Növényélettani gyakorlatok

PANNON AGRÁRTUDOMÁNYI EGYETEM GEORGIKON MEZŐGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR Növénytani és Növényélettani Tanszék Tanszékvezető: Dr. Szabó István egyetemi tanár

Allaga József

Szántóné Palánki Edit

Növényélettani gyakorlatok

KESZTHELY 1997

2

Lektorálta:

Dr. habil. Borbély György biológiai tudományok kandidátusa KLTE Természettudományi Kar Dr. Tóth Benedek mezőgazdasági tudományok kandidátusa PATE Georgikon Mezőgazdaságtudományi Kar

A jegyzet az „Alapítvány a Magyar Felsőoktatásért és Kutatásért” támogatásával jött létre.

3

TARTALOMJEGYZÉK ELŐSZÓ................................................................................................................................................................. 6 LABORATÓRIUMI RENDSZABÁLYOK......................................................................................................... 7 1.

PLAZMOLÍZIS VIZSGÁLATOK............................................................................................................... 9 ÉLŐ ÉS ELHALT SZÖVETEK PERMEABILITÁSÁNAK VIZSGÁLATA; A KONKÁV, A KONVEX ÉS A 1/A DEPLAZMOLÍZIS TANULMÁNYOZÁSA ................................................................................................................... 14 1/B SAPKA- ÉS TONOPLASZTPLAZMOLÍZIS VIZSGÁLATA KÁLIUMSZULFOCIANIDDAL ...................................... 15 1/C CA++-IONOK JELENTŐSÉGE A PLAZMOLÍZISKOR FELLÉPŐ HATÁRHÁRTYA-SÉRÜLÉSEKNÉL....................... 15

2.

TRAUBE-FÉLE SEJT TANULMÁNYOZÁSA........................................................................................ 17

3.

CITOPLAZMA-VISZKOZITÁS VIZSGÁLATA .................................................................................... 18

4.

NÖVÉNYI SZÖVETEK VÍZPOTENCIÁLJA (ψ) ÉS ANNAK MÉRÉSE............................................ 20 4/A 4/B 4/C

VÍZPOTENCIÁL MEGHATÁROZÁSÁRA ALKALMAS MÓDSZEREK ................................................................ 22 BURGONYAGUMÓ VÍZPOTENCIÁLJÁNAK MEGHATÁROZÁSA MÉRETVÁLTOZÁS ALAPJÁN ......................... 24 BURGONYAGUMÓ VÍZPOTENCIÁLJÁNAK MEGHATÁROZÁSA REFRAKTOMÉTERES MÉRÉSSEL ................... 26

NÖVÉNYI SZÖVETEK OZMOTIKUS POTENCIÁLJÁNAK (ψπ) MÉRÉSE .................................... 28

5.

5/A 5/B 6.

OZMOTIKUS POTENCIÁL MÉRÉSÉRE ALKALMAS MÓDSZEREK .................................................................. 28 NÖVÉNYI SZÖVETEK OZMOTIKUS POTENCIÁLJÁNAK (ψπ) MEGHATÁROZÁSA KRIOSZKÓPIÁVAL .............. 29

KÜLÖNBÖZŐ TÍPUSÚ NÖVÉNYEK VÍZTARTÓ KÉPESSÉGÉNEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA .... 34

7. A KUKORICA AKTUÁLIS TELÍTETTSÉGI HIÁNYÁNAK ÉS IGÉNYBEVÉTELÉNEK MEGÁLLAPÍTÁSA............................................................................................................................................ 36 8.

PROLIN-PRÓBA A VÍZHIÁNY KIMUTATÁSÁRA ............................................................................. 38

9.

A SZTÓMÁK VISELKEDÉSE KÜLÖNBÖZŐ pH-ÉRTÉKŰ PUFFER OLDATOKBAN................. 40

10.

SZTÓMÁK VIZSGÁLATA KOLLÓDIUMOS LEVONATON ......................................................... 42

11.

VÍZKULTÚRÁS KÍSÉRLETEK ........................................................................................................... 43

11/A 11/B 11/C 12.

A VÍZKULTÚRÁS KÍSÉRLETEK ÁLTALÁNOS SZEMPONTJAI ........................................................................ 43 HIÁNYTÜNETEK VIZSGÁLATA FIATAL EGYSZIKŰ ÉS KÉTSZIKŰ NÖVÉNYEKNÉL ........................................ 45 HIÁNYTÜNETEK HATÁROZÓ KULCSA ...................................................................................................... 47 FOTOSZINTETIKUS PIGMENTEK VIZSGÁLATA ........................................................................ 50

12/A 12/B

KLOROPLASZTISZ SZÍNANYAGAINAK SZÉTVÁLASZTÁSA MEGOSZLÁSI PAPÍR-KROMATOGRÁFIÁVAL ........ 51 A LEVELEK KLOROFILL ÉS KAROTINOID TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA SPEKTROFOTOMÉTERREL, A NYERS PIGMENTKIVONAT ABSZORPCIÓS SPEKTRUMÁNAK FELVÉTELE ................................................................ 53

13. FOTOSZINTÉZISES O2-TERMELÉS JODOMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA (WINKLERMÓDSZER) ......................................................................................................................................................... 57 14. A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT KEMÉNYÍTŐ KIMUTATÁSA SACHS-FÉLE JÓDPRÓBÁVAL................................................................................................................................................. 60

4

15.

A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT SZACHARÓZ MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA 62

16.

LÉGZÉSVIZSGÁLAT FRENYÓ-FÉLE "IDŐTITRÁLÁSSAL", A 2,4-D HATÁSA A LÉGZÉSRE 63

17.

KATALÁZ ENZIM AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA ................................................................... 65

17/A A KATALÁZ AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE TITRÁLÁSSAL ............................................................................... 66 17/B A KATALÁZ ENZIM AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE FRENYÓ-MÓDSZERREL (HASZNÁLATI UTASÍTÁS A FRENYÓ-FÉLE KATALÁZ-MÉRŐ ESZKÖZHÖZ) ...................................................................................................... 67 18. A POLIFENOLOXIDÁZ ÉS A PEROXIDÁZ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAK EGYÜTTES MÉRÉSE .............................................................................................................................................................. 70 19. DEHIDROGENÁZ ENZIMEK KIMUTATÁSA TTC SEGÍTSÉGÉVEL (VETŐMAGVAK ÉLETKÉPESSÉGÉNEK VIZSGÁLATA) ........................................................................................................ 73 20.

A KEMÉNYÍTŐ ENZIMES LEBONTÁSÁNAK VIZSGÁLATA...................................................... 76

21.

A POLARITÁS TANULMÁNYOZÁSA NÖVÉNYEKEN.................................................................. 80

22. NÖVEKEDÉSSZABÁLYOZÓ ANYAGOK HASZNÁLATA GYÖKEREZTETÉSI MÓDSZEREKNÉL ............................................................................................................................................. 82 22/A 22/B

A GYÖKEREZTETÉS FŐBB SZEMPONTJAI.................................................................................................. 82 AZ α-NAFTIL-ECETSAV HATÁSA A DUGVÁNYOK GYÖKÉRKÉPZÉSÉRE ...................................................... 86

23.

A GIBBERELLIN HATÁSA A HOSSZANTI NÖVEKEDÉSRE....................................................... 88

24.

A CCC NÖVEKEDÉSGÁTLÓ HATÁSA............................................................................................. 89

25.

SALÁTA HIPOKOTIL-TESZT A GIBBERELLINEK KIMUTATÁSÁRA..................................... 91

26.

AZ ETILÉN KIMUTATÁSA BORSÓEPIKOTIL-TESZT SEGÍTSÉGÉVEL ................................. 92

27. A CSÍRANÖVÉNYEK SZABAD AMINOSAVAINAK KIMUTATÁSA KÖRPAPÍRKROMATOGRÁFIÁVAL ................................................................................................................................. 93 28. 28/A 28/B 28/C 29.

A NÖVÉNYI KIVONATOK FEHÉRJETARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA......................... 97 A FEHÉRJE MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSA BIURET-REAKCIÓVAL................................................... 97 A FEHÉRJE MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSA LOWRY-MÓDSZERREL.................................................. 99 A FEHÉRJE MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSA BRADFORD-MÓDSZERREL .......................................... 102 FEHÉRJÉK VIZSGÁLATA POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL ........................ 105

29/A 29/B

A POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS (PAGE) JELLEMZŐI ............................................................... 105 BURGONYAFAJTÁK AZONOSÍTÁSA POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL A RAKTÁROZOTT FEHÉRJÉK ÉS AZ ÉSZTERÁZ IZOENZIMEK ALAPJÁN ............................................................................................................. 107

30.

AZ ANTOCIÁNOK KIVONÁSA ÉS TULAJDONSÁGAIK VIZSGÁLATA ................................. 111

31.

A NIKOTINTARTALOM MEGHATÁROZÁSA.............................................................................. 113

5

32. NÖVÉNYRÉSZEK C-VITAMIN TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA JODOMETRIÁS MÓDSZERREL................................................................................................................................................. 115 FÜGGELÉK ...................................................................................................................................................... 118 FELHASZNÁLT IRODALOM........................................................................................................................ 128

6

ELŐSZÓ Az agrármérnökök képzésében a növényélettani gyakorlatok célja az, hogy segítséget nyújtson a növények életfolyamatainak teljesebb megismeréséhez, az elméleti anyag mélyebb elsajátításához, és ezzel a tudományosan megalapozott növénytermesztői szemlélet kialakításához. Lényeges szempont, hogy a hallgatók megismerjék a kísérletezés eszközeit, módszereit, tudják az adatokat értelmezni, tudjanak elemezni, következtetéseket levonni az eredményekből. Fontos, hogy olyan módszereket

ismerjenek

meg,

amelyeket

későbbi

növényekkel

kapcsolatos

kutatómunkájuk során - szakdolgozat, TDK munka stb. készítésekor - is hasznosíthatnak. A feladatok sikeres megoldása során szerzett élmény elősegíti az elmélet maradandóbb rögzülését, bevésését, a gyakorlati munka a megszerzett tudást a készség fokára emeli. Az 1996/97-es tanévtől bevezetett új tanterv keretében növényélettani gyakorlataink óraszáma az A és B típusú tárgyakat együtt számolva kb. felére csökkent a korábbiakhoz képest. A mérések időigénye miatt az A típusú Növényélettan tárgy heti 1x40 perces gyakorlatait kéthetente összevontan tartjuk meg. Főként ezen új körülmények szükségessé tették a korábbi Növényélettani gyakorlatok című oktatási segédletünk átdolgozását és kibővítését. E változtatások keretében, jegyzetünkben az egyes méréseket több háttér-információval láttuk el, amit a hallgatók már otthon elolvashatnak a gyakorlatra készülve, így több idő marad a tényleges mérés végzésére. Növeltük a demonstrációs gyakorlatok arányát, ahol a hallgatók egy-egy kísérletnek csak bizonyos fázisait illetve végeredményét fogják tanulmányozni. A jegyzet anyagának bővítését új műszereink (Beckman VIS-UV spektrofotométer, poliakrilamid gélelektroforetikus készülékek) is lehetővé tették.

7

LABORATÓRIUMI RENDSZABÁLYOK

• A kijelölt feladatokat és a hozzájuk kapcsolódó elméleti részeket (előadások anyaga) a gyakorlatok előtt át kell tanulmányozni, a gyakorlatokra felkészülten kell érkezni. • Hallgatók felügyelet nélkül nem dolgozhatnak a laboratóriumban. • A laboratóriumban a dohányzás szigorúan tilos. • A gyakorlatokon védőköpeny viselése kötelező. • A kísérlet megkezdése előtt készítsünk elő minden szükséges eszközt, vegyszert. • A laboratóriumban használt vegyszerek nagy része mérgező, ezért a vegyszerekkel óvatosan bánjunk! Szigorúan tilos a vegyszerek, de a kísérletekhez használt növényi részek, termések megízlelése is, ez utóbbiak ugyanis már szennyeződhettek vegyszerekkel, pl. a laboratóriumban. Tilos a laboratóriumban enni, illetve az ott levő edényekből inni, vagy azokban ételt tartani. • Kísérletekhez vegyszereket csak megfelelő dugóval, csavaros fedővel elzárt, egyértelműen feliratozott, címkézett üvegekben, műanyagdobozokban tárolhatunk. • A szilárd vegyszereket vegyszerkanállal vegyük ki a vegyszeres edényből, utána a kanalat töröljük meg papírtörlővel. • A folyadékok kiméréséhez tiszta, száraz pipettát, vagy mérőhengereket használjunk. A maró, mérgező anyagok esetében biztonsági pipettát használjunk. • A vegyszer használata után az üveget a saját dugójával azonnal zárjuk le, különben a vegyszerek kipárologhatnak, összekeveredhetnek, elfolyósodhatnak stb. A kivett dugót az alsó felével sohase helyezzük az asztalra, mert szennyeződést viszünk vele az üvegbe, illetve az asztal felületére. • A kísérlet végén megmaradt anyagot - különösen az oldatokat - sohase tegyük vissza abba az üvegbe, amelyből kivettük. • A lefolyóba szilárd (pl. növényi maradványok), kenőcsös (zsírok, olajok), tűzveszélyes (pl. éter, benzol), valamint erősen savas vagy lúgos kémhatású (pl. HCl, H2SO4, NaOH stb.) anyagokat ne öntsünk, mert elzáródást, robbanást, illetve a csővezeték súlyos károsodását idézheti elő. Az előzőekben felsorolt anyagokat minden esetben a kijelölt üveg vagy műanyag edényekben kell összegyűjteni. • Az elszennyezett, használaton kívüli edényeket azonnal ürítsük ki az előbbiekben leírtak figyelembevételével, majd esetleges öblítést követően vigyük a mosogató helyiségbe. • A 0,5 literesnél nagyobb üvegeket szállítás közben ne csak a nyakuknál fogjuk, hanem alulról is támasszuk alá. • Kellemetlen szagú, mérgező, tűzveszélyes anyagokkal vegyifülkében dolgozzunk. • A kémcsövet hevítéskor, melegítéskor ne tartsuk nyílásával se magunk, se társunk felé.

8

• Arcunkat, szemünket, kezünket védjük a szétfröccsenő anyagoktól. Különösen tömény savakkal, lúgokkal végzett munka esetén védőeszközök (pl. szemüveg, kesztyű) használata kötelező. • A bőrünkre került erős savakat, lúgokat bő vízzel mossuk le, majd bikarbónát, illetőleg híg ecetsavas lemosással közömbösítsük. • Erős savak, különösen kénsav hígításánál mindig a savat öntjük a vízbe és nem fordítva. • Könnyen gyulladó, robbanó anyagokat (pl. benzin, éter) nyílt láng közelében nem tarthatunk. Ezen anyagok csak elektromos berendezéssel melegíthetők. Tűz és robbanásveszélyes anyagokkal csak akkor dolgozhatunk, ha a laboratóriumban nyílt lángot nem használunk. Megfelelő szellőztetésről gondoskodni kell. • Laboratóriumi tűz esetében fontos, hogy gyorsan és ésszerűen intézkedjünk. Kis tüzet (pl. főzőpohárban), az edény letakarásával, esetleg nedves ruhadarab segítségével oltunk el, nagyobb mennyiség meggyulladásakor a kézi tűzoltó készüléket használjuk. A környezetből távolítsuk el a gyúlékony anyagokat. Ruhánk meggyulladásakor azonnal a laboratóriumban található zuhany alá kell állni. • Nedves kézzel tilos hozzányúlni feszültség alatt álló elektromos készülékekhez, kapcsolókhoz és dugaszolóaljzatokhoz. Áramütés esetén a központi kapcsolóval áramtalanítunk, és csak azután nyúlhatunk a sérülthöz. Majd friss levegőre visszük és mesterséges légzést alkalmazunk. Azonnal orvost kell hívni! • Laboratóriumi centrifuga használata előtt a rotorban egymással szembekerülő centrifugacsöveket ki kell egyensúlyozni! • A laboratóriumban elsősegélydobozt és közömbösítő oldatokat helyeztünk el. A közömbösítő oldatok közül lúgmaráskor 0,5 %-os ecetsavat savmaráskor 2 %-os szódabikarbónát szemlúgmaráskor 2 %-os bórsavat szemsavmaráskor 2 %-os bóraxot használjunk. • A balesetveszélyt és a baleseteket mindig komolyan kell venni. Minden sérülést azonnal jelenteni kell a gyakorlatvezetőnek.

9

1.

PLAZMOLÍZIS VIZSGÁLATOK

A növényi sejtek membránjainak permeabilitása (áteresztőképessége, átjárhatósága) és a permeabilitást befolyásoló különböző tényezők hatása, jól megfigyelhető a plazmolízis tanulmányozásával. Plazmolízis (plazma „leoldás”) előidézéséhez az élő sejteket a sejtnél negatívabb vízpotenciálú oldatba (plazmolitikum) kell helyezni. A plazmolízis jelenségének oka az, hogy az alkalmazott plazmolitikum hatására a sejt vizet veszít mind a plazmából, mind a vakuólumból, így térfogatcsökkenés következik be. A sejt citoplazmájának nagymértékű zsugorodását a sejtfal egy idő után nem tudja követni, így elkülönülnek, elválnak egymástól. Ez a folyamat mikroszkóposan is jól követhető. (Megjegyezzük, hogy a citoplazmához való tapadása miatt a sejtfal először enyhén bedomborodik, kissé negatívvá válik a nyomáspotenciál (ψp), de ha az oldott anyagok át tudnak diffundálni a sejtfalon, akkor a sejtfal és a citoplazma kezd elválni egymástól, és a sejtfal visszatér az eredeti helyzetébe.) A plazmolízis bekövetkeztének két fontos feltétele van: 1. a sejtfal legyen átjárható a plazmolitikum számára, hogy bejuthasson a sejtfal és a plazmalemma közé. 2. Tartós plazmolízis bekövetkezésének feltétele az is, hogy a plazmolitikum oldott anyaga ne tudjon áthatolni a plazmalemmán, különben a plazmolízis legfeljebb átmeneti lesz: a víz gyorsabban jut ki a sejtből, mint ahogy oda a külső oldott anyag behatol; ám később a plazmolízis fokozatosan megszűnik a plazmolitikum oldott anyagának bejutása és az ezt követő vízvisszaáramlás miatt, más szóval deplazmolízis következik be. Deplazmolízis következik be akkor is, ha a plazmolizált sejtet tiszta vízbe helyezzük. Az alkalmazott plazmolitikumtól, az abban található ionoktól függően a plazmatömlő zsugorodásának morfológiája különbözik, így a plazmolízisnek különböző típusai jöhetnek létre. Határplazmolízisről beszélünk, ha a plazmolízis olyan kismérvű, hogy a citoplazma csak a sarkokban válik le kissé a sejfaltól.

10

1. ábra Határplazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat) Az 1. ábrán a hagyma (Allium cepa) epidermisz-nyúzatának sejtjeiben a sejtüreget hatalmas antociános vakuólum tölti ki, a vékony plazmatömlő a sejtfalhoz szorul. (A mikroszkópban az alkalmazott kezelés esetén általában csak a színes vakuólumot látjuk. A citoplazmát csak a sapkaplazmolízisnél figyelhetjük meg jól.) Konvex plazmolízis jön létre akkor, ha a plazmolitikum alkáli ionokat (K+, Na+) tartalmaz nagy koncentrációban.

2. ábra Konvex plazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat) A plazmolízis ezen típusa esetében a plazmatömlő lekerekített, gömb, vagy ovális alakzatot vesz fel. A jelenség magyarázata az, hogy az alkáli ionok bizonyos fokban hígítják a plazmát, csökkentik annak viszkozitását és ezért a plazmatömlő a felületi feszültség hatására gyorsan legömbölyödik. A viszkozitás csökkenését az idézi elő, hogy a kis ionsugárral rendelkező alkáli ionok erősen hidratált állapotúak, vastag vízburok veszi körül őket, és ez a plazmatömlő „hígulását” idézi elő. Az ionok hidratáltsági állapota révén felvett víz mennyisége azonban kisebb, mint a sejtből eltávozott víz mennyisége, és létrejön a plazmatömlő zsugorodási jelensége. A konvex plazmolízis visszafordítható állapota a sejteknek.

11

Konkáv plazmolízis jön létre akkor, ha a plazmolitikumként alkalmazott oldat alkáli földfém ionjait (pl. Ca++) tartalmazza.

3. ábra Konkáv plazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat) A konkáv plazmolízis során a citoplazma a sejtfalról csipkés, konkáv felszínek kialakításával válik le, a plazmalemma bizonyos pontokon (valószínűleg a plazmodezmák mentén) a sejtfalhoz tapad. A sejtfalról leváló plazmát helyenként plazmaszálak (Heckt-féle fonalak) kötik a sejtfalhoz. Az alkáli földfém ionok a citoplazma állományát tömörítik, szemben az alkáli ionokkal, növelik annak viszkozitását. A plazmatömlő a sejtfal felszínéhez nem egyforma erővel tapad mindenhol, így a zsugorodáskor a már említett "csipkés" konkáv felszínek jönnek létre. A viszkozitás-növelő hatás magyarázata az, hogy az alkáli földfém ionok, pl. a kalcium ionok nagyobb ionsugárral és vékonyabb hidrátburokkal rendelkeznek, mint az alkáli ionok, ezek térbelileg közelebb kerülnek a plazmakolloidokhoz, azok töltéseit befolyásolhatják, minek következtében a plazma-részecskék hidratációs köpenye vékonyodik, mely fokozza a plazma viszkozitását, így a zsugorodási hatást fokozza. A konkáv plazmolízis visszafordítható állapota a sejteknek. Megjegyezzük, hogy a plazmolízis kezdetben a plazmolitikumtól függően hosszabb-rövidebb ideig konkáv formájú de később, a kontrakció előrehaladtával - a felületi feszültség hatására - konvex formába mehet át. Sapkaplazmolízis

a

konvex

plazmolízis

egy

különleges

formája,

amely

káliumrodanidot (káliumszulfocianid, KSCN) tartalmazó plazmolitikummal idézhető elő és kialakulásában a határhártyák eltérő permeabilitásának is szerepe van. A folyamat konvex plazmolízisként kezdődik, majd a sejtüreg közepére zsugorodott plazmatömlő két vége eleinte félhold, majd sapkaszerűen vastagodni kezd. A sapkaplazmolízis jelensége azzal magyarázható, hogy a plazmolízis alatt a

12

plazmalemma áteresztőképessége fokozódik - a tonoplaszté még nem - és így a citoplazmába bejutott, de onnan a tonoplaszt ellenállása miatt a vakuólumba tovább jutni nem képes kálium és rodanid ionok erősen duzzasztják a fehérjéket. Ennek a duzzasztó hatásnak az eredménye a sejt két végében, a hossztengely irányában kialakuló sapka. A duzzadás következtében a citoplazma rövid idő múlva az egész sejtlument kitölti (→tonoplasztplazmolízis). A folyamat alatt a vakuólum térfogata nem változik meg jelentékeny mértékben, amit azzal magyarázhatunk, hogy szemben a plazmalemmával a tonoplaszt még megőrizte féligáteresztő képességét. A tonoplaszt nagyobb ellenállása - melynek a sejt normális működése szempontjából jelentősége van, hiszen a vakuólumban a citoplazma számára mérgező anyagok is tárolódnak - elsősorban a két membrán kémiai összetételében lévő különbségből adódik és nem azok vastagságából. (A plazmalemma átlagos vastagsága: ≈10 nm, a tonoplaszté: ≈7,5 nm, a tonoplaszt több lipidet tartalmaz.) A sapkaplazmolízis a sejtek visszafordítható állapota.

4. ábra Sapkaplazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat) Tonoplasztplazmolízis a sapkaplazmolízis fokozott változata, amikor a megduzzadt plazma teljesen kitölti a vakuólum és a sejtfal közötti teret. Pl. a káliumrodaniddal váltható ki. Tonoplasztplazmolízis akkor lép fel, amikor már csak a tonoplaszt az egyedül működő membrán. A folyamat elején a vakuólum összehúzódik, - a citoplazmába került ionok hatására a vakuólumból víz áramlik ki - miközben a citoplazma térfogata növekszik. Későbbiekben a tonoplaszt is elveszíti szemipermeabilitását és ez a vakuólum duzzadásához, végül a tonoplaszt szétszakadásához vezet.

13

A sapka- és a tonoplasztplazmolízissel egyidejűleg megváltozik a sejtmag alakja is. Először megduzzad, majd a sejtmaghártya szétreped és a sejtmagtartalom kiömlik. Ezt nevezzük karioptízisnek. A plazmolízis jelenségét különböző sejtélettani vizsgálatoknál gyakran használják: - a növényi sejt élő állapotának vizsgálatához (Csak élő sejt mutat plazmolízis jelenséget, mert az elhalt plazma az oldott anyagokat átengedi, így a koncentrációkülönbség

egyszerű

diffúzióval

kiegyenlítődhet.

Az

élő

sejt

membránja

szemipermeábilis (féligáteresztő), míg az elölt, vagy elhalt sejt membránja elveszti e tulajdonságát és permeábilissé lesz.) - a sejt permeabilitási viszonyainak tanulmányozására - a sejtek ozmotikus potenciál értékének mérésére - a citoplazma viszkozitásának jellemzésére, melynek a növény hő-, fagy- és szárazságtűrésében lehet szerepe. Néhány oldott anyag (pl. alkoholok) olyan gyorsan lép be a sejtbe, hogy plazmolízis egyáltalán nem jön létre. Ezek rendszerint irreverzibilis membrán károsítók és a növényi sejt pusztulását okozzák. Vannak olyan anyagok is (pl. a PEG = polietilén-glikol), amelyek nagy méretük miatt nem jutnak át a citoplazma membránon és a sejt zsugorodását okozzák. Ez a citorrízis jelensége. Ilyenkor – plazmadús, fiatal sejteknél - a protoplazma zsugorodásakor magával húzza a sejtfalat. Megjegyezzük, hogy a tartós zsugorodott állapot a sejt pusztulását okozhatja. A plazmolízis ritka jelenség a természetben, de átmenetileg kialakulhat, ha a külső ozmotikus potenciál (ψπ) gyorsan csökken, pl. amikor sós mocsárból forró napokon víz párolog el. Előfordulhat, hogy a sejtek hipotóniás környezetbe kerülnek, melynek hatására a citoplazma „cseppek” formájában kiáramlik a sejtekből. A jelenséget plazmoptízisnek nevezzük.

14

A növények az ozmoregulációnak nevezett jelenséggel képesek a környezeti ozmotikus változásokból adódó káros hatások kivédésére. Érdekességként

megjegyezzük

hogy

a

protoplasztok

(sejtfalnélküli

sejtek)

előállításának egyik korai lehetősége az volt, hogy a szöveteket plazmolizálták, majd metszeteket

készítettek.

Ilyenkor

azokból

a

sejtekből,

amelyeknél

a

metszetkészítésre használt eszközzel csak a sejtfalat vágták át - és az összezsugorodott plazmatömlőt nem sértették fel - ép protoplasztokat lehetett kinyerni.

(A

növénybiotechnológiában

alkalmazott

protoplasztfúziókhoz

-

pl.

szomatikus hibridek előállításához - ma már a protoplasztokat a sejtfal enzimatikus lebontásával állítják elő.)

1/a

Élő és elhalt szövetek permeabilitásának vizsgálata; a konkáv, a konvex és a deplazmolízis tanulmányozása

Színes, antociános hagyma-boruléklevelek domború, sötétvörös felületét szikével kis négyzetekre osztva gyengén bevágjuk, s az így körülvágott kis epidermisz darabkákat csipesszel leemeljük. Az epidermisz darabkákat tárgylemezre cseppentett vízben lefedve vizsgáljuk. Mikroszkóp alatt kiválasztunk egy egysejtsoros,

ép

sejtű,

antociántartalmú

nyúzatrészt és lerajzoljuk. A továbbiakban újabb epidermisz darabkákat helyezünk tárgylemezre és 10 %-os KNO3, illetve egy másik tárgylemezen 10 %-os CaCl2 oldatot cseppentünk rájuk, majd fedőlemezzel lefedjük mindegyiket. A változást megfigyeljük és lerajzoljuk, a változáshoz szükséges időtartamot feljegyezzük. Konkáv plazmolízist a CaCl2-vel, a konvex plazmolízist a KNO3-mal kezelt preparátumokon tanulmányozhatjuk. Bizonyos időn belül a plazmolizált, de élő sejtek képesek újból vizet felvenni; ez a deplazmolízis. A vizsgálatokat úgy végezzük, hogy a plazmolitikummal kezelt és már plazmolizálódott preparátumra, a fedőlemez mellé

15

vizet cseppentünk, amit szűrőpapírral átszívatunk. Néhány perc múlva a sejtek ismét eredeti turgorállapotba kerülnek. Helyezzünk néhány nyúzatdarabot 2-3 percre forró vízbe, majd ezeket is kezeljük a fenti plazmolitikumokkal. Ebben az esetben plazmolízis nem következik be, mivel a forralással megszüntettük a plazmahártyák szemipermeabilitását. A megfigyelteket rajzoljuk le, és a jelenségeket értelmezzük! Ügyeljünk a sejthártyák helyes rajzolására!

