Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk prostaty a tlustého střeva

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk prostaty a tlustého střeva

BRNO 2007

Zuzana Pernicová

Poděkování Děkuji svému školiteli Mgr. Karlu Součkovi, PhD. za všestrannou pomoc, rady a čas, který mi věnoval při zpracování této bakalářské práce. Dále děkuji doc. RNDr. A. Kozubíkovi, CSc. a doc. RNDr. J. Hofmanové, CSc. za vytvoření kvalitních pracovních podmínek a všem členům Oddělení cytokinetiky Biofyzikálního ústavu AV ČR, v.v.i. za pomoc a vstřícný přístup.

2

Seznam použitých zkratek Akt (PKB/Akt) - proteinová kináza B AR - androgenní receptor Bcl-2 - proapoptotický protein, produkt lidského protoonkogenu BCL-2 (translokovaný lokus leukemických B- buněk, B-cell leukemia/lymphoma) BHP - benigní hyperplazie prostaty CAE - karcinoembryonální antigen CgA - chromogranin A CS - „charcoal stripped“ sérum FBS - fetální bovinní sérum HNPCC - dědičná nepolypózní rakovina tlustého střeva a konečníku (hereditary non-polyposis colorectal cancer) IL-6 - interleukin-6 IL-6R - receptor pro interleukin-6 Jak - Janusovy kinázy MAPK - mitogen aktivující proteinová kináza NSE - neuron-specifická enoláza PI3K – fosfatidylinositol-3 kináza PSA - prostatický specifický antigen STAT3 - signal transducer and activator of transcription 3 TA buňky - přechodně se dělící prekurzorové buňky

3

Obsah Úvod ................................................................................................................................................6 1. Rakovina prostaty a tlustého střeva ........................................................................................7 1.1. Rakovina prostaty.................................................................................................................7 1.1.1. Incidence onemocnění ...................................................................................................7 1.1.2. Stavba prostatické žlázy ................................................................................................7 1.1.3. Diagnostika a léčba karcinomu prostaty......................................................................10 1.2. Rakovina tlustého střeva.....................................................................................................13 1.2.1. Incidence onemocnění .................................................................................................13 1.2.2. Stavba tlustého střeva ..................................................................................................13 1.2.3. Diagnostika a léčba nádoru tlustého střeva .................................................................15 2. Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk prostaty a tlustého střeva...................17 2.1. Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk prostaty................................................17 2.1.1. Neuroendokrinní buňky...............................................................................................17 2.1.2. Vliv hormonální terapie na neuroendokrinní diferenciaci...........................................19 2.1.3. Interleukin-6 a jeho vliv na neuroendokrinní diferenciaci ..........................................21 2.2. Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk tlustého střeva .....................................22 2.3. Markery neuroendokrinní diferenciace ..............................................................................23 2.3.1. Markery neuroendokrinní diferenciace rakoviny prostaty ..........................................23 2.3.2. Markery neuroendokrinní diferenciace rakoviny tlustého střeva................................26 2.3.3. Další možné markery neuroendokrinní diferenciace...................................................26 3. Technologie microarray - principy a aplikace v nádorové diagnostice a výzkumu ..........29 3.1. Technologie microarray......................................................................................................29 3.2. Databáze Oncomine............................................................................................................31 4. Materiál a metody....................................................................................................................34 4.1. Analýza dat z databáze Oncomine......................................................................................34 4.2. Detekce vybraných markerů neuroendokrinní diferenciace u in vitro kultivované buněčné linie LNCaP .......................................................................................................................35 4.2.1. Kultivace buněčné linie LNCaP in vitro .....................................................................35 4.2.2. Fixace a barvení buněk propidium jodidem pro účely měření buněčného cyklu........35 4.2.3. Příprava proteinových extraktů ...................................................................................36 4.2.4. Metoda „western blot“.................................................................................................36

4

5. Výsledky ...................................................................................................................................38 5.1. Analýza výsledků exprese vybraných markerů neuroendokrinní diferenciace z databáze Oncomine ..........................................................................................................................38 5.2. Exprese vybraných markerů neuroendokrinní diferenciace u buněčné linie LNCaP kultivované in vitro............................................................................................................42 Závěr .............................................................................................................................................46 Literatura .....................................................................................................................................48

