NIEUW OPKOMENDE MARIENE TOXINEN rapport van het seminarie 2012

NIEUW OPKOMENDE MARIENE TOXINEN – rapport van het seminarie 2012 Mirjana Andjelkovic

Mariene biotoxinen (ook bekend als fycotoxinen) worden geproduceerd door bepaalde soorten fytoplankton (diatomeeën en dinoflagellaten) en kunnen zich opstapelen in verschillende mariene soorten zoals vissen, krabben en filtrerende tweekleppige schaaldieren zoals mosselen, oesters, Sint-Jakobsschelpen en venusschelpen. De toxinen stapelen zich in schaaldieren hoofdzakelijk op in de spijsverteringsorganen zonder nadelige effecten voor de schaaldieren zelf. Wanneer mensen echter aanzienlijke hoeveelheden verontreinigde schaaldieren eten kan dat wel een ernstige vergiftiging veroorzaken. Per jaar komen zo’n 60 000 menselijke besmettingen met een gemiddelde mortaliteit van 1,5% voor die gerelateerd zijn aan door algen geproduceerde toxinen (inclusief toxinen van zoetwatercyanobacteriën) (1). Dat is zowel een probleem voor de volksgezondheid als een economisch probleem. De noodzaak om bijzonder gevoelige plaatsen geregeld te monitoren heeft een aanzienlijke economische weerslag. Als die plaatsen bovendien tijdens de oogst moeten worden gesloten kan de opbrengst in dat jaar en in het jaar daarop in het gedrang komen. Als verontreinigde producten toch op de markt worden gebracht en sterfte of ziekte veroorzaken, moeten de consumenten daarvoor worden vergoed. In Europa bestaat thans een regelgeving voor vijf groepen van toxinen : ‘amnesic shellfish poisoning’ toxinen, ‘paralytic shellfish poisoning’ toxinen, okadazuur- en pectenotoxinegroep, azaspiracidegroep en yessotoxinegroep (EG/853/2004). Een andere groep, de ‘neurotic shellfish poisoning’ toxinen (met o.a. brevetoxine) is gereglementeerd in de VS, Nieuw-Zeeland en Australië. Deze toxinen worden geregeld geproduceerd in de Golf van Mexico, vooral in de kustgebieden van Zuidwest-Florida. Jarenlang werden gereglementeerde toxines opgespoord bij middel van bioassays. Recent werden pogingen ondernomen om HPLC, en in het bijzonder LC-MS te doen aanvaarden als referentiemethoden omdat die internationaal steeds vaker worden gebruikt en op grond van hun hoge gevoeligheid. De toepassing ervan in zowel onderzoek als routinecontroles leidde tot de ontdekking van nieuwe mariene toxinen en analogen. Die worden beschouwd als ‘nieuw opkomende mariene toxines’. Zij zijn niet opgenomen in de Europese wetgeving, noch in de wetgevingen van andere regio’s in de wereld. Toch zijn wetenschappers en wetgevers zich bewust van het bestaan van deze toxinen maar zij beschikken over onvoldoende informatie om: 1. inzicht te krijgen in het werkingsmechanisme van alle onbekende toxinen; 2. de toxiciteit voor mensen in te schatten; 3. het risico voor mensen te beoordelen. Nieuw opkomende mariene toxinen werden voornamelijk gecontroleerd in schaaldieren. Landen als Frankrijk, Italië, Spanje en Noorwegen melden vooral palytoxinen (PlTX, ostreocine-D, ovatoxine-A, homopalytoxine, bishomopalytoxine, neopalytoxine, deopalytoxine en 42-hydroxypalytoxine) en cyclische iminen (spiroliden (SPXs), gymnodiminen (GYMs), pinnatoxinen (PnTXs) en pteriatoxinen (PtTXs)). De gemelde toxinegehalten variëren van 2-585 ng/g (2) tot 11–7950 ng/g (3) voor enkele cyclische iminen in respectievelijk uit Frankrijk en Italië afkomstige schaaldieren terwijl voor Spaanse mosselen waarden werden gerapporteerd van 13 tot 20 ng/g (4). Hypothetische palytoxine werd voor het eerst gevonden in Italiaanse wateren in een hoeveelheid van 1,350 ng in een planktonstaal en 1,950 ng in een butanolextract. Naar aanleiding daarvan werd verondersteld dat dit toxine de oorzaak was van een uitbraak van ademhalingsziekten bij mensen na blootstelling aan mariene aërosols in Genua

