Několik poznámek k laboratornímu vyšetřování antifosfolipidových protilátek

Několik poznámek k laboratornímu vyšetřování antifosfolipidových protilátek Karin Karin Malíčková, Malíčková, Petra Petra Šandová, Šandová, Ivana Ivana Janatková Janatková

Všeobecná Všeobecná fakultní fakultní nemocnice nemocnice aa Univerzity Univerzity Karlovy Karlovy vv Praze Praze

1.lékařská 1.lékařská

Klinická Klinická imunologie imunologie aa alergologie alergologie -- laboratoř laboratoř Ústav Ústav klinické klinické biochemie biochemie aa laboratorní laboratorní diagnostiky diagnostiky

fakulta fakulta

•• Před Před 23 23 lety lety bylo bylo vv Lancetu Lancetu poprvé poprvé popsáno popsáno vyšetření vyšetření protilátek protilátek proti proti kardiolipinu kardiolipinu uu skupiny skupiny nemocných nemocných ss rizikem rizikem opakovaných opakovaných tepenných tepenných a/nebo a/nebo žilních žilních trombóz trombóz aa opakovaných opakovaných spontánních spontánních potratů. potratů. •• Tento Tento soubor soubor klinických klinických aa laboratorních laboratorních příznaků příznaků byl byl zpočátku zpočátku nazýván nazýván antikardiolipinovým antikardiolipinovým syndromem, syndromem, avšak avšak po po průkazu průkazu zkřížené zkřížené reaktivity reaktivity kardiolipinu kardiolipinu ss jinými jinými fosfolipidy fosfolipidy se se ujal ujal název název antifosfolipidový antifosfolipidový syndrom syndrom (APS). (APS). •• Problematika Problematika APS APS je je dosud dosud předmětem předmětem řady řady diskusí. diskusí. Ani Ani po po dvou dvou desetiletích desetiletích výzkumu výzkumu nebylo nebylo dosaženo dosaženo shody shody ohledně ohledně standardizace standardizace aa interpretace interpretace výsledků výsledků vyšetření vyšetření antifosfolipidových antifosfolipidových protilátek protilátek (APLA). (APLA).

2/17/2008

© KIA ÚKBLD VFN & 1.LF UK 2006

2

•• Na Na téma téma standardizace standardizace vyšetření vyšetření APLA APLA se se konalo konalo mnoho mnoho mezinárodních mezinárodních workshopů, workshopů, více více nežli nežli uu kterýchkoliv kterýchkoliv jiných jiných autoprotilátek. autoprotilátek. •• Dosud Dosud však však panují panují vv detekci detekci APLA. APLA.

značné značné

mezilaboratorní mezilaboratorní

rozdíly rozdíly

•• ZZ tohoto tohoto důvodu důvodu je je třeba třeba do do rutinních rutinních analýz analýz APLA APLA integrovat integrovat komplexní komplexní postupy postupy kontroly kontroly kvality. kvality. Pro Pro laboratoř laboratoř usilující usilující oo poskytování poskytování kvalitních kvalitních služeb služeb je je nezbytná nezbytná důkladná důkladná externí externí kontrola kontrola kvality kvality vyšetření vyšetření (external (external quality quality assessment, assessment, EQA). EQA).

2/17/2008


3

1986 První mezinárodní workshop o protilátkách proti kardiolipinu •• Poprvé Poprvé nastolena nastolena otázka otázka standardizace standardizace detekce detekce ACLA. ACLA. •• Doporučen Doporučen způsob způsob kvantifikace kvantifikace ACLA ACLA vv jednotkách jednotkách GPL GPL (pro (pro ACLA ACLA IgG) IgG) aa MPL MPL (pro (pro ACLA ACLA IgM IgM ): ): jednotka jednotka je je definována definována jako jako 11 µg/ml µg/ml afinitně afinitně purifikované purifikované protilátky protilátky •• Zavedení Zavedení tzv. tzv. Harrisových Harrisových neboli neboli luisvillských luisvillských standardů, standardů, připravených připravených smícháním smícháním normálního normálního séra séra se se séry séry dvou dvou pacientů pacientů ss pozitivitou pozitivitou hematologických hematologických koagulačních koagulačních testů testů na na lupusové lupusové antikoagulans antikoagulans aa ss anamnézou anamnézou trombotických trombotických příhod. příhod. Tyto Tyto standardy standardy jsou jsou dosud dosud komerčně komerčně dostupné dostupné aa běžně běžně používané používané jako jako kalibrátory kalibrátory vv diagnostických diagnostických soupravách. soupravách. Harris Harris EN, EN, Gharavi Gharavi AE, AE, Patel Patel SP, SP, Hughes Hughes GR. GR. Evaluation Evaluation of of the the anti-cardiolipin anti-cardiolipin antibody antibody test: test: report report of of an an international international workshop workshop held held 44 April April 1986. Clin Exp Immunol. 1987 Apr;68(1):215-22 1986. Clin Exp Immunol. 1987 Apr;68(1):215-22

