NMR spektroszkópia a szerves szerkezetfelderítésben
Béni Szabolcs
Spektrális Paraméterek Kémiai eltolódás Intenzitás/terület Spin-spin csatolás Relaxáció
1
Sematikus felépítés
Superconducting Solenoid: generating B0 static magnetic field Sample Tube: 5-20 mg of sample in 0,5-1,0 ml suitable solvent
z x
Transmitter: generating B1 radiofrequency field
B0 y
Receiver detecting the answer
B1
A kriomágnes
Liquid Nitrogen (-196 °C) High vacuum (10-7 Pa) Liquid Helium (-269 °C) Main coil Sample position
2
Az izotópok mágneses tulajdonságai
Mágneses energiaszintek
E
∆E = B0 4,7 T
9,4 T
200 MHz
400 MHz
h γB 2π 0
h γB = hν 2π 0
B0
3
Az egypulzusos kísérlet z’ FID (Free Induction Decay)
spectrum
x’ y’
B0
FT
B1
frequency
time Fourier-transformation
B0 >> B
1
90° pulse:
z’ pw x’
• equalizing the spin-populations • phase coherence
at
x’
d1
y’
180° pulse:
nt
• inverts the spin-populations
AX spin-system Resonance signal of A hydrogen
X A
Resonance signal of X hydrogen
[ 3JHH ] ν
4
X
A
Without spin-spin coupling
A2 In the presence of spin-spin coupling
AX
AB
AB A2
AX
Az NMR idıskála és a kicserélıdés H3C
O N
N
H3C
Time Scale Slow Intermediate Fast Range (Sec-1)
H3C
Chemical Shift k << νA- ν B k = νA - ν B k >> νA - ν B 0 – 1000
O N
N
δobs = ρAν A + ρBνB ρA + ρB = 1 ρA, ρB – mole fraction of each species ν A, ν B – chemical shift of each species
5
Effect of the Magnetic Field Strength on the Spectrum A
AMX X
M
d
d dd
60 MHz
AMPX
600 MHz
dt ddd
ddd
ddd
The T1 Relaxation The recovery of the magnetisation along the z-axis.
T1
Mz
0
z’
0,63 Mz
x’ t
t − T Mz = Mz 1 − e t
0
1
B0
y’
6
The Inversion-Recovery Sequence Measuring T1 relaxation z’
z’
180X pulse
90X pulse
x’
z’
x’
x’
y’
y’
x’
y’
x’ τ
The T2 Relaxation The loss of magnetisation in the x-y plane.
T2
Mxy
0
z’ −
Mxy = Mxy e t
0,37 Mxy
t
0
t
x’
T2
B0
y’
7
The Spin-Echo Sequence Measuring T2 relaxation z’
90X pulse
z’
180X pulse x’
x’ y’
y’
x’
x’ τ
τ
Generating the Second Dimension x’
x’
t2
t1
z’
90X pulse
z’
x’
90X pulse x’
y’
z’ x’
y’
y’
COSY experiment (Correlation Spectroscopy)
8
Generating the Second Dimension
Az LCLC-NMR(NMR(-MS) technika jellemzé jellemzése és alkalmazá alkalmazási lehetı lehetıségei a modern analitiká analitikában Béni Szabolcs Gyógyszerészi Kémiai Intézet
+
= ?
9
Az NMR-mérés érzékenysége G ⋅Q S / N ∝ N spin ⋅ nt 1/ 2 ⋅ B02 / 3 ⋅ ⋅ NF T preamp coil ahol:
•
S/N
jel/zaj arány
Nspin
NMR-aktív magok száma a mérıfej aktív térfogatban
nt
akkumulált tranziensek száma
B0
szupravezetı mágnes térereje
G
mérıfej geometriai tényezıje
Q
mérıfej jósági tényezıje
NFpreamp
elıerısítı zajfaktora
Tcoil
RF adó- és vevıtekercs aktuális hımérséklete
Adott spektrális érzékenység (S/N) elérésének idıszükséglete a fenti kifejezés négyzetével arányos.