5

Úvod Rakovina prostaty a tlustého střeva patří mezi onemocnění s vysokou incidencí nejen v České republice, ale také ve vyspělých zemích světa. V České republice jsou tato onemocnění jedněmi z nejčastějších příčin úmrtí na rakovinu. Z hlediska rozvoje nádorového onemocnění prostaty je důležité poznat a porozumět procesům, které mohou ovlivňovat mikroprostředí nádoru. Jedním z nich je proces neuroendokrinní diferenciace, kdy neuroendokrinní buňky, které jsou přítomné jak v normální, tak v rakovinné tkáni, mohou ovlivňovat okolní epiteliální buňky a měnit jejich fenotyp. U rakoviny prostaty dochází v důsledku tohoto procesu ke změně reakce nádorových buněk na běžně aplikovanou hormonální léčbu. Ta je v těchto případech méně účinná, dochází k progresi rakovinného onemocnění a tvorbě metastáz. Neuroendokrinní diferenciace u nádoru tlustého střeva není tak popsána a je proto nutné hlubší poznání tohoto procesu. Z hlediska možnosti vyléčení je u rakovinného onemocnění důležitá včasná diagnóza. V současné době se stále věnuje velké úsilí nalezení nových znaků neuroendokrinní diferenciace, jejichž přítomnost v rakovinné tkáni by mohla mít spojitost s rozvojem nádoru. Jak u rakoviny prostaty, tak u rakoviny tlustého střeva již existuje několik faktorů, které je možné sledovat, jsou však užívány zejména v oblasti výzkumu. K tomuto účelu je využívána také technologie microarray, která umožňuje analýzu exprese velkého množství genů v rámci jednoho experimentu. Cílem této bakalářské práce je shrnout dosavadní poznatky o procesu neuroendokrinní diferenciace u nádorových buněk prostaty a tlustého střeva. První část práce se zabývá charakteristikou rakovinného onemocnění prostaty a tlustého střeva a možnou funkcí kmenových buněk ve vzniku těchto onemocnění. Další část popisuje proces neuroendokrinní diferenciace a některé její v současné době známé markery. Je zde naznačena možná úloha neuroendokrinních buněk, mužských pohlavních hormonů androgenů a prozánětlivého cytokinu interleukinu-6 v rozvoji nádorového onemocnění. Třetí část pojednává o technologii microarray a jejím využití při studiu nádorových onemocnění. Součástí práce je i praktická část, jejímž cílem bylo ustanovit model neuroendokrinní diferenciace u in vitro kultivované buněčné linie LNCaP. Dále byla provedena analýza exprese vybraných genů z veřejně dostupné databáze Oncomine sdružující data ze studií zabývajících se analýzou transkriptomu a jeho rozdíly mezi nenádorovou a nádorovou tkání.

6

1. Rakovina prostaty a tlustého střeva 1.1. Rakovina prostaty 1.1.1. Incidence onemocnění Rakovina prostaty je jednou z nejčastějších příčin úmrtí mužů v řadě vyspělých zemí světa. V současné době je rakovina prostaty v České republice na druhém místě ve výskytu všech nádorových onemocnění u mužů a třetí nejčastější příčinou úmrtí na zhoubné novotvary. V období mezi lety 1990 až 2001 došlo ke zvýšení incidence tohoto onemocnění téměř o 100 % (Obr. 1) (Dušek et al., 2005). Incidence rakoviny prostaty není vysoká jen v České republice, ale také v jiných zemích. Například ve Spojených Státech Amerických je rakovina prostaty nejčastějším maligním onemocněním kromě rakoviny kůže a druhou nejčastější příčinou úmrtí na nádorové onemocnění (Delongchamps et al., 2006). I když incidence stoupá, počet případů úmrtí na toto onemocnění zejména díky včasné diagnóze stagnuje nebo částečně klesá. Výskyt rakoviny prostaty je spojen s věkem, počet případů stoupá exponenciálně u mužů starších padesáti let (Dušek et al., 2005). Dalšími faktory, které mohou ovlivnit výskyt tohoto onemocnění, jsou dědičnost nebo rasa. U afroameričanů je pravděpodobnost vzniku onemocnění o 50 % vyšší než u bělochů stejného věku (Delongchamps et al., 2006). Důležitý je také možný vliv životního stylu, především kouření, zaměstnání a stravy na rozvoj onemocnění. Riziko onemocnění může zvyšovat vysoký příjem živočišných tuků a červeného masa, zatímco dostatek ovoce, zeleniny a antioxidantů, jako je vitamin E nebo selen může riziko snižovat (Nelson et al., 2003). Zvýšená hladina prozánětlivých cytokinů korelující s rozvojem onemocnění (např. Interleukin-6) a předpokládaný prozánětlivý mechanismus účinku některých chemopreventivních látek ukazují, že zánět má klíčovou úlohu ve vzniku a rozvoji nádorového onemocnění prostaty (De Marzo et al., 2007). V následujících podkapitolách bude popsána stavba prostatické tkáně a možná úloha kmenových buněk ve vzniku rakoviny prostaty. Dále budou zmíněny používané diagnostické přístupy k odhalení rakovinného onemocnění a možné způsoby léčby.