2/17/2008


4

•• Koncem Koncem 80-tých 80-tých let let 20.století 20.století bylo bylo jasné, jasné, že že zz řady řady diagnostických diagnostických kitů kitů kk detekci detekci ACLA ACLA jsou jsou funkční funkční pouze pouze ty ty soupravy, soupravy, které které používají používají diluent diluent ss obsahem obsahem bovinního bovinního séra. séra. •• Dnes Dnes je je zřejmé, zřejmé, že že bovinní bovinní sérum sérum bylo bylo zdrojem zdrojem beta-2beta-2glykoproteinu-1 glykoproteinu-1 (b2GP1), (b2GP1), jehož jehož patofyziologický patofyziologický význam význam kofaktoru kofaktoru vv roce roce 1990 1990 ozřejmily ozřejmily nezávisle nezávisle na na sobě sobě 33 pracovní pracovní skupiny skupiny (Koike (Koike & & kol., kol., Galli Galli & & kol. kol. aa Krilis Krilis & & kol.). kol.). •• VV současné současné době době je je proto proto součástí součástí většiny většiny ELISA ELISA souprav souprav purifikovaný purifikovaný lidský lidský b2GP1 b2GP1 (bovinní (bovinní sérum sérum je je méně méně vhodné, vhodné, protože protože je je zdrojem zdrojem dalších dalších proteinů proteinů interferujících interferujících ss imunoanalýzou). imunoanalýzou).

2/17/2008


5

•• Kardiolipin Kardiolipin byl byl prvním prvním fosfolipidem, fosfolipidem, uu kterého kterého byla byla prokázána prokázána asociace asociace ss imunopatologickými imunopatologickými stavy. stavy. Kardiolipin Kardiolipin se se však však nenachází nenachází vv membráně membráně trombocytů, trombocytů, ani ani není není součástí součástí koagulační koagulační kaskády. kaskády. ••

KK fosfolipidům fosfolipidům trombocytární trombocytární membrány membrány patří patří fosfatidylcholin fosfatidylcholin (50-60% (50-60% podíl podíl na na celkových celkových fosfolipidech fosfolipidech trombocytární trombocytární membrány) membrány) fosfatidylethanolamin fosfatidylethanolamin (20-30%) (20-30%) fosfatidylserin fosfatidylserin (10-15%) (10-15%) aa fosfatidylinositol fosfatidylinositol (cca (cca 5%). 5%).

•• Od Od konce konce 90-tých 90-tých let let 20. 20. století století se se proto proto uu trombofilních trombofilních stavů stavů ss imunopatologickou imunopatologickou příčinou příčinou rozšířila rozšířila diagnostika diagnostika oo detekci detekci protilátek protilátek proti proti těmto těmto aa dalším dalším fosfolipidům. fosfolipidům.

