NOVÝ PŘÍSTUP PŘI STANOVENÍ AKUTNÍ SYSTÉMOVÉ TOXICITY

Chem. Listy 110, 118125(2016)

Referát

NOVÝ PŘÍSTUP PŘI STANOVENÍ AKUTNÍ SYSTÉMOVÉ TOXICITY

PETRA KUBINCOVÁ, JIŘÍ NOVÁK a IVA SOVADINOVÁ

kládáno. Testování toxicity se v dnešní době provádí převážně s využitím vyšších obratlovců, tedy pomocí in vivo metod, které jsou často souhrnně nepřesně označovány jako „testy na zvířatech“. Tyto metody jsou relativně nákladné, zdlouhavé a jsou z etického hlediska považovány za kontroverzní. Navíc nejsou příliš vhodné pro studium mechanismu působení zkoumaných látek. Proto dochází v posledních letech k vývoji alternativních metod, které nevyužívají zvířata nebo aspoň výrazně snižují jejich potřebu a utrpení. Pokud projde alternativní metoda testování toxicity, ať už in vivo či in vitro, úspěšně procesem validace, může být následně zahrnuta v normované podobě do legislativy jako metoda doporučená pro testování toxicity a hodnocení rizik chemických látek a doplnit či nahradit tradiční metody in vivo. Již pouhou úpravou tradičních postupů in vivo došlo k podstatnému snížení počtu a utrpení pokusných zvířat a tyto alternativy již nyní mají normovanou podobu. Testování na zvířatech in vivo je již dnes dle legislativy Evropské unie (EU) přípustné (zákon REACH, tj. registrace, evaluace a autorizace chemických látek, a nařízení CLP), pouze pokud není k dispozici jiná, plně funkční náhrada, bohužel validovaných alternativ je zatím poskromnu. Následný text shrnuje současný stav alternativních metod v oblasti hodnocení akutní systémové toxicity a nastiňuje možné budoucí směřování.

Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno [email protected] Došlo 24.11.14, přepracováno 29.4.15, přijato 5.6.15.

Klíčová slova: testování toxicity, akutní systémová toxicita, alternativní metody, in vitro metody, koncept 3R

Obsah 1. 2. 3. 4.

Úvod Hledání nové cesty Alternativní změny testování in vivo Alternativní metody in vitro 4.1. Cytotoxicita a predikce akutní toxicity 4.2. Stupňovité schéma testování toxicity 4.3. Stávající situace 4.3.1. Testy cytotoxicity 4.3.2. Toxikokinetické metody 4.3.3. Orgánově-specifické testy toxicity 4.4. Budoucí směřování

2. Hledání nové cesty V poslední době prochází testování toxicity látek převratnými změnami. V EU bylo přijato nařízení REACH týkající se registrace, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, jehož účelem je chránit lidské zdraví a životní prostředí. Systém REACH požaduje, aby byla do roku 2018 dostupná toxikologická data pro každou chemickou látku vyráběnou v EU nebo do ní dováženou v množství větším než 1 t ročně. Vzhledem k množství látek spadajících do systému REACH bude testování toxicity s využitím pouze tradičních in vivo metod náročné až nemožné. Podle střízlivých odhadů Evropské agentury pro chemické látky (ECHA) se totiž jedná asi o 30 tis. již existujících látek a na kompletní testování bude potřeba okolo 9 mil. zvířat2. Ve Spojených státech amerických provedla Národní rada pro výzkum (US NRC) kritickou analýzu metod používaných pro testování toxicity a v roce 2007 vydala publikaci „Testování toxicity ve 21. století: vize a strategie“3. I z této analýzy vyplynula limitace postupu současné toxikologie založeného převážně na testování toxicity látek metodami in vivo a byla nastíněna vize nového přístupu využívajícího alternativní in vitro metody. Tato dlouhodobá vize a strategický plán klade důraz na využití nových

1. Úvod Akutní systémová toxicita se projevuje nepříznivými účinky na lidské zdraví po jednorázové aplikaci zkoumané chemické látky již po krátké době působení1. Bývá rozdělována podle způsobu vstupu látky do organismu na orální (nejčastější), inhalační nebo dermální. Akutně toxická látka se po vstupu do organismu dostává do krevního oběhu a cirkuluje do všech částí lidského těla, kde vyvolává systémové toxické účinky. V játrech může být daná látka přeměněna na jinou formu (tzv. biotransformace) a tento nový metabolit může být hlavní příčinou pozorované toxicity nebo k ní nezanedbatelně přispívat. Na základě výsledků testů akutní systémové toxicity jsou chemické látky tříděny do kategorií dle jejich nebezpečnosti dle nařízení CLP (nařízení Evropského parlamentu a Rady č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí sladěné s globálně harmonizovaným systémem klasifikace a označování chemikálií (GHS) zavedeným Organizací spojených národů), což pak dále ovlivňuje a předepisuje, jak je daná látka označena a jak je s ní na118

Chem. Listy 110, 118125(2016)