1.1.2. Stavba prostatické žlázy Prostata neboli předstojná žláza je největší přídatnou pohlavní mužskou žlázou. Je umístěna na spodní straně močového měchýře, mezi stydkou kostí a konečníkem a prochází jí močová trubice. Skládá se ze třiceti až padesáti prostatických žlázek a vazivově-svalového stromatu. Žlázky obklopují močovou trubici a vylučují do ní sekret, který obsahuje například kyselou fosfatázu nebo prostatický specifický antigen (PSA), látky důležité pro aktivitu spermií. Tyto 7

látky mohou také prostupovat do krve, proto dá jejich hladina relativně snadno monitorovat a používat v klinické diagnostice. Sekret svou alkalickou reakcí neutralizuje kyselou reakci v močové trubici a zvyšuje tak životnost a pohyblivost spermií. Vazivově-svalové stroma je tvořeno hustě propletenými svazky kolagenních vláken a snopečků hladkých svalových buněk. Na povrchu žlázy se stroma zhušťuje a vytváří vazivové pouzdro. Stavba prostatické žlázy je znázorněna na obr. 2.

Obr. 1. Incidence a mortalita karcinomu prostaty v ČR v letech 1977–2003 (Dušek et al., 2005). V normálním žlaznatém prostatickém epitelu je přítomno pět buněčných typů: kmenové buňky, přechodně se dělící prekurzorové buňky (TA buňky, transit-amplifying cells), neuroendokrinní buňky, bazální epiteliální buňky a sekreční luminální buňky (Lam a Reiter, 2006). Nejvíce zastoupené jsou zde sekreční luminální buňky, které jsou terminálně diferencované, nesou androgenní receptor, produkují PSA a jsou závislé na androgenech (Liu et al., 1997; Schalken a Van Leenders, 2003). Bazální buňky exprimují androgenní receptor na úrovni mediátorové RNA (mRNA) a v malém množství na úrovni proteinu, ale neprodukují PSA (Lam a Reiter, 2006). Neuroendokrinní buňky jsou terminálně diferencované, neexprimují androgenní receptor a neprodukují PSA (Huang et al., 2006). Populace TA buněk slouží jako prostředník mezi nediferencovanými kmenovými buňkami bazální vrstvy a vysoce diferencovanými exokrinními a neuroendokrinními buňkami lumenu (Isaacs a Coffey, 1989). Tyto TA pocházejí z kmenových buněk a jsou citlivé na přítomnost androgenů, nejsou však na nich závislé. Jednotlivé buněčné typy nesou charakteristické znaky (markery), na jejichž základě mohou být rozlišeny a také může být sledován jejich původ (Rizzo et al., 2005) (Obr. 3). 8

Obr. 2. Stavba prostatické žlázy (Collins a Maitland, 2006, upraveno). Na základě popisných imunohistochemických studií bylo postulováno, že rakovinné buňky prostaty pochází zejména z transformovaných sekrečních luminálních buněk, protože běžně exprimují především keratiny 8 a 18 a také PSA (Obr. 3). Poslední poznatky naznačují, že v rozvoji rakovinného onemocnění prostaty mohou být důležité rakovinné kmenové buňky. Rakovinné kmenové buňky, které mají schopnost samoobnovy, tvoří minoritní populaci nádorových buněk (Lam a Reiter, 2006). Původ těchto buněk je zatím nejasný, ale zřejmě jsou odvozeny buď z normálních kmenových buněk, nebo z progenitorových buněk, které získaly schopnost samoobnovy jako výsledek onkogenních mutací. Rakovinné kmenové buňky se významně liší od zdravých kmenových buněk zejména ztrátou kontroly sebeobnovy a asymetrického dělení. To se může projevit tím, že jsou na úrovni jedné buňky schopny dát vzniknout novým nádorům (Tang et al., 2007). Pro studium jejich úlohy v rakovinném onemocnění je nutné vyvinout metodiky, které umožňují jejich izolaci nebo spíše izolaci buněk obohacených o populaci rakovinných kmenových buněk. Rakovinné kmenové buňky byly izolovány pomocí průtokové cytometrie na základě exprese některých povrchových molekul, které nesou normální kmenové buňky, jako je molekula CD44. Na základě její exprese byly rakovinné kmenové buňky izolovány z myších xenograftů. Na základě exprese povrchové molekuly CD133 byla izolována populace buněk obohacených o rakovinné kmenové buňky ze vzorků lidské rakovinné tkáně prostaty. Bylo popsáno, že lidské kmenové buňky prostaty mohou za podmínek kultivace se stromálními buňkami tvořit tzv. epiteliální sferoidy. Toho se využívá ke sledování možnosti samoobnovy kmenových buněk prostaty, jak bylo například ukázáno na