1/b

Sapka- és tonoplasztplazmolízis vizsgálata káliumszulfocianiddal

Antociános vöröshagyma epidermisznyúzatára 10 %-os káliumszulfocianid (KSCN)oldatot cseppentünk, fedőlemezzel lefedjük és mikroszkópba tesszük. Néhány másodperc múlva beáll a konvex plazmolízis, majd 10-20 perc múlva a sapkaplazmolízis. A sapkaplazmolízis előkészítése során ügyeljünk arra, hogy a sejtek környezetébe ne kerüljön pl. csapvízből, vagy vegyszerből származó Ca++, az ugyanis a K+ ionok duzzasztó hatását és ezzel a sapkaplazmolízis kialakulását képes meggátolni. Okulármikrométer alkalmazásával jól megfigyelhető a plazma további duzzadása, és 15-20 perc elteltével a megduzzadt plazma teljesen kitölti a plazmolizált vakuólum és sejtfal közti teret. (Ez a sapkaplazmolízis fokozott változata, amit az irodalomban „tonoplasztplazmolízisnek” is neveznek.) Amíg azonban a sapka tovább duzzad, a vakuólum,

illetve

az

azt

körülvevő

tonoplaszt

jó

ideig

megtartja

eredeti

plazmolízisfokát. Megfigyeljük a mikroszkópi képet, tapasztalatainkat rögzítjük, a jelenséget lerajzoljuk. 1/c

Ca++-ionok jelentősége a plazmolíziskor fellépő határhártya-sérüléseknél

A növényi sejt plazmolízisekor a zsugorodó citoplazmafelületen, elsősorban plazmalemmán, sérülések jönnek létre. A keletkezett szakadások azonban a rendszerben

jelenlevő

Ca++-ionok

hatására

azonnal

regenerálódnak.

Ezen

16

„regenerációs” jelenség oka a felületi precipitáció, ami Ca++-ionok jelenlétében megy végbe. Allium cepa antociános epidermiszéből nyúzatokat készítünk, amelyekből néhányat 2 M-os karbamid-oldatban tárgylemezen lefedünk. Megfigyeljük a plazmolízis idejét, és milyenségét. A több nyúzat közül 3 darabot (amelyeket még nem kezeltünk karbamiddal) 0,1 M-os nátrium-oxalát-oldattal kezelünk 1 percig. Mivel az oxalátionok a felületi rétegben elhelyezkedő Ca++-ionokkal oldhatatlan Ca-oxalát csapadékot adnak, ilyen módon mintegy eltávolítjuk a citoplazmafelületek felületi precipitációjához feltétlenül szükséges Ca++-ionokat. A kezelt nyúzatdarabok közül egyet 2 M-os karbamid-oldattal, egyet 1 M-os CaCl2oldattal kezelünk. Megfigyeljük a plazmolízis típusában beálló változást, és a folyamat idejét is rögzítjük. A harmadik nyúzatdarabot mossuk ki csapvízzel! A csapvíz nagy mennyiségű Ca++-iont tartalmaz. Az így előkészített nyúzatdarabot plazmolizáljuk 2 M-os karbamid-oldattal és figyeljük meg a plazmolízis idejét és típusát. Indokoljuk részletes magyarázattal a lejátszódott folyamatokat! Megjegyzés: A plazmolízis idejét a plazmolitikum hozzáadásától kezdve számítjuk addig, amíg a nyúzatdarab közepén elhelyezkedő sejtek is plazmolizálódnak és a jelenségre jellemző képet veszik fel. Anyagok és eszközök vöröshagyma (lila húsú) 10 %-os KNO3-oldat, 10 %-os CaCl2-oldat, 10 %-os KSCN-oldat, 2 M-os karbamid, 0,1 M-os Na-oxalát, 1 M-os CaCl2-oldat tárgylemez, fedőlemez, lándzsatű, vegyszeres kanál, csipesz, fogászati csipesz, szike, szűrőpapír, főzőpohár, cseppentő, mikroszkóp, üvegbot, óraüveg

17

2.

TRAUBE-FÉLE SEJT TANULMÁNYOZÁSA

Ismeretes, hogy a sejtben előforduló plazmahártyák nem tökéletes féligáteresztők, azaz egy idő után elveszítik ezt a tulajdonságukat. Olyan hártyát, amely az oldatból csak az oldószert engedi át - és ezt a tulajdonságot hosszabb ideig is megtartja csak mesterségesen tudunk készíteni. Így pl., ha 4 %-os CuSO4 oldatot tartalmazó kémcsőbe sárgavérlúgsó K4Fe(CN)6-kristálykákat dobunk, vagy vízüveg-oldatba CoCl2, illetve FeCl3-kristálykákat szórunk, akkor a kristályok felületén „tökéletes” szemipermeábilis hártya jön létre. Magyarázat: A sárgavérlúgsó-kristályka a rézszulfát oldatban az érintkezési felületen rézferrocianid hártyát képez: K4Fe(CN)6 + 2 CuSO4 = Cu2Fe(CN)6 + 2 K2SO4 E szemipermeábilis hártyán belül a kristályanyag (sárgavérlúgsó) koncentrált oldata keletkezik, ami az ozmózis törvényei szerint vizet vesz fel. A belső feszültség következtében létrejött térfogat-növekedés hatására a hártya el is szakadhat, de a külső és belső oldat érintkezési felületén félig áteresztő hártya, illetve új tömlő képződik. A folyamat akkor szűnik meg, amikor a külső ozmotikus potenciál lényegében azonos lesz a hártya, illetve a tömlő belsejében uralkodó ozmotikus potenciállal. Ekkor a ki- és bediffundálódó oldószer között dinamikus egyensúly áll be. A vízüvegoldat és a CoCl2-, illetve FeCl3-rendszer viselkedésének magyarázata ugyanaz a következő egyenletek szerint: CoCl2 + Na2SiO3 = Co(SiO3) + 2 NaCl 2 FeCl3 + 3Na2 SiO3 = Fe2(SiO3)3 + 6 NaCl A jelenséget megfigyeljük és lerajzoljuk a Traube-féle sejteket. Anyagok és eszközök K4(Fe(CN)6 kristályos, CoCl2-kristály, FeCl3-kristály, 4 %-os CuSO4-oldat, vízüveg kémcsövek, kémcsőállvány, vegyszerkanál

18

3.

CITOPLAZMA-VISZKOZITÁS VIZSGÁLATA

Az élő állapotú sejtekben a kloroplasztiszok közel egyenletesen oszlanak el. Az ilyen sejtek centrifugálása során a kloroplasztiszok ülepedni kezdenek, ülepedésük a citoplazma viszkozitásának függvénye. Ha a sejteket a citoplazma viszkozitását befolyásoló anyagokkal kezeljük, a viszkozitást változtató hatásnak megfelelően változik a kloroplasztiszok ülepedési folyamata is. Ez a jelenség tanulmányozható kálium és kalcium ionok hatásának kitett sejtekben, ugyanis kálium ionok hatására csökken, kalcium ionok hatására nő a citoplazma viszkozitása. A munka menete 1. Vallisneria spiralis leveleiből kis darabot kivágunk és azt tárgylemezre helyezzük. (A Vallisneria az akváriumok kedvelt vízinövénye.) 2. Szikével az epidermiszt és az alatta elhelyezkedő asszimiláló szövet felső rétegét lekaparjuk, így elérhető, hogy 1-2 sejtsornyi réteget kapjunk. 3. A kaparékot eltávolítjuk és a levéldarabot vízzel lecseppentve lefedjük, mikroszkóppal megfigyelhető, hogy a kloroplasztiszok a citoplazmában közel egyenletes eloszlásban vannak. (20x-os nagyítású objektívet használunk, hogy nagyobb területről nyerjünk áttekintést.) A látott mikroszkópos képet rajzoljuk le! 4. Egy-egy levéldarabot műanyag-centrifugacsőbe erősítünk leukoplaszttal úgy, hogy a levél tengelye a csőtengellyel párhuzamosan helyezkedjen el. 5. Az egyik centrifugacsőbe 0,2 n káliumnitrátot, a másikba pedig 0,2 n kalciumnitrátot öntünk addig, hogy a leveleket az oldatok elfedjék. Ezt követően kb. fél óráig állni hagyjuk az anyagokat. 6. A centrifugacsöveket táramérlegen kitárázzuk, majd 1000-1500 fordulat/perc fordulatszámmal centrifugáljuk a csöveket 10 percig.

19

7. A leveleket az 1.-3. pontig leírtak szerint mikroszkóppal megvizsgáljuk, azzal a különbséggel, hogy nem vízzel, hanem a megfelelő oldattal cseppentjük le a vizsgálati anyagot a lefedés előtt. Mindkét preparátum mikroszkópos képét lerajzoljuk a jegyzőkönyvbe. A kísérletet nagyobb fordulatszámmal is elvégezhetjük. A plazma viszkozitásának jellemzésére azt a fordulatszámot használhatjuk, amelyiknél a kloroplasztiszok elmozdulása észlelhetővé vált. Anyagok és eszközök Vallisneria spiralis 0,2 n káliumnitrát, 0,2 n kalciumnitrát mikroszkóp, tárgylemez, fedőlemez, centrifuga, centrifugacső, táramérleg, szike

20

4.

NÖVÉNYI SZÖVETEK VÍZPOTENCIÁLJA (ψ) ÉS ANNAK MÉRÉSE

A vizes oldatnak egy rendszer bármely pontján és a tiszta víznek ugyanolyan hőmérsékleten

és

légköri

nyomáson

mért

kémiai

potenciál-különbségét

vízpotenciálnak (ψ = pszí) nevezzük. A tiszta víz kémiai potenciálját 25°C-on 1 bar (= 102 kPa) nyomáson 0-nak veszik. A vízpotenciál kifejezésére az energia/térfogat, azaz

a

nyomás

mértékegységeit

használjuk

(bar,

Pa).

A

víz

mindig

a

szabadenergiatartalom-csökkenés irányába, vagyis a negatívabb vízpotenciálú hely felé mozdul el. A vízpotenciállal kapcsolatos összefüggések levezetését a fizikaikémia tárgyalja. A vízpotenciált alapvetően meghatározza: 1. a vízmolekulák kötéseiben jelenlévő, munkára felhasználható energiamennyisége (szabadenergia = kémiai potenciál) 2. a vízmolekulák mennyisége (koncentráció). A víz koncentrációja a tiszta vízben a legnagyobb, oldott anyagok, vagy valamilyen mátrix (pl. kolloid részecske, elektromos töltésű felszín, kapilláris, amihez kötődnek a víz molekulák) jelenléte csökkentik a rendszerben lévő víz mennyiségét és a vízgőznyomást. Ez a vízgőznyomás-csökkenés felel meg az ozmotikus és a mátrixpotenciálnak. A vízpotenciál (ψ) a növényi sejtre alkalmazva a következő részpotenciálokból tevődik össze: ψ = ψp - ψπ - ψm ahol ψp = nyomáspotenciál, ψπ = ozmotikus potenciál, ψm = mátrix potenciál Az ozmotikus potenciál és a mátrixpotenciál mindig negatív szám, vagy nulla. Az ozmotikus és mátrixpotenciál (vízgőznyomás csökkenések) miatt a sejtekbe vízbeáramlás történik, ami egy belső hidrosztatikai nyomást, a nyomás potenciált hozza létre. A nyomáspotenciál pozitív szám, vagy nulla, ha negatív fali nyomás nincs. A xilémben azonban a nyomáspotenciál általában negatív a transzspiráció alatt, de pozitív is lehet a gyökérnyomás eredményeként a guttáló növényekben. A három részpotenciál értékének összege (a vízpotenciál) negatív szám, kivéve a

21

teljes turgor állapotában lévő sejtet, ahol a vízpotenciál nulla. Ebben az esetben a pozitív nyomáspotenciál kiegyenlíti a negatív ozmotikus és mátrixpotenciált. Noha a vízpotenciál kifejezést mint modern termodinamikai fogalmat már az 1960-as évek végén bevezették, még ma is előfordul, hogy a modern és a klasszikus fogalmakat keverten használják. E fogalmak az alábbiak szerint felelnek meg egymásnak. (A táblázatban felsoroltakon kívül még egyéb elnevezések, rövidítések is előfordulnak.) modern (termodinamikai) fogalom vízpotenciál (ψ)

klasszikus fogalom szívóerő (S vagy SZ) vagy diffúziós nyomás különbség (DPD) S = DPD = -ψ

ozmotikus potenciál (ψπ) vagy

ozmotikus nyomás, ozmotikus érték (π)

oldatpotenciál (ψs)

π = - ψπ = - ψs

nyomáspotenciál vagy fali nyomás (ψp)

turgornyomás (P)

mátrixpotenciál (ψm)

nincs megfelelője

A vakuolizált sejt vízpotenciálját nagyrészt a sejtnedv vízpotenciálja szabja meg. A sejt vizet vesz fel a sejtnedvnél nagyobb vízpotenciálú oldatból, és vizet ad le az annál kisebb (negatívabb) vízpotenciálú oldatba. A sejtek és szövetek vízpotenciáljának mérésére szolgáló eljárások többsége olyan közeg vízpotenciáljának a meghatározásán alapul, amelyből a sejt vagy a sejtek nem vesznek fel, de nem is adnak le vizet. Lehetetlen megmérni a sejtek vízpotenciálját egy sértetlen soksejtű növényben, mivel a potenciál rögtön változni kezd a szövet kimetszésekor, egyebek között a szöveti tenzió megszűnése és a párologtatás miatt, az izolált szövetekkel végzett mérések csak megközelítőleg adják meg a pontos értéket. Fontos, hogy a szövet kimetszése után olyan gyorsan el kell végezni a mérést, amilyen gyorsan csak lehet.

22

4/a

Vízpotenciál meghatározására alkalmas módszerek

A. Térfogatmérő módszerek Ld. 4/b feladatnál leírtakat. Ha a szövet szerkezete nem homogén, azaz az egyik oldalán merev kutikula vagy vastag falú sejtek akadályozzák a duzzadást vagy a zsugorodást, a másik oldalon levő sejtek vízpotenciálja megbecsülhető a különböző ozmotikus potenciálú oldatokba merítés okozta elgörbülés mértékéből. Annak az oldatnak, amelyben egy egyenes szövetdarab nem görbül meg, a vízpotenciálja megközelítőleg ugyanolyan, mint a bele helyezett sejteké. B. Gravimetriás módszer Mérlegen

pontosan

lemért

szövetszeleteket

ismert

ozmotikus

potenciálú

oldatsorozatba helyezik. Körülbelül egy óra múlva a szövetszeleteket kiveszik az oldatból, a felszínéről a nedvességet szűrőpapírok között leitatják, s újra lemérik a tömegét. Annak az oldatnak a vízpotenciálja azonos a szövetével, amelyben nem következik be tömegváltozás. Vízbe merítés helyett a szöveteket különböző gőznyomás mellett nedves levegőn is hagyhatjuk. A szövetből a levegőbe vagy a levegőből a szövetbe áramló víz mennyisége a szövet és a levegő vízpotenciál különbségétől függ. Ügyelni kell arra, hogy a hőmérsékletet nagyon pontosan ellenőrizzük, mert a vízpotenciál és a gőznyomás közötti viszony a hőmérséklet változásával módosul. C. Csardakov-módszer Ismert vízpotenciálú nádcukor vagy mannitol oldatsorozatot valamilyen színezékkel, például metilénkékkel megfestjük. Az ismeretlen vízpotenciálú szövetet először ismert vízpotenciálú festetlen oldatokba helyezzük körülbelül egy órára, amíg az egyensúlyi állapot kialakul. Ezután a szövetet kivesszük az oldatból és a megfelelő

23

ozmotikus potenciálú, megfestett oldatokból egy cseppet adunk pipettával mindegyik oldat felszíne alá. Ha a szövet vizet vett fel az oldatból, az oldat koncentrációja és sűrűsége is növekedni fog, s így a festett csepp emelkedni kezd, míg ha a szövet vizet vesztett, azaz az oldat hígult, a festett csepp ennek mértékében süllyed. Annak az oldatnak a vízpotenciálja egyezik meg a szövet vízpotenciáljával, amelyben a megfestett oldat úgy diffundál szét a cseppből, hogy az közben se nem süllyed se nem emelkedik. D. Refraktométeres módszer Ld. 4/c feladatnál leírtakat. Az

oldat

víztartalmának

élő

szövet

jelenlétében

bekövetkező

változása

refraktométerrel is nyomon követhető. Amikor a törésmutató nem változik, akkor azonos a sejtek vízpotenciálja a velük érintkező oldat vízpotenciáljával. E. Pszichrometriás módszer Az oldat ozmotikus potenciáljához hasonlóan a szövetdarabok vízpotenciálja is megmérhető termoelemes légnedvességmérő készülékkel. Ha annak a szövetnek, amelyből víz párolog el a nedves levegőbe, megmérjük a hőmérsékletét, és azt összevetjük ugyanilyen körülmények között elhelyezett ismert ozmotikus potenciálú oldatok hőmérsékletével, az adatokból a szövet vízpotenciálja kiszámítható. A rendelkezésre álló módszerek közül ezzel az eljárással lehet a vízpotenciált a legpontosabban meghatározni.

24

F.

Nyomáskamra módszer

5. ábra A leveles hajtás vízpotenciáljának mérésére használatos nyomáskamra vázlata E módszer lényege, hogy egy 5000 kPa gáznyomásnak is ellenálló kamrába úgy helyeznek el egy levelet, vagy egy leveles szárat, hogy a levélnyél, vagy a szár vágott vége kiáll az edény szájára rögzített zárószerkezetből. Ezután valamilyen inert gázt, például nitrogén gázt engednek a kamrába, s a gáz nyomását addig növelik, míg folyadék nem jelenik meg a növénynek a kamrából kiálló vágott felületén. Ekkor egyensúlyi helyzet áll fenn, a levél sejtjei és a farészben levő nedv között, és a gáz nyomás pontosan ellensúlyozza a levél sejtjeinek a vízpotenciálját. (Forrásmunka: Sutcliffe, J. F. 1982. A növények és a víz. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest)

4/b

Burgonyagumó vízpotenciáljának meghatározása méretváltozás alapján

A mérés lényege, hogy eltérő koncentrációjú, de ismert vízpotenciálú cukoroldatsorozatba szövetdarabokat helyezünk és megfigyeljük a szövetdarabok méretének változását.

A

szövetdarabok

méretváltozását

az

okozza,

hogy

a

szövetdarab/cukoroldat határfelületen a víz - a termodinamika törvényének

25

megfelelően

-

a

negatívabb

potenciálú

hely

felé

áramlik.

Ezért

a

szövetdarab/cukoroldat relatív vízpotenciál értékeknek megfelelően a szövet duzzad, vagy zsugorodik. Amelyik oldatban a burgonyaszelet meghosszabbodik, annak a vízpotenciálja pozitívabb, mint a sejtek vízpotenciálja, amelyikben megrövidül, ott a cukoroldat vízpotenciálja negatívabb, mint a sejtek vízpotenciálja, amelyik oldatban hossza nem változik, - izoozmotikus - annak értéke azonos a sejtével. A szövet vízpotenciálja (szívóereje) egyenlő ezen oldat bar-ban kifejezett vízpotenciáljával. Valamely

sejt

vagy

szövet

vízpotenciáljának

nagysága

tehát

azon

oldat

vízpotenciáljával egyenlő, amelyben mérete, térfogata vagy tömege nem szenved változást. A munka menete 1 térfogatmólos nádcukoroldatból kémcsövekben 0,1 M-tól 1,0 M-ig terjedő hígítási sorozatot készítünk (10-10 ml-t) 0,1 mólos emelkedéssel. A hígítási sorozatot duplán készítsük el, mert a feladat "B" részénél szükség van egy kontroll sorozatra is. Nagyméretű burgonyagumóból négyzetes alapterületű szövetoszlopokat vágunk ki. A szövetoszlopok végét az egyik oldalon lévő két távolabbi szemközti élre kihegyezzük, majd az így előkészített, kb. 2-3 cm-es, de azonos méretű darabok hosszát üveglap alatt elhelyezett mm-papíron megmérjük. A szövetoszlopok előkészítésével és a méréssel igyekezzünk, a kiszáradást el kell kerülni! Az első hígítási sorozat mindegyikébe egy-egy szövetoszlopot helyezünk, és a kémcsöveket gumidugóval bedugaszoljuk. 1-1,5 óra múlva a szövetoszlopok hosszát ismét megmérjük oly módon, hogy a bedugaszolt kémcsöveket mm-papírra helyezzük, és az előző méréspontok távolságát ismét leolvassuk és feljegyezzük. (A mérést azért végezzük ily módon, mert az oldatból eltávolított szeletek leitatásakor a szövetekre ható nyomás nagymértékben befolyásolja az eredményeket.) A kísérlet végén a burgonya-oszlopokat vegyük ki a cukoroldatból és a koncentráció növekvő sorrendjében, helyezzük az oszlopokat üveglapra. Fél óra múlva figyeljük meg az egyes oszlopok színváltozását. Adjunk rá magyarázatot!

26

4/c

Burgonyagumó vízpotenciáljának meghatározása refraktométeres méréssel

Az előzőekben leírt vizsgálat értékelését refraktométerrel is elvégezzük. A mérésekhez ABBE-féle refraktométert használunk. A cukoroldat törésmutatója a koncentrációval nő, minél töményebb az oldat, annál nagyobb a törésmutató értéke. Mérjük meg a tiszta cukoroldat-sorozat (kontroll) törésmutatóját, majd a gyakorlat végén a burgonyaszeleteket tartalmazó oldatokét! A cukoroldatok közül azt kell kiválasztani, amelyiknek a törésmutatója nem változott meg a burgonyaszelet jelenlétében. A refraktométer használatát a gyakorlatvezető mutatja meg. A feladat "b" és "c" részének közös értékelése: A kísérlet elejéről és végéről származó mérési eredményeket foglaljuk táblázatba és állapítsuk meg a szövet vízpotenciál értékét a mellékelt táblázat segítségével!

Szacharóz oldat koncentrációja (mól/liter)

vízpotenciálja (ψ ψ) barban 20°°C-on

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

-2,67 -5,36 -8,24 -11,26 -14,50 -18,01 -21,77 -25,87 -30,09 -35,05

Burgonya-oszlop mérete a kísérlet elején (mm)

a kísérlet végén (mm)

különbség (∆ ∆)

A szacharóz oldat törésmutatója burgonya nélkül a kísérlet elején

burgonyával a kísérlet végén

Izoozmotikus oldat:................................mól/liter Burgonya szövetének vízpotenciálja:........................bar

Anyagok és eszközök burgonya gumó

különbség (∆ ∆)

27

1,0 M-os szacharóz oldat, aceton kémcsövek, kémcsőállvány, szike, cseppentő, főzőpohár, 2db 10ml-es pipetta, mmpapír,

burgonyavágó,

refraktométer, törlőruha

vatta,

üveglap,

dugók,

csipesz,

üvegbot,

ABBE-féle

28

5.

NÖVÉNYI SZÖVETEK OZMOTIKUS POTENCIÁLJÁNAK (ψπ) MÉRÉSE

5/a

Ozmotikus potenciál mérésére alkalmas módszerek

A. Sejtnedvextrakciós módszer A magasabbrendű növények sejtjeiből nehéz tiszta sejtnedvet kivonni. Egyik különleges módszer az, amikor levéltetvek segítségével nyerik ki az ép növény háncsrészében levő rostacsövekben található nedvet. A levéltetű beszúrja szipókáját egy edénnyalábba, s megkeres vele egy rostacsövet. Ha ilyenkor átmetszik az állat szipókáját, a szipóka növényben maradt csonkján keresztül egy cseppnyi nedv préselődik ki a háncsrészből. Ez az eljárás nem terjedt el. A leggyakrabban egyszerűen kipréselik a sejtnedvet a parenchímasejtekből. Óvatosan kell eljárni, hogy a sejtek minél kevésbé roncsolódjanak. Ezért a présbe helyezett szöveteket fokozatosan növekvő nyomással préselik. A membránok úgy tehetők permeábilissé az oldott anyagokra, hogy a szövetet megfagyasztják, majd kiolvasztják. Az extrahált sejtek ozmotikus potenciálja krioszkópos

eljárással

(ld.

a

feladat

5/b

részénél),

ozmométerrel

vagy

pszichrométerrel határozható meg. B. Plazmometriás módszer Ez az eljárás egyedi sejtek vizsgálatára alkalmas. Az eljárás lényege, hogy a vakuólum térfogatát (Vt) megmérik, majd a sejtet ismert ozmotikus potenciálú oldatba (ψe) helyezik. A plazmolízis után újra meghatározzák a vakuólum térfogatát (Vp). A sejtnedv ozmotikus potenciálját (ψπ) a következő képlettel számolják ki: ψπ = ψe . [Vp/Vt] Föltéve, hogy egyensúlyi állapotban a plazmolizált sejt sejtnedvének a vízpotenciálja egyenlő ψπ -vel, azaz a citoplazmatikus nyomás és a mátrixpotenciál figyelmen kívül hagyható.

29

E módszerrel csak olyan sejtek esetében várható elég pontos eredmény, amelyek szabályos alakúak, és ezekből is csak akkor, ha a plazmolizált protoplazma hozzávetőleg szintén szabályos alakú, úgyhogy a vakuólum térfogata a méretek mikroszkóppal való megméréséből kiszámítható. A gyakorlatban az előnyös, ha a vizsgálandó szövet sejtjeinek egész populációját plazmolizáljuk, s kiválasztjuk közülük azokat a sejteket, amelyeknek szabályos az alakjuk és megfelelően plazmolizálódtak. C. Határplazmolízis módszere Ez az eljárás azon a feltételen alapul, hogy kezdődő plazmolízis esetén a sejtnedv ozmotikus potenciálja egyenlő a külső oldat ozmotikus potenciáljával, azaz a nyomáspotenciál nulla, a mátrixpotenciál és a citoplazma vízpotenciálja pedig elég kicsi, s így eltekintünk tőlük. Mivel elég nehéz meghatározni a plazmolízis kezdőpontját egy-egy sejtben, a módszer főként homogén szövetekben föllelhető sejtpopuláció sejtnedvének átlagos ozmotikus potenciáljának megállapítására való. Az 50 %-os plazmolízisnek megfelelő ozmotikus potenciált tekintik a határplazmolízis esetén a vakuólumban lévő nedv középértékének. (Forrásmunka: Sutcliffe, J. F. 1982. A növények és a víz. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest)

5/b

Növényi

szövetek

ozmotikus

(ψπ)

potenciáljának

meghatározása

krioszkópiával

A

növények

ozmotikus

potenciálja

meghatározható

a

fagyáspontcsökkenés

jelensége alapján. Ismert tény, hogy a híg oldatok ozmotikus potenciálja (oldatpotenciálja) állandó hőmérsékleten arányos az oldatban oldott anyagok koncentrációjával. A nem disszociáló anyagok 1 mólos vizes oldatainak moláris fagyáspont-csökkenése

Tm

=

1,86

°C.

Mivel

az

ozmotikus

potenciál

a

30

koncentrációval arányos, a fagyáspont-csökkenésből (T) koncentrációra, illetve az ozmotikus potenciálra lehet következtetni. Ha tehát egy oldat T-vel jelölt fagyáspontcsökkenését meghatározzuk, ozmotikus potenciálját kiszámíthatjuk abból kiinduIva, hogy 1,86 °C fagyáspont-csökkenésnek 0 °C-on -22,70 bar felel meg. Ha az ozmotikus potenciált 20 °C-ra akarjuk megadni, akkor a Gay-Lussac törvény alkalmazható.

-22,7 . T . → ψπ' =  = - 12,2043 T 1,86 273 + t . ψπ = ψπ'  273

1,86°C T  =  -22,70 bar ψπ'

T = mért fagyáspontcsökkenés (°C) t = hőmérséklet (példánkban t =20 °C) ψπ' = ozmotikus potenciál 0 °C-on (bar) ψπ = ozmotikus potenciál 20 °C-on (bar) A munka menete A gyakorlaton cukorrépa (Beta vulgaris cv. altissima) répatest-présnedvének ozmotikus potenciálját határozzuk meg. A jól fejlett répatest súlypontjából, e feletti és ez alatti részéből kb. 4-5 g-ot Petri-csészébe reszelünk. 10 percig a 3 minta felét főzőpohárban, lefedve 100 °C-on vízfürdőben tartjuk. (Az élő szervekből kipréselt nedv általában kisebb töménységű, mint a megölt szervekből származó présnedv, mert az elhalt membránok elveszítik szemipermeábilis tulajdonságukat.) Várjuk meg, míg a minták kihűlnek, majd darabka géz segítségével készítsünk présnedvet. A 3 minta másik felét - amit nem tartottunk vízfürdőn - közben szintén kipréseljük. Mérjük meg a 6 minta szárazanyagtartalmát kézirefraktométerrel, vagy ABBE-féle refraktométerrel! A mérések között acetonos vattával töröljük le a műszer prizmáját.

31

(A mérés során a minták hőmérsékletében ne legyen nagy eltérés!) Figyeljük meg, hogy a répatest melyik részében található a legtöbb szárazanyag! Krioszkópokban fagyasszuk le a 6 mintát és állapítsuk meg a fagyáspontcsökkenést! A jegyzőkönyvben a 6 minta T, ψπ' , ψπ értékét és a refraktométeren leolvasott értékeket kell megadni.