30

(2005). Daarom houden sommige van die toxinen niet alleen een risico in voor consumenten maar kunnen zij ook worden beschouwd als een milieugerelateerd probleem voor de volksgezondheid in het algemeen. De toxinen van de groep van cyclische iminen werden geïdentificeerd als nicotinereceptorblokkers en staan bekend als snel werkende toxinen. PlTX is een van de meest toxische bekende niet-peptide stoffen en vertoont zelfs bij zeer lage concentraties een opmerkelijke biologische activiteit. Dit toxine en de analogen ervan zijn wereldwijd een probleem geworden vanwege de toxische effecten die zij hebben op dieren en in het bijzonder op mensen. Er zijn anderzijds meer meldingen van vergiftigingen door met ciguatera verontreinigde vis waarbij vaak doden vallen. Ciguateravergiftiging wordt veroorzaakt door consumptie van met ciguatoxine of daaraan verwante toxinen uit dinoflagellaten (microalgen) en cyanobacteriën verontreinigde koraalvissen. Deze vorm van vergiftiging is een reeds lang bekende tropische en subtropische ziekte maar door de toenemende incidentie ervan is het een wereldwijd probleem geworden. Anderzijds is het door de steeds betere analysetechnieken mogelijk om te voldoen aan de vereiste om de vergiftiging beter te kennen en te bestrijden. Tijdens het onlangs in Vigo (Spanje) gehouden tweedaagse seminarie over “nieuw opkomende mariene toxinen” hebben de experten deze groep van toxinen besproken. De bijeenkomst vond plaats in de nieuwe site van het Europese referentielaboratorium die daarmee officieel werd geopend. De lezingensessie werd geopend met een uiteenzetting van prof. dr T. Yasumoto, een vooraanstaande figuur in het onderzoek naar mariene toxinen. Zijn onderzoeksgroep in Tokio verzamelt momenteel gegevens en maakt een databank aan van alle vissoorten die gerelateerd zijn aan ciguateravisvergiftiging in de Pacifische wateren. De toxinen worden daarbij geëxtraheerd en de groep werkt aan de productie van referentiemateriaal dat het mogelijk zou maken om de toxinen op te sporen. Het materiaal zal reeds dit jaar beschikbaar zijn voor een beperkt aantal laboratoria. Het besluit van professor Yasumoto is dat ciguatoxinen regio- en vissoortspecifiek zijn, maar dat de variatie binnen de soorten klein is. Hoewel sommige analogen zoals CTX1B-type toxinen dominant zijn in Okinawa (in het zuiden van Japan), is het CTX3C-type meer aanwezig in Miyazaki (in het zuidwesten) en in vissen van het Marcuseiland komen beide types voor. Deze toxinen worden ook steeds meer in het noorden van Japan teruggevonden. Het lab voert alle chemische analysen (LC-MS/MS) van het materiaal uit met hoge gevoeligheid. De ernst van het probleem met ciguateratoxinen op de Canarische eilanden werd verder besproken tijdens een rondetafelgesprek. Madeira (Portugal) werd ook aangewezen als een probleemgebied voor deze toxinen. Maar ook andere landen hebben ermee te kampen als gevolg van de invoer of het vervoer van tijdens het sportvissen in de Caraïben gevangen vis. Sinds 2004 doen zich episoden van ciguateratoxinen voor waarbij grote exemplaren van amberjack (Seriola spp) waren betrokken en die ongeveer 70 personen hebben getroffen. Er werd een lijst opgemaakt van de mogelijke oorzaken. Vervuiling en klimaatverandering werden reeds in verband gebracht met toxische algenbloei. Nu zoeken ook de autoriteiten en de wetenschappers van de Canarische eilanden naar verbanden tussen klimaatverandering, de instroom van ballastwater van binnenvarende boten en schepen, mogelijke migratie van Caribische vissoorten en de aanwezigheid van een algensoort (Gambierdiscus excentricus) die normaal niet voorkomt in die wateren. Sinds 2010 zijn deze toxinen opgenomen in het officiële bestrijdingsprogramma voor de regio en werden enkele nieuwe bestrijdingsstrategieën geïntroduceerd. De stalen worden onmiddellijk getest met een immunoassay kit (Ciga-Check) en dan doorgestuurd naar het lab voor bioassay met muizen, cytotoxiciteitstesten en aanvullende bevestiging via LC-MS/MS in het EURL-MB. Het grote nadeel bij dit alles is dat de detectiemethode niet gevoelig genoeg is. Om het resultaat te verbeteren zou een norm moeten worden ontwikkeld en een interlaboratoriumvalidatiestudie moeten worden opgezet. Er werd op gewezen dat deze studies het algemeen belang dienen en het onderwerp zouden moeten zijn van toekomstige onderzoekingen in een groot aantal Europese landen. De volgende groep van toxinen die werden besproken waren de palytoxinen. Prof. dr Aurelia Tubaro van de