9

myším modelu (Lawson et al., 2007). Tato metoda může být využita i pro izolaci rakovinných kmenových buněk. Objasnění role kmenových a rakovinných kmenových buněk v rozvoji nádorového onemocnění může vést ke zlepšení léčby onemocnění. Rakovinné kmenové buňky nemají androgenní receptor a neodpovídají tedy na běžnou hormonální léčbu (Tang et al., 2007). Předpokládá se, že rakovinné kmenové buňky přežívají v organismu běžné terapeutické zásahy a mohou být tím buněčným typem, který umožňuje vznik vzdálených metastáz. Proto by terapie cílená proti těmto buňkám mohla v kombinaci s hormonální léčbou vést k úspěšnější léčbě.

1.1.3. Diagnostika a léčba karcinomu prostaty Časná diagnostika nádorového onemocnění prostaty je důležitým faktorem ovlivňujícím možnost vyléčení. Proto mají podstatný význam preventivní prohlídky zejména u mužů starších čtyřiceti let, i když nemají žádné zjevné obtíže. Nejčastěji prováděným vyšetřením napomáhajícím včasné diagnóze je sledování hladiny PSA v krvi. Zvýšená hladina tohoto antigenu u mužů starších padesáti let může signalizovat onemocnění prostaty. V pokročilejších stádiích lze karcinom prostaty diagnostikovat digitálním rektálním vyšetřením a odběrem tkáně k histologickému vyšetření. PSA je glykoprotein produkovaný téměř výhradně epiteliálními buňkami prostaty. Vyšší sérová hladina PSA může být způsobena benigním zvětšením prostaty (benigní hyperplazie, BHP), což je nejčastější nezhoubný novotvar postihující zejména starší muže, dále může být hladina PSA ovlivněna zánětem (prostatitida) nebo přítomností karcinomu prostaty (Študent et al., 2006). Fyziologické hodnoty PSA se pohybují v rozmezí 0-4 ng/ml. U hodnot PSA mezi 410 ng/ml je prediktivní hodnota karcinomu prostaty asi 25-35 %, u hodnot PSA nad 10 ng/ml je to 50-80 % (Herber et al., 2005). K lepšímu rozlišení mezi benigním onemocněním a karcinomem prostaty zejména v rozmezí hodnot PSA 4-10 ng/ml mohou pomoci modifikace měření PSA. Příkladem je sledování poměru volného množství PSA k celkovému množství PSA (fPSA/tPSA) (Tanguay et al., 2002) nebo sledování absolutní rychlosti změny množství PSA v čase, nejčastěji v průběhu jednoho roku (PSAV, PSA-velocity). V neposlední řadě je nutno naměřené hodnoty srovnávat s průměrem ve věkové skupině pacienta, neboť starší muži mají obvykle větší prostatu a tím i vyšší hladinu PSA (Herber et al., 2005). PSA je nejstarším a nejčastěji klinicky používaným serologickým markerem nádorového onemocnění prostaty. Na základě novějších studií se ukazuje, že výpovědní hodnota stanovení samotné hladiny PSA je méně přesná, a je problematické stanovit hranici, jejíž překročení ukazuje na přítomnost karcinomu prostaty (Študent et al., 2006). 10

Vyšetření samotné prostaty je prováděno v rámci urologického vyšetření ultrazvukem. V případě podezření na rakovinné onemocnění je provedena biopsie, při níž je odebraný vzorek histopatologicky zkoumán. Zde se stanovuje hodnota tzv. Gleasonova skóre. Ta udává typ nádoru a jeho biologickou agresivitu. Gleasonovo skóre je systém rozdělující prostatickou rakovinnou tkáň do jednotlivých stupňů na základě mikroskopického vyšetření tkáně a její architektury. Pokud je ve vzorku odebraném biopsií zjištěna přítomnost rakovinných buněk, je Gleasonovo skóre založeno na ohodnocení toho, nakolik je daný vzorek tkáně svou architekturou odlišný od normální architektury žlaznatého epitelu (ƠDowd et al., 2001). Celkem se při tomto hodnocení rozlišuje pět stupňů nádoru. Tyto stupně byly stanoveny v 60. letech patologem Donaldem F. Gleasonem. Gleasonovo skóre je potom součtem primárního stupně, který je nejvíce přítomen v tkáni a sekundárního stupně, který je v tkáni přítomen v menší míře. Rozsah stupnice Gleasonova skóre je od 2 do 10. Čím vyšší je skóre, tím je tumor agresivnější a prognóza pacienta horší (Humphrey, 2004). Mezinárodním standardem při hodnocení stádia adenokarcinomu prostaty je tzv. TNM klasifikace. Zjednodušeně řečeno, v tomto případě číselná hodnota u písmene T charakterizuje rozšíření primárního tumoru (X-nelze posoudit, 0-4), N se vztahuje k zasažení mízních uzlin (X, 0, 1) a M se týká výskytu vzdálených metastáz (X, 0, 1) (Herben et al., 2005). Lokalizovaný nádor prostaty může být úspěšně léčen radikální prostatektomií. Tato operace zahrnuje odebrání celé prostatické žlázy a okolní tkáně. Mohou být odebrány i v blízkosti ležící lymfatické uzliny na vyšetření možných metastáz (http://www.prostate-cancer-institute.org). Tento způsob léčby bývá v počátečním stadiu rakoviny úspěšný. Dalším možným způsobem léčby lokalizovaného nádoru je ozařování nebo chemoterapie. Používanou léčbou zejména u pokročilejších stadií onemocnění, kdy jsou přítomny metastázy, je použití hormonální terapie. O tomto způsobu léčby a jejím vlivu na další rozvoj rakovinného onemocnění prostaty nezávislého na přítomnosti androgenů bude pojednáno v dalších kapitolách.