2/17/2008


6

•• VV současné současné době době je je vhodné vhodné používat používat termín termín “antifosfolipidové “antifosfolipidové protilátky” protilátky” (anti-phospholipid (anti-phospholipid antibodies, antibodies, APLA) APLA) aa pojem pojem ACLA ACLA vyčlenit vyčlenit pouze pouze pro pro protilátky protilátky proti proti samotnému samotnému kardiolipinu. kardiolipinu. •• Pozice Pozice ACLA ACLA jako jako “zlatého “zlatého standardu” standardu” pro pro detekci detekci APLA APLA je je pomalu pomalu překonávána, překonávána, ISTH-SSC ISTH-SSC (International (International Society Society on on Thrombosis Thrombosis and and Hemostasis Hemostasis -- Scientific Scientific Subcommittee Subcommittee on on Lupus Lupus Anticoagulants/Phospholipid-Dependent Anticoagulants/Phospholipid-Dependent Antibodies) Antibodies) dokonce dokonce vv roce roce 2002 2002 doporučila doporučila vyřadit vyřadit stanovení stanovení ACLA ACLA zz diagnostických diagnostických kritérií kritérií APS. APS. •• Dosud Dosud se se tak tak nestalo, nestalo, pozitivita pozitivita ACLA ACLA je je stále stále prvním prvním laboratorním laboratorním kritériem kritériem APS. APS. Vyšetřením Vyšetřením ACLA ACLA však však nedostaneme nedostaneme odpověď odpověď na na otázku, otázku, zda zda se se jedná jedná oo kofaktor-dependentní kofaktor-dependentní (a (a tudíž tudíž patologické) patologické) protilátky protilátky či či nikoliv. nikoliv. Lupus Lupus Anticoagulants/Phospholipid-Dependent-Antibodies Anticoagulants/Phospholipid-Dependent-Antibodies SSC, SSC, ISTH, ISTH, Boston, Boston, 2002 2002

2/17/2008


7

• Kity kalibrované na Harrisovy standardy: standardy jsou vyrobeny ze sér pacientů, proto prakticky není možné dodržet u jednotlivých šarží identickou afinitu, aviditu a specificitu. Potvrdila to např. studie Rebera a kol., která srovnávala devět komerčních kitů k detekci APLA kalibrovaných na Harrisovy standardy a zjistila v průběhu času signifikantní rozdíly v reaktivitě samotných standard a celých souprav. Reber Reber G, G, Tincani Tincani A, A, Sanmarco Sanmarco M, M, de de Moerloose Moerloose P, P, Boffa Boffa MC; MC; European European Forum Forum on on Antiphospholipid Antiphospholipid Antibodies Standardization Group. Variability of anti-beta2 glycoprotein I antibodies Antibodies Standardization Group. Variability of anti-beta2 glycoprotein I antibodies measurement measurement by by commercial commercial assays. assays. Thromb Thromb Haemost. Haemost. 2005 2005 Sep;94(3):665-72 Sep;94(3):665-72

2/17/2008


8

• Tento problém nastolil potřebu jiného způsobu standardizace testů, a to pomocí monoklonálních protilátek, které již existují jak pro izotyp IgM (EY2C9), tak i IgG (HCAL). Tyto monoklonální protilátky jsou cíleny proti jednomu určitému antigenu na první doméně molekuly b2GP1. I když se zdá, že právě tvorba protilátek proti antigenům z této domény má vztah ke klinickým projevům trombóz, výzkum protilátek proti dalším doménám dosud nebyl ukončen.

2/17/2008


9

•• Evropské Evropské fórum fórum antifosfolipidových antifosfolipidových protilátek protilátek vydalo vydalo vv roce roce 2004 2004 doporučení doporučení pro pro detekci detekci antifosfolipidových antifosfolipidových protilátek protilátek (bez (bez ohledu ohledu na na způsob způsob kalibrace kalibrace detekční detekční soupravy). soupravy). Obsahuje Obsahuje tato tato čtyři čtyři ustanovení: ustanovení: — — vyšetřovat vyšetřovat séra séra vv dubletech, dubletech, — — vytvořit vytvořit si si vlastní vlastní cut-off cut-off laboratoře laboratoře vyšetřením vyšetřením alespoň alespoň 50 50 sér sér zdravých zdravých jedinců, jedinců, — — kk výpočtu výpočtu cut-off cut-off použít použít 95, 95, 98 98 nebo nebo 99% 99% interval interval spolehlivosti spolehlivosti — — používat používat dvě dvě externí externí kontroly: kontroly: jednu jednu nižší nižší nežli nežli cut-off cut-off aa druhou druhou středně středně pozitivní. pozitivní. Tincani Tincani A, A, Allegri Allegri F, F, Balestrieri Balestrieri G, G, Reber Reber G, G, Sanmarco Sanmarco M, M, Meroni Meroni P, P, Boffa Boffa MC. MC. Minimal Minimal requirements requirements for for antiphospholipid antiphospholipid antibodies antibodies ELISAs ELISAs proposed proposed by by the the European European Forum Forum on on antiphospholipid antiphospholipid antibodies. antibodies. Thromb Thromb Res. Res. 2004;114(5-6):553-8 2004;114(5-6):553-8