6. ábra OX-102 típ. krioszkóp Az OX-102 típusú krioszkóp használata A vastag falú hűtőedényt /1/ töltsük meg jégből, konyhasóból és kevés vízből álló hűtőkeverékkel, amelynek a hőmérséklete 5-8 °C-kal legyen a 0 °C alatt. A fedőt tegyük az edényre és nyílásaiba helyezzük el a szerelvényeket. A hűtőkeveréket

32

időnként a keverővel /4b/ keverjük meg és a hőmérsékletét a hőmérőn /8/ kísérjük figyelemmel. A vizsgálandó folyadékból (feladatunkban a cukorrépa présnedvéből) annyit öntsünk a fagyasztóedénybe /3/, hogy a 0,01 °C pontos hőmérő /7/ higanyzsákja teljesen belemerüljön a folyadékba. Ügyeljünk arra, hogy a hőmérő se a fagyasztóedény falához, se a belső keverőhöz /4a/ ne érjen. Ezután állítsuk a fagyasztóedényt a hűtő-kémcső /2/ dugónyílásán keresztül a hűtőköpenybe úgy, hogy a két edény fala egymást ne érintse. Az így összeállított berendezést tegyük a hűtőedény /1/ középső nagy nyílásán keresztül a hűtőkeverékbe. Az összeállítás után a fagyasztóedény tartalmát kevergessük, hogy a vizsgálati anyag egyenletes hűlését elősegítsük. A hőmérséklet csökkenése meglehetősen lassan történik, mert a légköpeny és a fagyasztóedény közti levegőréteg hőszigetelőként szerepel. Amint a folyadék hőmérséklete 0,5 - 1 °C-kal a várható fagyáspont alá süllyed, a belső keverő /4a/ erélyes mozgatásával indítjuk meg a fagyást. A folyadék ugyanis legtöbbször nem fagy meg magától, hanem „túlhűtés” következik be. Ilyenkor a folyadék fagyását könnyebb elindítani, ha a fagyasztóedény /3/ oldalnyílásán keresztül a folyadék megfagyott kristályait, esetleg külön lehűtött üveggyöngyöt juttatunk a túlhűtött folyadékba. A fagyás beálltakor a felszabaduló fagyáshő a hőmérő higanyszálát hirtelen a fagyáspont hőmérsékletére emeli fel, melyen a higanyszál megállapodik. A készülékkel előbb a tiszta oldószer, majd az oldat fagyáspontját az ismertetett módon meghatározva, a mért hőmérsékleti értékek különbségeiből az oldat fagyáspontcsökkenése adódik. (A feladat során a tiszta oldószer fagyáspontját nem kell meghatározni, mert vizes oldatról van szó és tudjuk, hogy a víz fagyáspontja 0°C-on van.) Az eljárás mérési pontossága 1-3 %. (A hűtőedény fedelén külön nyílások vannak a hűtőkeverék hőmérsékletének mérésére szolgáló hőmérő /8/, a megolvadt hűtőkeveréknek a fedő leemelése nélküli eltávolítására alkalmas szivornya /5/ és a gumis pipettát tartalmazó kémcső /6/ részére. Ebben a hűtőkeverék hőmérsékletén tarthatjuk a fagyasztóedénybe /3/ szükség esetén pótlandó anyagot.)

33

Megjegyezés: A módszer hibaforrása az, hogy a préslé egy része nem sejtnedv, hanem a sejtfalból és a plazmából származó "törmelék". E módszer elsősorban erősen vakuolizált szövetekre alkalmazható. Anyagok és eszközök cukorrépa, konyhasó, jég, aceton krioszkópok,

reszelő,

Petri-csésze,

főzőpohár,

kézirefraktométer,

ABBE-féle

refraktométer, kémcsövek, géz, facsipesz, lábas, szike, tölcsér, kémcsőállvány, vegyszerkanál

34

6.

KÜLÖNBÖZŐ

TÍPUSÚ

NÖVÉNYEK

VÍZTARTÓ

KÉPESSÉGÉNEK

ÖSSZEHASONLÍTÁSA

A növények vízmegtartó képességét elsősorban az határozza meg, hogy melyik ökológiai csoportba tartoznak. Más a xerofiton, a mezofiton, illetve a higrofiton növények vízmegtartó képessége. E képesség szoros összefüggésben van a növények

morfológiájával

(pl.

hajtás/gyökér

arány,

kutikula

vastagsága,

gázcserenyílások száma és elhelyezkedése stb.), de a növények fejlődési és fiziológiai állapota, az anyagcsere intenzitása is hatással van a vízmegtartó képességre. Például a kultúrnövényeinknél - melyeknek többsége mezofiton – levágva a leveleket, a fiatal levelek rendszerint hamarabb elvesztik víztartalmukat, mint az idősebbek, mert kutikulájuk vékonyabb. Ép növényeken azonban más a helyzet. A fiatal levelek plazmája kevés szabad vizet tartalmaz, élénk anyagcserét folytat, és ennek folytán képes elvonni a vizet az idősebb levelektől, aszályban tehát azok víztartalmának rovására életben marad. A vékonyabb kutikulájú fiatal levelek élénkebb párologtatása ugyancsak hozzájárulhat ahhoz, hogy az idősebb levelek vize a fiatalabb levelekbe áramlik. Az elölt növényi szervek hamarabb elvesztik víztartalmukat, mint az élők. Ha a légzést gátoljuk, a határhártyák permeabilitásának növekedése miatt szintén csökken a vízmegtartó képesség. Kísérletünkkel nyomon tudjuk követni három különböző ökológiai csoportba tartozó növény laboratóriumi körülmények közötti vízmegtartó képességét. Kísérleti

növények:

xerofiton

(szukkulens):

Buxus

sempervirens,

mezofiton:

Pelargonium zonale, higrofiton: Vallisneria spiralis A munka menete A különböző típusú növények leveléből dugófúróval 5-5 korongot kivágunk, vagy néhány kisebb

levelet

leválasztunk.

A

növények

leveléről

a

nedvességet

35

szűrőpapírral felitatjuk, a korongokat (leveleket) növényenként torziós mérlegen lemérjük és Petri-csészébe tesszük. A mérést 10 percenként ismételjük, mindig feljegyezve az időpontot és az akkor megállapított tömeget. 60 perc múlva a vizsgálatot befejezzük és az adatokat táblázatba rendezzük. A

szárazanyag-tartalom

(eredeti

víztartalom)

meghatározásához

helyezzünk

növényenként 5 db ismert össztömegű levélkorongot (levelet) szárítószekrénybe (105 °C) 1 óra időtartamra, majd mérjük vissza. Az egyes időpontokban kapott értékekből kiszámítjuk a vízveszteségeket a friss tömeg százalékában és táblázatba foglaljuk, illetve grafikonon ábrázoljuk. A visszamért szárazanyagot is a friss tömeg százalékában fejezzük ki! A szárazanyag-tartalom ismerétében számoljuk ki az eredeti víz %-t ( = 100 - sz.a.%) és ezt is növényenként ábrázoljuk a grafikonon! Növény Friss tömeg (mg) Idő (perc) A növény aktuális tömege (mg) Vízveszteség (mg) Vízvesztés a friss tömeg % - ában Szárazanyag (mg) Eredeti víz tart. (%)

10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60

Anyagok és eszközök Buxus sempervirens, Pelargonium grandiflorum, Vallisneria spiralis torziós mérlegek, olló, csipesz, Petri-csésze, szűrőpapír, főzőpohár, mm-papír

36

7.

A

KUKORICA

AKTUÁLIS

TELÍTETTSÉGI

HIÁNYÁNAK

ÉS

IGÉNYBEVÉTELÉNEK MEGÁLLAPÍTÁSA A növények víztartalmuk bizonyos hányadát átmenetileg elveszíthetik anélkül, hogy jelentős károsodást szenvednének, elpusztulnának. Tartós szárazság esetén azonban felborul a növények vízmérlege, a vízleadásukat nem egyenlíti ki a vízfelvételük. Ez a turgeszcencia csökkenéséhez, a levélzet lankadásához vezet. A lankadást a növények kiheverik, ha pl. éjszaka a vízmérlegük helyre áll. Amennyiben a növények már éjszaka sem nyerik vissza turgorukat, a vízhiányok összegződése irreverzibilis károsodáshoz, hervadáshoz vezet. Ilyenkor már a gyökérszőrök is elpusztulnak és megszakad a növény és a talaj közötti kapcsolat. Az aktuális és a kritikus telítettségi hiány értékének ismerete az öntözés szempontjából különösen fontos. Az aktuális telítettségi hiány (vízdeficit) azt a vízmennyiséget jelenti %-ban, ami a vizsgálati időpontban mért víztartalom és a maximális víztartalom értéke közötti különbség (a maximális víztartalom %-ban kifejezve). A kritikus telítettségi hiány azt a vízdeficitet jelenti, amelynél a növény helyrehozhatatlanul károsodik. Ennek értéke elsősorban a növényfajtól függ, de külső és belső tényezők is befolyásolják. Amennyiben a kritikus telítettségi hiány értékét ismerjük, a naponként mért vízvesztés menetéből előre jelezhetjük - hogy az időjárás változatlansága esetén mikorra válik elkerülhetetlenné az öntözés. Azt is kiszámíthatjuk, hogy a szárazság hány százalékra vette igénybe bizonyos időpontokban a növény kiszáradástűrését. Ez az igénybevétel százaléka. aktuális telítettségi hiány Igénybevétel =  X 100 kritikus telítettségi hiány

37

A munka menete 1. Kukorica levelekből parafaalátéten dugófúróval 20 db 1cm átmérőjű korongot vágunk. Ügyeljünk arra, hogy a korongok a levelek azonos helyéről származzanak. Ha a leveleket szántóföldön gyűjtjük be, tegyük nylon zacskóba őket, hogy a vizsgálat megkezdéséig a további vízvesztést minimálisra csökkentsük. 10 korongot tömegmérés (A) után világos helyre állított Petri-csészében vízbe teszünk, 10 db-ot szárítószekrényben 105 °C-on súlyállandóságig szárítunk. 2. Kb. 2 óra múlva a levélkorongokat kivesszük a vízből is és a szárítószekrényből is. A vizes korongokat szűrőpapírral megszárítjuk és tömegüket megmérjük (T). A szárítószekrényből származókat exszikkátorban hűlni hagyjuk, majd újra megmérjük a tömegüket (SZ). Az eredmények kiértékelése A telített levél víztartalma:

vízmax = T - SZ

Az aktuális víztartalom:

vízakt = A - SZ .

Aktuális telítettségi hiány %: Hakt = [(vízmax - vízakt) / vízmax] 100 Számoljuk ki a kukorica levelek igénybevételét! A kukorica kritikus telítettségi hiánya 60 %. Számoljuk ki a kukorica szukkulencia fokát! szukkulencia fok = víztartalom (g) / kétszeres levélfelület (dm2) = = vízmax / a 10 korong területének kétszerese (dm2) Anyagok és eszközök kukorica levelek parafaalátét, dugófúró, Petri-csésze, szárítószekrény, exszikkátor, mérleg

38

8.

PROLIN-PRÓBA A VÍZHIÁNY KIMUTATÁSÁRA

Optimális vízellátás esetén csak nyomokban mutatható ki a levelekből a prolin. Vízhiány hatására a kloroplasztot tartalmazó szövetekben a prolin koncentrációja megnő, tartós szárazság esetén a prolin koncentráció az összes aminosav-tartalom 80 %-át is elérheti. A prolin felhalmozódása számos biokémiai változás eredménye lehet. Pl. csökken a beépülése a fehérjékbe, mérséklődik oxidatív lebomlása a mitokondriumokban; akkumulációja mégis legnagyobb mértékben a glutaminsav prolinná való fokozottabb átalakulásából ered. A

prolin

felhalmozódása

több

szempontból

előnyös.

Higroszkópossága,

vízoldékonysága következtében növeli az erősen kötött víz mennyiségét. Erősíti a vízstressz hatására labilissá váló sejtszerkezetet. Fontos szerepe van a fiziológiai szárazság tolerálásában is, melyet a talajokban levő nagy sótartalom valamint alacsony talajhőmérséklet vált ki. A munka menete Különböző mértékű szárazságstressznek kitett, valamint optimális vízellátottságú növények levelét 60 °C-on tömegállandóságig szárítjuk. A szárított levelekből a vizsgálathoz bemérünk 200 mg-ot, majd dörzscsészében késhegynyi kvarchomok jelenlétében pár ml 20 %-os etanollal pépesre dörzsöljük. Az extraktum térfogatát etanollal mérőhengerben 10 ml-re egészítjük ki, majd az egészet

centrifugacsövekbe

öntjük

és

6000-es

fordulatszámon

15

percig

centrifugáljuk. Centrifugálás után a felülúszót 10 ml-es osztott kémcsőbe töltjük át. (aminosav törzsoldat) Izatin-indikátor papírra a vizsgálandó levélextraktumok számával megegyező 2 cm átmérőjű kört rajzolunk ceruzával.

39

E

körökbe

az

aminosav

törzsoldatból

pipettával

pár

cseppet

szélesztünk

csigavonalban úgy, hogy a folt a kör belsejét kitöltse. A nedves foltokat felvitel után infralámpa alatt megszárítjuk, majd az izatin-indikátor papírokat előhívás céljából 15-20 percre kb. 60 °C-os szárítószekrénybe tesszük. Az izatin-indikátor papíron levő foltok színeződése alapján állapítsuk meg a vízellátottság, illetve vízdeficit mértékét. Az izatin-indikátor papíron lévő foltok színeződése és a levélextraktum prolintartalma között az alábbi összefüggés áll fenn: A tiszta izatin-indikátor papír sárga színű, míg kevés prolintartalom esetén, az indikátor papíron levő folt barnásrózsaszínes színeződést mutat. Enyhe vízdeficit esetén a folt zöldes árnyalatú, s a vízdeficit növekedésével fokozatosan átmegy zöldes-kék, majd kék színbe. Közepes vízhiány esetén már kék színű a folt, s ez a kék szín a vízhiány illetve prolinfelhalmozódás mértékével arányosan mélyül. Erős vízdeficit esetén a folt sötétkék színű. Megjegyzés: A vizsgált növényi részekből, levelekből aminosav törzsoldatot is készíthetünk későbbi analízisekhez. Az aminosav törzsoldat valamint az izatin-indikátor papír készítésének leírása a függelékben található. Anyagok és eszközök különböző mértékű szárazságstressznek kitett és öntözött növények levelei 20 %-os etanol, kvarchomok, izatin-indikátor papír 10 ml-es osztott kémcső, pipetta, hajszárító, dörzscsésze, szárítószekrény, centrifuga

40

9.

A

SZTÓMÁK

VISELKEDÉSE

KÜLÖNBÖZŐ

pH-ÉRTÉKŰ

PUFFER

OLDATOKBAN

Eltérően más epidermisz sejtektől, a zárósejtek kloroplasztiszokat tartalmaznak, melyeknek a sztómanyitódás fotoaktív reakciójában alapvető szerepük van. Ezekben a kloroplasztiszokban mindkét fotokémiai rendszer megtalálható, viszont nem működik bennük a Calvin-ciklus. A zárósejtekben található keményítő az epidermisz alatti mezofillumsejtekben asszimilált cukrokból szintetizálódik. Ezek a cukrok éjjel vándorolnak be a zárósejtekbe, ahol keményítővé alakulnak. Éjjel a legtöbb növény zárva tartja sztómáit, emiatt a légzésből származó és távozni nem tudó CO2 savasítja a sejtek környezetét. Reggel a fényre beinduló fotoszintézis miatt, az oldott CO2 tartalom lecsökken, ezért a pH emelkedni kezd. A semleges irányba elmozduló pH kedvez a keményítő lebontásának és ezáltal ozmotikusan aktív anyagok képződésének (kálium-malát). A kálium-malát felhalmozódása a vakuólumban vízfelvételhez vezet, ez a zárósejtek turgorát és a sztóma nyitódását idézi elő. Megjegyezzük, hogy a fénynek más hatása is van: biztosítja a K+ felvételhez szükséges ATP, és az almasav kialakulásához szükséges NADPH2 képződését az aciklikus elektrontranszport működtetése révén, másrészt aktivál két, az almasav kialakulásában szerepet játszó enzimet; a PEP-karboxilázt és a NADP-specifikus almasav-dehidrogenázt. Éjjel, sötétben a fény ezen hatásai nem működnek, ezért kálium-malát nem képződik, viszont a meglévő kálium-malát a légzésben lebomlik. Ez a víz kiáramlását, a turgor csökkenését, a sztómák záródását idézi elő. A pH változás (amit normál körülmények között elsősorban a fény és CO2 befolyásol) tehát a glikolízis és a glükoneogenezis szabályozásával hat a sztóma nyitódásra. A pH-nak ezt a hatását közvetlenül is demonstrálni tudjuk az alábbi kísérlettel. Célkitűzés: Annak bemutatása, hogy a pH-érték milyen módon befolyásolja a sztómák működését.

41

A munka menete Készítsünk acetát-puffer sorozatot a következők szerint: pH-érték

3,5

4,5

6,0

7,0

0,1 n ecetsav, ml

9,5

6,7

0,6

-

0,1 n Na-acetát, ml

0,5

3,3

9,4

10,0

Muskátli levélfonákáról húzzunk le kis epidermisz-darabokat és helyezzünk 1-1-et minden pufferoldatba. Szobahőmérsékleten, szórt fény mellett tartva, 1 óra múlva vegyük ki a nyúzatokat, tegyük tárgylemezre, és a megfelelő pufferanyaggal megcseppentve fedjük le azokat. Mikroszkóppal vizsgálva állapítsuk meg a sztómák nyitottsági fokát. Nyitott, közepesen nyitott és zárt kategóriák szerint értékeljük! Kiértékelés, következtetés - Írjuk a pH-értékek alá a nyitottsági fokot! pH-érték

3,5

4,5

6,0

7,0

nyitottsági fok

.....

.....

.....

.....

- Milyen összefüggésben vannak a pH értékváltozásai a fotoszintézis intenzitásával? - Készítsünk rajzot a különböző nyitottsági állapotban lévő sztómákról! Anyagok és eszközök muskátlilevelek 0,1 n ecetsav, 0,1 n Na-acetát óraüvegek, tárgylemez, fedőlemez, szemcseppentő, mikroszkóp

42

10.

SZTÓMÁK VIZSGÁLATA KOLLÓDIUMOS LEVONATON

A növények vízgazdálkodásában fontos szerepet játszik a gázcserenyílások egységnyi területre eső száma és nyitottsági foka. A sztómák számának és nyitottságának

megállapítására

több

módszer

alkalmazható

(pl.

infiltrációs,

porométeres stb.) köztük a kollódiumos eljárás is. Éteres kollódiumoldat a levélen vékony bevonatot, hártyát alkot. A lehúzott hártyán az epidermisz felületének pontos lenyomata látható. A kollódiumos módszerrel ugyanazon levélről bármikor és bármennyi lenyomatot készíthetünk anélkül, hogy a levél megsérülne. Hátránya, hogy csak szőrképlet nélküli leveleken alkalmazható. A munka menete Különböző fajhoz tartozó növények levelének színére és fonákára ecsettel 4 % -os kollódiumoldatot

kenünk.

Az

oldószer

elpárolgása

után

képződött

vékony

kollódiumhártyát csipesszel lehúzzuk és mikroszkóp alatt megszámoljuk a levél színéről és fonákáról származó hártyadarabkákon a látómezőbe eső sztóma lenyomatokat. A látómezőbe eső sztóma számát 5 számlálás középértéke alapján adjuk meg. A látómező területének kiszámításához a látómező átmérőjét tárgymikrométer segítségével mérjük meg. A sztómák hosszának, szélességének és a

nyitottság

fokának

megállapításához

okulár

mikrométert

használjunk.

A

jegyzőkönyvbe adjuk meg a különböző fajok levelének színén és fonákán megállapított sztómasűrűséget, a sztómák hosszát, szélességét és nyitottságát. Anyagok és eszközök különböző levelek 4 %-os kollódiumoldat mikroszkóp, okulár és tárgymikrométer, csipesz, tárgy- és fedőlemez, ecset

43

11.

VÍZKULTÚRÁS KÍSÉRLETEK

11/a A vízkultúrás kísérletek általános szempontjai

A tápelemek szükségességét, jelentőségét legszembetűnőbben a vízkultúrás kísérletekkel igazolhatjuk. A víztenyészeteket elsőként SACHS (1860) és KNOP (1865) alkalmazta. A tápoldat különböző sók keverékének vizes oldata, amely a növény növekedése, fejlődése szempontjából szükséges makroelemeket vagy azok nagy részét megfelelő koncentrációban tartalmazza. Azt a tápoldatot, amelyben az adott növény számára szükséges valamennyi makroelem megtalálható alap vagy teljes tápoldatnak nevezzük. Ellenkező esetben hiányos tápoldatról beszélünk. Ha az alaptápoldathoz mikroelemeket is adagolunk, akkor az úgynevezett kiegészített tápoldatot kapjuk. A tápoldatok összetételét, sajátságát mindig az adott növényfaj igénye illetve a kísérlet célja határozza meg. Nincs általánosan elfogadható, univerzális oldat, mert különböző a növények igénye az ásványi anyagok mennyiségét és az egymáshoz viszonyított arányát tekintve. A növények különböző fejlődési stádiumaiban is különböző igényeket támasztanak a tápoldatok összetétele iránt. Minden tápoldatban megtalálható a N, P, K, Ca, Mg, S, Fe és fő mikroelemként a B, Mn, Cu, Zn, Mo. A tápoldatokban az egyes elemek különböző vegyületekben fordulnak elő, eltérő az egyes tápoldatok kémhatása valamint a sókoncentráció. Különbség van még a tápoldatokban előforduló mikroelemekben, adalék-anyagokban és a pufferoló képesség tekintetében. Az a megfelelő tápoldat, amely kellő mennyiségben tartalmazza a növény számára szükséges

valamennyi

makroelem

készlet

tápelemet,

és

megakadályozza

amelyben a

a

közeg

helyesen

megválasztott

jelentősebb

mértékű

44

kémhatásváltozását. Ez utóbbi cél eléréséhez olyan sópárokat kell választani, melyek az oldat pH-jára gyakorolt hatásukat illetően valamilyen módon kompenzálják egymást, az egyik fiziológiailag savas, a másik fiziológiailag lúgos hatást fejt ki. Az optimális tápoldatnak a legnagyobb termést kell biztosítania azon legkisebb koncentráció esetén, amelynek emelése nem ad további javulást. Fontos, hogy a szükséges tápelemek koncentrációja feleljen meg a felvétel gyorsaságának, figyelembe véve az edény térfogatát valamint az oldatcsere gyakoriságát, a kémhatás stabilitását valamint könnyű diffúziót a gyökérzónában. A makroelemek szokásos koncentrációját meghatározza: a növényfaj, a növény fajtája, növény kora, az oldatcsere gyakorisága, a megvilágítás erőssége, a levegőztetés gyakorisága, más ionok koncentrációja. A tápoldatok összkoncentrációja általában 0,1-0,5 % közötti. Általános elv, hogy fiatalabb növényeknek hígabb, idősebbeknek fokozatosan töményebb oldatot kell adni. A korszerű tápoldatok ozmotikus potenciálja -0,4 és -1,0 bar között van. Fontos, hogy az ozmotikus potenciál ne legyen negatívabb -1,0 illetve -1,5 bar-nál. A közeg kémhatása legtöbb esetben 4,5 - 6,0 pH-érték közötti. 4 pH alatt károsodik a gyökér, és ezáltal gyengül a tápanyagok felvétele, lelassul a növekedés. A pH-érték felső határa pH 9 körül van. 9 pH-hoz közel a P, Ca, Fe és sok mikroelem (pl. Mn) felvehetősége csökken. A vízkultúrás kísérletek során használt edények térfogata függ: a növényfajtól, a növény fajtájától, a kísérlet körülményeitől, a kísérleti céltól, az oldatcsere gyakoriságától. A kísérlet során a tápoldatot többször kell cserélni. Az oldatcsere gyakoriságát befolyásolja: a növény faji tulajdonsága, a kísérlet célja, az edény térfogata. Az oldatcserék között naponta pótolni kell a transzspiráció következtében beálló vízveszteséget.

45

Az oldatot levegőztetni kell, hogy a gyökerek tápanyagfelvétele hatékonyan működjön. A tápközeg levegőztetésére általában sűrített levegőt használnak, melyet üvegcsövön át juttatnak a tápoldatba. A levegőztetés időtartama, gyakorisága függ: a növényfajtól, a növény fajtájától, a növény korától, az edény térfogatától, az edény felszínének nagyságától. A kísérlet kezdetén általában 15-20 percig szükséges levegőztetni. A tápoldatokat gyakran meg kell újítani, hogy a tápanyagok koncentrációja csak kevéssé változzon. (Forrásmunka:

Haraszty

Á.

1979.

Növényszervezettan

és

növényélettan.

Tankönyvkiadó, Budapest; Szalai I. 1994. A növények élete. JATEPress, Szeged)

11/b Hiánytünetek vizsgálata fiatal egyszikű és kétszikű növényeknél

Az ásványi tápelemek jelentőségét a növények növekedésében, fejlődésében jól tanulmányozhatjuk az alábbi vízkultúrás kísérlettel. A növény számára optimális tápanyagellátás (teljes tápoldat) esetén nem lépnek fel hiánytünetek a növényen. Ezzel szemben, ha a növényt hiányos tápoldatban neveljük, a növényen hiánytünetek jelentkeznek. Az alábbi kísérlet során egyes ásványi anyagok (N, P, Fe, Mg) hiánytüneteit figyelhetjük meg. A munka menete Az ásványi anyagokat tartalmazó törzsoldatokból különböző összetételű tápoldatokat készítünk (lásd a mellékelt táblázatot). A tápoldatokat a tenyészedényekbe öntjük, majd belehelyezzük a sziklevél nélküli bab és kukorica csíranövényeket. A kísérleti edényeket sötét papírral (alufóliával) borítsuk be az algásodás megakadályozására.

46

A kísérlet időtartama alatt folyamatosan gondoskodni kell a tápoldatokból elpárolgott víz pótlásáról, valamint a növények kiemelésével a gyökerek gázcseréjének biztosításáról. Fontos továbbá, hogy a tápoldatokat hetente újítsuk meg. A hiánytünetek kialakulása hosszabb időt vesz igénybe, ezért a kísérlet kiértékelése 5-6 hét múlva történjék. 2-3 hét után Fe-EDTA kiegészítést adva a vashiányos növényeknél megfigyelhetjük a hiánytünet megszűnését. A kísérlet során kövessük figyelemmel: a hiánytünetek kialakulását, a növények magasságát, a gyökerek hosszát, az internódiumok, levelek számát, a szár, a levelek és a gyökerek színét, a növények friss tömegét, a hajtás és gyökér arányát. A tápoldatok összetétele (1l-be bemérendő törzsoldatok ml-e) Törzsoldatok 10 % - os oldatok . Ca(NO3)2 4H2O (NH4)2SO4 . MgSO4 7H2O KNO3 KH2PO4 KCl K2SO4 . CaCl2 2H2O Fe-EDTA (1 % - os) 0,1 % - os oldatok H3BO3 . MnCl2 4H2O . CuSO4 5H2O . ZnSO4 7H2O . Al2(SO4)3 18H2O . NiSO4 6H2O . CoCl2 6H2O H2MoO4 H2O

Teljes

N-mentes

P-mentes Fe-mentes Mg-mentes

5 2,5 2,5 2,5 1,25 3

2,5 1,25 2,5 2,5 5 3

5 2,5 2,5 2,5 1,25 3

5 2,5 2,5 2,5 1,25 -

5 2,5 2,5 1,25 2,5 3

3 2 0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,025 977,875

3 2 0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,025 977,875

3 2 0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,025 977,875

3 2 0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,025 980,875

3 2 0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,025 977,875

47

Anyagok és eszközök bab és kukorica csíranövények tenyészedény, mérőhenger, mikropipetta, törzsoldatok (Forrásmunka: Ördög V. - Molnár Z. - Péter J. 1995. Növényélettani gyakorlatok. PATE Mosonmagyaróvár)

11/c Hiánytünetek határozó kulcsa

A. A hiánytünetek többnyire az idősebb vagy az alsó leveleken jelennek meg; a hatás lokalizált, vagy általános I. A hatás többnyire az egész növényre kiterjed; az alsó levelek többnyire elszáradnak, vagy elhalnak 1. A növény felső levelei világoszöldek, az alsóbb levelek sárgák, világos vagy barna foltokkal; a szár rövid és gyenge, ha a hiány a fejlődés későbbi szakaszában jelentkezett -----------------------------------------------------------------------------NITROGÉN 2. A növény abnormálisan sötétzöld, gyakran vöröses vagy bíborszínű; az alsó levelek néha sárgák, száradva zöldesbarnák vagy feketék. A hajtás rövid és gyenge, ha a hiány a fejlődés későbbi szakaszában lépett fel -------------FOSZFOR II. A hatás többnyire lokalizált; a levelek foltosak vagy klorotikusak; az alsó leveleken elhalt szöveti foltokkal, vagy azok nélkül; az alsó levelek kicsinyek, de nem száradnak el 1. A foltos vagy klorotikus levelek – típusos esetben - vörösödő, néha elhalt foltokkal; a levél csúcsa és széle csészeszerűen felgörbül; a szár gyenge ------MAGNÉZIUM

48

2. A foltos vagy klorotikus leveleken nagy, vagy kicsiny elhalt szöveti foltok vannak; 2.a. Az elhalt szövetfoltok kicsinyek, rendszerint a csúcson és az érközökben, többnyire a levélszéleken; a szár gyenge ----------------------------------------KÁLIUM 2.b. A foltok (pettyek) általánosak, gyorsan nagyobbodók, általában a levélerek között; a levelek kicsinyek, a szár internódiumai rövidek ------------------------CINK B. A hiánytünetek csak a rügyleveleken jelennek meg (lomblevélen nem), a tünetek lokalizáltak I. A csúcsrügy elhal, a következő fiatal levelek a csúcsukon elhaltak, vagy a bázison torzultak 1. A terminális rügy fiatal levelei először horgasak, majd elhalás előtt a csúcson és a bázison kiegyenesednek, később ezeken a pontokon kimetszettek -------KALCIUM 2. A terminális rügyek fiatal levelei alapjaikon világoszöldek, végül itt eltörnek; a később fejlődött levelek törpék, a csúcsi rész elhal -----------------------------------BÓR II. A csúcsrügy általában életben marad; a fiatal levelek fonnyadtak, vagy klorotikusak; elhalási foltok nélkül; az erek világosak, vagy sötétzöldek 1. A fiatal levelek állandóan fonnyadtak, foltok, vagy jellemző klorózis nélkül; a szár a csúcs alatt képtelen felegyenesedni; a fejlődés későbbi szakaszán a hiány akuttá válik -----------------------------------------------------------------------------------------------RÉZ 2. A fiatal levelek nem hervadtak; klorózis esetében elhalt szöveti foltokkal, vagy anélkül 2.a. Az elhalt szöveti foltok elszórtan helyezkednek el a levél felületén, a kisebb erek zöldek, hálózatos szerkezetet formálnak ---------------------------------------MANGÁN 2.b. Elhalt foltok nem jelennek meg; a klorózis nem terjed ki az erekre, azok világosvagy sötétzöldek a. A fiatal levelek erei és intercostalis szövetei világoszöldek ------------------KÉN

49

b. A fiatal levelek klorotikusak, az erek sötétzöldek, a szár rövid és fejletlen ----------------------------------------------------------------------------------------------------VAS (Forrásmunka: Szalai I. 1994. A növények élete. JATEPress, Szeged) Megjegyzés: Az egyes

kultúrnövények

hiánytüneteinek

pontosabb

meghatározásához jól

használható az alábbi könyv: Bergman, W. 1979. Termesztett növények táplálkozási zavarainak előfordulása és felismerése. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest

50

12.