Referát

poznatků molekulární biologie, biotechnologie, počítačového modelování toxicity a dalších rychle se rozvíjejících odvětví v hodnocení zdravotních rizik potenciálně toxických látek4. Navrženým řešením je tam, kde je to možné beze ztráty validity získaných dat, nahradit současné metody in vivo právě alternativními metodami in vitro využívajícími relevantní biologické modely, tedy lidské nerakovinné buňky izolované z různých typů tkání a pěstované pokročilým způsobem, který lépe odpovídá skutečným podmínkám v organismu5. Tento nový přístup v testování nežádoucích účinků látek by se měl soustředit také na identifikaci a mechanistické porozumění zasažených buněčných procesů a signálních drah, ve kterém by mohly hrát důležitou roli progresivní technologie označované názvem s příponou „omika“ (anglicky „omic“), tj. transkriptomika, proteomika, genomika, metabolomika a cytomika, a moderní postupy systémové a výpočetní biologie a bioinformatiky6. Aby se celý proces zrychlil a zautomatizoval, měly by se využívat vysokokapacitní robotické systémy s vysokou propustností označované jako HTS (high-throughtput) a HCS (high-content screening). Tato vize rady US NCR má za cíl podpořit vývoj a využití in vitro metod v dobře validovaných integrovaných testovacích sadách a začlenit je do legislativy USA. Pionýrským projektem je program Tox-21 (http:// www.epa.gov/ncct/Tox21/), který mapuje biochemické a signální dráhy zapojené do toxicity široké škály látek (přes 10 tis. látek ve více než 50 vysokokapacitních robotických systémech s vysokou propustností). Po uveřejnění vize „Testování toxicity ve 21. století“ se objevily kritické komentáře a ohlasy týkající se dopadu této vize na posouzení rizika pro lidské zdraví. Nejčastějšími výtkami reportu byla nejasnost v tom, jak bude tato dlouhodobá vize naplněna, převedena do praxe a začleněna do legislativy. Není jasně specifikována přesnost předpovídaného rizika a zda odhad rizika založený zejména na in vitro metodách bude vůbec přesnější než stanovené dnešními zaběhlými postupy a zda jsme vůbec schopni postihnout všechny neurčitosti6–8. Přesto se stala alespoň částečně součástí strategických plánů významných agentur pro testování toxicity, jako jsou Koordinační výbor pro validaci alternativních metod USA (ICCVAM)10 a Evropské centrum pro validaci alternativních metod (ECVAM)11. Naléhavá potřeba alternativních metod testování toxicity vedla k intenzívnějšímu úsilí v této oblasti a k vyššímu nasazení při hledání vhodných testovacích modelů. Za alternativní metodu lze považovat každou metodu, která se řídí tzv. konceptem 3R, který byl poprvé popsán již v roce 1959 v knize „Principy humánní experimentální techniky“12. Alternativní metoda totiž motivuje k nahrazení využívání zvířat v testování (replacement), ke snižování jejich počtu (reduction) nebo k vylepšení podmínek užití zvířat (refinement). Částečně nebo úplně mohou být tradiční toxikologické testy in vivo nahrazeny metodami in vitro, ex-vivo (izolované tkáně a orgány) nebo in silico (počítačové simulace a matematické modely) a jejich vzájemným propojením13,14. Každá alternativní metoda nahrazující klasickou me-

todu in vivo (stanovující střední letální dávku, LD50, nebo koncentraci, LC50) musí projít složitým a dlouhým procesem vývoje, validace a implementace (10 až 20 let), který zajišťuje, že každá validovaná alternativní metoda vyvinutá pro specifický účel v akademické či průmyslové sféře prošla nezávislým procesem vědeckého ověření (zjišťuje se zejména její reprodukovatelnost, spolehlivost a relevance) a následně může být po fázi připomínkování akceptována regulačními orgány13,15. Během procesu validace dochází také k porovnávání výsledků získaných alternativními testy s výsledky z klasického testování in vivo, které jsou brány jako referenční, přestože paradoxně samy nikdy formálně validovány nebyly4. Ideálně by během validace alternativní metody zabývající se účinky látek na lidské zdraví měla být získaná data srovnávána s daty týkající se expozice lidí. Testování na lidské populaci je nerealistické a neetické a jiných typů dat (např. zprávy o individuálních případech záměrných či neúmyslných otrav, epidemiologické studie či klinické studie) je poskromnu. Využití pouze dat získaných in vivo však neřeší tento problém zejména z důvodu mezidruhové odlišnosti. Doporučuje se proto využít i dostupná data z mechanistických studií a výsledky studií in vitro a in silico v závislosti na jejich spolehlivosti, kvalitě a reprezentativnosti16.

3. Alternativní změny testování in vivo Výsledkem tradičního akutního testu in vivo, jehož postup je normován mezinárodními institucemi, např. Organizací pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD), je střední letální dávka (LD50) nebo koncentrace (LC50), což je statisticky stanovená dávka/koncentrace studované látky jednorázově podaná, která způsobí úmrtí u 50 % zvířat v testované skupině. Od konce 70. let byl tento koncept kritizován jak z hlediska vědeckého, tak etického17. V rámci konceptu 3R jsou tradiční in vivo metody upravovány tak, aby se zejména redukoval počet testovaných zvířat a snížilo se jejich utrpení. Pro testování akutní systémové orální toxicity byly vyvinuty a validovány tři alternativy snižující množství potřebných zvířat (tab. I): metoda stanovení třídy akutní toxicity (ATC; OECD 423), postup stanovení využívající zvyšování a snižování dávky (UDP; OECD 425) a metoda fixní dávky (FDP; OECD 420). Tyto přístupy nahrazují tradiční test OECD 401, který byl v roce 2002 vyjmut ze seznamu doporučených testů18. Každá z těchto metod používá řadu dávek testované látky a první použitá dávka, tzv. výchozí dávka, je určena na základě dostupných in vitro nebo in vivo dat, skríningu cytotoxicity in vitro nebo nástřelové in vivo studie s malým počtem zvířat19. Po aplikaci látky jsou vyhodnoceny zjevné známky toxicity vedoucí k úmrtí exponovaných jedinců (ATC a UDP) nebo známky evidentní toxicity bez nutnosti úmrtí exponovaného jedince (FDP). Metoda FDP není odkázána na smrt zvířete, redukuje nejen počet zvířat, ale i jejich utrpení1, proto je podporováno její použití jako alternativy místo klasického testu OECD 401 (cit.1,20). 119