2/17/2008


10

Naše zkušenosti ze systému externí kontroly kvality vyšetření antifosfolipidových protilátek UK NEQAS Quality Quality Assurance Assurance == zabezpečení zabezpečení kvality kvality výsledků, výsledků, vv laboratorní laboratorní medicíně medicíně je je důležité důležité ss ohledem ohledem na na kvalitní kvalitní péči péči oo pacienta pacienta aa správnost správnost vyvozovaných vyvozovaných závěrů, závěrů, aa také také ss ohledem ohledem na na výměnu výměnu validovaných validovaných dat dat mezi mezi laboratořemi. laboratořemi. Quality Quality Assessment Assessment == hodnocení hodnocení kvality kvality výsledků výsledků se se děje děje pomocí pomocí vnějšího vnějšího hodnocení hodnocení External External Quality Quality Assessment, Assessment, EQAS EQAS nebo nebo také také EQA, EQA, kam kam patří patří také také mezilaboratorní mezilaboratorní porovnávací porovnávací zkoušky. zkoušky.

UK NEQAS (United Kingdom External Quality Assesment Service) 2/17/2008


11

•• jediné jediné pracoviště pracoviště zz ČR ČR •• cca cca 500 500 zúčastněných zúčastněných laboratoří, laboratoří, zz toho toho nejvíce nejvíce britských britských (382), (382), zz nových nových členských členských zemí zemí EU EU se se kromě kromě našeho našeho pracoviště pracoviště účastní účastní 11 estonská, estonská, 66 maďarských maďarských ss 11 maltská maltská laboratoř, laboratoř, zz mimoevropských mimoevropských zemí zemí má má největší největší zastoupení zastoupení Izrael Izrael (11 (11 laboratoří) laboratoří) aa USA USA (7 (7 laboratoří) laboratoří) •• kontrolní kontrolní vzorky vzorky jsou jsou připraveny připraveny jako jako pool pool sér sér aa rozesílají rozesílají se se jednou jednou za za 88 týdnů, týdnů, tj. tj. šestkrát šestkrát ročně ročně •• stanovuje stanovuje se se koncentrace koncentrace protilátek protilátek proti proti kardiolipinu, kardiolipinu, beta-2-glykoproteinu beta-2-glykoproteinu 11 aa fosfatidylserinu fosfatidylserinu vv izotypech izotypech IgG IgG aa IgM IgM •• kontrolní kontrolní vzorky vzorky mají mají být být zařazeny zařazeny vv rutinním rutinním provozu provozu klinické klinické laboratoře laboratoře mezi mezi běžné běžné denní denní vzorky vzorky nemocných, nemocných, aby aby mohly mohly odkrýt odkrýt případné případné problémy problémy celého celého analytického analytického procesu procesu 2/17/2008


12

Interpretace výsledků APLA v cyklech UK NEQAS

-klasifikace hodnot do skupin negativní - slabě pozitivní pozitivní – silně pozitivní GPLU – IgG Phospholipid Units - µg/ml afinitně purifikované protilátky v izotypu IgG MPLU - IgM Phospholipid Units - µg/ml afinitně purifikované protilátky v izotypu IgM Zdroj: http://www.ukneqas.org.uk/Directory/IMM/enaphos.htm

2/17/2008

< 20 GPLU-MPLU/ml

Negativní

20-40 GPLU-MPLU/ml

Slabě pozitivní

41-60 GPLU-MPLU/ml

Pozitivní

60 > GPLU-MPLU/ml

Silně pozitivní


13

•• Laboratoře Laboratoře vv protokolech protokolech uvádějí uvádějí jak jak naměřené naměřené hodnoty hodnoty vyjádřené vyjádřené vv jednotkách jednotkách doporučovaných doporučovaných výrobcem výrobcem použité použité diagnostické diagnostické soupravy, soupravy, tak tak ii adjustovanou adjustovanou hodnotu hodnotu na na referenční referenční vzorek vzorek (RP (RP 97/656) 97/656) neboli neboli Harrisův Harrisův standard. standard. •• Správnost Správnost výsledků výsledků každé každé individuální individuální laboratoře laboratoře je je hodnocena hodnocena několika několika způsoby. způsoby. Největší Největší vypovídací vypovídací hodnotu hodnotu pro pro praxi praxi má má index index OMIS OMIS (Overall (Overall Misclassification Misclassification Index Index Score). Score). Při Při tolerančním tolerančním rozpětí ±25% rozpětí ±25% udává udává index index OMIS OMIS počet počet nesprávných nesprávných stanovení stanovení laboratoře laboratoře vv určitém určitém časovém časovém úseku; úseku; ideální ideální hodnota hodnota OMIS=0. OMIS=0.