FOTOSZINTETIKUS PIGMENTEK VIZSGÁLATA

A fotoszintetizáló növények zöld színét klorofillok adják. A magasabb rendű növények a- és b-klorofillt tartalmaznak, az algákban egyéb klorofillok is előfordulnak (klorofill-c,-d,-e). A klorofillok mellett járulékos pigmentként karotinoidok (karotinok, xantofillok) is találhatók, melyek a klorofillokhoz hasonlóan szerepet játszanak a fotoszintetikusan aktív fény elnyelésében és továbbításában, de a karotinoidok speciális

funkciója

az,

hogy

védőpigmentként

megvédik

a

klorofillokat

a

fotodestrukciótól. A karotinoidok nem képesek a fényenergia kémiai energiává alakítására, ezt a feladatot a reakciócentrumokban (P680, P700) a fehérjékkel kapcsolódó klorofill-a molekulák látják el. Ezzel függ össze az, hogy míg klorofill-b illetve karotinoidhiányos mutánsok léteznek, olyan fotoszintetikusan aktív magasabb rendű növényt még nem találtak, amely klorofill-a-t ne tartalmazott volna. (Megjegyezzük, hogy a karotinoidhiányos mutánsok szélsőségesen fényérzékenyek és fotoszintézisre csak igen alacsony fényintenzitás mellett képesek.) A fotoszintetikus pigmentek a kloroplasztiszok belső membránrendszerében fehérjékhez kapcsolódva találhatók. E kapcsolat miatt torzul a pigmentek fényelnyelésért

felelős

π-elektronfelhők

szerkezete,

ezért

megváltozik

a

fényelnyelőképességük, abszorpciós maximumuk eltolódik a szerves oldószerekben mért abszorpciós maximumhoz képest. A szerves oldószerek a fehérjéket denaturálják,

a

pigmenteket

kivonják

a

pigment-protein

komplexekből.

A

színanyagok a kloroplasztiszok fehérjéihez kötődnek, ezért a vízmentes szerves oldószerek nem alkalmasak a nyers klorofill oldatok előállítására. A klorofill és fehérje közötti kötéseket először el kell bontani és erre a víztartalmú szerves oldószerek alkalmasabbak. A kloroplasztisz szerkezetéhez való kapcsolódás formája és erőssége ugyanazon pigment különböző abszorpciós maximummal rendelkező formáit alakítja ki (in vivo pigmentformák). Ezek lehetővé teszik a fény széles sávban történő abszorbeálását.

51

A klorofillok porfirinvázas vegyületek: négy pirrolgyűrűt metinhidak (-CH=) ciklikusan kapcsolnak össze (ciklikus tetrapirrolszármazékok). A pirrolgyűrűk metinhidakkal nem kapcsolódó szénatomjaihoz metil-, etil-, vinilcsoport kötődik. A III. pirrolgyűrű és a szomszédos metinhíd között öt szénatomos gyűrű (izociklus pentanongyűrű) jön létre,

aminek

karboxilcsoportját

metilalkohol

észterifikálja.

A

IV.

gyűrűhöz

propionsavgyök kapcsolódik, aminek karboxilját egy 20 szénatomos telítetlen alkohol, a fitol észteresíti. Ezáltal a molekula amfipatikussá (hidrofil és hidrofób sajátosságúvá) válik. A porfirinvázban centrális fématomként magnézium található. Az a-klorofillban a II. pirrolgyűrű egyik szubsztituense metil-, a b-klorofillban aldehidgyök. A karotinoidok (karotinok, xantofillok) 8 izoprénegységből álló 40 szénatomos vegyületek. A molekulalánc gerincét izoprén egységek alkotják, két végén általában jonongyűrűk vannak. A karotinokkal ellentétben a xantofillok jonongyűrűin OHcsoportok is találhatók. Fejlett levelekben a karotinoid tartalom a klorofill mennyiségének 1/3-a, azaz a kloroplasztiszok szárazsúlyának 8-10 %-a, illetve a levél szárazsúlyának 0,5-1 %-a. Előfordulásukra a következő moláris arány jellemző: klorofill-a : klorofill-b : xantofill : karotin = 8 : 2 : 3 : 3 A különböző fotoszintetikus pigmentek mennyisége és aránya összefüggésbe hozható a növény fiziológiás állapotával.

12/a Kloroplasztisz

színanyagainak

szétválasztása

megoszlási

papír-

kromatográfiával A papírkromatográfiáról A kromatográfiás szűrőpapírt alkotó cellulózrostok vizet kötnek meg, és ez a cellulózhoz kötött víz képezi a megoszlási kromatográfia álló fázisát. A szűrőpapírba beszívódó benzol alkotja a mozgó oldószerfázist. Amikor a benzol eléri az elválasztandó anyagkeveréket a startvonalnál, az anyagkeverék feloldódik, és megoszlás jön létre a papírhoz kötött vizes fázis és a benzolos fázis között.

52

Végeredményben, mire az oldószer (benzol) a papírcsík hosszában végigvándorol, igen nagy számú megoszlás játszódik le az álló és mozgó fázis között. A benzolos, mozgó fázisban jobban oldódó xantofill nagyobb utat tesz meg, mint a benzollal telített vizes fázisban is jól oldódó klorofillok, amelyek az álló fázisban elidőzve lemaradnak. Az erősen apoláros jellegű karotin az oldószer frontjával együtt mozog, mivel az álló fázisban gyakorlatilag nem oldódik. A munka menete A friss, zöld növényi részt késhegynyi MgCO3 és kevés kvarchomok jelenlétében eldörzsöljük. Vízelvonás céljából késhegynyi vízmentes Na2SO4-et adunk az összezúzott

anyaghoz.

A

homogenizátumot

néhány

milliliter

kloroformmal

extraháljuk, majd tölcsérben, kevés vattán keresztül jól zárható széles nyílású üvegedénybe szűrjük. Igyekezzünk minél töményebb színanyag oldathoz jutni. Kromatográfiás papírból kb. 2 cm széles csíkot vágunk ki. A papírcsík egyik végét a kloroformos extraktumba mártjuk és azt 1-2 cm magasságig szívatjuk. Ha a kivonat híg, a felszívatást megismételjük, miután az oldószer elpárolgott, esetleg többször is, de mindig ugyanolyan magasságig. Az extraháló szer elpárolgása után a papírcsík végét tiszta oldószerbe helyezzük, és a színanyagokat egyetlen egyenes, vékony sávba szívatjuk össze, ez lesz a startvonal, ceruzával oldalt jelöljük meg. (A startvonalnak kb. egy tompa zöld színes ceruzával húzott egyeneshez kell hasonlítania.) Ezután megvárjuk, amíg a papírcsíkról teljes mértékben elpárolog a kloroform. A futtatást 250 ml-es hengerben végezzük. Az edény lezárását parafa dugóval oldjuk meg. Az üveghenger aljába benzolt öntünk futtatószernek, majd parafa dugóhoz illetve

dróthoroghoz

kapcsolva

a

kromatográfiás

papírcsíkot

belógatjuk

a

mérőhengerbe egyelőre úgy, hogy ne érjen az eluáló folyadékba. 15 perces ekvilibrálás (futtatószer gőzeivel való telítés) után a papírcsík alját leengedjük a benzolba. A kapillaritás révén felfelé vándorló eluáló szer magával viszi a

53

színanyagokat. A vándorlási sebességet a két oldószerfázis közötti megoszlás határozza meg. Ügyeljünk arra, hogy futtatás közben a papír ne érjen a mérőhenger falához és ne is mozgassuk a hengerben lévő benzolt! A munka során nagyon óvatosan járjunk el, mert a benzol oldószergőzei erősen karcinogének. Célszerű vegyifülkében dolgozni, illetve a mérőhengert végig bedugaszolva tartani. A kromatografálás befejezése után megjelöljük az oldószerfrontot: a papíron: azt a pontot, ameddig a benzol felemelkedett. Megszárítjuk a kromatogrammot és ceruzával megjelöljük az egyes komponensek határait. Megjelöljük az egyes komponensek foltjainak súlypontját és kiszámítjuk az Rf -értékét (retenciós faktor), amely az anyag súlypontja és a start-, illetve az oldószerfront és a startpont távolságának hányadosa. Az oldószer útja mindig hosszabb (esetleg egyenlő) az anyag által megtett távolságnál (-gal), ezért az Rf -érték 1-nél kisebb (esetleg egyenlő .

1-el). Gyakran Rf l00 értéket adnak meg. A papírcsíkot beragasztjuk a gyakorlati jegyzőkönyvbe. (A kész kromatogrammon levő színes sávok fény hatására néhány nap múlva elhalványodnak, majd el is tűnnek.) A futtatás végén a színanyagok sorrendje: Az oldószerfront mögött a narancssárga karotin, majd a citromsárga xantofill frakciója (ez lehet kettős sáv is) után kékeszöld klorofill-a, ezt követően a sárgászöld klorofill-b található.

12/b A

levelek

klorofill

és

karotinoid

tartalmának

meghatározása

spektrofotométerrel, a nyers pigmentkivonat abszorpciós spektrumának felvétele

A pigmentkivonat színanyagainak mennyiségét meghatározhatjuk spektorofotométer segítségével, ha ismerjük az abszorpciós maximumokat. A klorofillok két abszorpciós maximummal jellemezhetők: az egyik a kék, a másik a vörös tartományban található. Az a- és b-klorofill abszorpciós görbéje nem fedi egymást, a b-klorofill két maximuma közelebb van egymáshoz. A karotinoidok csak a kék tartományban abszorbeálnak.

54

80 %-os acetonban a karotinoidoknak 440 nm-nél, a klorofilloknak a vörös tartományban - ahol nem zavar a karotinoidok fényelnyelése - 663 nm-nél (kl-a) és 645 nm-nél (kl-b) van az abszorpciós maximuma. Ezek az értékek olyan távol esnek egymástól, hogy nem zavarják az egyes színanyagok mennyiségi meghatározását. Az abszorpciós maximumok helyzete függ az oldószertől. A munka menete A vizsgált növény leveléből lemérünk 0,2 g-ot, majd előhűtött dörzscsészében, késhegynyi kvarchomokkal és MgCO3-al, 1-2 ml 80 %-os acetonnal eldörzsöljük. (A magnézium-karbonátot azért adjuk a keverékhez, hogy a sejtnedv savas vegyületeit közömbösítse és így megakadályozza a magnézium kihasadását, feofitin képződését a klorofill molekulákból.) A pigmentek extrakciójához további kb. 10 ml acetont (80 %-os) adunk részletekben az intenzíven dörzsölt, kevert homogenizátumba. Az egyes extrakciós lépésekben keletkező tiszta extraktumot mérőhengerbe töltjük. A kivonást addig végezzük, míg végül a dörzscsészében visszamaradt anyag elszíntelenedik. (A kivonás ideje 3 percnél ne legyen hosszabb!) A mérőhengerben összegyűjtött extraktumot - melynek homogénnek kell lennie, szövetdarabokat, kvarchomokot stb. nem tartalmazhat - 80 %-os acetonnal kiegészítjük 15 ml-re, majd az egészet centrifugacsőbe töltjük és 5 percig 5000-es fordulaton hidegben centrifugáljuk. Centrifugálás után az oldatot tölcsér segítségével óvatosan 20 ml-es kalibrált kémcsőbe töltjük és 80 %-os acetonnal 20 ml végtérfogatra egészítjük ki, lezárjuk és jól összerázzuk. Ezután a kivonatunkat küvettába töltjük. Egy másik küvettába 80 %os

acetont

öntünk

vakpróbának.

Spektrofotométer

segítségével

megfelelő

hullámhosszúságon lemérjük a klorofill-a, a klorofill-b és a karotinoidok extinkcióját. Az extinkció mérésével egyidőben vegyük fel pigmentkivonatunk abszorpciós spektrumát 400 és 700 nm között. Az extinkció méréséhez és a spektrumfelvételhez is a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Quant I Soft-PacTM Module „PROG6: PeakPick” programját használjuk. A program a spektrumot megrajzolja és ki is nyomtatja.

55

A kísérlet kiértékelése Számítsuk ki a levelek klorofill-a és -b, valamint a karotinoidok mennyiségét friss tömegre vonatkoztatva. A számításokhoz az alábbi képleteket használjuk: .

.

.

.

.

.

.

.

Kl-a = [9,78 E663 - 0,99 E645] [V/(1000 W)] Kl-b = [21,4 E645 - 4,65 E663] [V/(1000 W)] .

.

.

.

.

.

Kar = [4,69 E440 - 0,268 (5,13 E663 + 20,41 E645)] [V/(1000 W)] ahol E = az oldat adott hullámhossznál mért extinkciója V = az extraktum végtérfogata ml-ben (példánkban 20 ml) W = a bemért levélanyag friss tömege g-ban (példánkban 0,2 g) A pigmenttartalmat mg pigmentkomponens/g friss tömegben kapjuk meg. Számoljuk ki a különböző pigmentek arányát az egyes fajoknál, illetve az etiolált növényeknél. Elemezzük a kapott abszorpciós spektrumot. Figyelem! A gyakorlat során a szerves oldószerek tűzveszélyességét fokozottan figyelembe kell venni! Az oldószereket tartalmazó üvegeket ne hagyjuk nyitva, csak a szükséges mennyiségeket használjuk fel és igyekezzünk átgondoltan, gyorsan dolgozni, hogy minél kevesebb oldószergőz kerüljön a levegőbe, ezzel is elkerülve belégzésüket! A kivonat előállítását és az egész analízist a lehető leggyorsabban, célszerűen gyenge szórt fényben végezzük, a kivonatot tartalmazó kémcsövet alufóliába tekerjük be a felhasználásig, mert a színanyagok fotooxidációra érzékenyek és kémiailag átalakulnak. Anyagok és eszközök

56

zöld növények (búza, kukorica, muskátli stb.), etiolált növények ugyanezen fajokból benzol, kloroform, 80 %-os aceton, MgCO3, Na2SO4 vízmentes kvarchomok, parafa dugó, dörzscsésze, Whatman No. 1-es (vagy Schleicher-Schüll 2043 b) kromatografáló papír, Petri-csésze, olló, ceruza, vatta, hajszárító, tölcsér, 250 ml-es és 25 ml-es mérőhenger, fedeles üvegdoboz, vonalzó, Beckman DU 65ös spektrofotométer, K-24D hűthető centrifuga, centrifugacsövek, 20 ml-es kalibrált kémcső

57

13.

FOTOSZINTÉZISES O2-TERMELÉS JODOMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA (WINKLER-MÓDSZER)

Vízbe merített, megvilágított levél O2-t termel, amely vízben - a telítési határig oldódik. Az oldott O2-t jodometriásan meghatározhatjuk. Mivel az O2 csak kis mértékben oldódik a vízben (1 bar nyomáson 1 liter víz 15 °C-on 10,2309 mg; 20 °Con 9,2878 mg; 25 °C-on 8,4633 mg O2-t nyel el), a vizsgálatot viszonylag rövid idő alatt kell elvégezni. A módszer intercellulárisokat nem tartalmazó növények esetében ad megbízható eredményt, egyébként a meghatározás nem pontos. A munka menete 1. Elodea canadensisről vágjunk le 4 db kb. 10 cm hosszú darabot, papírtörlővel itassuk le a vizet róluk, majd mérjük le a tömegüket és jegyezzük fel. 2. 6 kémcső mindegyikébe tegyünk 5-5 db kicsiny üveggolyót és mérjünk be mérőhengerrel

20-20

ml

szénsavtartalmú

csapvizet.

(Célszerű

a

csapból

főzőpohárba nagyobb mennyiségű csapvizet engedni, és ezt használni a kimérésekhez, ezzel a vízminták kiindulási oldott gáztartalmát egységesítjük.) Közülük 4 kémcsőbe Elodea hajtást helyezünk úgy, hogy a víz teljesen ellepje, majd néhány csepp paraffinolajjal valamennyi kémcső vízfelületét zárjuk el a levegőtől. Helyezzünk a növényeket tartalmazó kémcsövek közül kettőt 1 óra időtartamra napfényre vagy 500 W-os villanyégő elé. (Ügyeljünk arra, hogy a víz ne melegedhessen fel túlságosan, a kémcsöveket vízzel telt főzőpohárba tegyük!) A másik kettő növényeket tartalmazó kémcsövet pedig ugyancsak 1 órára tegyük sötét helyre. 3. Határozzuk meg a növény nélküli kémcsövek vízének O2 tartalmát a következőképpen: a kémcső vízébe (a kémcső aljába) 0,5 ml lúgos KI oldatot és 0,5 ml MnCl2-oldatot juttatunk. Ezután olajjal színültig töltjük a kémcsövet, hogy ne maradjon benne levegő. Újunkkal befogjuk a nyílást és a kémcsövet néhányszor

58

megfordítgatva összerázzuk. A Mn(OH)3 csapadékot az üveggolyók jól eloszlatják. A kémcső egész tartalmát most 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba öntjük várunk 3-4 percet, míg a Mn(OH)3 csapadék leülepszik, utána adjunk hozzá - a csapadék fölé rétegezve - 1,5 ml 25 %-os HCl-t. Az olajréteggel fedett folyadékot óvatosan, mozgatással kevergetjük. Némi I2 - kiválást észlelünk. Keményítő (0,2 %-os) indikátor jelenlétében 0,01n Na2S2O3-mal megtitráljuk az oldatot. A színváltozás: kékből színtelenre. A vizsgálat során a következő reakciók játszódnak le: 2 MnCl2 + 4 NaOH = 4 NaCl + 2 Mn(OH)2 2 Mn(OH)2 + 1/2 O2 + H2O = 2 Mn(OH)3 2 Mn(OH)3 + 6 HCl = 2 MnCl2 + 6 H2O + Cl2 Cl2 + 2 KI = 2 KCl + I2 2 Na2S2O3 + I2 = 2 NaI + Na2S4O6 4. Egyórai megvilágítás illetve sötétben tartás után vegyük ki a növényeket a másik négy kémcsőből és vizük I2-tartalmát az előbbihez hasonlóan állapítsuk meg. Az adatok feldolgozása A titrálásnál 1ml 0,01n Na2S2O3 megfelel 0,08 mg oxigénnek. A sötétben tartott kémcsövekben a légzéshez felhasznált oxigén mennyiségét mérjük, a növény nélküli kémcsövekben pedig a csapvíz eredeti oxigéntartalmát határozzuk meg. Számoljuk ki a fotoszintézisből származó O2 mennyiségét és a légzésnél elhasznált O2 mennyiségét korrekcióba véve a növény nélküli oldat O2-tartalmát! (A két ismétlésnél kapott adatokat átlagoljuk!) Számoljuk ki a g friss tömegre vonatkoztatott fotoszintézis során képződő O2-mennyiségét mg-ban! Az egyes vízminták oxigéntartalma (mg): titrálásnál fogyott 0,01n Na2S2O3 ml-e szorozva 0,08 –al. A = a növény nélküli víz eredeti oxigéntartalma mg-ban (két minta átlaga)

59

B = a sötétben tartott kémcsövek vizének oxigéntartalma mg-ban (két minta átlaga) C = a megvilágított kémcsövek vizének oxigéntartalma mg-ban (két minta átlaga) L = 1g növény által a légzésnél átlagban felhasznált O2 mennyisége (mg) L = (A-B)/a sötétben tartott növények tömegének (g) átlaga F = 1g növény által a fotoszintézisben átlagban termelt O2 mennyisége (mg) F = [(C-A)/a megvilágított növények tömegének (g) átlaga] + L

Anyagok és eszközök Elodea canadensis lúgos KI oldatot, MnCl2-oldat, 0,01 n Na2S2O3, keményítőindikátor, 25 %-os sósav, paraffinolaj kémcsövek, pipetta, főzőpohár, 500 W-os villanyégő, 50 ml-es Erlenmeyer-lombik, büretta, kémcsőállvány, üveggolyó, mérőhenger, mérleg

60

14.

A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT KEMÉNYÍTŐ KIMUTATÁSA SACHS-FÉLE JÓDPRÓBÁVAL

A Calvin-ciklushoz kapcsolódó fotoszintetikus polimer szénhidrát szintetizáló út végterméke, a keményítő nappal (fényben) a kloroplasztiszban halmozódik fel. Éjjel (sötétben) a keményítő keményítő-foszforiláz hatására anorganikus foszfáttal foszforilálódik, és glükóz-1-foszfátra (G1P) bomlik. A G1P-ból G6P, F6P, FDP majd triózfoszfátok keletkeznek. Ez utóbbiak kivándorolnak a citoplazmába, ahol egy reakciólánc végén uridin-difoszfo-glükózból és F6P-ból szacharóz-foszfát majd szacharóz keletkezik. A szacharóz a mezofillumsejtekből elszállítódik a felhasználás, illetve raktározás helyére. Megjegyezzük, hogy a légrések zárósejtjeibe is - ahol ellentétes

a

keményítő

felhalmozódás

és

lebomlás

napi

menete

a

mezofillumsejtekével - ilyenkor vándorol be a mezofillumsejtekben keletkezett szénhidrát. Kísérletünkkel kimutathatjuk, hogy sötétben a keményítő nagy része kiürül a levelekből, illetve fény hatására a megvilágított részeken újból képződik. A munka menete Muskátli növényeket a kísérlet megkezdése előtt 1-2 nappal helyezzünk sötétbe, hogy keményítőtartalmuk elszállítódjék, illetve elhasználódjék. A sötét kezelés után erősítsünk a levelekre alufóliából különböző mintázatokat úgy, hogy azok a szembelevő oldalakat azonos módon fedjék, de legyenek jellegzetes le nem fedett területek a levélen. Az így előkészített leveleket tegyük ki erős megvilágításnak, pl. lámpával világítsuk meg. Körülbelül 4 óra múlva a leveleket vágjuk le és tegyük főzőpohárba, melyben 96 %-os alkohollal elszíntelenedésükig elektromos főzőlapon főzzük azokat. A főzőpoharat óraüveggel fedjük le, melyről az elpárolgott alkohol visszacsöpög. Főzés közben az alkoholt 1-2 alkalommal ki kell cserélni. A klorofill nélküli fehér leveleket merítsük 10 percre Petri-csészében tartott Lugol-oldatba.

61

Ezután főzőpohárban vízben többször öblítsük át. A levél fényérte részei lilás színűek lesznek, mely a keményítő jelenlétére utal (keményítő-jód reakció). Az előhívott

leveleket

szűrő-

vagy

újságpapír

közé

téve

megszáríthatjuk. Anyagok és eszközök muskátli Lugol-oldat, alkohol főzőpohár, óraüveg, Petri-csésze, elektromos főzőlap, szűrőpapír

lepréselhetjük

és

62

15.

A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT SZACHARÓZ MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA

A fotoszintetikus szénhidrátszintézis végterméke nem minden esetben a keményítő. Sok egyszikű esetében a szacharóz szolgál szénhidrátforrásként. A következő kísérletben a fotoszintézis során képződött szacharóz mennyiségi meghatározását végezzük el. A meghatározást fenol-kénsavas színreakció alapján végezzük. 1 %-nál kisebb koncentrációjú cukoroldatok fenol és tömény kénsav jelenlétében narancsvörös színeződést okoznak, amely jól fotometrálható. A munka menete Az 1 hetes kukorica csíranövények leveleiből 1 g-ot mérjünk be, majd daraboljuk fel. A feldarabolt leveleket tegyük 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba és öntsünk rá 19 ml desztillált vizet. A lombik nyílását parafilmmel zárjuk le. Digeráljuk az anyagot vízfürdőn fél óra hosszat, s ezután a kivonatot öntsük le. A kivonat 1 ml-éhez kémcsőben 1 ml 90 %-os vizes fenololdatot és óvatosan 5 ml tömény kénsavat adunk. A keletkezett narancsvörös színű oldatot 500 nm-en fotometráljuk. A hitelesítő görbét 50-250 µg/ml töménységű szacharóz oldatokból kell készíteni. A görbe alapján határozzuk meg a levelek szacharóz tartalmát (mg cukor/g friss tömeg). Anyagok és eszközök 1 hetes kukorica csíranövények, 90 %-os vizes fenol-oldat, tömény kénsav, 250 µg/ml-es szacharóz törzsoldat Beckman DU 65-ös spektrofotométer, pipetta, Erlenmeyer-lombik, kémcső, szike, olló, táramérleg, desztillált víz, vízfürdő, parafilm

63

16.

LÉGZÉSVIZSGÁLAT

FRENYÓ-FÉLE

"IDŐTITRÁLÁSSAL",

A

2,4-D

HATÁSA A LÉGZÉSRE

A növekedésszabályozó anyagok - köztük a gyomirtóként is használatos 2,4-diklórfenoxi-ecetsav (2,4-D) - bizonyos koncentrációban a növényi légzést serkenti. A légzés intenzitásának növekedését, az auxinok hatására megfigyelhető, érzékeny növényeknél jellemző növekedési zavarokhoz vezető fokozott nukleinsav- és fehérjeszintézis váltja ki. 2,4-D hatóanyagú gyomirtószert a kereskedelemben több változatban is forgalmaznak, pl. Dezormon, Dikamin D. Ezek a szerek elsősorban a széles levelű kétszikű gyomnövényeket irtják jól. A légzés intenzitását a következőképpen határozhatjuk meg: zárt edényben, fenolftaleinnel színezett ismert mennyiségű és koncentrációjú lúg fölé helyezzük a vizsgálandó - gyomirtóval kezelt és kezeletlen - növényrészeket. A légzés termelte CO2 semlegesíti a lúgot, amit a szín eltűnése jelez. A semlegesítés idejéből, a semlegesített lúg mennyiségéből, a szövet tömegéből következtetünk a légzés intenzitására. A munka menete 1. Burgonyagumóból dugófúróval vágjunk ki 2 db egyforma 4-5 cm hosszú szövetdarabot, mérjük le a tömegüket, majd gombostű segítségével rögzítsük őket egy-egy gumidugóhoz. 2. Az egyik gumóhenger felületét 2,4-D hatóanyagú gyomirtószerrel átitatott vattához nyomkodjuk. 3. 2 db 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba mérjünk 2-2 ml, fenolftaleinnel megfestett 0,001 n NaOH oldatot, majd az előkészített dugókkal zárjuk le a lombikokat. Jegyezzük fel az időpontot. 4. A lombik alján levő folyadékot időnként mozgassuk meg. Jegyezzük fel azt az időtartamot, amely alatt a termelt CO2 közömbösíti a lúgot.

64

Kiértékelés 1 ml 0,001 n NaOH-ot 0,044 mg CO2 semlegesít. A közömbösítés idejének ismeretében kiszámítjuk, hogy az adott növényi rész mennyi CO2-ot termel 1 óra alatt. Számoljuk ki, hogy a burgonya 1 g tömegű szövete mennyi CO2-ot termel 1 óra alatt. Hasonlítsuk össze a 2,4-D-vel kezelt szövet CO2 termelését a kontroll szövetével. Anyagok és eszközök burgonyagumó 0,001 n NaOH, fenolftalein indikátor, 2,4-D hatóanyagú gyomirtószer 50 ml-es Erlenmeyer-lombik, gumidugó, gombostű, dugófúró, mérleg

65

17.

KATALÁZ ENZIM AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

A kataláz rendkívül elterjedt Fe-porfirin tartalmú enzim a növényi szövetekben. A sejtek kataláztartalma elsősorban a peroxiszómákban és glioxiszómákban lokalizált, a kloroplasztisz nem tartalmaz katalázt. A kataláz funkciója a mérgező hidrogénperoxid bontása, ami in vitro a következő bruttó egyenlet szerint megy végbe: kataláz 2 H2O2 → 2 H2O + O2 (katalitikus működésmód) A kataláz a reakció során a H2O2 molekulához kapcsolódik, ebből a komplexből katalitikus reakció esetén, újabb H2O2 molekulával reakcióba lépve, az enzim szabaddá válása mellett víz és oxigén keletkezik. A katalázoknak katalitikus működésükön kívül - különösen alacsony H2O2 koncentráció mellett - peroxidatív funkciójuk is van. Ilyenkor a peroxid megkötése után az enzim valamely hidrogéndonorral (RH) reagál, mikor is az enzim és a donor szabaddá válása mellett víz keletkezik. kataláz H2O2 + RH → R + 2H2O (peroxidatív működésmód) A szervezetben számos enzimatikus reakció jár H2O2 termeléssel. A H2O2-t az aktivált oxigénformák közé soroljuk, belőle elektronfelvétellel hidroxil szabad gyök .

(OH ) keletkezhet, ez pedig gyökös láncreakciókat indíthat el. A C3-as növényekben jellegzetes H2O2 termelő hely a fotorespiráció során a peroxiszóma, ahol a glikolsav FAD-tartalmú glikolsav-oxidáz segítségével glioxálsavvá oxidálódik és közben H2O2 keletkezik, amit a kataláz bont. Ugyancsak keletkezhet H2O2 pl. a sejtfalban a lignifikáció során, vagy olajos magvak raktározószövetében a glioxiszómákban, az olajok lebontása során. A növények öregedése során a kataláz aktivitása csökken, ami a szabad gyökök és peroxidok akkumulációjához vezet, ez pedig elsősorban a membrán lipidek és ezáltal a membránok károsodását idézi elő. Kinetinkezeléssel mérsékelni lehet a kataláz aktivitásának csökkenését.