•
Hőtött mérıfej (cold probe / cryoprobe) : a mérıtekercs és az elıerısítı 20 K-re hőtése eliminálja a termikus elektronikus zajt és 3-4x érzékenységnövekedést eredményez
Felbontás és térerı összefüggése
Me OH 18
Me
19
O
∆1-dehidrotesztoszteron
10
A hőtött mérıfej
A 25 K re lehőtött elektronika – a kisebb elektromos zaj miatt – drámai érzékenységnövekedést biztosít
- jelentıs mérésidı csökkenés - kisebb anyagmennyiség elegendı - egységnyi idı alatt több információ szerezhetı meg - hagyományos mérıfejjel eddig esélytelen problémák nagy valószínőséggel megfejthetık - szerkezetigazolás biztonsága nagyobb
11
13C 13C
érzékenység
izotóp természetes elıfordulása : 1.1 %
~ 6000-szer érzéketlenebb mag mint az 1H OH
H
H
mintaoldat : 6 mg / 0.75ml CD3OD koncentráció : 23.4 mM
CH2OH
O
HO
H
HO H
MW : 342 g/mol
H
O
H
OH
OH
H
OH
H
CH2OH O
nt = 4 (13 sec)
nt = 16 (52 sec)
rutin 13C NMR felvétel !!! nt = 64 (3,5 perc)
Az LC-NMR kapcsolás kezdetei „Egyesíteni a HPLC elválasztási hatékonyságát az NMR szerkezeti információ-gazdagságával.” 1978. Watanabe, Niki: normál fázisú elválasztás (CCl4), az áramlás megállítása spektrumfelvételhez (stop-flow) 1979. Bayer, K. Albert: új típusú mérıfej, spektrumfelvétel áramlás közben is (on-flow spektrumok) 1980-90. üzemanyagok normál fázisú LC-NMR analízise Kis felbontás (< 200 MHz), Normál fázisú kromatográfia korlátai Fordított fázisú HPLC eluensek (acetonitril, víz, metanol) – erıs 1H jelek! Egyre nagyobb térerejő szupravezetı mágnesek - Mágneses térgradiens pulzusok (PFG)
} egyre hatékonyabb oldószerelnyomási technikák
- Formázott (szelektív) pulzusok ⇒ 1995. Smallcombe: WET oldószerelnyomási pulzusprogram
12
Benzilalkohol 1H NMR-spektruma oldószerelnyomás nélkül •
100 ul 15 mg/ml benzilalkohol injektálása (1,5 mg az oszlopon)
•
Varian C18 oszlop, ACN : D2O 50 : 50 izokratikus analízis, a benzilalkohol zónája megállítva az NMR-mérıfejben
12CH
3CN
„stop-flow”
H
H H
DO CH2 H
H
HDO 13CH
3CN
13CH
3CN
CH2
fenil
7
6
5
4
3
2
1
ppm
Benzilalkohol 1H NMR-spektruma WET oldószerelnyomással mágneses térgradiens pulzusokon alapul egyszerre több oldószerjel (+szatellitek) „eltüntetése”, minimális alapvonal-torzulással
CH2
H
− a kromatografált anyag jeleit is eltüntetjük,
H
ha egybeesnek az oldószerével
H
DO CH2
⇒ ezért nem szeretjük a „bonyolult” szerkezető, sokféle szénkötéső protont tartalmazó
H
H
oldószereket, adalékokat az LC-NMR-ben
fenil CH3CN
HDO 7
6
5
4
3
2
1
ppm
13
Varian 800 MHz LC-NMR-MS, on-flow üzemmód ProStar 230 pumpa
1200L triple-quad MS 800 MHz NMR: valósidejő LC-detektor
splitter
← 5%
injektor
ProStar 430 autosampler
95% →
ProStar 335 diódasoros UV-detektor
eluensgyőjtı
HPLC oszlop
Varian 800 MHz LC-NMR-MS, stop-flow üzemmód ProStar 230 pumpa
1200L triple-quad MS 800 MHz NMR
splitter SF-szelep
injektor
ProStar 430 autosampler
ProStar 335 diódasoros UV-detektor
HPLC oszlop
eluensgyőjtı eluensgyőjtı
14
Az LC-NMR(-MS) berendezés vázlata
aktív árnyékolású szupravezetı mágnes: 5 G határ: 75 cm LC + tartozékok közelebb kisebb holttérfogatok
Az átfolyó mérıcella
120 ul teljes térfogat, 60 ul aktív térfogat (RF)
0,1 mm ∅ PEEK (poli-éter-éter-keton) csövek:
X
O
O
O C
X n
15
Az LC-NMR analízis módjai 1. Spektrumfelvétel folytonos áramlás mellett (On-flow / continuous flow LC-NMR) NMR: folyamatosan mőködı detektor, hasonlóan a diódasoros UV-detektorhoz. Egydimenziós 1H NMR spektrumok folyamatos, gyors (1-3 s) felvétele
2. Megállított áramlás utáni spektrumfelvétel (Stop-flow LC-NMR)
ESI
Az UV-detektoron észleljük a komponenseket. Amikor egyegy komponens a mérıfej aktív térfogatába ér, megállítjuk az áramlást és idıigényes (2D) NMR-felvételeket készíthetünk akár több napon keresztül. Az áramlás újraindítása után jöhet a következı komponens.