Chem. Listy 110, 118125(2016)

Referát

Tabulka I Přehled alternativních metod pro stanovení akutní systémové toxicity v procesu validace nebo implementace13,15, 35 Akutní systémová toxicita Orální Stanovení třídy akutní toxicity ATC Metoda fixní dávky FDP

Test

Koncept 3R

Účel testu

In vivo

↓počet

In vivo

↓počet/ utrpení

Stanovení toxicity in vivo Stanovení toxicity in vivo Stanovení toxicity in vivo Stanovení výchozí dávky in vivo Stanovení výchozí dávky in vivo Skríning netoxických látek

Postup zvyšování a snižování dávky UDP Test NHK NRUb

In vivo

↓počet

In vitro

↓počet

Test 3T3 NRUc

In vitro

↓počet

In vivo

↓počet

In vivo

↓počet/ utrpení

Dermální Metoda fixní dávky FDP

In vivo

Dermální penetrace In vitro absorpce kůží

Inhalační Stanovení třídy akutní toxicity ATC Metoda fixní dávky FDP

Validace

Implementace OECD TGa 423 OECD TG 420

ICCVAM

OECD TG 425

ICCVAM

Návrh OECD TG

ICCVAM ECVAM

Návrh OECD TG

Stanovení toxicity in vivo Stanovení toxicity in vivo

OECD TG 436

↓počet/ utrpení

Stanovení toxicity in vivo

Návrh OECD TG 434

In vitro

↓počet

Stanovení penetrace přes kůži

OECD

OECD TG 428

Hematotoxicita Test CFU-GMd

In vivo

↓počet nahrazení

Akutní neutropenie, náhrada za testování na 2. zvířecím druhu

ECVAM

Návrh OECD TG

Toxokinetika cryoHepaRG primární lidské hepatocyty

In vitro In vitro

↓počet ↓počet

Metabolismus  indukce enzymů cytochromů P450

ECVAM

Návrh OECD TG 433

a

Technický manuál; b Metoda stanovující příjem barvy neutrální červeně lidskými normálními keratinocyty; c Metoda stanovující příjem barvy neutrální červeně myšími embryonickými fibroblasty; d Metoda stanovující dělení granulocytů a monocytů pomocí tvorby kolonií; ICCVAM: Koordinačního výbor pro validaci alternativních metod; ECVAM: Evropské centrum pro ověřování alternativních metod

V roce 2008 provedlo Evropské centrum ECVAM studii zaměřenou na kosmetické přípravky, zda by bylo možné identifikovat „netoxické“ chemické látky (dle CLP neklasifikované s LD50 > 2000 mg kg–1) vstupující orální cestou na základě výsledků subchronického testu 28denní opakované aplikace chemické látky (OECD 407). Správně bylo zařazeno 63 % „netoxických“ látek. Méně než 1 % škodlivých, ale ne vysoce toxických látek (LD50 300–2000 mg kg–1), bylo nesprávně označeno za netoxické21. Přestože jsou subchronické testy mnohem náročnější, vyžadují

větší počet experimentálních zvířat než testy akutní a předběžný odhad toxicity pro správnou volbu dávkování, bylo by užitečné prozkoumat vhodnost tohoto přístupu i pro další skupiny látek, pro které je dle legislativy stejně nutné tento subchronický test vždy provést, např. při klasifikaci a označování chemických látek dle CLP22. V případě inhalační systémové toxicity je již schválenou náhradou klasického in vivo testu (OECD 403) metoda ATC (OECD 436) (tab. I). Metoda FDP již prošla procesem validace a připomínkování a je ve fázi čekání na 120

Chem. Listy 110, 118125(2016)

Referát

schválení (návrh OECD 433)13. Stanovení akutní dermální systémové toxicity následuje až po orální a inhalační, jelikož se jedná o méně pravděpodobný vstup látky. Před testováním vlastní akutní dermální toxicity by měl vždy předcházet krok, kdy se stanoví, zda se studovaná látka vůbec může absorbovat kůží či penetrovat přes ni (norma OECD 428). Alternativa ke klasickému testu OECD 402 (tab. I) je metoda FDP modifikovaná pro dermální aplikaci, která má normovanou podobu a čeká na akceptování (návrh OECD 434)13. ICCVAM zkoumá možnost využití dat o akutní systémové orální toxicitě pro nepřímé určení dermální akutní systémové toxicity pro pesticidy22. Tento přístup by měl být následně zvážen i pro další skupiny chemických látek23.