66

17/a A kataláz aktivitásának mérése titrálással

A kataláz mérésére egyéb módszerek mellett, a titrimetriás módszer is alkalmazható. A kataláz aktivitás egysége az 1 g növényi anyag által 1 óra alatt elbontott H2O2 mennyisége. A munka menete 2,5 g növényi anyagot - a gyakorlat során különböző korú leveleket, vagy különböző fotoszintézis típusú (C3, C4) növényeket is felhasználhatunk - kvarchomokkal dörzscsészében

homogenizálunk,

10

ml

pufferoldat

kis

részletekben

való

hozzáadásával. A homogenizált anyagot szintén pufferoldattal centrifugacsőbe bemossuk és centrifugáljuk. A centrifugacsőből a felülúszót mérőlombikba öntjük át és pufferrel 25 ml-re töltjük. Az így nyert enzimkivonat minden 10 ml-e kb. 1 g növényi anyagot tartalmaz. Ezután 2 Erlenmeyer-lombikban elkészítjük a következő reakcióelegyeket: E = 10 ml enzimkivonat + 5 ml 0,5 %-os H2O2-oldat K = 10 ml felfőzött enzimkivonat + 5 ml 0,5 %-os H2O2 (kontrollnak) Mindkét Erlenmeyer-lombikban lévő anyagot 1 óráig 25 °C-on inkubáljuk, majd 10 ml higított

kénsavval

megállítjuk

az

enzimtevékenységet.

permanganáttal halvány rózsaszínig titráljuk. 1 ml 0,1 n permanganát 1,7008 mg H2O2-nek felel meg. A kísérlet kiértékelése

A

mintákat

0,1

n

67

Számítsuk ki a kataláz-enzim által elbontott H2O2 mennyiségét és ennek alapján, hasonlítsuk össze a vizsgált növényi részek kataláz-aktivitását. .

.

Enzimaktivitás = (K - E) f 1,7008

H2O2 mg/óra/g növény

Anyagok és eszközök zöld növényi részek (bab, kukorica, búza levelek, szára, gyökere) hígított (1:5) kénsav, 0,1 n KMnO4-oldat, 0,5 %-os H2O2, 0,15 M-os 7,0 pH-jú foszfátpuffer kés, dörzscsésze törővel, kvarchomok, K-24D hűthető centrifuga, 100 ml-es mérőlombik, mérleg, Erlenmeyer-lombik, büretta, elektromos főzőlap

17/b A kataláz enzim aktivitásának mérése Frenyó-módszerrel (Használati utasítás a Frenyó-féle kataláz-mérő eszközhöz)

Az eszköz két változatban szerepel. Az egyik Y alakú, a másik egyenes, de recipiensén kis kiöblösödés van. Ezt az utóbbi típust szoktuk használni, pl. levélből kiszúrt korongok katalázaktivitásának mérésére. Mintavétel levelekből Legkisebb méretű (kb. 3-6 mm átmérőjű) dugófúrót használjunk. Tegyünk a levéllemez alá parafadugót és így metszünk ki belőle 10-20 korongot. (Átlagminta esetén más-más növényegyed leveléből szúrjuk ki a korongokat). Ha leszedett levelekkel dolgozunk; akkor egymásra tehetjük azokat, és egyszerre fúrhatjuk át az egészet. Szükség esetén egyetlen levéllemezt is össze Iehet hajtogatni, hogy egyetlen átszúrással sok korongot kapjunk. (A kutató természetesen maga dönti el, hogyan célszerű eljárni.) A szövetkorongok bejuttatása a recipiens öblébe

68

A recipienst vízszintesen tartjuk. Öbléhez közelítjük a levélkorongokat tartalmazó dugófúró nyílását. Pálcika (hurkapálcika, üvegbot stb.) segítségével úgy toljuk ki a szövetkorongokat, hogy a recipiens öblébe essenek. Szükség esetén megigazítjuk a korongokat. A recipiens megtöltése hidrogén-peroxid oldattal Miután a levélkorongokat elhelyeztük a recipiens öblében, a nyílásával fölfelé tartott recipiens egyenes részébe 1 %-os (esetleg hígabb, de nem töményebb) H2O2oldatot juttatunk pipettával. A legtöbb recipiensen 1,5 ml-nél jel található, idáig töltsük. A folyadék még ne érintkezzék a levélkorongokkal! Illesszük a recipiens nyílásába a becsiszolt mérőkapillárist. A mérés elvégzése Ha a berendezést a mérőkapillárisnál fogva hirtelen megfordítjuk úgy, hogy a recipiens fölfelé kerüljön, a mérőkapilláris pedig lefelé irányuljon, akkor a reagens folyadék és a levélkorongok találkoznak. A levélkorongok sebfelületén, vagyis a kerületén lévő sejtek kataláz enzime elkezdi bontani a reagenst. A sebzett sejtek kataláz-enzimének a hatására oxigén gáz szabadul fel, a fejlődő gáz pedig a mindenkori térfogatának megfelelően folyadékot szorít ki a recipiens teréből a lefelé irányuló mérőkapillárisba. A térfogat ezen éppúgy leolvasható, mint az osztott pipettán. Reagáltatás közben enyhén rázogatni kell (a metronóm szárának mozgását utánozva)

a

készüléket,

hogy

a

korongok

mindig

újabb

folyadékrésszel

találkozzanak. (A kapilláris végét nem szabad befogni!). A méréshez stopper, vagy másodperc-mutatós karóra szükséges. Egyszerűbbnek látszik annak mérése, hogy időegység (pl. 1 perc) alatt mennyi oxigén fejlődik, azaz az oxigén mennyi folyadékot szorít bele a mérőkapillárisba. Ez a mérés mégsem ajánlható, mert az így kapott eredmény nem egyszerűen arányos a katalázaktivitással. Inkább ajánlható a következő mérési mód: megnézzük, hogy pl. a kezeletlen levelekből kiszúrt szövetkorongok mennyi idő alatt fejlesztenek annyi oxigént, hogy a kiszorított folyadékoszlop eléri a mérőkapilláris közepe táján kiválasztott valamelyik jól leolvasható jelet. Ha most a kísérleti növény variánsaiból vett ugyanolyan korongok

69

mondjuk fele annyi idő alatt mutatják ugyanazt a hatást, akkor a katalázaktivitás kétszer olyan intenzív. (Célszerű megfigyelni, hogy ha pl. 20 korong hatására a folyadékoszlop 1/2 perc alatt éri el a jelet, akkor ugyanolyan 10 korong 1 perc alatt eléri-e a jelet, vagyis ugyanolyan 10 korong 1 perc alatt fejleszt-e ugyanannyi oxigént.) Tisztítás két mérés között Mérés után a recipienst vízzel kiöblítjük, megszárítani nem szükséges. A mérőkapillárist azonban csak szárazon használjuk, máskülönben folyadékcseppek dugaszolják el. Percek alatt használhatóvá tesszük a kapillárist, ha egyik végét 96 %os alkoholba merítjük. A behatolt alkoholt végigfolyatjuk a kapillárisban és kirázzuk belőle. Azután gumilabdával (pipettaballonnal) néhányszor átfújatjuk, amíg meg nem szárad. Ha ez nem volna kéznél, vízlégszivattyúval, sőt szájjal is szárazra szívhatjuk. Belefújni nem szabad, mert párás lesz. Anyagok és eszközök zöld növényi részek 0,5 vagy 1 %-os H2O2-oldat, 96 %-os etanol Frenyó-féle kataláz-mérő eszköz, dugófúró, parafa dugó, hurkapálcika vagy üvegbot, pipettaballon, stopperóra

70

18.

A POLIFENOLOXIDÁZ ÉS A PEROXIDÁZ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAK EGYÜTTES MÉRÉSE

A polifenol-oxidázok csoportjába több, a szubsztrátspecifitás alapján különböző, réztartalmú enzim tartozik. A lehetséges természetes szubsztrátok számát még megközelítőleg

sem

ismerjük,

a

növényekben

előforduló

fenolszármazékok

rendkívüli variabilitása miatt. A polifenoloxidázok egyes, a mitokondriális légzési lánctól eltérő végoxidációs rendszerekben (exomitokondriális légzés, direkt oxidáció) a polifenolokat színes anyagokká, kinonokká oxidálják a levegő oxigénjének jelenlétében. Pl. : p-difenol-oxidáz 2 p-difenol + O2 → 2 p-kinon + 2 H2O A kinonok aminosavakkal és fehérjékkel kapcsolódva alakítják ki azt a jellegzetes barna színű komplexet, amit sebzett növényi szöveteknél, pl. hámozott burgonyánál lehet megfigyelni. Ez a barnulási reakció csak oxigén jelenlétében játszódik le, a vízbe helyezett szeletelt burgonyagumó nem barnul. Ép szövetekre a reakció azért nem jellemző, mert a polifenoloxidáz és szubsztrátja (fenolok) intakt, egészséges szövetekben

egymástól

térben

elkülönítettek,

más-más

kompartmentekben

találhatók, csak a sejtek, membránok sérülésekor kerülnek egymás közelébe. A peroxidázok különböző H-donorokat (RH2) képesek eloxidálni H2O2, vagy szerves peroxidok (ROOH) jelenlétében, közöttük különböző fenolokat is. peroxidáz RH2 + H2O2 → R + 2 H2O A peroxidázoknak nagy szerepe van a ligninszintézisben. A növényi peroxidázok vastartalmú enzimek, amelyeknek hatócsoportja protohem. Mindkét enzim meghatározása azon alapul, hogy a szubsztrátumként használt pirogallol hatásukra narancsszínű purpurogallinná oxidálódik és a keletkezett festék mennyisége arányos az enzim aktivitásával.

71

A munka menete Homogenizáljunk 2,5 g burgonyagumó szövetet 25 ml pH = 6,5 foszfátpufferrel, majd szűrőpapíron szűrjük át. A szűrletből további kiegészítés nélkül vegyünk ki 3-szor 5 ml-t. Állítsuk össze a következő reakcióelegyeket: a,

50 ml 0,25 %-os pirogallol oldat 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpufferben, 0,25 ml 0,5 %-os H2O2 oldat 5 ml enzimkivonat

b,

50 ml 0,25 % -os pirogallol oldat 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpufferben, 0,25 ml desztillált víz 5 ml enzimkivonat

c,

50 ml 0,25 %-os pirogallol oldat 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpufferben, 0,25 ml desztillált víz 5 ml felfőzött enzimkivonat

10 percig vezessünk át finoman elosztott légáramot az edényeken, majd 20 perc múlva a reakciót állítsuk le 10 ml hígított (1:5) kénsavval. Az oldatokat Beckman DU-65-ös spektrofotométeren 430 nm hullámhosszon fotometráljuk. A keletkezett purpurogallin mennyiségét hitelesítő görbe segítségével állapíthatjuk meg. A kalibrációs görbét 100 µg/ml purpurogallin törzsoldat hígításaiból készítettük és tároltuk a spektrofotométer memóriájában. A c mintánál kapott értékeket levonjuk az a-ból és b-ből. Az így kapott a1(=a-c) értékekből levonva b1(=b-c) értékeket, megkapjuk a peroxidáz aktivitását, b1 pedig a polifenoloxidáz aktivitását adja. A keletkezett purpurogallin mennyiségeket számítsuk át 1g szövetre és 1 órára. Az enzim aktivitásokat mg purpurogallin/g növényi anyag/óra egységben adjuk meg.

72

Anyagok és eszközök burgonyagumó 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpuffer, kvarchomok, 0,25 %-os pirogallol oldat 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpufferben oldva, 0,5 %-os H2O2-oldat, 100 µg/ml purpurogallin törzsoldat Beckman DU-65-ös spektrofotométer, levegőztető inhalátor, mérőhenger, pipetták, 250 ml-es lombik, dörzsmozsár

73

19.

DEHIDROGENÁZ

ENZIMEK

KIMUTATÁSA

TTC

SEGÍTSÉGÉVEL

(VETŐMAGVAK ÉLETKÉPESSÉGÉNEK VIZSGÁLATA)

A légzési folyamatban számos enzim vesz részt. Ezek közül, a dehidrogenázokat TTC segítségével, színreakcióval mutathatjuk ki. A módszer lényege, hogy az élő növényi részekben - magvakban, rügyekben - működő dehidrogenázok a színtelen fenol

típusú

trifeniltetrazolium-kloridot

(TTC)

redukálják. A rózsaszínű formazán jelzi a

rózsaszínű

trifenil-formazánná

növényi szövetek,

vetőmagvak

életképességét. Magvak vizsgálata esetén a módszer előnye az, hogy azokon a fajokon, amelyek magja lassan csírázik, vagy nyugalmi állapotban van (és ezért ilyenkor közvetlenül csírázóképességet nem is lehet vizsgálni), a vetőmag életképességét biokémiai vizsgálattal határozhatjuk meg, nem kell a csíraképesség eldöntése céljából a nyugalmi állapot végét, illetve az elhúzódó csírázás eredményét megvárni.

7. ábra A dehidrogenázok redukált koenzimének (NADH2) oxidálása TTC-vel vörös színű trifenilformazán keletkezése közben. A reakció flavinenzim közreműködésével megy végbe. A tetrazóliumsók (használható a trifenil-tetrazólium jód és bróm származéka is) magvizsgálatokban való elterjedésének okai, hogy viszonylag gyorsan behatolnak a sejtekbe, rövid idő alatt redukálódnak, a redukció irreverzibilis és a redukció végbemeneteléhez különös beavatkozásra nincs szükség, a redukált alakjuk színes és stabil, a kivált formazán a redukció helyén marad, és bár fitotoxikusak de a

74

vizsgálatot végzőre veszélytelenek. A TTC-módszer minden növény magjára alkalmazható életképesség kimutatása céljából. A százalékban kifejezett életképesség azt jelzi, hogy a vizsgált magmennyiség milyen arányban tartalmaz olyan élő magvakat, amelyekről feltételezhető, hogy megfelelő körülmények között csírázásnak indulva ép csíranövényekké, majd szántóföldön, kedvező körülmények között normális növényekké fejlődnek. Az életképesség

tulajdonképpen

potenciális

csírázóképesség,

az

életképességi

százalék pedig a maximálisan kicsíráztatható magvak számát jelzi. Csírázáskor a külső környezeti feltételek és a magvak állapota (biológiailag érett, nincs magnyugalomban, nem sérült stb.) között összhang van. Minél jobban eltér egymástól e két fő tényező, annál nagyobb a különbség az életképesség és a csírázóképesség százalékai között. (A csírázóképesség a fajazonos és ép magvakból, a legkedvezőbb laboratóriumi feltételek közti csíráztatással, meghatározott idő alatt kapott normális csírák százalékát jelenti. A csírázóképesség természetesen a mag életképességét is jelzi, de nem biztos, hogy minden TTC-vel életképesnek minősített mag csírázásakor normális fejlődést mutató csírát fogunk kapni.) A munka menete 25

db,

előre

duzzasztott

kukoricaszemet

szikével

pontosan

az

embrió

hossztengelyében megfelezünk. A kettévágott szemek egyik felét Petri-csészébe tesszük és annyi TTC-oldatot öntünk a csészébe, hogy a magvakat ellepje. A Petricsészéket sötét helyre tesszük és kb. 3-4 óra múlva (a gyakorlaton idő hiányában 1 óra múlva) megszámláljuk a rózsaszínűre színeződött, életképes szemeket. A kettévágott szemek másik felét főzőpohárba helyezzük és leöntjük annyi desztillált vízzel, hogy ellepje azokat. A főzőpoharat ezután közvetlenül elektromos főzőlapra helyezzük és kb. 10 percig forraljuk. A főzött szemekről a vizet eltávolítjuk és TTColdatot öntünk rá. Megfigyeljük 1 óra múlva, hogy van-e színreakció. A kísérlet kiértékelése

75

Számítsuk ki a kukoricaszemek életképességét, amelyet %-ban fejezünk ki, és magyarázzuk is meg a jelenséget. Az életképesség eldöntéséhez használjuk a 8. ábrát. (A szemen pirosan elszíneződött részek az ábrán satírozva vannak. + életképes, - nem életképes)

8. ábra Kukoricaszem TTC-reakciója (Szabó L.Gy.,1980) Megjegyzés: 1. Szabályos életképesség vizsgálatoknál nagy számú, pl. 2x100 db fajazonos, tiszta vetőmagot kell kiválasztani és megfelelően preparálni. 2. A különböző magvakat különböző ideig kell vízben majd TTC-ben áztatni. Pl. kukoricaszemek esetében 3-4 órán keresztül kell vízben, majd ugyanennyi ideig TTC oldatban áztatni. Anyagok és eszközök duzzasztott kukoricaszemek 0,1 %-os frissen elkészített TTC-oldat Petri-csésze, főzőpohár, vízfürdő

76

20.

A KEMÉNYÍTŐ ENZIMES LEBONTÁSÁNAK VIZSGÁLATA

Gabonafélék szemtermésének csírázásakor a fejlődő csíra és a szkutellum gibberellineket választ ki (A), amelyek az aleuronrétegbe transzlokálódnak (B), és ott hidrolitikus enzimek (α-amiláz, proteáz, glükonáz, ribonukleáz) de novo szintézisét indukálják. Ezek az enzimek bejutnak az endospermiumba (C) és a vízben oldhatatlan tartalék tápanyagokat oldható vegyületekre bontják. Ezek egyrészt az aleuronrétegbe (E), másrészt a szkutellumon keresztül a fejlődő csírába (F) jutnak, ahol a növekedéshez szükséges szervesanyag- és energiaforrásként hasznosulnak. Az endospermiumban a keményítő hidrolitikus elbontása nagy energiaveszteséggel egybekötött elbontási folyamat, mert a glikozidkötések energiája, mint reakcióhő válik szabaddá. Az amilázok bontó hatása csak a raktározó szövetekben bizonyított.

9. ábra Csírázó gabonaszemek tartalék tápanyagainak mobilizálása, a gibberellinek szerepe (magyarázatot ld. a szövegben) A vizsgálat elve

77

Néhány napos csíranövényekből enzimkivonatot készítünk, mely amilázokat tartalmaz. Az alfa-amilázok a keményítőmolekula láncközi kötéseit bontják, a bétaamilázok a keményítőből és a dextrinekből, a lánc nemredukáló végétől kezdve maltóz-egységeket

hasítanak

le,

így

alfa-amiláz

hatására

főként

dextrinek

/(C6H10O5)x/, a béta-amilázra maltóz /C12H22O11/ keletkezik. Ezen specifikus hatásuk alapján endo- és exoamiláznak is mondják őket. Mindkét enzim bontja az el nem ágazó amilózt és az elágazó amilopektint is, de csak az alfa-1,4-glikozidos kötéseket. Az elágazó molekulák 1,6-kötései miatt relatíve nagy molekulájú, ún. "határdextrinek" is keletkeznek a bontás során. Ezeket az izo-amilázok (1,6glükozidáz) bontják el.

A maltóz lebontását glükózzá a maltáz enzim (alfa-

glükozidáz) katalizálja. Az enzimkivonatokkal lebontjuk a keményítőt és kimutatjuk a keletkezett termékeket. A keményítőt jódpróbával mutatjuk ki, amely azon alapul, hogy a jódmolekulák az amilóz

spirálisan

csavarodott

szerkezetének

(hélix-konformáció)

belsejébe

beépülnek, ahol van der Waals-vonzás rögzíti őket. A jódmolekulák itt más jellegű (apoláris) környezetben vannak, mint vizes vagy alkoholos oldatban. Ez a környezeti hatás a jódmolekulák elektronszerkezetét kis mértékben megváltoztatja, aminek az a következménye, hogy az amilóz-hélix apoláros belsejében más hullámhosszú fényt nyelnek el, mint vizes oldatban. Innen ered a jód színváltozása. A jód és a keményítő kék színű reakciója mindenkor bekövetkezik, ha az amilózlánc legalább 35 glükózmaradványt tartalmaz. A rövidebb dextrinláncok a jóddal ibolyaszínt adnak, ami a molekulalánc rövidülésével mindinkább vörösbe megy át és 13 glükózmaradvány esetén vörös színű jódkomplex képződik. Még rövidebb dextrinláncok esetén a színeződés egyre világosabb lesz és 6 glükózmaradványon túl a jódkomplexnek semmiféle színeződése nem következik be.

78

A munka menete Enzimpreparátum készítése Homogenizáljunk 4-5 napos árpa csíranövényekből kb. 2-3 g-ot dörzsmozsárban, kvarchomokkal és 30 ml desztillált vízzel. Mossuk be a homogenizátumot a centrifugacsövekbe és centrifugáljuk K-24D centrifugával 10 percig 10000-es fordulatszámon. A felülúszót öntsük le, és 60 ml-re egészítsük ki desztillált vízzel. Az így elkészített enzimkivonat keményítőmentes legyen (ezt jódpróbával állapítsuk meg). Az enzimkivonat hatásának vizsgálata a) Az enzimhatást különböző enzimkoncentrációk és állandó hőmérséklet mellett vizsgáljuk a következő összeállítás alapján: 1.

3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 0,5 ml

amiláz-oldat

2.

3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 1,0 ml

amiláz-oldat

3.

3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 2,0 ml

amiláz-oldat

4.

3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 4,0 ml

amiláz-oldat

5.

3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 4,0 ml

felfőzött amiláz-oldat

Az oldatokat kémcsőbe készítsük el és mindegyiket desztillált vízzel egészítsük ki 7 ml-re, majd helyezzük el azokat 40°C-os termosztátba. Kövessük a keményítő elbomlását 3 perces időközökben, cseppanalízissel, oly módon, hogy fehér porcelánlapra vigyünk fel 5 jódcseppet egymás mellé, s mindegyikhez adjunk egy csepp vizsgálandó anyagot. Amikor a jód barna színe nem változik, az elbomlás véget ért. A keményítőbontás befejezése után mutassuk ki a maltózt Fehlingpróbával: egy kémcsőbe tegyünk 2 ml Fehling-I (CuS04) és 2 ml Fehling-II (NaOH+Seignette só)-oldatot. Adjunk hozzá 4 ml-t a vizsgálandó anyagból, majd 5 percre állítsuk forró vízfürdőbe. A redukáló cukrok, így a maltóz is, a tiszta sötétkék Fehling-oldatot vörös Cu2O-csapadék kiválásával egyidejűleg elszínezik.

79

b)

Az enzimhatást az oldat különböző pH-értékei mellett vizsgáljuk:

Készítsünk Mc Ilvain-féle pufferoldat-sorozatot a következő pH értékekre: 2,2 - 3,0 4,0 - 5,0 - 6,0 - 7,0 - 8,0 Tegyünk kémcsövekbe 2-2 ml-t az egyes pufferoldatokból és mindegyikhez adjunk 2 ml keményítő- és 2 ml amiláz-oldatot. Helyezzük a kémcsöveket 40 °C-os termosztátba, és jódreakcióval kövessük a keményítő lebomlás ütemét. Ügyeljünk arra, hogy az elbomlási időt pontosan az enzim (amiláz) és a szubsztrátja (keményítő oldat) összeelegyítésének időpontjától kezdve mérjük! Mc Ilvain-féle pufferoldat I. 0,2 mólos Na2HPO4

Törzsoldat

II. 0,1 mólos citromsav pH 0,2 mólos Na2HPO4 0,1 mólos citromsav

2,2 0,2

3,0 2,05

4,0 3,85

5,0 5,15

6,0 6,31

7,0 8,23

8,0 9,72

7,95

6,15

4,85

3,80

3,69

1,17

9,72

Kiértékelés, következtetés - Ábrázoljuk grafikonon

a) az enzim koncentráció függvényében b) a pH függvényében a keményítő elbontás idejét!

- A grafikonok alapján értékeljük az enzimműködés sajátosságait! - Miért gátolhatja és serkentheti a pH változás az enzimműködést? - Mi által befolyásolja a hőmérséklet az enzimműködést? Anyagok és eszközök árpa csíranövények keményítő-oldat, jódoldat, Fehling I-II reagens, 0,2 M Na2HPO4, 0,1 M citromsav dörzsmozsár,

főzőpohár,

pipetta,

kémcsövek,

elektromos főzőlap, termosztát, vízfürdő, mm-papír

fehér porcelánlap,

centrifuga,

80

21.

A POLARITÁS TANULMÁNYOZÁSA NÖVÉNYEKEN

A polaritás a növényi és állati sejtek, szervek, ill. az egész szervezet két pólusának fiziológiailag és morfológiailag eltérő jellege. A polaritás vagy „sarkosság” mélyreható alak- és élettani differenciálódás bizonyos szervezet vagy szerv csúcsa (apikális pólusa) és alapi része (bazális pólusa) között. A polaritás jelenségét növényi sejtek esetében az auxin és más, közelebbről még nem ismert tényezők egyenlőtlen eloszlása eredményezi. Lényege a különböző gradiensek kialakulásában van. Mindazok a külső és belső tényezők, amelyek a különféle anyagok vagy aktivitások eloszlását megváltoztatva gradienseket tudnak létrehozni a növényben egyben a polaritás kiváltói is. A polaritás egyebek mellett, az auxinok áramlásának irányától függ. Az a pólus, amely felé az auxinok vándorolnak, a bazális pólus, és ahonnan vándorolnak, az apikális pólus. A polaritás fogalma azt is jelzi, hogy a citoplazma a sejten belül egész tömegében nem azonos tulajdonságú. A tulajdonságok a sejt pólusától a szemben álló másik pólusig, a „polaritástengely” mentén - sokszor folyamatosan - változnak. A polaritás következtében a sejtek két ellentétes pólusa különböző módon reagál a környezeti feltételekre. A polaritás hormongradienseket hoz létre, ugyanakkor ezek a gradiensek erősítik a polaritást. Az auxinoknak fontos szerepe van a polaritás kialakulásában. A bazipetális transzport révén az egyszer determinálódott polaritás legtöbbször végleges és maradandó. A polaritás jelenségével magyarázható, pl. az, hogy in vitro mikroszaporitás, vagy egyéb vegetatív szaporítás esetén csak az a hajtásdarab fog növekedni, amelyiknek a bazális részét dugtuk a táptalajba, illetve tápközegbe, mert a tápanyag felvételhez szükséges járulékos gyökeret csak a bazális póluson tud fejleszteni a hajtás. A

81

bazális póluson felhalmozódó sok auxin, illetve az itt kialakuló auxin/citokinin arány elősegíti a járulékos gyökerek differenciálódását. Ennek igazolására kísérjük figyelemmel a nedves légtérben felfüggesztett fűzfaágak új hajtásainak és gyökereinek megjelenését. A munka menete 1. Magas üveghengert vagy 1 literes mérőhengert nedves szűrőpapírral bélelünk ki. Az edény aljára kevés vizet öntünk. Kartonpapírból készített fedőlappal befedjük. A fedőlapra 3 db kb. 30 cm hosszú, friss, rügyes fűzfaágat függesztünk fel: az egyiket alapjával lefelé (normális helyzetben), a másikat csúcsával lefelé (fordítva), a harmadikat is normális helyzetben de úgy, hogy középső szakaszán a kérget 2-3 cm szélesen, gyűrű alakban eltávolítjuk (pl. szemzőkéssel vagy szikével). 2. Az ágdarabok ne érjenek a vízbe, a kísérletet sötétbe állítsuk be. Vigyázzunk arra, hogy a hengerben a relatív páratartalom mindig magas legyen. 2-3 hét múlva a hajtások és a járulékos gyökerek képződése alapján értékeljük a polaritás jelentőségét. Anyagok és eszközök Salix viminalis (vagy más Salix faj) fiatal ágdarabjai nagyméretű

mérőhenger

szemzőkés vagy szike

vagy

üveghenger,

szűrőpapír,

kartonpapír,

cérna,

82

22.

NÖVEKEDÉSSZABÁLYOZÓ ANYAGOK HASZNÁLATA GYÖKEREZTETÉSI MÓDSZEREKNÉL

22/a A gyökereztetés főbb szempontjai GYÖKEREZTETÉSHEZ ALKALMAZHATÓ SZEREK A járulékos gyökérképződés elősegítésére legtöbbször az alábbi auxinhatású vegyületeket használják: indol-3-vajsav (IBA) Nagyon aktív gyökeresedést serkentő anyag. Relatíve lassan bomlik le, gyengén transzlokálódik és így nagy része a kezelés helyén marad. Kereskedelemben Indolvajsav WP, Gyökereztető por B néven forgalmazzák. indol-3-ecetsav (IES) Az IBA-nál gyengébb hatású, és a felhasználásakor figyelembe kell venni, hogy sterilizálatlanul gyorsan lebomlik. α-naftilecersav (α-NAA) Szintén igen jó gyökereztető szer. Toxikusabb hatású, mint az

IBA

és

IES,

ezért

alacsonyabb

koncentrációban

kell

alkalmazni.

Kereskedelemben Rhizopon B, Gyökereztető por A, Incit1,2,5,8 néven forgalmazzák. A klór-fenoxiecetsavak közül jól alkalmazható megfelelő koncentrációban a 2,4-D, 2,4,5-T. A különféle anyagok különböző típusú gyökérzetet eredményeznek, így pl. az indolvegyületek szálasabb, a naftalinszármazékok zömökebb gyökeret produkálnak. ALKALMAZÁSI MÓDSZEREK Az

auxinok

dugványokba

való

bejuttatásának

számos

módszere

közül

a

legelterjedtebbek: 1.