3. LC-komponensek kigyőjtése hurkokba (Loop Collection / Storage LC-NMR) Folyamatos áramlás mellett az UV-detektoron észlelt komponensek egyenként acélhurkokba kerülnek („parkolás”). Innen jutnak egyenként az NMR-mérıfejbe, ahol idıigényes mérésekre is lehetıség van.
4. In-line szilárd fázisú extrakciót követı NMR (LC-SPE-NMR) Az UV-detektoron észlelt komponenseket külön-külön cartridge-on szilárd állapotban koncentráljuk, majd minimális mennyiségő deuterált oldószerrel beoldva kerülnek az NMR-mérıfejbe, ott hosszabb 2D méréseket is lehetıvé téve.
1. Folytonos áramlás (On-flow NMR) •
gyors 1D pásztázás ⇒ néhány sec tartózkodási idı az aktív térfogatban ⇒ csak fıkomponensek (> 10 ug) gyors egydimenziós 1H (esetleg 19F) NMR mérésére
•
gradiens elúció: az oldószerösszetétel folyamatos változását követnie kell az oldószerelnyomásnak (< 3% / perc gradiens!)
16
Pszeudo-2D szintvonalas ábrázolás (kontúrplot) ACN jel
retenciós idı
maradéka
LC-UV kromatogram
HDO-jel maradéka
• Erythroxylum vacciniifolium alkaloid-extraktuma (3 mg inj.) • C18 oszlop; ACN (2 mM NH3):D2O (2 mM NH3) gradiens (5:95 – 100:0; 80 min); 1,2 ml/min • NMR: 500 MHz, 60 ul (3 mm) átfolyó cella; 32 tranziens JL Wolfender, EF Queiroz, K. Hostettmann, Magn. Reson. Chem. 2005, 43, 697-709.
On-flow
19F-NMR
Stop-flow 1H-NMR
M Tugnait, EM Lenz, ..., JK Nicholson, ID Wilson, J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 28, 875-885.
17
2. Megállított áramlás (Stop-flow NMR) • komponens megjelenik az UV-detektoron ⇒ adott transzferidı után megállítjuk a mérıfejben • UV→NMR transzferidı pontos kalibrációja • ha a megállított anyaghullámban >1 ug anyag
⇒ 1D 1H NMR spektrum
> 50 ug anyag ⇒ 2D 1H NMR spektrumok
Fitokémiai, gyógynövénykutatási alkalmazások • motiváció A gyógyszerkutatási programokba bevont molekulák 40%-a növényi eredető ! [ Cragg, Newmann, Snader, J. Nat. Prod. 60, 1997, 52. ]
• hagyományos protokoll - növényi extraktumok, frakciók győjtése, majd preparatív HPLC-s szétválasztása - 20-30 mg izolált komponensbıl off-line spektroszkópiai vizsgálatok (UV, IR, NMR, MS) ⇒ teljes szerkezetmeghatározás (konstitúció, konfiguráció, eseteg konformáció) - ÚJ: hideg mérıfejek: 20-30 ug (!) elegendı a teljes szerkezetfelderítéshez (NMR-csıben)
• kapcsolt technikákon (LC-NMR-MS) alapuló új protokoll (1999-) - injektált mintából elıször on-flow spektrum ⇒ fıkomponensek spektruma - stop-flow spektrumok a minor komponensekre - a szerkezetmeghatározásra általában szükség van MS (esetenként MSn) adatokra is - a leghatékonyabb analitikai mőszerkombináció a növényi metabolitok szerkezetkutatásában
18
Növényi eredető, instabil vegyületek analízise (stop-flow NMR) • Jamesbrittenia fodina metanolos extraktumában két izobár fahéjsavészter • 500 MHz stop-flow 1D NMR spektrumok 240 ug injektálásból • ezután off-line 2D HMBC a cisz-transz elegyre ⇒ ramnóz és a cinnamoil kapcsolódási helye
JL Wolfender, EF Queiroz, K. Hostettmann, Magn. Reson. Chem. 2005, 43, 697-709.