k cílovým orgánům. Tento koncept se také nezaobírá možností narušení specifických funkcí různorodých typů buněk, tzn. nebere do úvahy orgánově- a tkáňově-specifické účinky látek a jejich roli v akutní systémové toxicitě19,27. Pokud se ovšem vezmou do úvahy právě kinetické procesy a orgánově-specifické účinky látek, výrazně se zlepší předpověď akutní systémové toxicity in vivo na základě výsledků z in vitro testů28,29, přesto tato předpověď zatím není a je otázkou, zda někdy bude, stoprocentní. 4.2. Stupňovité schéma testování toxicity Je zřejmé, že jeden izolovaný alternativní test in vitro není schopen obsáhnout složitost biologických procesů in vivo, proto byl navržen koncept sady neboli baterie testů (test battery) a rozhodovacích schémat, který povede k relevantnějším výsledkům s přesnější výpovědní hodnotou30. Využívá tzv. stupňovitého schématu testování (tiered test strategy), kdy jsou výsledky z jednoho stupně testování použity pro následný komplexnější krok. Po každém kroku se posuzuje získaná informace a rozhodne se, zda na jejím základě může být predikován toxický účinek, nebo je nutné další testování. Tento přístup obvykle začíná u rešerše existující literatury a dat a dále postupuje k namodelování jejich aktivity pomocí modelu (Q)SAR, tj. (kvantitativního) vztahu mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou. Dalším krokem jsou jednoduché skríningové in vitro testy, komplexnější třírozměrné (3D) buněčné modely, testování na nižších živočišných druzích a až posledním stupněm jsou tradiční in vivo testy na savcích. Na konci následuje integrovaná strategie testování (integrated testing strategy), kdy jsou všechny typy dostupných dat a informací hodnoceny najednou a až po hromadném zpracování se dochází k výslednému rozhodnutí o dané látce. ECVAM navrhl stupňovitou strategii testování také pro akutní systémovou toxicitu19. Studovaná látka by byla postupně hodnocena modelem (Q)SAR a testy in vitro následujícím způsobem: (Q)SAR → testování bazální cytotoxicity → počítačový model pro metabolismus → testy biotransformace → in vitro testování specifické toxicity. Pokud bude látka v některém z kroků klasifikována jako „vysoce toxická“, testování bude ukončeno s tímto verdiktem. Omezené testování in vivo by proběhlo, pouze pokud by se látka ve všech krocích jevila jako „nepříliš toxická“. Všechny navržené sady testů a stupňovité a integrované strategie testování musí projít procesem prospektivní validace15. Zlepšováním strategie stupňovitého testování pro orální akutní systémovou toxicitu se podrobněji zabýval mezinárodní projekt ACuteTox, jehož náplní byla optimalizace a pre-validace testování in vitro a in silico k predikci akutní toxicity31. Projekt ukázal, že cytotoxický test 3T3/ NRU (test stanovující příjem barvy neutrální červeně myšími fibroblasty) má vysokou schopnost identifikovat látky, které nejsou dle CLP klasifikované jako nebezpečné s ohledem na jejich akutní toxicitu (LD50 > 2000 mg kg–1)32, což by umožnilo výrazně snížit počet zvířat nutných

4. Alternativní metody in vitro Progresivnějším přístupem, než je pouhá úprava postupů testů in vivo, je úplná náhrada testovacích organismů jejich in vitro alternativami. Latinský termín in vitro znamená „ve skle“ a in vitro metodu lze volně definovat jako „alternativu bez použití celých zvířat“. Metoda in vitro je tedy založena pouze na buněčných a tkáňových systémech nebo izolovaných orgánech. Náplní této kapitoly je souhrn a bližší seznámení s metodami in vitro používanými nebo plánovanými pro použití pro predikci akutní systémové toxicity v rámci konceptu 3R. Přehled alternativních metod v procesu validace nebo procesu implementace je v tab. I. 4.1. Cytotoxicita a predikce akutní toxicity Cytotoxicita je definována jako nepříznivé účinky způsobené chemickou látkou plynoucí z narušení struktur nebo procesů nutných pro přežití, dělení a funkčnost zasažené buňky24. Ekwall24 popsal koncept „bazálních buněčných funkcí“, které v podstatě každá buňka udržuje, a naznačil, že spousta akutně toxických látek narušuje právě tyto základní nespecifické buněčné funkce, což pak může vést k účinkům orgánově-specifickým nebo k úmrtí organismu. Řada studií následně ukázala dobrou korelaci mezi bazální cytotoxicitou in vitro a hodnotami LD50 získanými v klasických testech in vivo19, 25a ještě lepší korelaci mezi bazální cytotoxicitou in vitro a letální koncentrací daných látek v lidské krvi26. Koncept založený na predikci akutní systémové toxicity in vivo z bazálního cytotoxického působení látky stanoveného in vitro, tedy na tom, že koncentrace látky způsobující 50% pokles stanovované bazální funkce v buněčné kultuře in vitro bude odrážet hodnotu LD50/LC50 in vivo, však selhával pro asi 30 % látek19,26. Předpokládá totiž, že látka bude po expozici rychle a téměř úplně absorbována a distribuována v organismu, nepředpokládá její rychlou eliminaci nebo tvorbu toxických metabolitů. Výsledná toxicita in vivo však často závisí na vícestupňové metabolické aktivaci/detoxikaci v různých orgánech a tkáních (nejen v játrech) a na transportu aktivních metabolitů 121

Chem. Listy 110, 118125(2016)

Referát

k dalšímu testování, jelikož většina látek (přes 80 %) testovaných v EU spadá do této kategorie21. Tato klasifikace se ještě zpřesní, pokud jsou do hodnocení zahrnuty i výsledky z testu neurotoxicity in vitro na primární kultuře z potkaního mozku, hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanolvoda a in silico predikce intestinální absorpce a přechodu přes bariéru krev-mozek33.