11

Obr. 3. Exprese vybraných markerů diferenciace v normálním a nádorovém epitelu prostaty (Rizzo et al., 2005, upraveno). Kmenové buňky v nenádorové i nádorové tkáni mají stejný bazální fenotyp, exprimují CD133, β1 integrin a keratiny K5 a K14. Tyto buňky dávají vzniknout přechodně se dělícím prekurozorovým buňkám (transit-amplyfiing cells, TA buňky), populaci, která také exprimuje integrin, ale už ne CD133. Normální TA buňky se diferencují do luminálních buněk s přechodnou expresí K19, dokud se zcela nediferencují do buněk, které produkují prostatický specifický antigen a exprimují K8, K18 a androgenní receptor (AR). Rakovinné TA buňky ztrácí schopnost exprimovat integriny a diferencují se do sekrečních rakovinných buněk, které tvoří většinu tumoru. Neuroendokrinní buňky pochází z diferenciace normálních buněk a exprimují smíšené markery bazálních a luminálních keratinů. Navíc vylučují chromogranin A a serotonin. Původ NE buněk u nádorů je nejasný, ale mohou zřejmě pocházet z TA buněk, nebo z více diferencovaných nádorových buněk.

12

1.2. Rakovina tlustého střeva 1.2.1. Incidence onemocnění Rakovina tlustého střeva a konečníku patří mezi často diagnostikovaná onemocnění v České republice, kdy u mužů je nejčastěji diagnostikovaným typem rakoviny a u žen je na druhém místě. Celosvětově patří Česká republika na první místo z hlediska počtu pacientů s tímto typem onemocnění v přepočtu na 100 000 obyvatel. Incidence tohoto onemocnění každým rokem v České republice stoupá (Obr. 4), každý rok je hlášeno přibližně 7800 nových pacientů. U většiny případů není známa příčina vzniku tohoto onemocnění. Obecně je uznávána řada rizikových faktorů, které mohou ovlivnit vznik rakoviny tlustého střeva. Jedním z těchto faktorů je věk. Riziko onemocnění významně stoupá od padesátého roku života (Dušek et al., 2005). Ale jsou známy i případy onemocnění mladších pacientů. Dalšími faktory, které mohou ovlivnit vznik rakoviny tlustého střeva, jsou genetické predispozice. Výskyt onemocnění tlustého střeva, jakým je například dědičná nepolypózní rakovina kolorekta (HNPCC) nebo familiární adenomatózní polypóza, v rodině, může zvyšovat riziko vzniku onemocnění (Fernandez et al., 2004). Mezi onemocnění, která zvyšují riziko rakoviny, patří dále zánětlivá onemocnění tlustého střeva jako například ulcerózní kolitida a Crohnova choroba. Důležitý je také životní styl a způsob stravování. Konzumace červeného masa a masa tepelně upravovaného například smažením, uzením nebo pečením je spojena se zvýšením rizika onemocnění (Norat et al., 2005). Naopak vyšší konzumace ryb a vlákniny riziko onemocnění snižuje. Geneticky je rakovina kolorekta výsledkem progresivní transformace epiteliálních buněk tlustého střeva především kvůli nahromadění mutací v mnoha onkogenech a tumor supresorových genech (Fearon a Vogelstein, 1990). V dalších podkapitolách bude popsána stavba tlustého střeva, především stavba krypty tlustého střeva, možný vliv kmenových buněk na vznik onemocnění a dále možnosti diagnostiky a léčby tohoto onemocnění.