3. Hurokba győjtés (Loop collection LC-NMR)
• a komponensek megjelennek az UV-detektoron ⇒ automata szeleprendszer külön-külön 130 ul-es acélhurkokba irányítja az elválasztott komponenseket (9 – 36 hurok) • a hurkokból a komponens retenciós idejének megfelelı eluensösszetétellel, egyenként, tetszıleges sorrendben oldjuk ki a komponenseket és „tetszılegesen” hosszú ideig 1D, illetve 2D NMR kísérleteket végezhetünk rajtuk • Feltétel:
az elválasztott komponensek kémiai stabilitása a „parkolás” idıtartama alatt
19
LC-MS-NMR: „tömegvezérelt” csúcsdetektálás „metabolithalászat” kutyavizeletbıl: UV 254 nm...
és EIC ioncsapda MS2-bıl: hidroxi-glükuronid!
GW420867 hidroxi glükuronid
GJ Dear, RS Plumb, ..., JK Nicholson, IM Ismail, J. Chromat. B 2000, 748, 281-293.
A kromatográfia NMR-kompatibilitási szempontjai • D2O + szerves oldószerkomponens(ek) – D2O: az izokratikus analízis során lockjelet szolgáltat – acetonitril (1,93 ppm; s), metanol – oldószerek: a kromatográfiás tisztaságnál is szigorúbb feltételek ! pl. acetonitril propionitril szennyezıje, metanol hangyasav-szennyezıje, THF peroxidjai... – legújabb: túlhevített víz!
• pufferalkotók – bár ionos, pl. foszfát alapú pufferek is használhatók elvileg, – gyakoriak az MS-kompatibilis ammónium-acetát és –formiát pufferek – trifluorecetsav adalék – trietilamin, ionpárképzık, ... általában nem elınyösek (csak perdeuterálva vagy perfluorozva)
• áramlási sebesség – a kromatográfiás csúcsdiszperzió és az NMR-érzékenység kompromisszuma – 0,2 – 1,5 ml/perc
(általában 1 ml/perc)
• injektálás: nagyobb oszlopterhelés ! – LC-DAD-UV, LC-MS: 10 ul inj. – LC-NMR:
1 mg/ml mintából
100 ul inj. 1 mg/ml mintából
⇒ 10 ug az oszlopra ⇒ 100 ug az oszlopra
hogy az 1% szennyezıbıl 10 ug kerüljön az oszlopra ⇒ 100 ul 10 mg/ml mintából inj. (!)
20
Az LC-NMR próbafejek jellemzı érzékenysége (2003) • érzékenységi teszt: 120 ul aktív térfogatú mérıcella, 500 MHz 1H mérési frekvencia • az aktív térfogatba juttatott anyag (Mt 500) mennyisége • 2D mérések jellemzı idıszükséglete
• Gyógyszeranalízis érzékenységi követelményei a törzskönyvezéshez: minden > 0,1% szennyezı vagy metabolit szerkezetazonosítása (és kvantitatív mérése) G. J. Sharman, I. C. Jones, Magn. Reson. Chem. 2003, 41, 448-454.
További érzékenységvesztés a mérıfejben • átfolyó cella térfogata: 120 ul,
aktív térfogat (RF tekercs): 60 ul
• 1 ml/perc áramlási sebességnél ez kb. 4 s tartózkodási idıt jelent • ennél nagyobb félértékszélességő kromatográfiás anyaghullámnak csak egy részét detektáljuk!