2/17/2008


14

Rozložení Rozložení úspěšnosti úspěšnosti zz hlediska hlediska výrobců výrobců diagnostických diagnostických souprav souprav (cyklus (cyklus 056, 056, prosinec prosinec 2005, 2005, ACLA ACLA IgG IgG)) SD SD –– směrodatná směrodatná odchylka, odchylka, tj. tj. rozptyl rozptyl hodnot hodnot kolem kolem střední střední hodnoty, hodnoty, vypovídající vypovídající oo tom, tom, jak jak moc se od sebe navzájem liší naměřené hodnoty v rámci každé jednotlivé diagnostické metody. moc se od sebe navzájem liší naměřené hodnoty v rámci každé jednotlivé diagnostické metody. Je-li Je-li malá, malá, jsou jsou si si naměřené naměřené hodnoty hodnoty vv souboru souboru většinou většinou navzájem navzájem podobné, podobné, naopak naopak velká velká směrodatná odchylka signalizuje velké vzájemné odlišnosti. směrodatná odchylka signalizuje velké vzájemné odlišnosti. CV CV -- variační variační koeficient, koeficient, tj. tj. míra míra relativního relativního rozptýlení rozptýlení dat, dat, počítá počítá se se jako jako podíl podíl směrodatné směrodatné odchylky k průměru v procentech odchylky k průměru v procentech

n

SD

CV (%)

242

20,6

32,1

Binding Site

9

9,6

21,2

Cheshire Diagnostics

5

13,7

35,9

CLS Autozyme

28

5,7

14,2

Diamedix

10

18,9

19,1

Euroimmun

7

18,5

43,4

Grifols

15

9,3

13,6

ImmunoConcepts

5

31,4

46

in-house ELISA kity

17

13,3

27,1

Inova

16

13,5

25,8

Orgentec

80

12,3

15,8

Pharmacia Upjohn

29

17,4

26,1

Všechny metody

2/17/2008


15

••

Mezilaboratorní Mezilaboratorní (a (a tím tím ii geografické) geografické) rozdíly rozdíly hodnot hodnot koncentrací koncentrací APLA APLA mohou mohou být být způsobeny způsobeny používáním používáním různých různých metodických metodických přístupů přístupů vv analytice, analytice, různým různým přístrojovým přístrojovým vybavením vybavením aa způsobem způsobem tvorby tvorby referenčních referenčních rozsahů. rozsahů.

••

Domníváme Domníváme se, se, že že by by bylo bylo třeba třeba dosáhnout dosáhnout standardizace standardizace těchto těchto faktorů, faktorů, protože protože podstatným podstatným způsobem způsobem ovlivňují ovlivňují hodnoty hodnoty měřených měřených parametrů. parametrů.

••

Provádění Provádění pravidelných pravidelných kontrolních kontrolních postupů postupů zajišťuje zajišťuje nejen nejen požadovanou požadovanou spolehlivost spolehlivost vyšetření, vyšetření, ale ale ii potřebnou potřebnou jistotu jistotu pro pro zaměstnance zaměstnance laboratoře, laboratoře, vyšetřované vyšetřované pacienty pacienty aa ordinující ordinující lékaře. lékaře.

••

ZZ vlastních externí vlastních zkušeností zkušeností doporučujeme doporučujeme pravidelné pravidelné externí hodnocení kvality systémem objektivního hodnocení hodnocení kvality systémem objektivního hodnocení laboratorních laboratorních výsledků výsledků externí externí nezávislou nezávislou organizací organizací kk tomu tomu pověřenou. pověřenou. Cílem Cílem je je dosáhnout dosáhnout srovnatelnosti srovnatelnosti výsledků výsledků vyšetření vyšetření APLA APLA mezi mezi jednotlivými jednotlivými pracovišti pracovišti vv národním národním ii mezinárodním mezinárodním měřítku. měřítku.

2/17/2008


16

Děkuji za pozornost.

Práce byla podpořena Výzkumným záměrem MŠMT ČR MSM0021620807.

2/17/2008


17

Několik poznámek k laboratornímu vyšetřování antifosfolipidových protilátek

Recommend Documents