31

universiteit van Triëste deelde daarover enkele inzichten. Zij doet uitvoerig onderzoek naar de toxiciteit van palytoxinen. Onderzoek op muizen en op celkweken verschaften haar kennis over de dosis van deze zeer toxische verbindingen. Reeds vanaf een dosis van 30 µg/kg treedt er functiebeperking op van de skelet- en de hartspieren. Toch wees prof. Tubaro erop dat de kennis rond farmacokinetica, herhaalde orale toxiciteit (basis voor NOAEL) zowel als de evaluatie van de cardiotoxiciteit van palytoxinen (maar ook van ovatoxinen) nog steeds schaars is. Het is gepast om hier de symptomen van intoxicatie met die verbindingen te vermelden. Proefdieren vertoonden gedrag zoals krabben, springen, ademnood en verlamming. Als het dier herstelde, ging dat gewoonlijk gepaard met gewichtsverlies. Palytoxinen werden tijdens het seminarie enkele keren vermeld vanwege hun toxiciteit en de pseudoallergische reactie die zij kunnen veroorzaken bij mensen die er in het lab mee werken of bij toeristen in en bewoners van het gebied met algenbloei. Volgens sommige hypothesen kunnen ook andere componenten, zoals sommige vluchtige verbindingen die worden vrijgegeven door microalgen (Ostreopsis) deze reacties veroorzaken. De Noord-Europese landen krijgen ook steeds meer te maken met toxinen waarvan de aanwezigheid vroeger alleen bekend was in warmere wateren. Sinds 2009 rapporteert Noorwegen de aanwezigheid van door Alexandrium ostendfeldi aangemaakte spiroliden en door Vulcanodinium rugosum aangemaakte pinnatoxinen. Er werd bewezen dat laatstgenoemde toxinen ook een aantal verwanten hebben, waaronder twee die worden aangemaakt in algen (PnTx F en G) en andere die het resultaat zijn van de metabolische hydrolyse van die twee toxinen in schaaldieren. Pinnatoxinen worden in kleine hoeveelheden aangetroffen langs de hele Noorse kust met slechts één ‘hot spot’ waar de toxineconcentratie groter kan zijn. Dr. Chris Miles (Norwegian Veterinary Institute) stelde de acties en de doelstellingen voor die Noorwegen heeft vastgelegd om die problemen aan te pakken. Volgens hem bestaat reeds enkele jaren een monitoringprogramma voor die toxinen. Schaaldieren en andere soorten (mosselen, oesters, Sint-Jakobsschelpen, kokkels, paardenmosselen, zeeslakken, krabben en zeewormen) worden gecontroleerd bij middel van SPATT disks. De autoriteiten tonen veel interesse in het ontrafelen van het ‘hot spot-locatiepatroon’ om een antwoord te geven op de vraag waarom die toxinen het hele jaar door aanwezig zijn en om het organisme of de groep van organismen te typeren die verantwoordelijk zijn voor dit “subtropisch voorkomen” in noordelijke wateren. Dr. P. Hess vermeldde op gelijkaardige wijze dat het hele jaar door lage concentraties van pinnatoxinen (PnTx G ongeveer 100 mg/kg) voorkomen in bepaalde gebieden in Frankrijk, namelijk in warme lagunes. De situatie wordt gevolgd via een officieel controleprogramma en een wetenschappelijk project in samenwerking met een instituut in Nieuw-Zeeland. Hoewel er geen meldingen zijn van door SPXs, GYMs, PnTXs of PtTXs veroorzaakte ziektegevallen bij mensen werden wel een aantal losstaande gevallen waarbij aspecifieke symptomen optraden zoals maag- en buikpijn en tachycardie gemeld in Nova Scotia (Canada). Het ging om mensen die schelpdieren hadden gegeten tijdens de periode waarin SPXs aanwezig waren in de wateren. De symptomen konden echter niet met zekerheid aan SPXs worden toegeschreven omdat zij niet overeenstemden met de toxiciteitsymptomen bij muizen. Deze toxinen worden beschouwd als zeer toxisch met een LD50 van 10 µg/g. Cyclische iminen kunnen worden geanalyseerd met bio-analytische en fysisch-chemische methoden om de werkingsmechanismen te beschrijven, zoals werd uiteengezet door dr. R. Araoz (Nationaal onderzoekscentrum, Frankrijk). Zij werken in op de nicotine-acetylcholine receptoren die in de hersenen aanwezig kunnen zijn. Achteruitgang, verstoring of veranderingen in de nicotine-cholinerge mechanismen kunnen een rol spelen in bepaalde stoornissen zoals epilepsie, schizofrenie, ziekte van Parkinson, autisme, dementie, ziekte van Alzheimer en verslaving. De neurotoxische doses van PnTx en SPX zijn vergelijkbaar met die van ‘paralytic shellfish poisoning (PSP)’ toxinen. Aangezien die toxinen niet gereglementeerd en minder bekend zijn hebben wij alle mogelijke informatie nodig en zouden functionele methoden veel vragen kunnen beantwoorden. Om het gebrek aan gevoeligheid van bijvoorbeeld de receptorbindingstest weg te werken zouden die methoden echter moeten worden gekoppeld aan MS.