Gyors bemerítés módszere

A dugványok alját csupán kb. 3-5 percre mártják bele a hatóanyag viszonylag tömény alkoholos oldatába, majd utána azonnal a gyökereztető közegbe ültetik. A módszer előnye, hogy kicsi a felszerelésigénye, a kezelés rövid ideje alatt kevéssé

83

függ a külső körülményektől, mint a többi eljárás. Ugyanaz az oldat ismételten is felhasználható. Alkalmazandó koncentrációk:

kb. 1000 ppm alacsony kb. 5000 ppm közepes 10000-20000 ppm magas

2.

Hosszabb idejű áztatás

E módszert leginkább akkor alkalmazzák, ha az auxinnal együtt más anyagokat (citokinineket, vitaminokat) is be akarnak juttatni a dugványba. Ha vízben kevésbé oldódó savat (IES, IBA, 2,4-D stb.) használunk, a kristályos anyagot kevés metilvagy etil-alkoholban kell feloldani, s ezt a törzsoldatot vízzel a kellő töménységre hígítani. Az auxinok sói, észterei, aminjai vízoldékonyak. A dugvány-kötegek alját kb. 2,5 cm mélyen szokták az oldatba állítani, a kívánt ideig. A kezelés időtartama a növénytől, a külső körülményektől és az oldat koncentrációjától függően 12h-tól 24hig vagy több napig is tarthat. E módszernél az oldat csak egyszer használható fel az auxinok bomlási készsége miatt. Alkalmazandó koncentrációk:

10-20 ppm alacsony 50-100 ppm közepes 200 ppm magas

3.

Púder módszer

Az eljárásnál vivőanyagként tiszta gyógyszertári talkumot használnak, mely semmiféle hatóanyagot nem tartalmaz. Az auxin megfelelő mennyiségét metil- vagy etil-alkoholban feloldják, hozzákeverik a púdert, majd az oldószert a pépes keverékből elpárologtatják. A dugványok illetve dugvány-kötegek alját 2,5 cm magasságig vízbe mártják és beleforgatják a púderbe, majd azonnal elültetik. Ez a legelterjedtebb eljárás. Alkalmazandó koncentrációk:

200-1000 ppm alacsony 2000-3000 ppm közepes 4000-5000 ppm magas

84

4.

Egyéb eljárások

Az egész leveles dugvány bemerítése az oldatba Az egész leveles dugvány permetezése Az auxinoldat beinjekciózása a dugványba Az auxinoldat vákumfiltrációval való bejuttatása A gyökereztető közeg öntözése a hatóanyag oldatával Lanolinpasztás eljárás, miszerint az auxint tartalmazó lanolint a dugvány bazális részének oldalára kenik (legelőnytelenebb eljárás) A KÜLÖNFÉLE NÖVÉNYEK SZÁRDUGVÁNYAINAK AUXINSZÜKSÉGLETE Az auxinkoncentráció helyes megválasztása rendkívül fontos, amitől nagyban függ a kezelés sikere. Minden esetre érvényes dózist azonban nem lehet megadni, mert a szükséges koncentráció számos körülménytől függ: a. A növény faji tulajdonságai A legkisebb töménység a lágyszárú egyéves növényeknek kell, ezek ugyanis könnyen gyökereznek. Közepes koncentrációt igényelnek a legtöbb fás növény fiatal hajtásdugványai. Legerősebb töménységet a legnehezebben gyökerező erősen fás hajtások (Rhododendron, citromfélék) és különösen az örökzöldek (fenyőfélék, ciprusfélék) dugványainak esetében kell alkalmazni. b. Kezelési idő Fordítottan arányos a koncentrációval. c. Gyökereztetési közeg A gyökereztetési közeg szintén befolyásolja az auxinszükségletet. Így pl. a homok nagyobb koncentrációt kíván, mint a homok-tőzeg keveréke. d. Hőmérséklet Ugyanaz a töménység magasabb hőmérsékleten jobban hat, mint alacsonyabb hőmérsékleten, mivel az auxin felvétele és transzlokációja magasabb hőmérsékleten gyorsabb.

85

A sikerre vezető koncentrációt minden esetben kísérleti úton kell meghatározni, és előre ki kell próbálni. Mivel a magas dózis valamennyi módszernél károsodást, sőt a dugványok pusztulását okozhatja, tanácsos először alacsonyabb koncentrációkkal próbálkozni. KÜLSŐ KÖRNYEZETI FELTÉTELEK HATÁSA A GYÖKEREZTETÉSRE A kezelt dugványok számára a transzspiráció csökkentése érdekében biztosítani kell a páradús környezetet. Ugyanebből a célból csökkenteni kell a párologtatási felületet, azaz a leveleket kevés kivételtől eltekintve el kell távolítani a hajtásról. A levelek eltávolítása azonban csak az auxinkezelés után történjék, mert a hormon a transzspirációs árammal szívódik fel a szárba, ennek biztosításához pedig kezdetben a levelek jelenléte szükséges. A növény igénye szerinti hőmérséklet fenntartása ugyancsak lényeges. KIEGÉSZÍTŐ KEZELÉSEK 1. Etiolálás A dugványok rendszerint könnyebben gyökereznek, ha az anyanövény előzőleg sötétben nevelkedett. Az etiolált dugványok jobban reagálnak az auxinokra is. 2. Sebzés Fás növényeknél, melyek nehezen gyökereznek, a bázishoz közel az epidermisz vagy kéreg hosszanti bemetszése vagy egy hosszirányú csík eltávolítása elősegíti a gyökeresedést. Ennek oka az, hogy a sérült sejtekből úgynevezett "sebhormonok", azaz a sejtosztódást stimuláló citokininek szabadulnak fel. 3. Cukor-kezelés Nádcukornak 2-4 %-ban az auxinoldatba való keverése ugyancsak előnyös a gyökeresedés szempontjából. A gombafertőzés elkerülése végett azonban fungicid anyagokat is kell adni a keverékhez.

86

4. Vitamin adagolás A B-komplex tagjai (B1, B2, B6-vitamin, biotin vagy H-vitamin, nikotinsav), mint a sejtosztódás és gyökérnövekedés stimulátorai, megfelelően adagolva fokozzák a gyökeresedést. 5. N-vegyületek Tapasztalatok szerint aminosavak és ammónium-foszfát adása a hormon oldathoz általában szintén stimuláló hatású. 6. Citokininek adása Megfelelő koncentrációban adva az auxinoldathoz, szintén fokozza a dugványok gyökeresedését. (Forrásmunka:

Varga

M.

1976.

Növekedésszabályzó

anyagok

gyakorlati

alkalmazása a növénytermesztésben. JATE, Szeged)

22/b Az α-naftil-ecetsav hatása a dugványok gyökérképzésére A dugványozás vegetatív szaporítási eljárások egyike, melynek során a szülővel genetikailag megegyező új növényeket nevelünk. A szaporítás sikerét meghatározza a dugványok gyökérképzésének intenzitása. A gyors gyökérképződést legtöbbször auxinhatású vegyülettel segítjük elő. Megjegyezzük, hogy csak a gyökér (járulékos gyökér)

differenciálódása

igényel

magas

auxinkoncentrációt,

a

gyökér

növekedéséhez alacsony auxinkoncentrációra van szükség, sőt a túlzottan nagy auxinkoncentráció a gyökérnövekedést gátolja. Egyes eredmények szerint az auxinnak mind a differenciálódásnál, mind a növekedésnél megfigyelt hatása nem közvetlenül az auxin jelenlétével, hanem az auxin hatására jelentkező fokozott etiléntermeléssel magyarázható. Erre bizonyítékul szolgál az, hogy az optimálisnál nagyobb auxinkoncentráció növekedésgátló hatását az etilénszintézis inhibitoraival (pl. kobalt-kloriddal) fel lehet oldani, illetve az etilénné átalakuló klór-etil-foszfonsav (pl. az Ethrel nevű szintetikus regulátorban) szintén serkenti a járulékos gyökerek kialakulását.

87

A munka menete 3-4 hetes fejlett primer levéllel rendelkező bab növények föld feletti részét levágjuk. Az alsó 1-2 cm-es részt a NES (α-naftil-ecetsav) 1000-2000 ppm-es oldatába mártjuk 3-4 percre. (A NES-t célszerű kevés alkoholban feloldani, majd tovább hígítani vízzel, ld. függelék.) A kontroll növényeket csak etanol/víz 1:5 arányú keverékébe mártjuk. A kezelést követően a felületet vízzel öblítjük, majd a növényeket úgy helyezzük nedves szűrőpapírral bélelt, kevés vizet tartalmazó, alufóliával elsötétített Erlenmeyer-lombikba, hogy a vágásfelület 1-2 cm-re a víz felszíne alatt legyen. A növényeket 25 °C-on, fényen tartjuk. 7-10 nap elteltével összehasonlítjuk a kezelt és a kontroll növények járulékos gyökérképződését.

Megszámoljuk

a

járulékos

leghosszabb gyökerek hosszát. Anyagok és eszközök 3-4 hetes babnövények NES 2000 ppm-es 96 %-os etanolos oldata, etanol Erlenmeyer-lombik, alufólia

gyökerek

számát,

mérjük

a

88

23.

A GIBBERELLIN HATÁSA A HOSSZANTI NÖVEKEDÉSRE

A gibberellinek általános hatása a hajtás hosszanti növekedésének fokozása. Ez felhasználható a gibberellinek kimutatására, illetve mennyiségi meghatározásra. A munka menete A búzaszemeket a kezelést megelőzően 30 °C-on 2 napig csapvízen áztatjuk. A kísérlethez 0,5 mm-es koleoptillal rendelkező növényeket válogatunk ki. A kiválogatott szemeket a GA3 0 - 0,1 - 1,0 - 10,0 - 100,0 ppm-es oldatával átitatott steril vattára helyezzük. Az 5 cm átmérőjű Petri-csészékbe 2-3 mm vastagságban helyezzük el a vattát és 3 ml gibberellin oldattal nedvesítjük. Azt követően, hogy a vatta kissé megszáradt a csírázó szemeket húszasával újabb Petri-csészébe rakjuk át, a vattát 5 ml vízzel nedvesítve. A Petri-csészéket fedjük és két napra fényre helyezzük, majd 3 ml vízzel kiegészítve, kifedve, nedves körülmények között fényen tartjuk. 5-7 nap elteltével a mezokotil és a második levélhüvely közötti távolságot mérjük. Anyagok és eszközök búzaszemek 100 ppm-es gibberellin oldat, desztillált víz Petri-csésze, szűrőpapír, termosztát, vatta

89

24.

A CCC NÖVEKEDÉSGÁTLÓ HATÁSA

A CCC /chlor-colin-chlorid/ egyike a legrégebben és legáltalánosabban használt növekedésszabályozó anyagoknak. Kereskedelemben Bercema CCC, CCC Siefes, Cycocel 460 néven forgalmazzák, kalászosok szárszilárdítására használják. Növekedésgátló hatását a gibberellinszintézis közvetett gátlásán keresztül fejti ki (gibberellininhibitor). Hatásmechanizmusa feltehetően a következő: gátolja a szövetek kolin-észterázát, ezáltal a szövetekben jelenlévő acetil-kolin nem bomlik le, és ez gátolja a gibberellin szintézist. Mivel a gibberellin szint lecsökken, ezért a megnyúlásos növekedés is mérséklődik, ez rövidebb, de erősebb internódiumok kialakulását eredményezi, ami a gabonák megdőlésének csökkentése, jobb betakaríthatósága szempontjából kedvező. Megjegyezzük, hogy a CCC-vel kezelt növények hideg- és fagytűrése, sőt betegségekkel szembeni rezisztenciája is nő. A jobb fagytűrésre a magyarázatot az adja, hogy a CCC a gibberellinekkel részben közös biokémiai úton keletkező szteroidok bioszintézisét is gátolja, ezért azok szintje lecsökken a membránokban, másrészt a CCC kolin része beépül a foszfolipidekbe (megnő a foszfatidil-kolin szint), és ez a változás a membránok összetételében a membránok fázisváltozás hőmérsékletének csökkenését eredményezi: alacsonyabb hőmérsékleten mennek át folyadékkristályos állapotból gélszerű állapotba. A munka menete 10-3 mólos CCC törzsoldatból koncentrációsorozatot készítünk: a tízszeresére hígított törzsoldat koncentrációja 10-4 mól. Ezt ismét tízszeresére hígítva 10-5 mólos oldatot nyerünk. A legkisebb vizsgálandó koncentráció: 10-8 mól. Búza, árpa szemeket 24 óráig különböző koncentrációjú CCC oldatban áztatunk. Kontrollként desztillált vizet használunk. A kezelést követően a szemeket kerti földbe,

90

cserepekbe vetjük. 2-3 hét elteltével mérjük a kezelt növények kontrollhoz viszonyított magasságát. Anyagok és eszközök búza vagy árpa szemek 10-3 mólos CCC törzsoldat pipetta, lombikok, cserepek

91

25.

SALÁTA HIPOKOTIL-TESZT A GIBBERELLINEK KIMUTATÁSÁRA

A növényi szövetekben természetesen előforduló gibberellinek és gibberellinszerű anyagok kimutatásához számos biológiai tesztet dolgoztak ki, mint pl. a törpe kukorica és törpe borsó teszt; borsó epikotil teszt; zab levélkorong teszt; gabona levélszekció tesztek; rizs csíranövény teszt; árpa endospermium teszt; salátamag csírázási teszt; saláta hipokotil teszt. Utóbbi teszt alapja, hogy a saláta hipokotil megnyúlása arányos a gibberellin koncentrációval. A teszt kivitelezése viszonylag egyszerű, a csíranövények kis méretük folytán nagy számban használhatók, tehát szériavizsgálatra

rendkívül

alkalmas

eljárás.

Érzékenység

és

specifitás

szempontjából azonban az árpa endospermium, valamint a törpe-növény tesztek jobbnak minősíthetők. A munka menete Csíráztassunk salátamagot nedves papírt tartalmazó Petri-csészében, 25 °C-on sötétben, míg a hipokotilok hossza a 4-5 mm-t el nem éri (kb. 36 óra). Készítsünk a 100 mg/l koncentrációjú GA3 törzsoldatból 0,01 - 0,1 - 1,0 - 10,0 mg/l-es hígításokat. A különböző hígítású oldatok néhány ml-ével nedvesítsünk meg Petri-csészébe tett szűrőpapírt és helyezzünk rá 20-20 db azonos fejlettségű saláta csíranövényt. Állítsunk be kontrollt desztillált vízzel. Inkubáljuk a csíranövényeket állandó fényen 25 °C hőmérsékleten. 48 óra elteltével mérjük meg a hipokotilok hosszát. Számítsuk ki a hipokotilok átlaghosszát az egyes koncentrációk esetében és fejezzük ki a megnyúlást a kontroll százalékában. Anyagok és eszközök saláta csíranövény 100 mg/l-es gibberellinsav (GA3) törzsoldat Petri-csésze, pipetta, csipesz, szűrőpapír, vonalzó, tálca, termosztát

92

26.

AZ ETILÉN KIMUTATÁSA BORSÓEPIKOTIL-TESZT SEGÍTSÉGÉVEL

A teszt a légtérben lévő etilén jelenlétének kimutatására alkalmas. Azon alapszik, hogy a borsó epikotil görbület alatti része (nem osztódó szövetek) etilén jelenlétében megduzzad, a görbület feletti levelek nem nyílnak szét, és az epikotil növekedése a kontrollhoz viszonyítva gátolt. A megnyúlási zónában az etilén gátolja a sejtek hosszanti megnyúlását, a sejtnagyobbodást azonban nem, így izodiametrikus óriás sejtek jönnek létre (apoláros sejtnagyobbodás). A borsó hajtáscsúcsában (osztódó szövetek) az etilén a sejtosztódást és a DNS szintézist is gátolja. A munka menete 2-3 cm epikotillal rendelkező etiolált borsó csíranövényeket 100 ppm-es 2-klóretilfoszfonsav

(etefon)

hatóanyaggal

permetezzük.

(A

szert

Ethrel

néven

növekedésszabályozó anyagként forgalmazzák a kereskedelemben, hatóanyaga 40 % etefon.) A 2-klóretil-foszfonsav a növényben etilén képződés közben bomlik. A kontroll növényeket desztillált vízzel kezeljük. A szerrel kezelt és a kontroll növényeket külön inkubátorban, sötét, 20 °C-os termosztátba helyezzük. A kiértékelést 4-5 nap elteltével végezzük. Anyagok és eszközök etiolált, 2-3 cm-es borsó csíranövények 100 ppm-es 2-klóretil-foszfonsav oldat (ETHREL-ből készítve) exikkátor, termosztát

93

27.

A

CSÍRANÖVÉNYEK

SZABAD

AMINOSAVAINAK

KIMUTATÁSA

KÖRPAPÍR-KROMATOGRÁFIÁVAL

A csíranövények nitrogén-anyagcseréje nagyon intenzív. A gyökerekben és hajtásban egyaránt nagy mennyiségben képződnek aminosavak, melyek elsősorban a fehérjék, de minden egyéb N-tartalmú szerves vegyület szintézisének alapanyagát képezik. A növényi fehérjék aminosav-összetétele a környezeti tényezők változásainak hatására nem változik, ugyanakkor a növények szabad aminosavainak spektruma a külső behatásokra érzékenyen reagál. A nitrogén-ellátás és az ásványos táplálkozás eltérései, a fertőző növényi betegségek, valamint a vízellátás, a hőmérséklet és napfénytartam különbségei a növények szabad aminosavtartalmában 200-300 %-os eltérést is előidézhetnek: az egyik aminosav koncentrációja erősen nőhet, amikor más aminosavaké csökken. Igen jellegzetes, pl. kórokozókkal fertőzött szövetekben a savamidok (glutamin, aszparagin), vízhiány esetén pedig a prolin felhalmozódása. Megjegyezzük, hogy pl. a pillangósokban olyan különleges szabad aminosavakat is azonosítottak, amelyek fehérjékben nem, vagy csak ritkán fordulnak elő, és állati szervezetekből teljesen hiányoznak. Kémiailag e vegyületek valamelyik fehérjeépítő aminosav homológjai, azoktól CH2 csoporttal különböznek. Pl. az azetizin-2karbonsav a prolin homológja. E különleges aminosavak szerepe még tisztázásra vár, de ismereteink szerint a fehérjeszintézis inhibitorai, illetve a növények védekezési reakciójában is szerepet játszhatnak. Pl. a pipekolsav (hidroxi-prolin homológ) fertőzött növények leveleiből jelentős koncentrációban kimutatható. A körpapír-kromatográfia a megoszlási kromatográfia egyik esete, ahol a papírt kör alakúra vágják és az eluáló szert a papír közepére viszik. Az elválasztandó anyagot a kör alakú papír közepétől kis távolságra elhelyezkedő koncentrikus körre visszük fel a 10. ábra szerint. A körpapír-kromatográfia előnye, hogy egyszerű, kis helyet

94

elfoglaló berendezésben végrehajtható, és rövid idő alatt elfogadható elválasztást ad. A gyakorlaton az eluáló szert papírkanóc (= összetekercselt kromatográfiás papírcsík) segítségével juttatjuk a papírra úgy, hogy a papír közepét dugófúróval kilyukasztjuk és ide bedugjuk a kanócot. A papírt felosztjuk 4 részre és az "A", illetve "B" szektorra az ismert összetételű kontroll-oldatokat visszük fel.

10. ábra A körpapírkromatográfia elrendezése A "C" és "D" körívre az alábbiak szerint készített ismeretlen összetételű oldatokat vigyük fel. A papíron csak grafitceruzával jelöljünk! A munka menete A

feladatot

sötétben

tartott

(etiolált)

és

fényen

tartott

csíranövényeken

párhuzamosan végezzük el. 5 napos búza csíranövények hajtás- (1g) és gyökérrendszerét (2g), külön-külön dörzscsészében kvarchomok segítségével 15-15 ml 80 %-os etanollal eldörzsöljük. A homogenizátumokat tölcsérbe tett szűrőpapíron megszűrjük, majd az oldatot óraüvegen infralámpa alatt bepároljuk. A visszamaradt anyagot 1-1,5 ml desztillált vízben feloldjuk. A növényi kivonatokból, valamint a standard aminosav-oldatokból is mikropipettával 20-20 µl-t viszünk fel a papírra, a startvonalnak számító körívekre. Ha ez a mennyiség egyszerre nem vihető fel a körívre, a maradékot a folt

95

beszáradása után ugyanoda cseppentjük. Megjegyezzük, hogy a "D", illetve a "C" szektorba gyökér-, illetve hajtáskivonatot vittünk. Futtatószernek butanol-ecetsav-víz 4:1:5 arányú elegyét használjuk, amit egy Petricsésze aljba öntünk. (A futtató oldatot kitöltés előtt fel kell rázni!) A Petri-csészére helyezzük a papírlapot, benne a kanóccal, egyelőre úgy, hogy a kanóc ne érjen a futtató oldatba és a papírlapra tesszük a Petri-csésze fedelét. A kromatografáló papír kb. 15 perc alatt telítődik az oldószer gőzeivel, ekkor lenyomjuk a papírkanócot, ezzel megkezdődik a szétválasztás. Ügyeljünk arra, hogy a Petri-csészék pereme szorosan zárjon. A futtatás befejezésekor (az oldószerfront eléri a Petri-csésze szélét) ceruzával megjelöljük az oldószerfrontot, és megszárítjuk a kromatogrammot. A megszárított kromatogrammokat ninhidrinnel (0,2 g/100 ml) hívjuk elő. Az előhívás során ügyeljünk arra, hogy a ninhidrinnel egyenletesen porlasszuk be a kromatogrammot és a szer ne follyon végig a papíron, mert ez összemosná a foltokat. (Vigyázzunk arra, hogy a ninhidrin ne kerüljön a bőrünkre és ne is lélegezzük be!) A ninhidrines kezelés után melegítsük (max 80 °C-on), illetve szárítsuk meg a kromatogrammot (pl. infralámpával) - a foltok a melegítés során fognak megjelenni. Az előhívott kromatogrammon körülrajzoljuk a foltokat és kiszámítjuk az Rf - értékeket. (Rf - érték =

az

egyes

foltok

középpontjának

távolsága

a

startvonaltól

osztva

az

oldószerfrontnak a startvonaltól mért távolságával). A standard oldatokkal történő összehasonlítás alapján állapítsuk meg, hogy a csíranövények hajtása és gyökere milyen szabad aminosavakat tartalmaz. Hasonlítsuk össze az etiolált és a fényen tartott növények aminosav-kivonatával készített kromatogramokat. Megfigyeléseinket rögzítsük és a kromatogramokat mellékeljük a kísérleti jegyzőkönyvbe. Az egyes kontroll-oldatokban levő aminosavak és azok sorrendje a kromatografáló papíron, a felcseppentés helyétől kiindulva: "A" : cisztin, aszparaginsav, glutaminsav, metionin, leucin "B" : aszparagin, glutamin, tirozin, valin, fenilalanin Megjegyzés:

96

1. Amennyiben a felvitt aminosavmennyiség az 1 mg-ot meghaladja, valamennyi komponens a startpont közelében halmozódik fel és kromatogram teljesen használhatatlan lesz. Jó kromatogramot csak akkor kapunk, ha a felvitt anyagmennyiség 20-60 µg között van. 2. A színfoltok, amelyeket az aminosavak és a peptidek a ninhidrinnel adnak, csak rövid ideig tartósak. Néhány nap múlva az éles határok (különösen fény hatására) kezdenek eltűnni, a foltok elszíntelenednek. A ninhidrinnel kapott foltokat rézreagenssel

állandósíthatjuk,

stabilis

rézkomplexek

keletkezése

útján.

A

rézkomplexfoltok kárminpiros színűek. Anyagok és eszközök etiolált és fényen tartott búza csíranövények futtató oldat (butanol-ecetsav-víz 4:1:5 arányban), 1 µg/µl-es aminosav-oldatok (a felsorolás szerint) 0,1 n HCl-ben, ninhidrines előhívó oldat, rézreagens, kvarchomok, 80 %-os etanol Petri-csészék, Whatman No. 1-es papír, kromatografáló papírcsíkok, mikropipetta, dörzscsésze,

olló,

hajszárító,

szárítószekrény

üvegtölcsérek, szűrőpapír, permetező készülék

vagy

infralámpa,

óraüvegek,

97

28.

A NÖVÉNYI KIVONATOK FEHÉRJETARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA

Növényélettani,

biokémiai

kutatások

során

enzimaktivitás

mérésekkor,

gélelektroforetikus elválasztások előtt, stb., gyakran szükség van a növényi kivonatunk fehérjetartalmának ismeretére. A növényi sejt protein készlete nagy számú, különböző proteinből áll, amelyek egymástól nemcsak az aminosavak szekvenciájában, hanem a kémiai és

fizikai sajátosságok

tekintetében

is

különböznek. Ezek a különbségek olyan nagyok, hogy nem lehet egy sejt, vagy egy szövet összproteinjét egyetlen módszerrel meghatározni. Mivel a proteinek extrahálása függ az extrahálószer összetételétől, a pH-tól és az ionerősségtől, vizsgálataink során azt a protein frakciót határozzuk meg, amely egy meghatározott pH-értéknél és meghatározott ionerősség mellett az alkalmazott oldószerben oldódik. Mivel sok protein magasabb hőmérsékleten denaturálódik és ezáltal oldhatatlan lesz, célszerű a meghatározásokat 15 °C-nál nem magasabb hőmérsékleten végezni. A fehérjék kimutatására sok módszer ismeretes; kicsapási- és színreakciók. A kivonat protein mennyiségére lehet következtetni - bár meglehetősen pontatlanul - a proteinoldat 280 nm-nél mért fényelnyeléséből is. A színreakciók a /Biuret-, Xanthoprotein-, Millon-reakció stb./ a fehérjék alkotórészeire, a bennük előforduló csoportokra jellemzőek.

28/a A fehérje mennyiségének meghatározása Biuret-reakcióval

A Biuret-reakció peptidekre és fehérjékre specifikus. A legalább két peptidkötést tartalmazó láncok kupri-ionok hatására alkalikus közegben lila színeződést adnak. A színeződés mértéke a protein mennyiséggel függ össze. Fotometrálással állapítjuk meg a protein-mennyiséget kalibrációs görbe felhasználásával.

98

E módszer - a Lowry-féle módszerhez képest - kevésbé érzékeny az aminosav összetételre, a különböző aminosav-összetételű proteinek a színintenzitást nem befolyásolják. Jelentős interferencia nem lép fel, de minden olyan anyag, amely 540 nm-nél abszorbeál zavarja a meghatározást. A módszer 10 és 1200 µg /ml koncentrációk között használható fehérje mérésre. A munka menete Mérjünk le 1 hetes babnövény gyökeréből és szikleveléből 5-5 g-ot, és hideg dörzscsészében kevés kvarchomokkal 5 ml pH 7,5 foszfátpufferrel homogenizáljuk. A sejttörmeléket 4x-es mullszöveten átpréseljük és a szövetnedvet hideg főzőpohárban felfogjuk. A présnedveket 4000-es fordulatszámmal centrifugáljuk 10 percig. Az enyhén zavaros felülúszót (nyers fehérjekivonat) öntsük át kalibrált kémcsőbe, és egészítsük ki a kivonatokat azonos térfogatúakra foszfátpufferrel. Ezt az oldat használjuk fel a fehérjekimutatáshoz. A fehérjekivonatból pipettázzunk 2 ml-t centrifugacsőbe és adjunk hozzá 2 ml 10 %os triklór-ecetsavat. A keletkező csapadékot centrifugáĺjuk le, és mossuk addig 5 ml 80 %-os alkohollal, amíg teljesen színtelen lesz. Rövid centrifugálás után öntsük el az alkoholt, majd a csapadékhoz adjunk 1 ml desztillált vizet és 4 ml Biuret-reagenst és kémcsőkeverővel jól rázzuk fel. A teljes feloldódás után kb. 25 perc múlva fotometráljuk 540 nm-nél. Kalibrációs görbe készítése 10 mg/ml kristályos marhaszérum-albumint tartalmazó törzsoldatból a következő hígításokat készítsük el. Hígításisor Törzsoldat, ml Desztillált víz, ml Biuret-reagens, ml

0. (vak) 1,0 4,0

1. 0,2 0,8 4,0

2. 0,4 0,6 4,0

3. 0,6 0,4 4,0

4. 0,8 0,2 4,0

5. 1,0 4,0

99

A mintákat jól rázzuk össze és kb. 25 perc múlva fotometráljuk az oldatokat 540 nmnél. Vakpróbaként a 0. mintát használjuk. A méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay Soft-Pac Module "PROG9:Biuret" programját használjuk. Kiértékelés, következtetés Az összehasonlító görbe alapján - illetve a spektrofotométer programjának eredményei alapján - állapítsuk meg a kivonatok protein-koncentrációját. Számoljuk ki az eredeti szövetek 1 g-jának fehérje tartalmát is figyelembe véve a hígításokat és azt, hogy 5-5 g szövetből indultunk ki. Hol képződnek a sejtben aminosavak és fehérjék? Anyagok és eszközök 7 napos bab csíranövények 7,5 pH-jú foszfátpuffer, 10 %-os triklór-ecetsav, 80 %-os alkohol, Biuret-reagens, marhaszérum-albumin (BSA) 10 mg/ml-es oldata dörzscsésze, porcelántálak, pipetta, kvarchomok, 4x-es mullszöveten, centrifuga, spektrofotométer

28/b A fehérje mennyiségének meghatározása Lowry-módszerrel

A fehérjetartalmat fotometriás módszerrel határozzuk meg. A meghatározás alapja, hogy a fehérjék tirozin és triptofán aminosavai alkalikus pH-n redukálják a FolinCiocalteu reagenst, aminek következtében kék színű komplex keletkezik. A keletkezett szín intenzitása erősen függ az inkubációs időktől, ezért ezek pontos betartására fokozottan ügyeljünk. A reakció az egyik legáltalánosabban használt fehérje-meghatározási módszer. A fehérjetartalmat előzőleg készített kalibrációs

100

görbéről olvassuk le. A fehérje-meghatározás az oldatban jelenlévő pufferektől, detergensektől, kelatizálószerektől és az aminosavösszetételtől (tirozin, triptofán) erősen függ. (A klorofill jenléte is zavaró, ezért szerves oldószerrel el kell távolítani a kivonatból.) A módszer 100-szor érzékenyebb, mint a Biuret-reakció. A munka menete Kukorica levelekből bemérünk 2 g-ot, majd dörzsmozsárban homogenizáljuk 10 ml 7,5 pH-jú foszfátpufferrel és 10 percig 6000-es fordulatszámmal centrifugáljuk. A centrifugálás során kapott felülúszót használjuk a fehérje-meghatározáshoz (eredeti kivonat). A fehérjekivonatból pipettázzunk 2 ml-t centrifugacsőbe és adjunk hozzá 2 ml 10 %os triklór-ecetsavat. A kicsapott fehérjét 10 percig 4000-es fordulattal centrifugáljuk. Centrifugálás után a folyadékot öntsük el, a csapadékhoz pedig adjunk néhány ml 80 %-os alkoholt. Kémcsőkeverővel jól keverjük meg, és tegyük félre kb. 10 percre. Az oldószer extrahálja a pigmenteket; a fehérjepelyhek elszíntelenednek. Az oldatot ismét centrifugáljuk, a színes oldószert lehetőleg maradéktalanul elöntjük, a kevés maradék alkohol elpárolog. Szerves oldószerrel végzett kicsapás hatására a fehérjetartalmú csapadék tömörré válik, és nehezen oldódik híg lúgban. A csapadékhoz adjunk 1ml 1n NaOH-ot, majd a fehérje oldódása után 9 ml desztillált vizet, ezzel az oldatot lúgra nézve 0,1 n-ra állítjuk be. (Ha a fehérje nehezen oldódna, a lúgos oldatot forró vízfürdőn is melegíthetjük.) Fehérje meghatározás: 0,5 ml mintához (fehérjekivonat 0,1n NaOH-ban) 4 ml C oldatot adunk, összerázzuk és 10 percig állni hagyjuk. Ezután a D oldatból 0,5 ml-t adunk hozzá, majd ismét azonnal összerázzuk. 30 perc elteltével a mintát fotometráljuk. A oldat: 2 %-os Na2CO3 0,1 n NaOH-ban oldva

101

.