1.2.2. Stavba tlustého střeva Tlusté střevo člověka měří asi 1,5 metru a je členěné na několik oddílů: slepé střevo s červovitým výběžkem, tračník a konečník. Jeho hlavní funkcí je resorpce vody a elektrolytů, zahušťování nevstřebaných zbytků potravy spolu s trávicími šťávami a jejich odstraňování z těla. Stěna tlustého střeva je tvořena několika vrstvami. Sliznice střeva je hladká a méně členěná, je tvořena jednovrstevným cylindrickým epitelem a v ní se nacházejí četné žlázy, Lieberkühnovy krypty a lymfatické uzlíky. Další vrstvou je podslizniční vazivo, které spojuje sliznici pohyblivě

13

se svalovým podkladem. Svalová vrstva je tvořena vnitřní cirkulární a zevní longitudinální vrstvou. Na povrchu je střevo částečně kryto serosou.

Obr. 4. Incidence a mortalita rakoviny tlustého střeva v ČR v letech 1997-2003 (Dušek et al., 2005). Až 95 % nádorů tlustého střeva pochází z epitelu. Epitel tlustého střeva tvoří mnoho vchlípenin neboli krypt. V této rychle se obnovující tkáni je buněčná homeostáza regulována rovnováhou mezi proliferací, diferenciací a apoptózou. Na bázi krypty se nacházejí kmenové buňky. Z pluripotentní kmenové buňky pochází pět diferencovaných buněčných typů, které se ve střevě nacházejí. Jsou to enterocyty, pohárkové buňky, neuroendokrinní buňky, Panethovy buňky a G buňky. Dělící se buňky migrují kryptou, kde tvoří monoklonální populaci epiteliálních buněk (Renehan et al., 2002). Hierarchie kmenových buněk v kryptě tlustého střeva je třístupňová. Kmenová buňka dá nejprve vzniknout přechodně se dělícím prekurzorovým buňkám. Po vyčerpání jejich proliferačního potenciálu tyto buňky vystoupí z buněčného cyklu a dochází k jejich terminální diferenciaci (Obr. 5). Proliferační aktivita epitelu tlustého střeva může mít souvislost s rozvojem zhoubné transformace. U pacientů se zvýšeným rizikem onemocnění byla pozorována jeho zvýšená proliferace, není však jasné, jestli je příčinou rakovinného onemocnění nebo jen reakcí na již přítomný nádor. Na zvýšenou proliferaci má také vliv nárůst počtu kmenových buněk (Wang et al., 2006). Přesná role rakovinných kmenových buněk v rozvoji nádorového onemocnění zatím není objasněna. Existují dvě teorie popisující vznik neoplastických buněk z kmenových buněk. Teorie „zespoda nahoru“ (bottom-up) předpokládá, že nejprve se neoplastické buňky objevují mezi buňkami kmenovými na dně krypty, odkud migrují do vyšších zón. Druhá teorie „shora dolů“ 14

(top-down) říká, že neoplastické buňky se nacházejí jen ve vrchních zónách krypty, zatímco v nižších částech krypty jsou buňky nezměněné (McDonald et al., 2006). Objasnění skutečné role rakovinných kmenových buněk může být velmi užitečné z hlediska cílené terapie proti tomuto onemocnění.

Obr. 5. Lieberkühnova krypta tlustlého střeva: hierarchie proliferace (převzato z www.maths.nottingham.ac.uk , upraveno). Epitel tlustého střeva se obnovuje každých 4 až 6 dnů koordinací procesů proliferace, migrace, diferenciace a apoptózy (anoikis). Na dně krypty je málo početná populace kmenových buněk, které se dělí a produkují přechodně se dělící prekurzorové buňky. Tyto částečně diferencované buňky se několikrát rozdělí, než u nich dojde k terminální diferenciaci. Zároveň přicházejí nové buňky do spodní třetiny krypty, celá populace přechodně se dělících a terminálně diferencovaných buněk migruje směrem ven z krypty, kde se terminálně diferencované buňky odlupují z povrchu. 1.2.3. Diagnostika a léčba nádoru tlustého střeva Z hlediska možnosti vyléčení je u rakoviny tlustého střeva nutné její včasné diagnostikování. Proto je důležité podstupovat především se stoupajícím věkem pravidelná vyšetření. V České republice se provádí pro diagnostiku rakoviny tlustého střeva test okultního krvácení. Toto tzv. screeningové vyšetření by měl pacient podstupovat od padesáti let každé dva roky. V rámci testu na okultní krvácení se sleduje přítomnost krve ve stolici, která může signalizovat přítomnost karcinomu tlustého střeva i v začátcích onemocnění. Tento test zachytí přítomnost karcinomu asi 15

u 17 % případů. Přesnějším vyšetřením je kolonoskopie, kdy je pomocí vizualizační techniky prohlédnuto celé střevo. Léčba karcinomu tlustého střeva závisí na stadiu onemocnění. Primární tumory bývají úspěšně léčeny chirurgickou resekcí. U pokročilejších stadií je často chirurgická operace kombinovaná s léčbou chemoterapií, kdy je podáván například 5-fluorouracil a leucovorin nebo oxaliplatina. Případně může být aplikováno ozařování (Wang et al., 2006).