32

De manier waarop men omgaat met nieuw opkomende toxinen kan worden uitgelegd als een “hedendaagse aanpak” (dr. J.Diogene, IRTA). De klassieke aanpak van toxinen is gebaseerd op toxische episodes en ervaring die de wetenschapper heeft opgedaan terwijl de hedendaagse aanpak ligt in het verwerven van inzicht in de bron van de toxinen, de vectoren van intoxicaties, de structuur en de risicobeoordeling van mogelijke nieuwe gevallen. Wij maken daartoe onderscheid tussen bekende en “klassieke” toxinen die wel of niet gereglementeerd zijn, tussen lokale en buitenlandse toxinen en tussen toxinen met een geïdentificeerde bron en die met onbekende bron. Als besluit kan worden gesteld dat tot nu toe geen lijst van nieuw opkomende toxinen bestaat. Dat is deels te wijten aan de interpretatie van “nieuw opkomend” in de lokale context. Er werd hoe dan ook veel gepraat over palytoxinen, ovatoxinen, brevetoxinen, cyclische iminen (gymnodiminen, pinnatoxinen, pteriatoxinen en spiroliden), azaspiraciden en ciguatoxinen. Er is nood aan een systematische identificatie van toxinen en de vectoren ervan. De overgang van de klassieke aanpak naar de “hedendaagse aanpak” wordt mogelijk gemaakt door de vooruitgang op technisch vlak en door een grotere sensibilisering bij het uitvoeren van het monitoringprogramma. Tot slot, kwamen de deelnemers aan het einde van het symposium en de vergadering van een rond nieuw opkomende toxinen opgerichte werkgroep tot de conclusie dat gezamenlijke inspanningen zouden kunnen worden geleverd met het oog op de validatie van een detectiemethode voor ciguateratoxinen in het kader van een internationale validatiestudie. Er zou daarbij ook onderzoek moeten worden gedaan naar referentiematerialen en de vlottere beschikbaarheid daarvan.

Mirjana Andjelkovic, WIV-ISP Brussels [email protected]

Referenties 1. 2. 3. 4.

Lina Kantiani & Marta Llorca & Josep Sanchís & Marinella Farré & Damià Barceló. Emerging food contaminants: a review; Anal Bioanal Chem (2010). 398:2413–2427) Amzil Z, Sibat M, Royer F, Masson N, Abadie E. Report on the First Detection of Pectenotoxin-2, Spirolide-A and Their Derivatives in French Shellfish (2007) Marine Drugs 5:168–179 Ciminiello P, Dell’Aversano C, Fattorusso E, Forino M, Tartaglione L, Boschetti L, Rubini S, Cangini M, Pigozzi S, Poletti R. Complex toxin profile of Mytilus galloprovincialis from the Adriatic sea revealed by LC–MS (2010) Toxicon 55:280–288 González AV, Rodríguez-Velasco ML, Ben-Gigirey B, Botana LM. First evidence of spirolides in Spanish shellfish (2006) Toxicon 48:1068–1074

33

34