mace o osudu dané látky v organismu. Doporučené toxikokinetické testy in vivo popisuje norma OECD 417. Sledovaná látka a její metabolity se stanovují v tělních tekutinách, tkáních a exkrementech testovaných zvířat. Zohlednění toxikokinetických procesů zlepšuje možnost stanovení akutní systémové toxicity na základě in vitro modelů, jedná se zejména o19: 1. permeabilitu přes intestinální stěnu (in vitro model intestinálních buněk) a přechod přes bariéry krev-tkáň, zejména přes kůži (lidská nebo prasečí kůže; modely kůže z lidských keratinocytů) a epiteliální bariéru plic či mozku; 2. biotransformaci, zejména první fáze probíhající v játrech (buněčné organely mikrozomy bohaté na metabolické enzymy, lidské hepatocyty a jaterní řezy36); 3. distribuci látek v těle na základě rozdělovacích koeficientů tkáň a plazma a aktivního transportu; 4. schopnost látky vázat se na tzv. na plazmatické proteiny. Seznam dostupných validovaných alternativních metod v těchto oblastech je poměrně krátký. Pro dermální penetraci lze použít validovanou in vitro metodu stanovující absorpci látek přes kůži (OECD 428) a pro první fázi biotransformace jsou dva testy ve fázi validace pod záštitou centra ECVAM. Jedná se o posouzení vhodnosti buněčné linie cryoHepaRG® a lidských primárních hepatocytů zamražených tekutým dusíkem a měření indukce jaterních enzymů cytochromů P450 jako vhodného modelu in vitro pro stanovení metabolických procesů u lidí15. Další alternativní možností je nahradit biologický model modelem matematickým, např. QSAR model pro predikci permeability látek přes kůži37, expertní softwarové systémy METEOR pro predikci metabolických transformací a METAPC pro metabolismus a biodegradaci38,39. Přestože matematické modely nemohou ze své podstaty plně nahradit testování na biologickém materiálu, mají velký potenciál v získávání předběžných informací o toxicitě chemických látek. Na rozhraní mezi in vitro a in silico alternativami hodnotícími toxikokinetiku patří matematické modely vyvinuté na základě experimentálních dat, které kvantitativně popisují osud látek v organismu. Jedná se o tzv. fyziologicky podložené farmakokinetické (PBPK) nebo toxikokinetické (PBTK) modely31. Jako vstupní parametry se sice zadávají zejména data získaná in vivo, stále častěji se však uplatňují i data získaná pomocí in silico (např. QSAR), ex vivo či in vitro metod40.

4.3. Stávající situace Metody in vitro využitelné pro stanovení akutní systémové toxicity spadají do tří obsáhlých kategorií: 1) testy cytotoxicity, 2) orgánově-specifické testy a 3) toxikokinetické metody19. V současné době neexistuje žádná validovaná alternativní metoda in vitro přímo nahrazující testování akutní systémové toxicity in vivo a ani není ve fázi validace. Jejich uplatnění zatím spočívá ve snižování počtu a utrpení zvířat nutných pro testování in vivo. Dále slouží k výběru vhodných kandidátů do stupňovitého způsobu testování akutní systémové toxicity. 4.3.1. Testy cytotoxicity Testy cytotoxicity našly uplatnění hlavně při určení výchozí dávky pro testování in vivo. Proces validace probíhá u dvou testů cytotoxicity stanovujících příjem barviva neutrální červeně (NRU, neutral red uptake) v myších fibroblastech BALB/c 3T3 (tzv. test 3T3 NRU) a v lidských keratinocytech (tzv. test NHK NRU)13,15,17. ICCVAM oba testy doporučil pro určení výchozí dávky studované látky pro metody UDP a FDP, což povede k výraznému snížení počtu zvířat potřebných pro in vivo testování (redukce asi o 50 % zvířat). Z výsledků validace testu 3T3 NRU pro správnou klasifikaci chemických látek do tříd nebezpečnosti dle CLP vyplynulo, že celková kvalita predikce byla sice nízká, ovšem látky s LD50 spadající do rozmezí 300–2000 mg kg–1 byly zařazeny správně s 81% přesností34. Následná post-validační studie centra ECVAM zaměřená na aplikaci tohoto testu pro rozlišení mezi toxickou/nebezpečnou (LD50 ≤ 2000 mg kg–1) a netoxickou látkou (LD50 > 2000 mg kg–1) ukázala, že tento test je vhodný pro skríning netoxických látek v prvním kroku stupňového testování akutní orální toxicity, což by podstatně snížilo nutnost in vivo testování (redukce asi o 40 % zvířat)35. V rámci jednoho in vitro testu cytotoxicity se většinou stanovuje v jednom typu buněk jeden parametr, a proto sám není schopen postihnout celou šíři možných odpovědí. Jako možné východisko se nabízí baterie testů cytotoxicity zaměřujících se na nejrůznější cíle (např. na obsah proteinů, produkci volných kyslíkových radikálů a ATP, metabolickou aktivitu, integritu cytoplazmatické membrány a mezibuněčnou komunikaci) v různých typech buněk17,19,31. Složení baterie testů i modelových in vitro kultur je stále pouze ve fázi vývoje a pre-validace.

4.3.3. Orgánově-specifické testy toxicity Akutní systémová toxicita zasahuje zejména ledviny, játra, centrální nervovou soustavu, kardiovaskulární systém, respirační systém, krev a gastrointestinální trakt19. Vhodný in vitro model by měl být založen na lidských buňkách či tkáních těchto orgánových soustav, proto je nutné zlepšit techniku izolace a uchování materiálu použitého pro vývoj in vitro kultur, aby nedocházelo ke ztrátě jejich funkčnosti a morfologické podobnosti buňkám in situ, jak je často pozorováno. Pro každý testovaný orgán je také potřeba zvolit i vhodnou referenční látku a v nepo-

4.3.2. Toxikokinetické metody Toxikokinetika, tj. popis procesů absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece látky, nám poskytuje cenné infor122

Chem. Listy 110, 118125(2016)

Referát

slední řadě se musí identifikovat a validovat biologicky relevantní parametr toxicity pro každý orgánový systém40. Validací zatím prošel pouze jeden orgánověspecifický test pro akutní systémovou toxicitu. ECCVAM schválil buněčný test stanovující proliferaci granulocytů a makrofágů na základě tvorby kolonií (tzv. test CFU-GM, colony forming unit-granulocyte/macrophage) pro predikci akutní neutropenie, což je hlavní znak hematotoxicity a následně septického šoku, tedy i jednoho z projevů systémové toxicity. Tento test může být použit ve schématu testování místo druhého nutného druhu zvířete, což bývá nejčastěji pes. Nejde tedy o plnou náhradu in vivo testu, ale opět spíše o redukci počtu potřebných zvířat15.