16

2. Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk prostaty a tlustého střeva 2.1. Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk prostaty Mikroprostředí nádoru může být ovlivněno celou řadou faktorů, které jsou produkovány okolními nádorovými buňkami i normální tkání. Důležitou úlohu v ovlivnění tohoto mikroprostředí mohou mít neuroendokrinní buňky, které se vyskytují jak v normální, tak v nádorové prostatické tkáni. Proces, kterým neuroendokrinní buňky (normální či nádorové) vznikají,

se

nazývá

neuroendokrinní

diferenciace.

Neuroendokrinní

diferenciace

(transdiferenciace) nádorových buněk prostaty je pravděpodobně součástí rozvoje tohoto nádorového onemocnění. U rakoviny prostaty se neuroendokrinní buněčné populace vyskytují ve třech typech nádorů: v malobuněčném karcinomu, v karcinoidech a karcinoidům podobných nádorech a ohniskově v běžném karcinomu prostaty (Shariff a Ather, 2006). Malobuněčné karcinomy jsou velmi agresivní, u pacientů jsou často přítomny metastázy. Také karcinoidy prostaty jsou agresivní, dokonce více než karcinoidy jiných orgánů a vykazují intenzivní neuroendokrinní diferenciaci. Ohnisková neuroendokrinní diferenciace je tedy prakticky přítomna ve všech typech nádorů prostaty, liší se však množstvím buněk u jednotlivých typů. V následujících podkapitolách budou popsány neuroendokrinní buňky a jejich role v progresi rakovinného onemocnění, vliv hormonální terapie na neuroendokrinní diferenciaci a role interleukinu-6 jako významného prozánětlivého cytokinu v rozvoji rakoviny prostaty. 2.1.1. Neuroendokrinní buňky Neuroendokrinní buňky jsou hybridní epiteliální/ nervové/ endokrinní buňky, které exprimují a vylučují serotonin, ale i celou řadu biologicky aktivních peptidů. Některé tyto látky jsou vylučovány nejen těmito buňkami, ale také neurony v nervové tkáni. Také fenotypově se neuroendokrinní buňky podobají neuronům. In vitro bylo ukázáno, že některé buněčné linie odvozené od rakoviny prostaty získávají po kultivaci v médiu bez přítomnosti androgenů fenotyp podobný neuronům (Wu and Huang, 2007). Neuroendokrinní buňky byly poprvé popsány Prettlem roku 1944. Předpokládá se, že neuroendokrinní buňky, které jsou nejméně zastoupeným buněčným typem v epitelu prostaty, pocházejí stejně jako bazální a sekreční buňky prostatické tkáně ze společných kmenových buněk. Jak již však bylo řečeno v předchozí kapitole, neuroendokrinní buňky exprimují jiné diferenciační znaky než buňky sekreční a bazální (Obr. 3). Za použití 17