4 sec
16 sec
36 sec
• a minor szennyezık analízisénél alkalmazott nagyobb oszlopterhelés ⇒ további csúcsdiszperzió a csúcs akár 500 ul-re is kiszélesedhet! (gradiens-elúcióval gyakranvisszaszorítható) • további csúcsszélesedés / torzulás az UV-átfolyó cellában, illetve a csıcsatlakozásoknál
G. J. Sharman, I. C. Jones, Magn. Reson. Chem. 2003, 41, 448-454.
21
A gyógyszeranalízis érzékenységi követelményei • > 0,1% szennyezık, metabolitok szerkezetazonosítása (és kvantitatív mérése) • a (szemi)preparatív út (kromatográfiás izolálás több injektálásból, frakciógyőjtés, beszárítás, majd mintaoldat NMR-csıbe) gyorsabb, mint az LC-NMR módszeroptimálás?
GJ Sharman, IC Jones, Magn. Reson. Chem. 2003, 41, 448-454.
Érzékenységnövelési stratégiák az LC-NMR-ben 1. Nagyobb térerı alkalmazása
G ⋅Q S / N ∝ N spin ⋅ nt 1/ 2 ⋅ B02 / 3 ⋅ NF ⋅ T preamp coil
2. Off-line mintadúsítás az LC-NMR analízis elıtt •
extrakció, liofilizálás / újraoldás D2O-ban, SPME ...
3. Komponens dúsítása, bekoncentrálása többszörös injektálásból (LC-multiple peak trapping SPE-NMR) •
beoldás kismennyiségő deuterált oldószerbe
•
4x érzékenységnövekedést eredményez.
4. Hideg mérıfej (cold probe / cryoprobe) alkalmazása •
a mérıtekercs és az elıerısítı 20 K-re hőtése eliminálja a termikus elektronikus zajt és újabb 3 – 4x érzékenségnövekedést eredményez.
5. Kapilláris LC-NMR (CapLC-NMR / microflow LC-NMR) •
tekercs miniatürizálása ⇒ a geometriai állandó és a jósági tényezı jelentıs növekedése
22
4. In-line szilárd fázisú extrakció (LC-SPE-NMR) •
komponensek észlelése UV-detektoron, a komponens zónája 5-6x vízzel hígítva (5 ml/min)
•
szárítás nitrogéngázzal, majd deuterált oldószerbe beoldva jut a komponens a mérıfejbe
kicsapódik egy-egy 2 x 10 mm SPE cartridge-on („peak trapping”)
a kromatográfia nem deuterált oldószerekkel történik - igen költségtakarékos - nem kell oldószerelnyomás a mérıfej térfogatához pontosan illesztett oldószertérfogat minor komponens megkötése ugyanazon a cartridge-on több injektálásból (multiple peak trapping) ⇒ további dúsítás, érzékenységnövelés 3-4 x érzékenységnövekedés a hagyományos LC-NMR-hez képest ⇒ fıkomponensre elérhetıvé válnak a 2D 13C-1H NMR mérések
M Sandvoss, B Bardsley, et al. Magn. Reson. Chem. 2005, 43, 762-770.
Új: félpreparatív LC-SPE-NMR •
10 mm C18 oszlop, ACN/H2O gradiens, 5 ml/perc, injektálás: 2 ml 5 mg/ml minta
•
HiCRAM: High Capacity Retention And Mixing: 10-100x hígítás vízzel, majd He-gáz
•
Beoldás 100 ul deuterált szerves oldószerrel → 60 ul-es NMR-mérıfejbe
két párhuzamos SPE-cartridge-ra viszi a komponenst. Szobahıfokon He-gázzal beszárítás.
egyetlen injektálással is elérhetık buspiron
az 1D 13C és a 2D 13C-1H mérések ~1% (50 ug/ml) komponensre is! ⇒ teljes szerkezetazonosítás minor komponensre 3 x 1 ug/ml x 2 ml injektálásból dúsítva 2D 1H-1H mérések elérhetık 0,02% komponensre >30x érzékenységnövekedés a dúsítás nélküli LC-NMR-rel szemben
F Xu, AJ Alexander Magn. Reson. Chem. 2005, 43, 776-782.
