NMR a peptid- és fehérje-kutatásban
A PDB adatbázisban megtalálható NMR alapú fehérjeszerkezetek számának alakulása az elmúlt évek során 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
19 87 19 88 19 89 19 90 19 91 19 92 19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04
0
PDB = protein data bank
Kémiai Nobel-díj 2002
Kurt Wüthrich "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules"
NMR spektrum
spinrendszerek azonosítása
spinrendszerek szekvenciális rendezése
kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás
1. spinrendszerek azonosítása
2. spinrendszerek szekvenciális rendezése
3. kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás
spinrendszerek azonosítása
Homonukleáris eljárás (homonukleáris 3J, M<8kDa) (1H-1H COSY, 1H-1H RELAY, 1H-1H TOCSY )
Heteronukleáris eljárás (heteronukleáris 1J, 2J, 3J) 15N-szerkesztés
(M <15kDa)
(1H-15N TOCSY-HSQC, 1H-15N NOESY-HSQC ) 15N, 13C-szerkesztés
(M <20kDa)
(HNCA, HNCOCA, ….) 15N, 13C-szerkesztés (2H)
(M <30kDa)
spinrendszerek azonosítása
Peptidekben és a fehérjékben az aminosavak hidrogénatomjai elkülönülő spinrendszereket alkotnak
3J
–
Ala
–
Ser
–
Glu
–
Gly
–
Phe
–
Cys –
spinrendszerek azonosítása
1H-spektrum
I -Iy és
S
-Sy
Ix sin(ΩI t1) és
Sxsin(ΩS t1)
ΩI
ΩS
F1(ppm)
A spektrumban a JIS okozta modulációtól eltekintünk
spinrendszerek azonosítása
Egy ~17 kDa globuláris fehérje 1H-spektruma H2O/D2O 9/1, T=300K, c≈1mM
10.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0 (ppm)
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
spinrendszerek azonosítása 1H-1H
TOCSY protonok teljes korrelációját létrehozó spektrum Hγ2
I NH HSα1
Hβ
S2 β H
Iy HKα
H 3Sγ23
F1(ppm)
3S4 γ1 H
Hγ1
ΣSkx βodsin(ΩI t1)cos(ΩSt2)
k=1
diagonális jelek diagonálison kívüli jelek
NH
F2(ppm) kívüli intenzitások βod = diagonálison A spektrumban a JIS okozta modulációtól eltekintünk
spinrendszerek azonosítása
Fehérje modul 1H-1H TOCSY spektruma
spinrendszerek azonosítása 15N-szerkesztéssel
3D-TOCSY-HSQC
–Ix βod sin(ΩIt3) cos(ΩNt2) –2Izβod cos(ΩKt1) cos(ΩKt1) –Ix βodcos(ΩKt1)cos(ΩNt2) –2Izcos(ΩIt1)
-Iy
I
–2IzNy βodcos(ΩKt1)cos(ΩNt2)
ΩH
N
–2IzNy βodcos(ΩKt1)
ΩN
K ΩNH
βod = off diagonális intenzitás A JIK okozta modulációtól eltekintünk
spinrendszerek azonosítása
1H-1H
15N-szerkesztett
TOCSY amid NH
(ujjlenyomat) tartománya
Homonukleáris 2D TOCSY
TOCSY spektrum
spinrendszerek azonosítása 15N-szerkesztett
1H-1H
1H
2D TOCSY
TOCSYamid NH 1H
(ujjlenyomat) tartománya
15N 1H-15N
3D TOCSY-HSQC csíkok
EVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAACTLKACPQ
spinrendszerek azonosítása 15N, 13C-szerkesztéssel
3D-HNCA –Hxcos(ΩNt1) cos(ΩCα(i)t2) cos(ΩHt3) és –Hxcos(ΩNt1) cos(ΩCα(i-1)t2) cos(ΩHt3)
-Hy
ΩCα(i) ΩCα(i-1) Cα(i-1) H
N
Cα(i) ΩNH
ΩN
A skaláris csatolás okozta modulációktól eltekintünk
(AMX) Ser (AX) Gly
1. spinrendszerek azonosítása (A3X) Ala
(A2M2X) Glu
2. spinrendszerek szekvenciális rendezése
3. kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás
A szekvenciális hozzárendelés és a szerkezetszámolás alapja a nukláris Overhauser- effektus (NOE)
6Å
(NOE) ⇓ Távolság jellegű adatok
spinrendszerek szekvenciális rendezése
A spinrendszerek szekvenciális rendezését biztosító Hαi-1-HNHi NOE-k
–
Ala
–
Ser
–
Glu
–
Gly
–
Phe
–
Cys –
spinrendszerek szekvenciális rendezése
Ala
Ser
Glu
A szekvenciális hozzárendelés Gly
Ala
Ser
Glu
Gly
Phe
Cys
Phe
Cys
(AMX) Ser (AX) Gly
1. spinrendszerek azonosítása (A3X) Ala
(A2M2X) Glu
2. spinrendszerek szekvenciális rendezése - Ala –
Ser
–
Glu
-
Gly -
3. kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás
szerkezetszámolás
Fehérje modul 1H-1H NOESY spektruma
Fehérjék NMR-szerkezetvizsgálata
Kurt Wüthrich (ETH, Zürich)
OmpX bakteriális membránfehérje térszerkezete
Mozgékony szekvenciarésszel rendelkező prion fehérje
Biomolekulák dinamikai vizsgálata
GCN4 élesztő transzkripciós faktor gerinc-dinamikájának vizsgálata
Arthur G. Palmer III (Columbia University)
Fehérje feltekeredés vizsgálatok (ns és ms időskálán)
Alan Fersht (Cambridge University)
A proteomika és a szerkezeti genomika korában öszönöm megtisztel ő figyelm üket azKNMR-spektroszkópia jelentősége tovább nő!!
