oligonucleotiden) welke aan het DNA binden via complementaire base paren na afkoelen tot ca. 54 °C. 3) Na het binden van de primers wordt verwarmd tot 72 °C, de ideale temperatuur voor de hitte stabiele DNA polymerase, welke met behulp van de dNTPs (desoxynucleotidetriphosphaten) de primers verlengd en een copy maakt van het DNA. 4)=1) De zo gevormde twee dubbelstrengs worden verwarmd en het proces wordt opnieuw doorlopen.
+ 3' 2 Primer-5' 1´
5' 3'
T= 95°C 3
5'
2
3'
5'
2´
5
3'
1´
5
3'
1
5'
2´
3'
1
Primer P-P 3
5
5'
2
3
3'
1´
5
P-P usw.
P-P
P-P
5 a. DNA amplificatie, DNA transcriptie en mRNA translatie zijn alle drie zeer precieze processen. Desalniettemin, is er een gradatie in precisie tussen de drie processen. Geeft u deze gradatie aan (dus welk proces is het meest precies en welke het minst) en verklaart u ook, waarom dit uw inziens zo is. Eenmaal fout gekopieerd zal het DNA als bron van alle informatie in de cel deze fout steeds met zich meedragen en bij ieder volgende deling doorgeven. mRNA wordt iedere keer opnieuw gesynthetiseerd en slechts een beperkt aantal keren uitgelezen. Hierdoor wordt de ingevoerde fout niet oneindig gekopieerd. Translatie van het mRNA in eiwit zorgt slecht voor een fout eiwit (in een omgeving met veel meer kopien van dit eiwit welke wel correct zijn). Tevens worden fout gevouwen eiwitten door het proteasome gedegradeerd. Precisie: amplificatie > transcriptie > translatie b. Om het DNA op specifieke posities uit te kunnen lezen voor transcriptie is er een complex mechanisme voorhanden, de zogenaamde chromatine remodelling. Beschrijft u het mechanisme welk optreedt zodat uiteindelijk de RNA polymerase het DNA op een specifieke positie kan uitlezen. Gaat u daarbij ook in op eventuele chemische reacties die optreden en hoe het specifieke stuk DNA dat uitgelezen moet worden, wordt herkend. Een transcriptiefactor bind aan een specifieke DNA sequentie upstream (voor) van het stuk DNA dat uitgelezen moet worden. Deze transcriptiefactor bind vervolgend aan coactivator eiwitten, welke enzymen zijn die de amino-groepen van de histonen kunnen acetyleren. Hierdoor valt de positieve lading weg en wordt de interactie van het histon met het DNA verzwakt en komt het DNA losser te zitten. Hierdoor kan vervolgens de RNA polymerase binden en het DNA uitlezen.
6 Van een stukje dubbelstrengs prokaryotisch DNA is de volgende sequentie bekend voor de templaat strand/streng. 3’-TACCGGTCTACGCTTGAA-5’ a. Geef de sequentie van de coding strand (coderende streng) van het DNA en de sequentie van het mRNA als dit dubbelstrengs DNA vervolgens met een RNA polymerase wordt uitgelezen. Geeft u hierbij ook de uiteindposities aan (3’ / 5’) Coderende streng: 5’-ATGGCCAGATGCGAACTT-3’ mRNA: 5’-AUGGCCAGAUGCGAACUU-3’ b. Het zo ontstane mRNA codeert voor 6 aminozuren en wordt vervolgens uitgelezen met behulp van het ribosoom (U mag er dus vanuit gaan dat de eerste 3 basen een compleet codon vormen). Welke aminozuur sequentie volgt dan uit dit dubbelstrengs DNA? Geef hierbij de -NH2 en -COOH uiteinden van de aminozuursequentie aan. H2N-MARCEL-COOH c. Schets de structuur van een t-RNA en geef daarbij in ieder geval aan waar de anticodon loop zit en waar het aminozuur vast zit.
d. Leg in detail uit wat de rol is van het t-RNA in de eiwitsynthese. Betrek in uw antwoord ook hoe de beladen t-RNA ‘verwerkt’ wordt in het ribosoom. e. Stel dat er een mutatie plaatsvindt in het anticodon van een van de menselijke t-RNA’s. Wat zouden de gevolgen van een dergelijke mutatie kunnen zijn?
6 d. Leg in detail uit wat de rol is van het t-RNA in de eiwitsynthese. Betrek in uw antwoord ook hoe de beladen t-RNA ‘verwerkt’ wordt in het ribosoom. Het t-RNA wordt beladen met aminoacyl t-RNA synthetase. Voor iedere t-RNA is er een specifiek enzym die het t-RNA belaadt met een specifiek aminozuur. Herkenning gebeurd met bhv het anticodon. Vervolgens wordt het aminoacyl-tRNA met behulp van EF-Tu naar de Aminoacyl (A)site van het ribosoom gebracht. Hier wordt het aminoacyl-tRNA alleen los gelaten en aan het ribosoom overgedragen als er een juiste match is tussen het codon op het mRNA en het antidocon op het t-RNA. Vervolgens draagt the tRNA met de peptideketen die zich in de Peptidyl (P)site bevind de peptide keten over aan het tRNA in de A site waarbij deze in the 50S ribosoom (of 60S ribosoom) doorschuift naar de P site. EF-G zorgt er vervolgens voor dat het tRNA ook doorschuift van de A naar de P site in het 30S (of 40S) ribosoom. Dit proces wordt opnieuw doorgelopen met een nieuw aminoacyl-tRNA, waarbij het tRNA in de A site op een zelfde stapsgewijze manier doorgeschoven wordt naar de Exit (E)site in het ribosoom en deze dan verlaat en opnieuw beladen kan worden. e. Stel dat er een mutatie plaatsvindt in het anticodon van een van de menselijke t-RNA’s. Wat zouden de gevolgen van een dergelijke mutatie kunnen zijn? 1. In het geval deze mutatie plaatsvindt tijdens de transcriptie van DNA in t-RNA dan zal dat leiden tot een t-RNA molecule dat of een aantal keer verkeerd beladen wordt en een verkeerd aminozuur inbouwt in eiwitten of niet beladen kan worden en verder geen rol speelt. 2. In het geval de mutatie zich in het DNA bevindt zijn de gevolgen erger. Dit specifieke t-RNA zal dan altijd verkeerd zijn en of leiden tot complete absentie van eiwit synthese of vele verkeerde eiwitten. In beide gevallen waarschijnlijk fataal.