23
LC-1H-NMR hideg mérıfejjel: acetaminofen metabolitok
• 500 mg acetaminofen fogyasztása után humán, centrifugált vizeletbıl 100 ul injektálva • C18 (5 um) oszlop, ACN-d3 (+TFA):D2O(+TFA), (2:98 – 60:40; 15 min); 0,4 ml/min • split: 500 MHz NMR (95%) : ioncsapda MS (5%) • az ismert szulfát- és glükuronid-metabolitok mellett három újabb detektálása stop-flow 2D és MS spektrumok alapján
M Spraul, AS Freund, RE Nast, RS Withers, WE Maas, O Corcoran Anal. Chem. 2003, 75, 1546-1551.
Advantages of Microcoil NMR
Improved mass sensitivity Improved limits of detection Reduced sample size Easy coupling to microscale separations (HPLC, CE, cITP)
Vobs ~ 25 nL
Disadvantage Poor Concentration Sensitivity F.C. Schroeder and M. Gronquist Angew Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7122 – 7131
24
Capillary Electrophoresis
Capillary Isotachophoresis (cITP) Migration TE
LE
Sample A and B
µe(TE) < µe(B)
< µe(A)
< µe(LE)
Apply appropriate electric field
TE
BA
LE
Sample is injected between the LE and TE
Separates ions based on electrophoretic mobility (µe) Charged analytes will form welldefined, focused bands depending upon relative µe
Advantages: cITP concentrates analytes up to 2-3 orders of magnitude Compensates for the poor sensitivity of NMR microcoils Reduces interference from sample matrix
Radola, B. J., Ed. Analytical Isotachophoresis; VCH: New York, 1988
25
cITP-NMR Setup Modified capillary surface to minimize electroosmotic flow
Microcoil
Hydrodynamic injection is used to introduce sample into the capillary
Capillary
An electric field is applied across the capillary (15 kV) 600 MHz spectrometer Each spectrum is 8 scans/10 sec Pulse width = 45°
Inlet Vial
Outlet Vial High Voltage
R. A. Kautz, et al. J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 3159-3160 A. M. Wolters, D. A. Jayawickrama, C. K. Larive and J. V. Sweedler Anal. Chem.2002, 74, 4191-4197
cITP-NMR Probe
Vobs ~ 25 nL
A. Korir and C. K. Larive Anal. Bioanal. Chem. 2007, 388,1707-1716
26
Kapilláris LC-NMR (microcoil NMR) • rézdrót közvetlenül a kapillárisra +perfluorozott folyadék • 50-100 um ∅ transzferkapilláris vezet a mérıfejbe, 5-10 ul/min • stop-flow: jelentıs diffúzió már percek alatt ⇒ buborékcella (1-5 ul)
2-5 ug (összesen 12 ug) metabolit 40 ul vizeletbıl (600 MHz, 2h) • eluens: CD3OD/D2O gradiens, +DCOOD • gradiens on-flow nehéz. • SF: 5 ng-ból 1 éjszaka alatt 1H spektrum • 1.5 ul cella ⇒ nagyobb konc. kell!
RJ Lewis, MA Bernstein, SJ Duncan, CJ Sleigh, Magn. Reson. Chem. 2005, 43, 783-789.
LC-UV(PDA)-FTIR-NMR-TOFMS: „totál szervesanalitika”
rozsdamentes acél átfolyó cella (400 ul) + ZnS Attenuated Total Reflection (ATR) kristály FT-IR spektrum / 5 s (8 cm-1 spektrális felbontás), oldószerspektrum automatikus kivonása NMR / MS elosztás: 95 / 5, minden mőszer a 5G vonalon kívül, 500 MHz, 4-mm id, 120 ul cell 2 + 32*1 sec / spektrum ESI-TOF-MS Z spray-forrás: 0,9 s adatgyőjtés 0,5 mL/min 5 ng/mL D. Louden, A. Handley, I. D. Wilson, et al. Anal. Chem. 2000, 72, 3922-3926.