B1 oldat: 1 %-os CuSO4 5H2O B2 oldat: 2 %-os Na-K-tartarát C oldat: 0,5 ml B1 és 0,5 ml B2 oldatot összekeverünk, majd 50 ml A oldatot adunk hozzá ("C" mindig frissen készítendő) D oldat: Gyári Folin-Ciocalteu reagens és desztillált víz 1:1 arányú elegye Kalibrációs görbét - melyet a fotométer memóriájában tárolunk - humán szérum albuminból (HSA) készítünk 40-400 µg tartományban a táblázatnak megfelelően.

Kémcső száma

1,0 mg/ml-es HSA oldat (µ µl)

Desztillált víz (µ µl)

C oldat (ml)

D oldat (ml)

µg feh./teszt

0. (VAK) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

40 60 80 100 150 200 250 300 350 400

500 460 440 420 400 350 300 250 200 150 100

4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,0 40,0 60,0 80,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0 350,0 400,0

A méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay Soft-Pac Module "PROG 8:Lowry LS" programjátot használjuk. Ezt a programot akkor használjuk, ha a koncentráció 25 µg/ml felett van (alacsony érzékenységű mérés 500 nm-en). Ha az oldatunk fehérjetartalma igen nagy, akkor 0,1 n NaOH-val hígítjuk. Számoljuk ki az eredeti kivonat fehérje koncentrációját figyelembe véve a hígításokat. Megjegyzés:

102

Ha híg fehérjekivonattal dolgozunk (a kivonat fehérje koncentrációja 25 µg/ml alatt van), akkor a méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay SoftPac Module "PROG 7:Lowry HS" programját használjuk (nagy érzékenységű mérés 750 nm-en) és annak megfelelő koncentráció tartományban készítsünk standardokat. Anyagok és eszközök kukorica levelek pH 7,5 foszfátpuffer, 1 n NaOH, 80 %-os alkohol, 1mg/ml-es HSA oldat, reagensek: ld. a szövegben Beckman DU 65-ös spektrofotométer, dörzsmozsár, centrifugacső, kémcsövek, kémcsőkeverő

28/c A fehérje mennyiségének meghatározása Bradford-módszerrel

A Bradford-módszer mikrogramm mennyiségű fehérje gyors és érzékeny fotometriás meghatározására alkalmas. Ez a módszer négyszer érzékenyebb, mint a Lowry-féle módszer. A mérés színreakción alapul, amit a Coomassie Brilliant Blue G-250 festék (CBBG-250) fehérjékkel való komplexe ad. A vörös színű festék fehérjéhez kapcsolódva kék színűvé alakul át. A szín 2 perc alatt alakul ki és 1 órán át stabil. A mérés során kevés interferencia van, a meghatározást a fehérjeoldatban levő egyéb anyagok (puffer-komponensek, detergensek, stb.) csak kevésbé befolyásolják, hatásuk a kontroll megválasztásával kiküszöbölhető. A módszerrel 1 és 140 µg/ml fehérjekoncentrációk között mérhetünk, ha 10 µg/ml alatt, illetve felett külön-külön standard sorozatot használunk. Ebben a leírásban 10 µg/ml alatti méréshez használható protokollt adunk meg. A munka menete

103

Homogenizáljunk 1 hetes bab növény gyökeréből 1 g szövetet 5 ml 7,5 pH-jú foszfátpufferrel. A homogenizátumot centrifugáljuk 6000-es fordulattal 10 percig. A felülúszóból (eredeti kivonat) vegyünk ki 1 ml-t és készítsünk 3-4 tagú, ötös léptékű hígítási sorozatot az extrakciós pufferrel, hogy a feltételezett fehérjekoncentráció a mérhető (illetve ebben a mérésben ≤ 10 µg/ml ) tartományba essen. Standardok készítése és mérése

µg feh. /ml

0. (VAK)

2,5

5,0

7,5

10,0

1 mg/ml BSA (µ µl) 0,15 M NaCl (µ µl) CBBG-250 oldat (ml)

-

7,5

15,0

22,5

30

300

292,5

285,0

277,5

270,0

2,7

2,7

2,7

2,7

2,7

Mérjük össze a táblázat szerinti komponenseket, majd 5 perc múlva mérjük az extinkciójukat. A minta koncentrációjának megállapítása Mérjünk be 300 µl megfelelően hígított vizsgálandó oldatot egy centrifugacsőbe és adjunk hozzá 2,7 ml Coomassie Brilliant Blue G-250 oldatot. Kémcsőkeverővel gondosan rázzuk össze, de kerüljük el az oldat túlzott habosodását. Mérjük meg 4-5 perc múlva 595 nm-nél a minta extinkcióját. Számoljuk

ki

az

eredeti

kivonat

fehérjekoncentrációját

a

hígítások

figyelembevételével. Megjegyzés: A méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay Soft-Pac Module "PROG 6:Bradford" programját használjuk. Anyagok és eszközök

104

1 hetes bab növény pH 7,5 foszfátpuffer, 1 mg/ml BSA, 0,15 M NaCl, CBBG-250 oldata dörzsmozsár, centrifuga, centrifugacsövek, kémcsőkeverő, mikropipetták

105

29.

FEHÉRJÉK VIZSGÁLATA POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

29/a A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) jellemzői

A növényi fehérjék (polipeptidek, enzimek) vizsgálatára az egyik legalkalmasabb módszer a gélelektroforézis. A gélelektroforézis egy olyan elválasztási technika, ahol valamely gélszerű hordozóra felviszik a vizsgálandó anyagot, majd a gélt elektromos erőtérbe helyezik. Az erőtér hatására megindul a minta egyes frakcióinak vándorlása töltésüktől függően az ellentétes pólus felé. Az eltérő vándorlási sebesség miatt a frakciók elválnak egymástól. A szétvált frakciókat speciális festéssel láthatóvá lehet tenni és amennyiben a gélen – megfelelő körülmények között - ismert méretű (tömegű) standardokat is futtattunk, akkor a frakciók méretét is meghatározhatjuk. A gélelektroforézisnek több változata ismert a hordozók szerint. Kezdetben a keményítőgéleket, majd az agargéleket használták, mindkettőnek ma is speciális alkalmazási területe van. A poliakrilamidgélek 1959-ben jelentek meg. A poliakrilamidgél az akrilamid és metilén-bisz-akrilamid monomerekből képződő kopolimer. A lineáris poliakrilamid-struktúrát helyenként metilénhidak stabilizálják. Ez térhálós szerkezetet eredményez. A polimerizációs folyamat tetrametil-etiléndiamin indikátor (TEMED) vagy dimetilamino-propionitril (DMAPN) és perszulfát katalizátor jelenlétében, vagy riboflavin jelenlétében fotokatalitikus úton (fényhatásra) indítható meg. Térhálós szerkezete folytán a gél molekuláris szitaként viselkedik. A pórusnagyság az akrilamid monomer koncentrációjával függ össze (7,5 %-os gél esetében 50 Å). A poliakrilamid gélelektroforézis számos előnnyel rendelkezik a keményítő gélelektroforézissel szemben: felbontó képessége nagyobb, a gél átlátszó, így kvantitatív kiértékelésre is alkalmas. Egyik alkalmazási formája, a „disc”elektroforézis 50-200 µg-nyi fehérjemennyiség elektroforetikus vizsgálatát is lehetővé teszi. A PAGE a 103 és 106 D (dalton) közé eső molekulatömegű molekulák töltés és méret szerinti elválasztására alkalmas.

106

A PAGE hátrányaként szokták felemlegetni, hogy az akrilamid monomer rákkeltő hatásúnak és idegméregnek bizonyult. Az alapvető laboratóriumi munkavédelmi előírások betartásával (kesztyű használata) azonban felhasználása veszélytelenné tehető. A PAGE-t lehet csövekben, illetve üveglapok között kiöntött gélen végezni. A géllapokra épülő technika előnyösebb a csövek alkalmazásánál. Módot ad kétdimenziós technikák végzésére, másrészt egy gélen számos minta precíz összehasonlító elemzését teszi lehetővé. A gélek kiöntésére és készülékbe helyezésére speciális küvetták szolgálnak, melyeket a futtatás előtt kell összeállítani. A küvetta részei a gélnek megfelelő méretű üveglapok és a gél vastagságát meghatározó keskeny távtartó üvegcsíkok. A mintafelvivőhelyeket tetszőleges fogszámú műanyag „fésű”-nek a még folyékony monomer oldatba helyezésével lehet kialakítani. A polimerizáció után a fésűt eltávolítjuk. A fogak helyén a gélben „zsebek” maradnak vissza, oda juttatjuk be a mintát. A minták felviteléhez mikropipettát használunk. Egy mintahelyre általában 530 µl folyadék vihető fel. A

futtatáshoz használt

berendezések

rendszerint

egy alsó

és

egy felső

puffertartályból épülnek fel, melyek a platina elektródokat is tartalmazzák. (A két tartály között a gélen keresztül vándorol az áram.) Az elektródok érintésvédelemmel ellátva, szabályozható, egyenáramú tápegységhez kapcsolódnak. A tartályokba esetenként hűtőfolyadék keringető rendszer van beépítve. Ennek hiányában a futtatást hűtőszekrényben végzik. A futtatás közben a gélek felmelegedését el kell kerülni részben azért, mert egyenlőtlen futást eredményezne a géllap szélei és közepe között („a gél mosolyog”), másrészt pedig inaktiválná az enzimeket, ami izoenzim elválasztás esetén lehetetlenné tenné az enzimműködésre épülő speciális festéseket. A megfelelő áramerősség és feszültség a puffer ionerősségétől függ. A túlzott felmelegedés megelőzése érdekében a teljesítmény nem haladhatja meg az 50 W-ot. A futtatás után kikapcsoljuk a tápegységet, eltávolítjuk a csatlakozó huzalokat, az üveglemezeket rögzítő kapcsokat és a gélt festőtálba juttatjuk. A fehérjék

107

nemspecifikus festésére általában Coomassie Brillant Blue R 250 festéket használunk. Ezzel csíkonként 0,5 µg fehérjét lehet minimálisan kimutatni. Gyakran használják az ezüstfestést, azzal 0,01 µg fehérjét lehet minimálisan kimutatni. A festet géleket fotózni szokták, kiértékelésük vizuálisan vagy géldenzitométerrel történik. A poliakrilamid gélelektroforézisnek a leírtakon túlmenően számos változata létezik.

29/b Burgonyafajták azonosítása poliakrilamid gélelektroforézissel a raktározott fehérjék és az észteráz izoenzimek alapján

A hagyományos morfológiai jellemzésen alapuló módszerek mellett, egyes esetekben szükség lehet biokémiai jellegű vizsgálatra is, egy genotípus pontos azonosítása érdekében. Pl. in vitro körülmények között (in vitro génbankban) a genotípusok morfológiájuk alapján nem azonosíthatók. Ugyancsak bizonytalan lehet egy fajta azonosítása a kereskedelemben, amikor már nem az egész növény, csak pl. a burgonya esetében a gumó áll rendelkezésünkre. Kereskedelmi, fajtavédelmi szempontok, a genetikai stabilitás ellenőrzése tehát igényli ezeket a kemotaxonómiai módszereket. Az egyes fajok, genotípusok azonosítására ma már több fehérje, izoenzim és DNS technika áll rendelkezésünkre. Burgonya esetében a gumó raktározott fehérjéinek és észteráz izoenzimjeinek elektroforetikus spektruma megbízhatóan használható egy-egy fajta azonosítására. A módszert az 1960-as években vezették be, azóta kétszer is közzétették az európai burgonya fajták - gélelektroforetikus mintázatokat is tartalmazó - katalógusát.

108

A munka menete Fehérje kivonat készítése Készítsünk kivonatot különböző burgonya fajtákból. A kivonat készítéshez használt gumónak frissen felszedettnek, érettnek és egészségesnek kell lennie. Amennyiben már betárolt gumót vizsgálunk, akkor lehetőleg 4-10 °C-os tárolóból származzon és legfontosabb, hogy a gumónak nyugalmi állapotban kell lennie, nem csírázhat. A gumót hideg vízben mossuk meg és töröljük szárazra, majd -20 °C-on fagyasszuk egy éjszakán át. Másnap szobahőmérsékleten kiolvasztjuk és homogenizátorral (gyümölcscentrifuga) lét nyerünk belőle. A lé minden 10 ml-éhez 0,05 ml szulfitoldatot adunk, amivel a nem kívánatos oxidációs reakciókat gátoljuk meg. Centrifugálással (10 perc, 3000 g-vel) eltávolítjuk a léből a keményítőt. (A szulfittal kezelt oldat nagy részét kisebb adagokba szétporciózva lefagyaszthatjuk, így évek múltán is alkalmazható fajtaazonosításra.) A lecentrifugált mintánk felülúszójának 0,9 ml-éhez 0,1 ml festék-oldatot adunk, ami cukor/amidofekete keveréke (ld. függelék). A festékkel a gélen nyomon tudjuk követni az ionfront vándorlását, a cukorral pedig a minta fajsúlyát növeljük meg, ami a minta felvitelénél az ülepedést segíti elő a zsebekben. A gélküvetta összeállítása Állítsunk össze az alábbiak szerint két küvettát. A küvetta két oldalát képező üveglapok közé helyezzük a 3 mm-es távtartókat, majd szigetelőszalaggal oldalt összeragasztjuk a lapokat. A küvetta aljába vékony szilikon csövet helyezünk, majd itt is szigetelőszalaggal leragasztjuk. A küvettát oldalt erős csipeszekkel fogjuk össze és a belső éleket körbe folyatjuk mikrohullámú készülékben felolvasztott 1 %-os forró agarózzal. Az agaróz pillanatok alatt megdermed és ettől kezdve jól szigetel a távtartók mentén. A gél elkészítése és a futtatás

109

Az elválasztást 2 db 3 mm vastag, 6 %-os poliakrilamidgélen végezzük. Ehhez főzőpohárban állítsuk össze a következő monomer-oldatot: - 200 ml akrilamid (6 %) / bis-akrilamid (0,3 %) monomer pH 8,9 TRIS/bórsavas pufferben - 714 µl 10 %-os frissen készített Na-szulfit oldat - 500 µl DMAPN (3-dimetilamino-propionitril) - 4 ml 2 %-os frissen készített ammonium-perszulfát-oldat (AMPS) Az oldatot az összemérés és óvatos keverés után azonnal a gélküvettába kell tölteni. Ehhez a küvettát rögzítsük függőlegesen, majd óvatosan, buborékmentesen töltsük bele a monomer-oldatot, és helyezzük bele a fésűt. A teljes polimerizálódás ideje alatt (kb. 0,5-1 óra) a küvettát nem szabad mozgatni. A polimerizációt követően óvatosan eltávolítjuk a fésűt, a szigetelőszalagokat és a szilikoncsövet, és a gélküvettát csipeszekkel rögzítjük az elektroforézis készülék puffertartályához. Az érintkező részeket itt is forró agarózzal futtatjuk be. A tartályokat feltöltjük TRIS/bórsavas pufferrel. Az összfehérje vizsgálathoz fajtánként 5-10 µl megfestett mintát vigyünk fel az egyik gélre. Az észterázokhoz a másik gélre - azonos sorrendben - 3-5 µl-t mintát vigyünk fel burgonya fajtánként. A minták felvitele után csatlakoztatjuk a készüléket a tápegységhez, a készüléket hűtőszekrénybe helyezzük és 300 V feszültséggel megindítjuk a futtatást úgy, hogy a vándorlás az anód felé történjen. A futtatást addig végezzük, amíg a gélen a festékcsík el nem éri a gél alját (2-3 óra). Ekkor a készüléket kikapcsoljuk, a géleket kiszedjük az üveglapok közül és megfestjük őket. A gélek festése A fehérjék nemspecifikus festéséhez a gélt Coomassie Brillant Blue R 250 0,025 %os oldatába helyezzük 3 óra időtartamra, vagy 0,01 %-os oldatba éjszakán át történő festés esetén. (A gélfestő-oldat leírását a függelék tartalmazza.) Festés közben célszerű a gélt enyhén rázatni. A festés után a gélt 3-4 alkalommal színteleníteni kell víz/metanol/ecetsav 14:6:1 arányú keverékével (kb. 300 ml-el alkalmanként). A

110

színtelenítés során a gélnek azon részei, melyek nem tartalmaznak fehérjét, elszíntelenednek, a fehérje-festék komplexek viszont jól látható kék csíkok formájában jelennek meg. Az észtározok megjelenítéséhez a másik gélt 200 ml 0,15 M-os pH 7,2 foszfátpufferbe helyezzük szobahőmérsékleten 5-10 percre, majd hozzáadunk 3 ml acetonban feloldva 40 mg 1-naftil-acetátot (ezt használjuk az észterázok szubsztrátumaként) és vízben oldva 100 mg Fast-Blue-RR sót. Kb. 1 óra alatt megjelennek az észterázokra jellemző barna sávok, ezek az enzimreakció következtében felszabaduló 1-naftol és a Fast-Blue-RR só színes komplexei. A reakció leállításához a gélt a fehérjék festésénél használt színtelenítő oldatba helyezzük. Kiértékelés Hasonlítsuk össze az egyes burgonya fajták fehérje és észteráz spektrumát! Figyeljük meg a közös és az eltérő sávokat. A géleket fotózás, vizuális vagy/és denzitométeres kiértékelés után nylon zacskóba hegesztve szárítva, vagy nedvesen hosszú ideig tárolni lehet. Anyagok és eszközök különböző burgonya fajták gumói szulfit-oldat, festék-oldat (cukor/amidofekete), 1 %-os agaróz, akrilamid (6 %) / bisakrilamid (0,3 %) monomer pH 8,9 TRIS/bórsavas pufferben, 10 %-os frissen készített Na-szulfit oldat, DMAPN, 2 %-os frissen készített ammonium-perszulfátoldat (AMPS), Coomassie Brillant Blue R 250 0,025 %-os oldata, pH 8,9 TRIS/bórsavas puffer, víz/metanol/ecetsav 14:6:1 arányú keveréke, 0,15 M-os pH 7,2 foszfátpuffer, aceton, 1-naftil-acetát, Fast-Blue-RR só elektroforézis készülék tartozékokkal, centrifuga, homogenizátor, kémcsövek, Eppendorf-csövek,

mikropipetták,

festőtálak, rázatógép, főzőpoharak

szigetelőszalag,

mikrohullámú

készülék,

111

30.

AZ ANTOCIÁNOK KIVONÁSA ÉS TULAJDONSÁGAIK VIZSGÁLATA

Az antociánok piros és kék virágok, valamint színes gyümölcsök nagy részének színét adó flavan-vázas amfoter jellegű vegyületek. Szerkezetüket tekintve antocianidin-glikozidok, melyekben a cukorpartner (pentóz, hexóz, vagy szacharóz) egy

festékkel

(antocianidinnel)

kapcsolódik.

A

vöröskáposzta

cianidinje

szinapinsavval kapcsolódik. Az antocianidin maga vízben oldhatatlan, azonban cukorral kapcsolódva már oldódik a vakuólum sejtnedvében. Az antociánok főként felületi szövetekben találhatók, de mélyebben elhelyezkedő szövetekben is előfordulnak rendszerint a sejtnedvben oldva vagy ritkábban kristályosan. Ásványi és szerves savakkal jól kristályosodó sókat képeznek. Színük sokféleségét a bennük levő festék változatossága adja, de a közeg pH-ja is befolyásolja a szín kialakulását. Savanyú közegben piros, lúgos közegben kék színűek. A festékeknek különböző ionokkal való komplexei fontosabb szerepet kapnak, mint a pH-érték. A búzavirág kék színe pl. az antocianidin káliumsójától származik, nem pedig a lúgos kémhatás következménye. A virágpigmentek, köztük az antociánok biológiai szerepe sokféle. Elsősorban mint színszűrők működnek, a pollen generatív sejtjeit védik a rövidhullámú sugarakkal szemben, valamint védelmet nyújtanak a gombák és baktériumok támadása ellen is. Színükkel a rovarokat már messziről csalogatják, segítve ezzel a megporzást. A virágok különleges rajzolata az ún. "mézösvények" mutatják a rovaroknak a nektárhoz vezető utat. A piros és kék színű virágokban, gyümölcsökben a megporzást és a termésterjesztést (madarak) szolgálják. Az antociántartalmú levelek a Nap hősugarait jobban hasznosítják (fagyvédelem). Megjegyezzük, hogy a növények színének kialakításában az antociánok és a korábban tárgyalt fotoszintetikus pigmentek mellett más vegyületek is részt vesznek. Ilyenek, pl. a flavonol-glükozidok, melyek az antociánokkal rokon vegyületek, sok

112

növény - köztük a napraforgó - sárga virágszínét okozzák. Míg az antociánok okozta szín a sejtnedv savas vagy lúgos jellegétől is függ, addig a flavonol-glükozidok színe állandó. Kísérletünkben antocián-kivonatot készítünk, és különböző pH-értékeknél vizsgáljuk a színét. A munka menete Vékonyan szeleteljünk fel vöröskáposztát, 5-szörös mennyiségű desztillált vízben főzzük fel, majd szűrjük le az oldatot. Az antocián-kivonatból tegyünk néhány ml-t kémcsövekbe és adjunk hozzájuk 0,1 n sósavból annyit, amíg színük élénkvörös lesz. Ekkor cianidin-klorid keletkezik. Ezután 0,1 n NH4OH-val semlegesítsük azt az eredeti szín visszatéréséig. Adjunk több lúgot is az oldatba és figyeljük a szín megváltozását (kékeszöld-zöld-sárga). Készítsünk foszfátpufferrel oldatsorozatot; pH 2,1-11,2-ig. (A puffer receptjét a függelék tartalmazza.) Töltsük be ezeket egy sorozat kémcsőbe (3-3 ml-t) és a sorozathoz adjunk az antocián-extraktumból 5-5 ml-t. Figyeljük meg a színváltozást! Mártsunk be a tömény antocián kivonatba egy-egy szűrőpapírcsíkot, majd szárítsuk meg azokat. A száraz antociános papírra a pH érték növekedésének sorrendjében cseppentsünk pufferoldatokat. Ragasszuk be a jegyzőkönyvbe a papírcsíkokat és írjuk az egyes foltok mellé a pH értékeket! Anyagok és eszközök vöröskáposzta (Brassica oleracea convar. capitata f. rubra) .

0,1 n HCl, 0,1 n NH4OH, 0,066 M KH2PO4, 0,066 M Na2HPO4 2H2O, 0,066 M K3PO4 kémcsövek, pipetták, szűrőpapír, cseppentő, fazék, kés, tölcsér, elektromos főzőlap

113

31.

A NIKOTINTARTALOM MEGHATÁROZÁSA

A nikotin a dohánynövény fő alkaloidja. A közönséges dohánylevél (Nicotiana tabacum) finom minőségű fajták esetén 0,5-1,5 %, a durvább minőségű fajták esetén 2,5-3 % nikotint tartalmaz. A kapadohány (N. rustica) nikotintartalma szárazanyagra számítva meghaladja az 5 %-ot. Vannak majdnem teljesen nikotin mentes fajták is, némelyek pedig 15 % -ot tartalmaznak. A nagy nikotintartalmú fajtákból tiszta nikotint állítanak elő. A tiszta nikotin színtelen, kábító szagú folyadék, erős idegméreg. Levéltetvek, szilvamoly, szőlőmoly stb. ellen 0,1-0,2 %-os permetlében használják. (Mérgező hatása megközelíti a hidrogéncianidét.) A halálos dózisa emberre 40-60 mg, ezért levélzöldség-féléknél tilos felhasználni. A nikotinon kívül a dohány többféle mellékalkaloidot is tartalmaz (nikotirin, nikotein, nikoririn, nikotellin). A nikotin nagy részének szintézise a dohány gyökerében játszódik le. A nikotin a természetben a citromsav, borkősav, almasav, vagy más szerves savak sójaként fordul elő. A só formájában való extrahálás vízzel vagy alkohollal könnyen és gyorsan megvalósítható, de az eljárásnak a további vizsgálatot nehezítő hibája az, hogy az alkohol, de még inkább a víz az alkaloidok mellett egyéb extrahálható anyagokat is kiold. Ezért előnyben részesítjük azt az eljárást, amely a nikotint, mint szabad bázist vonja ki. Ez esetben a növényi anyagot lúgosítani kell, és valamilyen szerves oldószerrel extrahálni. A BOGNÁR-féle térfogatos meghatározás elve az, hogy meglúgosított dohányból éter-petroléterrel kivonjuk a nikotint, amelyet metilvörös indikátor jelenlétében 0,01 n sósavval közvetlenül megtitrálunk. A munka menete 1. A mérést párhuzamosan végezzük két különböző minőségű dohányon. (A gyakorlaton különböző minőségű cigarettákat használunk.)

114

Mérjünk be 1 g finoman porított dohányt a jódszám-lombikba, adjunk hozzá 2 ml 20 %-os nátrium-hidroxidot, üvegbottal keverjük jól el, végül öntsünk hozzá 20 ml éterpetroléter keveréket. (Az éter-petroléter keveréket mérőhengerrel mérjük ki!) 2. A lúg a dohányban levő nikotint felszabadítja, az éter-petroléter keverék pedig kioldja. 3. A bedugaszolt lombikot 1 órán át gyakori rázogatással kezeljük. 4. A keverékből 10 ml-t mérőhengerrel átöntünk egy másik lombikba és az oldószert vízfürdőn, vegyifülkében elpárologtatjuk. 5. A maradékot kevés desztillált vízzel felvesszük, és 2-3 csepp metilvörös indikátor hozzáadása után 0,01 n sósavval hússzínűre titráljuk. Számoljuk ki a különböző minőségű dohányok nikotintartalmát szárazanyagra számítva! A dohány nedvességtartalmát légszáraznak, 14 %-nak vegyük. 1 ml 0,01 n HCl 1,62 mg nikotinnak felel meg. .

.

.

fogyott 0,01 n HCl ml faktor 1,62 100 nikotin % =  . bemért anyag fele mg-ban 0,86 Anyagok és eszközök különböző dohánytermékek 20 %-os NaOH, 0,01 n HCl, éter-petroléter (1:1) keveréke, metilvörös indikátor mérleg, dörzsmozsár pisztillussal, üvegbot, 50 ml-es jódszámlombik, 40 ml-es titrálólombik, 2 ml-es pipetta, 10 ml-es mérőhenger, 25 ml-es büretta, vízfürdő

115

32.

