Nové metody v průtokové cytometrii Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.
Průtoková cytometrie Analytická metoda – využívající interakce částic a záření. Technika se vyvinula z počítačů částic
Počítače částic Průtokové cytometry sortéry buněk
Měřená data •
Fyzikální vlastnosti
přímý rozptyl (forward scatter, FSC) – „velikost buněk“ • boční rozptyl (side scatter, SSC) – „granularita buněk“ •
•
Chemické vlastnosti •
Fluorescence
Vazbou fluorochromu na monoklonální protilátku • Využití chemické látky , která má fluorescenční vlastnosti •
Fluorescence
Vysoce nestabilní stav, doba existence 10-12 s
E*
excitovaný stav Excitační záření 488 nm
E1
Emisní záření 575 nm E1 stav
E0 ‐ Molekula phycoerytrinu
Základní metody Stanovení CD znaků
•
CD3+ T-lymfocyty CD3+ CD4+ Th – lymfocyty CD3+ CD8+ Tc – lymfocyty CD3- CD19+ B lymfocyty CD3- CD16+ CD56+ NK buňky HLA-Dr – aktivované T lymfocyty
•
Sledujeme produkci kyslíkových radikálů (granulocyty)
• • • • •
Funkční testy granulocytů
1,2,3 – dyhydroxirodamin (nefloreskuje) 1,2,3 rodamin (intenzivní fluorescence)
Funkční test lymfocytů •
Sledujeme změny v buněčném cyklu po inkubaci s mitogenem hodnotí se změna intenzity fluorescence propidium jodidu vázaného na DNA
Aktivační test bazofilů •
Sledujeme změny v expresy aktivačního znaku CD63 Neaktivní bazofily znak neexprimují na povrch.
granulocyty monocyty lymfocyty debris
Stanovení intracelulární produkce cytokinů Cytokiny se stanovují intracelulárním značením v endoplazmatickém retikulu. Funkce endoplazmatického retikula je blokována přídavkem momensimu. Pro stanovení se s výhodou používají separované buňky.
Stanovení kvantitativní exprese CD znaků Stanovení zle provést pouze u monoklonálních protilátek konjugovaných s phycoerytrinem (PE). (vazba protilátky s fluorochromem v poměru 1:1)
Při stanovení se měří (MIF) střední hodnota intenzity fluorescence Pro stanovení jsou nutné speciální kalibrační kuličky s přesně známým počtem molekul PE. Kalibrační kuličky pro PE Obsah 100 – 10 000 molekul PE
Stanovení fosforylovaných molekul Díky vývoji monoklonálních protilátek zle sledovat jak fosforylované tak základní formy molekul. Stanovení je nutné provádět v přítomnosti metanolu. - Blokuje funkci fosfatáz - Perforuje buněčnou membránu
Je nutné používat fluorochomy, které jsou vysoce stabilní (Alexa-Fluoro).
Stanovaní potenciálu mitochondriálních membrán
Využívá se vlastností barviva JC-1 , které mění emisní spektrum v závislosti na náboji na membráně mitochondrií. Díky měření zle získat informace o počátečních stadiích apoptózy.
Agregace
Příklady měření potenciálu JC-1 aktivita spermií
kontrola
vzorek aktivita hematopoetických buněk
kontrola
vzorek
Stanovení intracelulární koncentrace Ca2+ Využívá se stanovení s Indo-1-AM, který je po transportu do cytoplazmy buněk rozkládán esterázami na Indo-1, které reaguje s vápenatými ionty. Intenzita fluorescence při 405 nm je přímo úměrná koncentraci iontů vápníku. 2
kontrolní vzorek zamrazené buňky
1.8 1.6 1.4 IF 405/485
1.2 1
0.8 0.6 0.4
Aktivace ATP
0.2
Zdroj: http://www.lifetechnologies.com/
0 0
50
100 čas [s]
150
200
Stanovení intracelulárního pH
Využívá se stanovení s 5(6)-karboxyfluorescein ester, který je po transportu do cytoplazmy buněk rozkládán esterázami na karboxyfluorescein, který reaguje s H+. Intenzita fluorescence je přímo úměrná koncentraci H+ pH. Graf závislosti intracelulárního pH na době kryokonzervace buněk. N: pH = 7,32 STC: pH = 7,30 LTC: pH = 7,21
Stanovení počtu dělení buněčné kultury 5 (6-)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester proniká do cytosolu buněk kde je za pomoci esteráz přeměňován na CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester), který se kovalentně váže na bílkoviny cytosolu buněk. Po odstranění zdroje CFDA, při každém dělení buňky dojde k poklesu intenzity fluorescence o ½.
Využití měření CFSE
Kontrolní vzorek lymfocyty
Lymfocyty aktivované PHA za přítomnosti mezenchymálních kmenových buněk
Lymfocyty aktivované PHA
Cytotoxický test pro NK buňky
Je založen na inkubaci NK buněk s cílovými buňkami. Po inkubaci jsou buňky značeny 7-aminoactinomycin D (7AAD), který je fluorescenční značkou pro DNA. 7AAD/DNA má při excitaci 488 emisní maximum 647 nm. 7-AAD je aktivně vylučováno z buněk.
Kontrolní vzorek
NK buňky 1:1
NK buňky 20:1
Multiplexové metody Využívají k reakci uměle připravené částice, které nesou protilátky proti hledaným cytokinům. Zle stanovit až 96 cytokinů v 1 vzorku (20ul). Stanovení je velice levné (více parametrů v jedné reakci) Při výběru parametru pro stanovení je nutné zvažovat dynamiku hladin cytokinů při léčbě. Koncentrace cytokinů je přímo úměrná MIF PE.
Y
Y
IL-17
IL-6
IL-6
IL-6 IL-17
IL-17
Stanovení IL-6 multiplexovou metodou
Vyhledání kuliček s hledaným cytokinem
Kalibrační křivka pro IL-6
Závěr Díky obrovskému rozvoji průtokové cytometrie máme možnost měřit mnoho parametrů. To klade velké nároky na správnou interpretaci získaných dat. Dodržovat navržený postup analýzy • Zavedený systém QC. •Kritický pohled na výsledky •