27
LC-UV(PDA)-FTIR-NMR-TOFMS: NSAID keverék analízise naproxen (1)
flurbiprofen (2)
ibuprofen (4)
[M−D] −
UV (254 nm)
indometacin (3)
• kötött C18 fázis • ACN / 1% hangyasav D2O-ban (pH 2) 50 / 50 • inj. 200 ul 10 mg/ml NSAID (2 mg) • alapvonal elválasztás 17 perc alatt • UV-detektor (254 nm) ⇒ SF-NMR idızítés • ESI-TOF-MS: negatív ion mód D. Louden, A. Handley, I. D. Wilson, et al. Anal. Chem. 2000, 72, 3922-3926.
Túlhevített víz (D2O), mint eluens: vitaminok hıbomlása
D
D3
tiamin (3,77 min)
•
200 °C, 50 bar víz: alacsony polaritás és viszkozitás
•
⇒ fordított fázisú mozgófázis, szerves
•
a pumpa után egy termosztátban:
•
a detektorokat lehőtés után éri el az eluens,
komponens nélkül (minimális háttérjel) elıfőtı kolonna és a HPLC-oszlop (PS-DVB) majd nyomásszabályozó következik
!
D hıbomlási termék (8,55 min)
forró D2O-ban akár alkilcsoportok is deuterálódhatnak !
D •
160 °C D2O, dihidrogénfoszfát puffer (pH 3): hıbomlási termék (stop-flow 1H NMR, MS)
•
50 °C D2O, dihidrogénfoszfát puffer (pH 3): nincs hıbomlás és csak a C1-H deuterálódott
O. Chienthavorn, R. M. Smith, et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 36, 477-482.
28
Növényi ekdiszteroidok LC-UV-FTIR-NMR-MS analízise túlhevített D2O-ban • Silene nutans etanolos extraktumaiból ekdiszteroidok azonosítása • HPLC: 160 °C D2O eluens (0,8 ml/min), C8 XTerra oszlop után jeges vízfürdıs hőtés • 5% APCI Single-Quad MS, pozitív ion mód, 95% ATR-FTIR, majd UV-DAD (188–1000 nm) • 500 MHz NMR spektrométer, 60 ul mérıfej • 600 ug / 20 ul injektálva
2: 20-hidroxiekdizon és polipodin B koelúciója 1: integriszteron A
D. Louden, A. Handley, et al. Anal. Chem. 2002, 74, 288-294.
LC-NMR-MS: hazai ipari alkalmazási lehetıségek Szintetikus intermedierek szennyezıi, bomlástermékei • preparatív munka támogatása: - szerkezet eddig elérhetetlen mennyiségő szennyezıkrıl - nagyobb mennyiségő szennyezıkrıl gyorsabb és biztosabb szerkezet Gyártást kísérı minıségbiztosítás •
hatóanyagban megjelenı új, minor szennyezık szerkezetazonosítása
Formulált termékek szennyezıi, bomlástermékei • tabletta stresszvizsgálatok • szennyezésprofil-vizsgálatok: minor szennyezık, kísérı komponensek szerkezetazonosítása elıször válik izolálás nélkül lehetıvé, felgyorsítva pl. szabadalmi kérdések megoldását Gyógyszer(jelölt) vegyületek metabolitjai in vitro mintából •
megfelelı mintaelıkészítés és dúsítás szükséges
Biológiai minták analízise – LC/MS(n) eredmények kiegészítése •
toxikológia, metabolizmus kutatás (regioizomerek, glükuronid pozíciója...)
29
Összefoglalás Az LC-NMR(-MS) 10 év alatt kereskedelmileg elérhetı technikává fejlıdött. Jelentıs szerepet tölt be: • Új gyógyszermetabolitok azonosítása biológiai mintákból • ”Natural product science”, növényi hatóanyagok, metabolitok szerkezetazonosítása • ”Natural product science”, fitokémia Az érzékenység növelésének útjai: • Hideg mérıfejek alkalmazása • LC – [Multiple-trapping-SPE] – NMR • NMR csatolása kapilláris elválasztástechnikákhoz (microcoil NMR)
1H
mellett kevésbé érzékenyen detektálható magok is mérhetıvé válnak
30