doporučených pro stanovení akutní systémové toxicity. Co se týká stupňovitého schématu testování a baterií testů in vitro a in silico dochází v současné době k vyhodnocování výsledků projektu ACuteTox. Tento projekt byl zaměřen na vytipování nejkritičtějších faktorů (zejména týkajících se biokinetiky, metabolismu a orgánové toxicity) pro predikci akutní toxicity, které musejí být vzaty do úvahy, aby se zlepšila přesnost určení akutní systémové toxicity na základě dat získaných in vitro a in silico. Současně měl projekt za cíl sestavit baterii testů pro stupňovité testování33,45. Projekt ukázal, že pro rozlišení látek na „toxické“ (látky s LD50 ≤ 2000 mg kg–1 zařazené do jedné ze čtyř kategorií dle jejich akutní toxicity) vs. „netoxické“ (LD50 > 2000 mg kg–1) jsou metody in vitro ve schématu stupňovitého testování akutní systémové toxicity nezastupitelné. Ohledně orgánově-specifických účinků se potvrdila významná role neurotoxicky a ukázala se potřeba vyvinout obecnější test neurotoxicity in vitro, který by postihl rozličné mechanismy působení. Dále se jeví jako důležité zlepšit odhad příjmu a distribuce látky v těle se zaměřením na rychlost její detoxikace a eliminace. Přes všechny naděje, které nová strategie a přístup ve stanovení akutní systémové toxicity budí, celý proces změny rutinního testování v praxi je úplně na začátku a teprve další vývoj ukáže, zda daná očekávání jsou vůbec splnitelná a kde jsou hlavní omezení a limitace, které možná nebudou moct být překročena.

4.4. Budoucí směřování V současné době dochází k revolučním změnám v provedení in vitro testů na buněčných kulturách, které se snaží upravit stávající způsoby kultivace a expozice tak, aby se aspoň částečně přiblížily podmínkám v celém organismu, jedná se o tzv. pokročilé techniky pěstování a exponování buněk30,41. Přechází se přes různé mezistupně od statické kultivace buněk rostoucích na dně plastových Petriho misek v monovrstvě ve dvourozměrném uspořádání (2D) při atmosférické hladině O2 (cca 20 %) až k 3D buněčným strukturám podobně organizovaným jako skutečné tkáně in situ rostoucím v hypoxických podmínkách (3–5 % O2). Buněčné struktury mohou mít podobu tzv. sferoidů, které mají buňky organizované v prostoru v přirozené mezibuněčné matrix (např. kolagen typu IV, Matrigel®) a k jejichž tvorbě dochází nejrůznějšími postupy kultivace, např. metodou růstu v zavěšené kapce média, využitím neadhezivních povrchů, rotací kultury během kultivace nebo mikrogravitací. Dalším zásadním krokem ve vylepšování in vitro metod je náhrada savčích rakovinných buněčných linií jejich lidskými nerakovinnými ekvivalenty. Jako vhodné alternativy se jeví lidské primární kultury, netransformované buněčné linie, ko-kultury více typů buněk, 3D modely, tkáňové řezy, izolované lidské orgány či přístupy zvané orgán na čipu (organ-on-chip)22,33. Jelikož je potřeba testování cytotoxicity zefektivnit, je snahou vyvíjet miniaturizované varianty již zavedených cytotoxických metod (systémy HTS a HCS), které umožňují simultánně stanovovat několik buněčných parametrů najednou (např. počet buněk, velikost jádra, membránový potenciál mitochondrií, permeabilita cytoplazmatické membrány a koncentrace vnitrobuněčného vápníku) a na více buněčných modelech současně v mikrotitračních deskách s 384 a více jamkami43. Testování je polo- či plně automatizováno, což celý testovací proces zjednodušuje a výrazně zrychluje. Již existují HTS/HCS verze řady stávajících cytotoxických testů. Např. verze testu 3T3 NRU s vysokou propustností44 se zdá být plně kompatibilní s formou testu 3T3 NRU právě validovanou společností ICCVAM pro stanovení výchozí dávky in vivo a skríning „netoxických“ látek. To vše ruku v ruce se změnou kultivace in vitro modelů a způsobu a provedení in vitro testů se v budoucnu zásadně promítne do složení baterie in vitro testů

Seznam zkratek 3R ATC ATP CFU-GM CLP ECVAM ECHA EURL

FDP GHS

HCS

123

Replacement Reduction Refinement (Nahrazení, zredukování, zjemnění) Acute Toxicity Class (Třída akutní toxicity) adenosintrifosfát Colony Forming Unit-Granulocyte/ Macrophage (Jednotky tvořící koloniegranulocyty/makrofágy) Classification, Labelling and Packaging Regulation (Nařízení pro klasifikaci, značení a balení chemikálií) The European Centre for the Validation of Alternative Methods (Evropské centrum pro validaci alternativních metod) European Chemicals Agency (Evropská agentura pro chemické látky) European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (Referenční laboratoř EU pro alternativy testování na zvířatech) Fixed Dose Procedure (Metoda fixní dávky) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (Globálně harmonizovaný systém klasifikace a značení chemikálií) High-Content Screening (Systém pro multiparametrický skríning)

Chem. Listy 110, 118125(2016)