„És ha nem láthatunk már többet, szálljon tovább a képzeletünk. Képzeletünk elfáradt, de a természet kimeríthetetlenül gazdag marad…” PASCAL: Gondolatok
A részletesebb és a csatolási tényezőt is tartalmazó képek
spinrendszerek azonosítása
Egy ~17 kDa globuláris fehérje 1H-spektruma H2O/D2O 9/1, T=300K, c≈1mM
amid
10.0
Hα
aromás
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0 (ppm)
alifás
4.0
3.0
metil
2.0
1.0
0.0
1H-1H
spinrendszerek azonosítása
COSY (homonukleáris korrelációs spektrum) –2IzSysin(ΩIt1)
I
S
Iy
Sxsin(ΩI t1)cos(ΩSt2)
ΩS
2IySzsin(ΩIt1)
ΩI ΩI
ΩS
spinrendszerek azonosítása
1H-1H
COSY
Hγ2
NH Hγ1
Hα Hβ
Hβ Hγ2
Hα
F1(ppm)
Hγ1
ΩS NH ΩI ΩI
ΩS
F2(ppm) A spektrumban a JIS okozta modulációtól eltekintünk
1H-1H
COSY (homonukleáris korrelációs spektrum) –2IzSysin(ΩIt1)sin(πJISt1)
JIS≈ 8±6Hz I
S
Ix ΩS
Sxsin(ΩI t1)sin(πJISt1) cos(ΩSt2)sin(πJISt2)
2IySzsin(ΩIt1)sin(πJISt1)
ΩI ΩI
ΩS
–IxaIIcos(ΩIt1) cos(πJIKt1)cos(ΩNt2) és –IxaIKcos(ΩKt1)cos(πJIKt1)cos(ΩNt2) –2Izcos(ΩIt1)cos(πJIKt1)
3D-NOESY-HSQC
Iz –2IzaIIcos(ΩIt1)cos(πJIKt1) és –2IzaIKcos(ΩKt1)cos(πJIKt1)
–IxaIKcos(ΩKt1)cos(πJIKt1) sin(ΩIt3)cos(πJIKt3) cos(ΩNt2)
–2IzNyaIIcos(ΩIt1) cos(πJIKt1)cos(ΩNt2) és –2IzNyaIKcos(ΩKt1)cos(πJIKt1)cos(ΩNt2)
–2IzNyaIIcos(ΩIt1)cos(πJIKt1) és –2IzNyaIKcos(ΩKt1)cos(πJIKt1)
spinrendszerek azonosítása Heteronukleáris
egyszeres-kvantum koherencia spektrum HSQC = Heteronuclear Single-Quantum Coherence
1,1J~90Hz
Hz
ΩN ΩH
-2HzNy +2HzNy cos(ΩNt1) Hx cos(ΩNt1) Hx cos(ΩNt1)cos(ΩHt2)
spinrendszerek azonosítása
3D-NOESY-HSQC
–IxaIKcos(ΩKt1)cos(ΩNt2) –2Izcos(ΩIt1)
3D-NOESY-HSQC
–IxaIKcos(ΩKt1) sin(ΩIt3) cos(ΩNt2)
Iz –2IzaIKcos(ΩKt1)
–2IzNyaIKcos(ΩKt1)cos(ΩNt2)
–2IzNyaIKcos(ΩKt1) A JIk okozta modulációtól eltekintünk
–2HzNxCzα(i-1) cos(ΩNt1) és –2HzNxCzα(i) cos(ΩNt1) –2HzNycos(ΩNt1)
spinrendszerek azonosítása
3D-NHCA
Hz
–Hxcos(ΩNt1) cos(ΩCα(i)t2) cos(ΩHt3) és –Hxcos(ΩNt1) cos(ΩCα(i-1)t2) cos(ΩHt3)
–2HzNy
ΩCα(i)
Cα(i1)
α(i-1) cos(Ω t ) N 1 –2HyNxCyα(i-1) cos(ΩNt1) –2HyNxCy cos(ΩCα(i)t2) és és N –2HyNxCyα(i) cos(ΩNt1) –2HyNxCyα(i) cos(ΩNt1) Cα(i) cos(ΩCα(i-1)t2)
H
ΩNH
ΩCα(i-1) ΩN
A skaláris csatolás okozta modulációktól eltekintünk