NÖVÉNYRÉSZEK

C-VITAMIN

TARTALMÁNAK

MEGHATÁROZÁSA

JODOMETRIÁS MÓDSZERREL

A C-vitamin (aszkorbinsav) a sejtlégzésben nélkülözhetetlen vitamin, amit a Nobeldíjas Szent-Györgyi Albert izolált először 1928-ban. A C-vitamin savanyú közegben aránylag állandó, lúgosban gyorsan bomlik. Bomlását a fémek is - különösen a Cu és a Fe - gyorsítják. Az aszkorbinsavnak a növényi sejtekben is fontos szerepe van a gyökös reakciók kivédésében. Egyik ilyen szerepe pl. a kloroplasztiszban figyelhető meg, ahol intenzív megvilágítás esetén - elegendő NADP hiányakor - az elektronok a ferredoxinról a molekuláris oxigénre kerülnek és így rendkívül toxikus szuperoxidgyök keletkezik, amit a szuperoxid-diszmutáz (SOD) nevű enzim tovább alakít hidrogénperoxiddá. Kloroplasztiszokban nem működik a kataláz, viszont a jelenlévő aszkorbinsav segítségével az aszkorbinsav-peroxidáz képes a H2O2-ot bontani és így a további gyökös reakciókat kivédeni. aszkorbinsav-peroxidáz aszkorbinsav + H2O2 → dehidro-aszkorbinsav + 2 H2O

A dehidro-aszkorbinsav még vitaminhatású vegyület, azonban további oxidáló enzimek inaktívvá alakítják. A C-vitamin dehidro-aszkorbinsavvá alakítását végzi az aszkorbinsav-oxidáz nevű enzim is. C-vitamin-tartalmú konzervek készítésénél a növényi anyagot először forró gőzzel leforrázzák, ezáltal a különböző enzimeket inaktíválják, így a C-vitamintartalom jelentős részét meg tudják őrizni. A mérésünk során alkalmazott módszer a valóságosnál kissé nagyobb C-vitamin értéket szolgáltat, de a viszonylagos összehasonlításra jól beválik. A vizsgálandó növényrész aszkorbinsav-tartalmát megsavanyított vízzel extraháljuk, hogy bomlását gátoljuk. A titrálást kálium-jodáttal végezzük, ami a kálium-jodidból jódot szabadít fel.

116

Utóbbi az aszkorbinsavat dehidroaszkorbinsavvá oxidálja, amikor az aszkorbinsav teljes

mennyisége

átalakul,

a

feleslegben

lévő,

felszabaduló

jódtól

a

keményítőindikátor megkékül. A munka menete A vizsgálandó növényrészt rozsdamentes szikével felaprítjuk és ebből 1 g-ot porcelánmozsárba mérünk, bidesztillált vízzel készített 2 %-os sósavval nedvesítjük a felaprózott anyagot, péppé dörzsöljük és kevergetés közben sósavval 10-15 ml-re hígítjuk. A folyadékot tölcsérbe tett vattarétegen át mérőhengerbe szűrjük, 2 %-os sósavval a mozsárban és dörzsölőn maradt törmeléket is néhányszor ráöblítjük. A szüredéket ezután 2 %-os sósavval 50 ml-re feltöltjük és összerázzuk. A C-vitamintartalmú szüredékből 10 ml-t Erlenmeyer-lombikba pipettázunk, 30 ml desztillált vízzel, 5 ml 2 %-os sósavval, 5 ml 1 %-os KI-oldattal és 5 ml 0,2 %-os keményítőindikátorral elegyítjük. Ezután mikrobürettából 0,004 n KIO3-oldattal titráljuk, amíg a kék szín kb. fél percig megmarad. Az adatok feldolgozása Számítsuk ki mg %-ban a vizsgált növényrész C-vitamin tartalmát! 0,3522 . i . a . 100 C-vitamin, mg % =  bemért növényi anyag g-ban i = a titráláshoz fogyott kálium-jodát ml-ben (több titrálás középértéke), a = a teljes kivonat (50 ml) és egy-egy titrálásra kivett mennyiség (10 ml) hányadosa (példánkban 5) 1 ml 0,004 n KIO3 oldat 0,3522 mg aszkorbinsavval equivalens.

117

Anyagok és eszközök alma, citrom 2 %-os sósav, 1 %-os KI-oldat, 0,2 %-os keményítő-indikátor, 0,004 n KIO3-oldat szike, dörzsmozsár, tölcsér, vatta, 50 ml-es mérőhenger, parafilm, 100 ml-es Erlenmeyer-lombik, mikrobüretta

118

FÜGGELÉK A függelékben azok a reagensek találhatók meg, melyek leírása az adott feladatnál nem, vagy csak részlegesen szerepel, illetve több feladatnál is szükség van rá. Acetát puffer Törzsoldat: 0,1 n ecetsav (6,3 ml jégecet 1000 ml-re ) 0,1 n Na-acetát (8,2 g Na-acetát 1000 ml-re) A két törzsoldatot az alábbi arányban keverjük: A keverék pH-ja

0,1 n CH3-COOH ml

0,1 n CH3-COONa ml

A keverék pH-ja

0,1 n CH3-COOH ml

0,1 n CH3-COONa ml

3,19 3,30 3,80 4,10 4,40 4,70

97 94 89 80 66,7 50

3 6 11 20 33,3 50

5,00 5,30 5,60 5,90 6,22

33,3 20 11 6 3

66,7 80 89 94 97

Akrilamid / bis-akrilamid monomer pH 8,9 TRIS/bórsavas pufferben 11,9 g akrilamidot és 0,63 g metilén-bis-akrilamidot oldjunk fel 210 ml pH 8,9 TRIS/bórsavas pufferben, majd szűrjük meg. Az oldatot (rendkívűl mérgező, bőrön keresztül is!) hűtőszekrényben, sötétben legfeljebb egy hétig tároljuk. Aminosav kivonat készítése Optimális vízellátás mellett nevelt és vízhiányos, vagy egyéb módon kezelt növények (borsó, napraforgó, búza, paprika) hajtásait vagy kifejlett leveleit frisstömeg mérés után 60°C-on tömegállandóságig kiszárítva száraztömeget mérünk, majd elektromos őrlővel elporítjuk. 200 mg levélport kevés kvarchomokkal és 20 %-os etanol néhány ml-ével pépesre dörzsöljük és centrifugacsőbe öntjük úgy, hogy a végső térfogata 10 ml legyen. 20 percig 6000 fordulattal centrifugáljuk, majd a felülúszót 10 ml-es üvegfiolába töltjük és gumidugóval lezárjuk. (Ez az aminosav analízis törzsoldata) Aminosav-oldatok (összehasonlításhoz) 'A' oldat: 100 ml 0,1 n HCl-ben feloldunk 0,1-0,1g-ot a következő aminosavakból: cisztin, aszparaginsav, glutaminsav, metionin, leucin 'B' oldat: 100 ml 0,1 n HCl-ben feloldunk 0,1-0,1g-ot a következő aminosavakból: aszparagin, glutamin, tirozin, valin, fenilalanin Az oldatok hűtőszekrényben több hónapig eltarthatók. Biuret-reagens

119

.

.

0,75 g CuSO4 5H2O-t és 3 g Na-K-tartarát 4H2O-t 100 ml desztillált vízben oldjunk fel, adjunk hozzá 150 ml 10 %-os NaOH-oldatot és desztillált vízzel 500 ml-re hígítsuk fel. (Hónapokig eltartható!) CCC-oldat (10-3 M) Az eredeti töménységű Bercema CCC-ből (500g/l klórmekvát) kiveszünk 16 µl-t és desztillált vízzel kiegészítjük 50 ml-re. Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG-250) oldata Egy 1 literes lombikban oldjunk fel 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250-t 50 ml 95 %-os etanolban. Adjunk hozzá 100 ml 85 %-os foszforsavat. Egészítsük ki 1000 mlre desztillált vízzel. Whatman No. 1 papíron szűrjük meg. 4°C-on tároljuk. 2,6-Diklórfenol-indofenol (0,001 n)-oldat M/15 6,9-7,0-es pH-jú SÖRRENSEN-féle foszfátpufferből 300 ml-t készítünk. (A festék vizes oldata igen gyorsan bomlik). 0,0266 g 2,6 -diklórfenol-indofenolhoz 700 ml desztillált vizet és 300 ml puffert adunk. Jól összerázzuk, és a következő napon leszűrjük. Ezután még két-három órán át állni hagyjuk, és időnként összerázzuk, majd sötét üvegbe öntjük. A festékoldat a titer ellenőrzés mellett kb. 20 napig használható. Az oldat titerének megállapítása céljából fenti festékoldatból 10 ml-t Erlenmeyerlombikba pipettázunk, 5 ml telített ammónium-oxalátot adunk hozzá és mikrobürettával 0,001 n Mohr-sóval (ammónium-ferroszulfáttal) szalmasárga színig titráljuk. Faktor: a fogyott Mohr-sóoldat ml száma szorozva a Mohr-só faktorával. 0,001 n Mohr-só készítése és faktorozása: 0,3921 g Mohr-sót /NH4/2Fe/S04/2 . 6 H20 (molsúly = 392,14) 0,02 n kénsavban oldjunk 1 literre. Ebből kipipettázunk 10 ml-t, hozzáadunk 1,5 ml 1,84 fajsúlyú, vízzel 1:2 arányban higított kénsavat, és 0,001 n KMn04-tal rózsaszínig titráljuk. A KMn04 titerét viszont nátrium-oxaláttal vagy oxálsavval állítjuk be. Ecetsav (5 %-os) 52,08 ml -t 1000 ml-re hígítva Ecetsav (0,1 n) 6,3 ml jégecetet 1000ml-re egészítsünk ki desztillált vízzel. Etilalkohol Az alkohol különböző koncentrációban rendkívül gyakran alkalmazott oldószer. A kereskedelem 95-96 %-os tiszta szesz és vízmentes (abszolút) alkohol néven hozza forgalomba. A különböző hígítású alkoholsorozatot 95-96 %-os tiszta szeszből állítjuk elő (a táblázat szerint), általában térfogat alapján, azonban analitikai célokra sokkal helyesebb a vízzel való keverés során bekövetkező fajsúlyváltozást alapul venni. Hígításnál az alkohol előbb felmelegedik, majd az elegyben oldott gázok

120

lépnek ki. A fajsúlyt csak a megfelelő (+15 oC) hőmérsékleten és feltisztulás után állapítsuk meg. A táblázatban 100 ml adott töménységű (hígítandó) alkoholhoz adandó desztillált víz mennyisége (ml) van feltüntetve.

Előállítandó %

A hígítandó alkohol százaléka 95 % 90 % 85 % 80 % 75 % 70 % 65 % 60 % 55 % 50 % 45 % 40 % 35 %

90 85 80 70 70 65 60 55 50 45 40 35 30

6,50 13,36 20,16 29,68 39,16 50,66 63,16 78,36 96,36 117,86 144,86 178,86 224,4

6,56 13,79 6,83 21,89 14,48 7,20 31,05 23,14 15,35 7,64 41,53 33,03 24,66 16,37 8,15 53,65 44,48 35,44 26,47 17,58 8,76 67,87 57,90 48,07 38,32 28,63 19,02 9,47 84,71 73,90 63,04 52,43 41,73 31,25 20,47 105,34 93,90 81,33 69,54 57,78 46,09 34,46 130,30 117,34 104,01 90,76 77,58 64,48 51,43 163,48 143,01 132,83 117,82 102,84 87,93 73,08 206,22 188,57 171,05 153,61 136,04 118,94 101,71

10,35 22,90 38,46 58,31 84,54

11,41 25,55 43,59 67,45

12,8 27,6 50,6

14,3 33,4

16,8

Faktorozás a fotoszintetikus oxigéntermelés meghatározásához 20 ml 0,1 n KJO3-at bemérünk titrálólombikba. Hozzáadunk 0,8-1,0 g KJ-ot. HCl-val vagy H2SO4-el kicsit megsavanyítjuk (1-2 csepp) megtitráljuk 0,1 n Na2S2O3-mal. indikátor: keményítő faktor = 20,0/A A = fogyott Na2S2O3 ml Faktorozás: 0,1 n KMnO4 faktorának beállítása (COOH)2.2H2O-ra Analitikailag legtisztább (alt.) oxálsavból 0,1 n oldatot készítünk. Ehhez 6,3034 g oxálsavat mérünk 1000 ml-re. 20 ml 0,1 n oxálsavoldatot mérünk titrálólombikba, hozzáadunk 10 ml 20 %-os H2SO4-oldatot és 70-80 °C-ra melegítjük, majd ezen a hőmérsékleten 0,1 n KMnO4-tal megtitráljuk. Kezdetben a mérőoldatot cseppenként adagoljuk az oldathoz és kevergetés közben addig várunk, míg az oldat elszíntelenedik. A permanganát ugyanis önmagában csak lassan reagál az oxaláttal, a reakció folyamán keletkező mangán(II) ionok azonban katalizálólag hatnak az oxidációra és így később a reakció pillanatszerűvé válik. Miután az első permanganát részlet elszíntelenedet, a titrálást gyorsabban folytathatjuk mindaddig, míg végül az oldat az első csepp KMnO4 fölöslegtől észrevehetően ibolyaszínű lesz és a színeződést 1-2 percig megtartja. A titrálást legalább háromszor végezzük el. Faktor: 20/A A = fogyott 0,1 n KMnO4-oldat (ml) Fehling-oldat I. oldat: 69,28 g kristályos réz(II)-szulfát 1000 ml-re oldva. II.oldat: 364 g kálium-nátrium-tartarát és 100 g nátrium-hidroxid 1 literre oldva. Fenolftalein (1 %-os)

121

Oldjunk fel 0,5 g fenolftaleint 50 ml 96 %-os alkoholban és hígítsuk 50 ml vízzel. Az átcsapási területe pH 8,3-10 Festék-oldat gélelektroforetikus mintákhoz Oldjunk fel 1 mg Amidofekete 10 B festéket 5 ml desztillált vízben, adjunk hozzá 10 g szacharózt, majd desztillált vízzel egészítsük ki 10 ml-re. A mikrobás fertőződés megakadályozása céljából adjunk hozzá 0,1 ml propilén-oxidot (erős méreg). Foszfátpuffer Törzsoldatok:

0,1 n HCl 0,066 M KH2PO4 (9,078 g/l) . 0,066 M Na2HPO4 2H2O (11,876 g/l) 0,066 M K3PO4 (14,156 g/l)

pH

0,1 n HCl ml

2,1 3,6 4,7 5,6 5,9 6,2 6,5 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,7 8,0 9,8 10,7 11,2

9,5 0,5 -

0,066 M 0,066 M KH2PO4 Na2HPO ml 4 ml 0,5 9,5 10,0 9,5 0,5 9,0 1,0 8,0 2,0 7,0 3,0 6,0 4,0 5,0 5,0 4,0 6,0 3,0 7,0 2,0 8,0 1,0 9,0 4,5 5,0 3,0 3,0

0,066 M K2PO4 ml 5,5 5,0 7,0 7,0

Foszfátpuffer észterázok festéséhez ( 0,15 M, pH 7,2) . „A” oldat: 107,4 g Na2HPO4 12 H2O-t oldjunk fel 2000 ml-re desztillált vízzel . „B” oldat: 46,8 g NaH2PO4 2 H2O-t oldjunk fel 2000 ml-re desztillált vízzel Egy gél festéséhez keverjünk össze 120 ml A oldatot és 80 ml B oldatot. Futtató oldat (aminosavak elválasztásához) Elegyítsünk 400 ml butanolt 100 ml ecetsavval és 500 ml desztillált vízzel. Gélfestő-oldat

122

Oldjunk fel 30 g triklór-ecetsavat 800 ml desztillált vízben, adjunk hozzá 200 ml metanolt és 70 ml ecetsavat. Ennek a keveréknek a 400 ml-hez adjunk 10 ml 1 %-os Coommassie Brillant Blue R 250 vizes oldatot. H2O2 oldat 1 %-os: 30 %-osból 16,6 ml-t 500 ml-re hígítunk 0,5 %-os: 30 %-osból 8,3 ml-t 500 ml-re hígítva Hg(ll)klorid-oldat (2 n) 2,72g HgCl2 100ml-re oldva. Izatinpapír-indikátor 200 ml metanolhoz 5 ml ecetsavat és 2 g izatint adunk. Az izatin reagenst nagyméretű Petri-csészébe öntjük, és kromatografálópapír csíkokat áztatunk benne 5 percig. Ezután a csíkokat szűrőpapírra helyezzük 10 percre, majd 80 oC-os szárítószekrényben 15 percig aktiváljuk. Fóliába csomagolva sötét helyen tároljuk. Jódoldat 12,7 g J2-ot és 25 g KJ-ot 35 ml vízben oldunk, majd vízzel 1l-re feltöltjük. Karbamid 2 M-os oldata 120,118 g karbamid-ot oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel. Kálcium-acetát (normál) 88 g kristályos Ca-acetát H2O-t desztillált vízzel 1 l-re oldjuk. Használat előtt mészvízzel, fenolftalein jelenlétében halvány rózsaszínig titráljuk. Kálciumklorid-oldat (tömény) 80 g kristályos CaCl2-ot 100 ml-re oldunk. Kálciumklorid 1 M-os oldata . 219,09 g CaCl2 6H2O-t oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel. Kalciumnitrát 0,2 n oldata . . 16,41 g Ca(NO3)2-t, vagy 21,81 g Ca(NO3)2 3H2O-t, vagy 23,62 g Ca(NO3)2 4H2O-t oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel. KIO3-oldat (0,004 n) 0,1427 g KIO3 desztillált vízzel 1 l-re oldva KI-oldat (10 %-os) 10 g KI-ot oldunk 100 ml frissen kiforralt és lehűtött vízben. Frissen készítendő. KJO3 0,1 n oldata

123

150-180 °C-on szárított KJO3-ból 1,7835 g-ot mérünk be 500 ml-re. Jól záródó üvegdugós üvegben korlátlanul eltartható és a tioszulfát titerének ellenőrzésére bármikor felhasználható. Káliumjodidos jódoldat készítése (0,0003 n) 0,03 n HCl-t készítünk (3 ml cc. sósavat 1 l-re hígítunk). 3-4 ml vízben feloldunk 0,38 g színjódot és 0,8 g KI-t, és a 0,03 n sósavval kiegészítjük 1 literre. Így az oldat 0,003 n lesz; ez a törzsoldat. Ez tovább hígítandó tízszeresre: 100 ml jódoldat + 900 ml 0,03 n HCl. Káliumnitrát 0,2 n oldata Oldjunk fel 20,22 g KNO3-t 1000 ml-re desztillált vízzel. Káliumpermanganát-oldat (0,1 n) Lemérünk 3,200 g KMnO4-ot. 1,5 l-es lombikban 1000 ml desztillált vízben feloldjuk. Az oldatot 1 óra hosszat forráspontja közelében tartjuk, de nem forraljuk, majd lehűlés után finom pórusú üvegszűrőn, vagy porcelán szűrőtégelyen keresztül (szűrőpapír nélkül) krómkénsavval tisztított, desztillált vízzel és mérőoldattal kiöblített üvegdugós, sötét színű üvegbe szűrjük. A kész mérőoldatot portól és laboratóriumi gőzöktől elzárva, fénytől és hőtől óvott helyen tartjuk. Az üveg szájára poharat borítunk, hogy a portól védjük a csiszolatot. A kapott oldat titerét legalább hetente ellenőrizzük. KMnO4-al való titráláshoz a büretta üveg csapját kevés vazelinnel (nem csapzsírral) tömítsük. KMnO4-reagens 10 mg KMnO4-et mérjünk be, és ezt 100 ml 5 %-os NaOH-ban oldjuk fel. Analitikai tisztaságú vegyszereket és a lúghoz frissen készített desztillált vizet kell használnunk, mert a reagens a legkisebb szennyezésre is nagyon érzékeny. Keményítő-indikátor oldat Késhegynyi (kb. 0,02-0,04 g) finoman elporított burgonyakeményítőt kémcsőben 3-5 ml desztillált vízzel alaposan összerázzuk, hogy tejszerű folyadék álljon elő. Másik kémcsőbe 2/3 részig vizet teszünk és felforraljuk. A keményítőoldatot hirtelen mozdulattal a forró vízhez öntjük és az oldatot még egyszer felforraljuk. Keményítő-oldat (amiláz mérésnél) Szuszpendáljunk 1 g oldódó keményítőt 10 ml vízben. Adjunk hozzá 90 ml forró vizet, majd melegítsük forrásig, hűtsük le, és adjunk hozzá teljes telítődésig Na- vagy K-kloridot. Ha keményítőcsiriz képződne, meg kell szűrni. Kénsav (0.02 n) 5,4 ml 96 %-os H2SO4-at desztillált vízzel 1000 ml-re töltünk fel. Kénsav (25 %-os)

124

Kb. 50 ml desztillált vízhez kis részletekben 25,5 g tömény kénsavat mérünk, majd kihűlés után 100 ml-re egészítjük ki. Kénsav (10 %-os) 10,3 ml H2SO4 100 ml-re hígítva Lugol oldat 1 g KI és 1 g I2 100 ml desztillált vízre oldva. Lúgos KI oldatot 40 g NaOH + 20 g KI + 80 ml desztillált víz Mangánklorid oldat . 100 g MnCl2 4H20 + 200 ml desztillált víz Mértékegységek 1 mikrométer (µm) = 0,0001 cm = 10-4 cm régi nevén mikron 1 nanométer (nm) = 0,000 0001 cm = 10-7 cm régi nevén: millimikron 1 angström (Å) = 0,000 000 01 cm = 10-8 cm Nyomás egysége: pascal (Pa), dimenziója: kgm2s-2 (1 Pa = 1 Nm-2) 100 kPa = 1 bar = 0,987 atmoszféra Metilvörös indikátor 0,05 g metilvöröst 3,6 ml 0,05 n NaOH-vel eldörzsölünk és 250 ml 60 %-os alkoholban oldjuk, vagy vizes oldat esetében desztillált vízzel 100 ml-re feltöltjük. Molális oldat 1 mól oldott anyag 1000 g vízben (Szemben a moláris oldattal, ahol 1 mól oldott anyag 1 liter oldatban van.) Nátrium-acetát 0,1 n oldata 8,2 g kristályos nátrium-acetátot oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel. Nátriumkarbonát-oldat 28,6 g kristályos nátriumkarbonátot oldjunk 100 ml-re. NaOH-oldat (n/20) 0,2 g NaOH-ot oldjunk desztillált vízzel 100 ml-re.

125

Nátriumklorid 0,15 M-os oldata 8,76 g NaCl-t oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel. Nátrium-oxalát 0,1 M-os oldata 13,4 g nátrium-oxalátot oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel. Nátriumszulfát (telített) 170 g Na2SO4 . 1H2O 1 liter vízben. Nátriumszulfid-oldat 5 g nátriumszulfidot 10 ml vízben oldunk, s az oldatot 30 ml glicerinnel elegyítjük. Néhány nap múlva az oldatot előzetesen szesszel kimosott, kis vattapamaton szükség esetén többszöri felöntéssel - kristály tisztára szűrjük. Félévesnél régebbi oldatot nem használunk. Nátriumtioszulfát (0,1 és 0,01 n) oldata . 24,81 g Na2S2O3 5H2O-t 1000 ml-es mérőlombikba viszünk, hozzáadunk kb. 0,2 g Na2CO3-t, 10 ml izobutilalkoholt (vagy amilalkoholt) és forralással CO2-mentesített, majd gyorsan lehűtött desztillált vízzel jelig töltjük. Az oldat beállítását 2-3 napi állás után végezzük el, végleges hatóértékét 2 hét múlva állapítjuk meg. A 0,01 n-os oldatot a 0,1 n oldat 10-szeres hígításával készítjük. Nátronlúg (8 %-os) 8 g NaOH-ot oldjunk 100 ml-re frissen kiforralt és lehűtött vízben. Vazelinnel vékonyan megkent üvegdugós üvegben tartjuk. α-NES-oldat (2000 ppm) 200 mg α-NES-t feloldunk 20 ml etilalkoholban. Gyengén melegítjük, majd feltöltjük 100 ml-re desztillált vízzel. Neutralvörös Oldjunk fel 0,01 g neutrálvöröset 100 ml 50 %-os alkoholban. Átcsapási területe pH 6,5-8. Ninhidrin aminosavak és aminek számára Permetezőoldat: 0,2 g ninhidrint oldjunk fel 95 ml metanolban, izopropanolban vagy vízzel telített n-butanolban. Az oldathoz adjunk 5 ml kollidint. ppm parts per million, milliomod rész (pl. mg/kg illetve mg/l vagy µg/g illetve µg/ml)

126

Réznitrát oldat telített, vizes . 5 ml desztillált vízhez 20 g Cu(NO3)2 3H2O-t adunk, és az üveget légmentesen lezárjuk. (Az oldatnak feloldatlan kristályokat kell tartalmaznia.) Rézoldat ninhidrin komplex stabilizálására 1 ml telített, vizes réznitrátoldathoz adjunk 0,2 ml 10 %-os salétromsavat és 4 ml desztillált vizet, majd töltsük fel metanollal 100 ml-re. Salétromsav (kb. 2 n) 141 ml 65 %-os salétromsavat oldjunk 1l-re. Sósav (25%-os) 65 ml 37 %-os HCl-t 100 ml -re egészítünk ki desztillált vízzel. Sósav (0,1 n) 8,6 ml tömény (37 %-os) HCl-t 1 l-re oldunk desztillált vízzel. Sósavas ammónium-molibdát 5 g ammónium-molibdátot 100 ml desztillált vízben melegítéssel feloldunk és ehhez 30 ml tömény sósavat adunk. Szacharóz oldat 1M-os 1 térfogatmólos (moláris) nádcukoroldat készítéséhez lemérünk 342,3 g szacharózt, desztillált vízben feloldjuk és 1 literre feltöltjük. Frissen készítendő. Szacharóz oldat ozmotikus potenciáljának bar-ban kifejezett értékei 20 °C-on Koncen0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 tráció (M) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

0,00 2,67 5,36 8,24 11,26 14,50 18,01 21,77 25,87 30,09 35,05

0,26 2,95 5,64 8,53 11,58 14,83 18,37 22,16 26,30 30,59 35,56

0,54 3,21 5,94 8,83 11,90 15,16 18,75 22,56 26,72 31,10 36,16

0,80 3,48 6,22 9,12 12,22 15,49 19,11 22,95 27,15 31,50 36,67

1,07 3,75 6,51 9,41 12,53 15,85 19,49 23,35 27,55 32,01 37,18

1,34 4,01 6,79 9,71 12,86 16,20 19,86 23,74 27,96 32,52 37,68

1,61 4,28 7,07 10,00 13,18 16,57 20,24 24,15 28,36 33,02 38,19

Szulfit-oldat (burgonya fehérje-kivonat készítéséhez) 10 g Na2SO3 + 7,5 g Na2S2O5 50 ml-re oldva desztillált vízben

1,87 4,54 7,37 10,30 13,51 16,93 20,61 24,59 28,77 33,53 38,70

2,14 4,81 7,65 10,62 13,84 17,29 20,99 25,01 29,17 34,04 39,30

2,41 5,08 7,94 10,94 14,18 17,65 21,37 25,44 29,68 34,54 39,81

127

TRIS/bórsavas puffer pH 8,9 fehérjék és észterázok gélelektroforetikus elválasztásához Törzsoldat készítése: Oldjunk fel 605 g Tris(hidroximetil)-aminometánt és 46 g bórsavat desztillált vízzel 5000 ml-re. A gélek futtatásánál és a monomer oldat készítésénél ennek a törzsoldatnak az 1:7 arányú hígítását kell használni. TTC oldat (0,1 %-os) 1g TTC-ot 1000 ml desztillált vízben feloldunk. Sötétben több hónapig bomlás nélkül eltartható.

128

FELHASZNÁLT IRODALOM

Allaga J. - Borka Gy. - Szabó P.-né 1994. Növényélettani gyakorlatok. PATE Georgikon Mezőgazdaságtudományi Kar, Keszthely Ausubel, F.M. - Brent, R. - Kingston, R.E. - Moore, D.D. - Seidman, J.G. - Smith, J.A. - Struhl, K. 1995. Short protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc., USA Brugovitzky E. 1957. Növényélettani vizsgálatok I-II. Mezőgazdasági és Erdészeti Állami Könyvkiadó, Bukarest Botz L. - M.-né Bordács M. - Szabó L. Gy. - Técsi L.I. 1995. Növényélettani gyakorlatok. JPTE, Pécs Dévényi T. - Gergely J. 1971. Aminosavak, peptidek, fehérjék. Medicina Könyvkiadó, Budapest Farkas G. 1984. Növényi biokémia. Akadémiai Kiadó, Budapest Haraszty Á. 1979. Növényszervezettan és növényélettan. Tankönyvkiadó, Budapest Hoffmann P. 1987. Fotoszintézis. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest Horváth-Köves-Mainé-Nagy-Pécsváradi-Szabó-Tari-Zsoldos 1993.

Növényélettani

gyakorlatok. Munkafüzet. JATEPress, Szeged Komáromy L. 1989. Biológiai gyakorlatok. POTE Pécs Lévai L. 1985. Növényélettani gyakorlatok. DATE, Debrecen Moore, T. C. 1981. Research Experiences in Plant Physiology - a Laboratory Manual. Springer - Verlag, New York, Heidelberg, Berlin Metzner, H. 1982. Pflanzenphysiologische Versuche. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York Nagy M. - Szabó M. 1980. Növényélettani gyakorlatok. Munkafüzet. JATE Szeged Növényi fehérjék gélelektroforézises vizsgálata. 1986. OMIKK, Budapest Ördög V. - Molnár Z. - Péter J. 1995. Növényélettani gyakorlatok. PATE Mosonmagyaróvár Pethő M. 1993. Mezőgazdasági növények élettana. Akadémiai Kiadó, Budapest

129

Rubin B. A. 1984. Növényélettani praktikum. Tankönyvkiadó, Budapest Stegemann, H. - Schnick, D. 1985. Index 1985 of European Potato Varieties. Mitteilungen aus der Biolog. Bundesanstalt, Heft 227. Suba J. 1981. Növényélettani gyakorlatok. Tankönyvkiadó, Budapest Sutcliffe, J. F. 1982. A növények és a víz. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest Szabó L. Gy.(szerk) 1980. A magbiológia alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest Szalai I. - Frenyó V. 1962. Növényélettani kísérletek. Tankönyvkiadó, Budapest Szalai I. 1994. A növények élete. JATEPress, Szeged Szalai J. 1981. Növényélettani gyakorlatok. Kertészeti Egyetem, Budapest Szilágyi S. - Sz.-né Somogyi E. 1979. Növényélettani gyakorlatok. Tankönyvkiadó, Budapest Varga

M.

1976.

Növekedésszabályzó

növénytermesztésben. JATE, Szeged

anyagok

gyakorlati

alkalmazása

a