HTS ICCVAM

LC50 LD50 NHK NRU OECD PBPK PBTK QSAR REACH

UDP US EPA US NIH US NRC

Referát

High-Throughtput Screening (Systém pro skríning s vysokou propustností/kapacitou) Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (Koordinační výbor pro validaci alternativních metod USA) Mean lethal concentration (Střední letální koncentrace) Mean lethal dose (Střední letální dávka) Normal human keratinocytes (Normální lidské keratinocyty) Neutral Red Uptake assay (Metoda stanovení cytotoxicity založená na příjmu neutrální červeně) Organisation for Economic Co-operation and Development (Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj) Physiologically Based Pharmacokinetic Modelling (Fyziologicky podložené modelování farmakokinetiky) Physiologically Based Toxicokinetic Modelling (Fyziologicky podložené modelování toxikokinetiky) Quantitative Structure-Activity Relationship (Kvantitativní hodnocení vztahu strukturaaktivita) Regulation on Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (Chemická legislativa EU (Registrace, Evaluace a Autorizace CHemických látek)) Up and Down Procedure (Metoda stanovení využívající zvyšování a snižování dávky) US Environmental Protection Agency (Agentura ochrany životního prostředí, USA) US National Institutes of Health (Národní institut zdraví, USA) US National Research Council (Národní rada pro výzkum, USA)

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

12. 13. 14. 15. 16.

17. 18. 19.

Tato práce vznikla za podpory grantu SoMoPro 2SGA2764 (spolufinancován Evropským společenstvím v rámci 7. rámcového programu dle Grantové dohody č. 229603 a Jihomoravským krajem). Výzkumná infrastruktura RECETOX byla podpořena projekty Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy (LO1214 a LM2011028).

20. 21.

LITERATURA 1. Andrew D. J., v knize: Reducing, Refining and Replacing the Use of Animals in Toxicity Testing (Allen D., Waters M. D., ed.), str. 183. The Royal Society of Chemistry, Cambridge 2013. 2. Höfer T., Gerner I., Gundert Remy U., Liebsch M., Schulte A., Spielmann H., Vogel R., Wettig K.: Arch. Toxicol. 78, 549 (2004). 3. NRC (National Research Council): Toxicity testing in

22. 23. 24. 25. 26. 124

the 21st century: A Vision and a strategy. National Academy Press,Washington DC 2007. Tralau T., Riebeling C., Pirow R., Oelgeschläger M., Seiler A., Liebsch M., Luch A.: Environ. Health Perspect. 120, 1489 (2012). Haycock J. W., v knize: 3D Cell Culture (Haycock J. W., ed.), kap. 1. Humana Press, Totowa 2011. Krewski D., Andersen M. E., Mantus E., Zeise L.: Risk Anal. 29, 474 (2009). Conolly R. B.: Risk Anal. 29, 480 (2009). Elliott D. E.: Risk Anal. 29, 482 (2009). Andersen M. E., Krewski D.: Toxicol. Sci. 107, 324 (2009). NICEATM/ICCVAM: The NICEATM-ICCVAM Five-Year Plan (2008-2012), NIH Publication No 086410 (NIH 2008). Prieto P.,Burton J., Graepel R., Whelan M., Worth A.: EURL ECVAM strategy to replace, reduce and refine the use of animals in the assessment of acute mammalian systemic toxicity (European Commission 2014). Russell W. M. S., Burch R. L.: The Principles of Human Experimental Technique. Methuen, London 1959. Kandárová H., Letašiová S.: Interdiscip. Toxicol. 4, 107 (2011). Tichý M., Roth Z., Bláha K., Worth A. P.: Chem. Listy 99, 675 (2005). Leist M., Hasiwa N., Daneshian M., Hartung T.: J. Toxicol. Res. 1, 8 (2012). Hoffmann S., Edler L., Gardner I., Gribaldo L., Hartung T., Klein C., Liebsch M., Sauerland S., Schechtman L., Stammati A., Nikolaidis E.: ATLA 36, 343 (2008). Gribaldo L., Gennari A., Blackburn K., Clemedson C., Dequercy A., Menequz A., Pfaller W., Ruhdel I..: ATLA 33 Suppl. 1, 27 (2005). Whitehead A., Stallard N.: ATLA 32 Suppl 2, 73 (2004). Gennari A., van den Berghe C., Casati S., Castell J., Clemedson C., Coecke S., Colombo A., Curren R., Dal Negro G., Goldberg A., Gosmore C., Hartung T.,Langezaal I., Lessigiarska I., Maas W., Mangelsdorf I., Parchment R., Prieto P., Sintes J. R., Ryan M., Schmuck G., Stitzel K., Stokes W., Vericat J. A., Gribaldo L.: ATLA 32, 437 (2004). Schlede E., Genschow E., Spielmann H., Stropp G., Kayser D.: Regul. Toxicol. Pharmacol. 42, 15 (2005). Bulgheroni A., Kinsner-Ovaskainen A., Hoffmann S., Hartung T., Prieto P.: Regul. Toxicol. Pharmacol. 53, 16 (2009). Seidle T., Robinson S., Holmes T., Creton S., Prieto P., Scheel J., Chlebus M.: Toxicol. Sci. 116, 382 (2010). Seidle T., Prieto P., Bulgheroni A.: ALTEX 28, 95 (2011). Ekwall B.: Ann. N. Y. Acad. Sci. 407, 64 (1983). Halle W.: ATLA 31, 89 (2003). Ekwall B.: Toxicol. In Vitro 13, 665 (1999).

Chem. Listy 110, 118125(2016)

Referát

27. Seibert H., Balls M., Fentem J. H., Bianchi V., Clothier R. H., Dierickx P. J., Ekwall B., Garle M. J., Gomez-Lechon M. J., Gribaldo L., Gulden M., Liebsch M., Rasmussen E., Roguet R., Shrivastava R., Wallum E.: ATLA 24, 499 (1996). 28. Ekwall, B., Ekwall, B., Sjöström, M.: ATLA 28, 201 (2000). 29. Clemedson S., Nordin-Andersson M., Bjerregaard H. F., Clausen J., Forsby A., Gustafsson H., Hansson U., Isomaa B., Jørgensen C., Kolman A., Kotova N., Krause G., Kristen U., Kurppa K., Romert L., Scheers E.: ATLA 30, 313 (2002). 30. Bhanushali M., Bagale V., Shirode A., Joshi Y., Kadam V.: Int. J. Adv. Pharm. Sci. 1, 15 (2010). 31. Clemedson C., Kolman, A., Forsby A.: ATLA 35, 33 (2007). 32. Prieto P., Cole T., Curren R., Gibson R. M., Liebsch M., Raabe H., Tuomainen A. M., Whelan M., Kinsner-Ovaskainen A.: Regul. Toxicol. Pharmacol. 65, 344 (2013). 33. Prieto P., Kinsner-Ovaskainen A., Stanzel S., Albella B., Artursson P., Campillo N., Cecchelli R., Cerrato L., Díaz L., Di Consiglio E., Guerra A., Gombau L., Herrera G., Honegger P., Landry C., O’Connor J. E., Páez J. A., Quintas G., Svensson R., Turco L., Zurich M. G., Zurbano M. J., Kopp-Schneider A.: Toxicol. In Vitro 27, 1357 (2013). 34. National Institutes of Health (NIH): Background Review Document (BRD): Validation of Neutral Red Uptake Test Methods NIH /In Vitro Cytotoxicity Test Methods for Estimating Acute Oral Systemic Toxicity, Publication No. 07-4518 (NIH 2006). 35. ECVAM: Follow-up study on the predictive capacity of the 3T3 Neutral Red Uptake cytotoxicity assay to correctly identify substances not classified for acute oral toxicity under the EU CLP system (LD50 > 2 000 mg/kg), Final study report (ECVAM 2011). 36. Kučera O., Lotková H., Křiváková P., Roušar T., Červinková Z.: Cesk. Fyziol. 55, 55 (2006). 37. Geinoz S., Guy R.H., Testa B., Carrupt P. A.: Pharm. Res. 21, 83 (2004). 38. Coecke S., Blaauboer B. J., Elaut G., Freeman S., Freidig A., Gensmantal N., Hoet P., Kapoulas V. M., Ladstetter B., Langley G., Leahy D., Mannens G., Meneguz A., Monshouwer M., Nemery B., Pelkonen O., Pfaller W., Prieto P., Proctor N., Rogiers V., Rostami-Hodjegan A., Sabbioni E., Steiling W., van de Sandt J. J. J.: ATLA 33 Suppl. 1, 147 (2005). 39. Peach M. P., Zakharov A. V., Liu R., Pugliese A., Tawa G, Wallqvist A., Nicklaus M. C.: Future Med. Chem. 4, 1907 (2012). 40. Basketter D., Clewell H., Kimber I., RossiA., Blaauboer B., Burrier R., Daneshian M., Eskes C., Goldberg A., Hasiwa N., Hoffmann S., Jaworska J., Knudsen T. B., Landsiedel R., Leist M., Locke P., Maxwell G., McKim J., McVey E., Ouédraogo G., Patlewicz G., Pelkonen O., Roggen E., Rovida C., Ruhdel I., Schwarz M., Schepky A., Schoeters G.,

41. 42. 43. 44. 45.

Skinner N., Trentz K., Turner M., Vanparys P., Yager J., Zurlo J., Hartung T.: ALTEX 29, 3 (2012). Bhattacharya S., Zhang Q., Carmichael P. L., Boekelheide K., Andersen M. E.: PLoS One 6, e20887 (2011). Huh D., Hamilton G. A., Ingber D. E.: Trends Cell Biol. 21, 745 (2011). O’Brien P., Haskins J. R.: Methods Mol. Biol. 356, 415 (2007). King A.V., Jones P. A.: Toxicol. In Vitro 17, 717 (2003). Kinsner-Ovaskainen A. Prieto P., Stanzel S., KoppSchneider A.: Toxicol. In Vitro 27, 1377 (2013).

P. Kubincová, J. Novák, and I. Sovadinová (Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Masaryk University, Brno): Acute Systemic Toxicity: Alternative in Vivo and in Vitro Methods This paper provides a brief overview of alternative methods in acute systemic toxicity and focuses on their position in the modern human health risk assessment. Current traditional toxicity testing strategies rely primarily on the observation of adverse health responses in homogeneous groups of animals exposed to high doses of a test agent. However, human reaction to chemicals often differs from that of animals and the animal-based methods are quite expensive, not suitable for high throughput testing and, last but not least, they are ethically controversial. The current advances in science have led to the formulation of a new strategy in human risk assessment based on methods that will be cost effective, with a higher throughput, and will be more comparable to real-life exposures in humans; moreover, they will significantly reduce the number of animals needed for testing. So far, the validated in vitro methods are used to estimate starting doses for acute oral lethality assays, which could potentially reduce animal use by as much as 50 %. They are also useful for determining the skin penetration of a substance and for assessing hematotoxicity. Currently, there is none of the in vitro alternative methods or their combinations which could fully replace in vivo methods for acute systemic toxicity. However, they play an essential role in the prediction of acute systemic toxicity, mainly in tiered-based screening and testing strategy. A promising tiered-based strategy consisting of a test battery assessing basal cytotoxicity, hematotoxicity, neurotoxicity, metabolism and biokinetics was suggested and pre-validated within the ACuteTox project. The whole testing strategy still needs to be validated to fully replace current classical acute toxicity testing approach based on in vivo assays. Despite hopes driven by these new strategies and approaches, the whole process of changes in routine toxicity testing is at the very beginning stage and will be long and hard. The future progress will show us if the expectations are reasonable and achievable, what are the main constraints and limitations and if they can be overcome. 125