imunohistochemických metod bylo zjištěno, že neuroendokrinní buňky jsou zřejmě blíže příbuzné se sekrečními buňkami, s nimiž mají více společných znaků než s buňkami bazálními (Huang et al., 2006). Přesný původ neuroendokrinních buněk v normální i rakovinné tkáni ale není zcela jasný. Sekreční buňky prostatické tkáně exprimují androgenní receptor a jsou na androgenech závislé, čehož se využívá při hormonální terapii nádoru prostaty, kdy se zamezí produkci androgenů, nebo je inhibována jejich signální dráha pomocí antiandrogenů. Neuroendokrinní buňky však androgenní receptor nemají, a tudíž na snížení hladiny androgenů neodpovídají (Huang et al., 2006). Přestože neuroendokrinní buňky nejsou pod kontrolou androgenních hormonů, mohou být pod vlivem lokálních růstových faktorů produkovaných zejména stromatem prostaty jako je například epidermální růstový faktor (Iwamura et al., 1994b). V prostatické tkáni se neuroendokrinní buňky nacházejí jak jednotlivě rozptýlené, tak ve shlucích. Nádory prostaty, v nichž se tyto buňky vyskytují spíše ve shlucích, více proliferují a jsou spojeny s horší prognózou, než nádory, kde se tyto buňky vyskytují jednotlivě (Grobholz et al., 2005). Existují dva typy neuroendokrinních buněk – otevřené a uzavřené (Abrahamsson, 1999). Otevřené buňky jsou charakteristické svým lahvovitým tvarem a přítomností dlouhých tenkých rozšířených výběžků, kterými se dotýkají lumenu. Uzavřené neuroendokrinní buňky se svými výběžky lumenu nedotýkají. Jak otevřené, tak uzavřené neuroendokrinní buňky mají nepravidelné dlouhé výběžky podobné výběžkům dendritickým. U obou typů se také nacházejí granula, která jsou typickým znakem endokrinních buněk. Jejich funkce je důležitá v procesu uskladnění a vylučování celé řady endogenně aktivních látek. Funkce neuroendokrinních buněk jsou stále předmětem studia. Zejména u nádorových neuroendokrinních buněk bylo prokázáno, že řada látek, které produkují, se může podílet na regulaci buněčné proliferace, diferenciace a invazivity (Vashchenko a Abrahamsson, 2005). Faktory exprimované a sekretované neuroendokrinními buňkami mohou také sloužit jako diagnostické znaky neuroendokrinní diferenciace, tzv. neuroendokrinní markery. Mezi tyto látky patří různé neuropeptidy a biogenní aminy, jako například chromogranin A, serotonin, bombesin, neuron-specifická enoláza, kalcitonin nebo somatostatin. Stanovení hladiny těchto znaků neuroendokrinní diferenciace může pomoci při diagnostice nádoru prostaty, při stanovení odpovědi pacienta na léčbu a při určení jeho prognózy. Pro normální i patologickou funkci neuroendokrinních buněk je také důležitá přítomnost celé řady receptorů na cílových buňkách, jako jsou například receptory pro gastrin-releasing peptid, serotonin, somatostatin, kalcitonin nebo neuropeptid Y.

18

Úloha neuroendokrinních buněk se tedy zdá být významná v případě, kdy nádor neodpovídá na hormonální léčbu a stává se nezávislý na přítomnosti androgenů. Tento proces transdiferenciace epiteliálních buněk a zisk vlastností neuroendokrinních buněk umožňuje zřejmě nádorové populaci přežít podmínky s nedostatkem androgenů (Zelivianski et al., 2001). Neuroendokrinní buňky mohou ovlivnit prostředí nádoru tak, že podpoří selekci buněčného klonu nezávislého na androgenech a způsobí tak další progresi nádoru. Neuroendokrinní transdiferenciace nádorových buněk by tedy mohla být významným procesem ovlivňujícím rozvoj rakoviny prostaty. V případě potvrzení této její role a poznání signálních drah, které ji regulují, by se otevřela perspektivní cesta pro její cílenou léčbu.

2.1.2. Vliv hormonální terapie na neuroendokrinní diferenciaci Růst a funkce prostatického epitelu jsou závislé na androgenech, které se v buňce vážou na androgenní receptor. Androgenní receptor (AR) nesou sekreční a stromální buňky prostatické tkáně (Iwamura et al., 1994a), zatímco neuroendokrinní buňky tento receptor nenesou (Huang et al., 2006). Při léčbě rakoviny prostaty je využíváno antiandrogenů, které se vážou na AR, znemožňují navázání androgenů a inhibují tak přenos signálu. Příkladem antiandrogenu je bicalutamid. Dalším možným přístupem je zamezení tvorby androgenů chirurgickou kastrací. Odpověď organismu je ve většině případů rychlá a hormonální terapie bývá dočasně účinná. Po určité době však dojde k návratu onemocnění ve stavu, kdy jsou nádorové buňky nezávislé na přítomnosti androgenů (De La Taille et al., 2001). Tato fáze onemocnění je spojena s obtížnou léčbou a horší prognózou. Androgeny jsou mužské pohlavní hormony, mezi něž patří testosteron a dihydrotestosteron. Většina mužského hormonu testosteronu vzniká v Leidigových buňkách ve varlatech. Společně s dalšími androgeny, které vznikají v kůře nadledvinek, zajišťují celou řadu funkcí, jako například rozvoj samčích pohlavních orgánů, vývoj sekundárních pohlavních znaků, řídí spermatogenezi nebo ovlivňují intenzitu růstu a sekrece přídatných pohlavních žláz, kam patří i prostata. Signální dráha androgenů je klíčová pro kontrolu řady buněčných procesů, jako je proliferace, růst nebo odumírání buněk epitelu prostatické tkáně (Obr. 6). Androgenní receptor patří do rodiny jaderných receptorů. V různém množství je přítomen v celé řadě tkání. Nejvyšší exprese v prostatické tkáni byla stanovena v sekrečních buňkách (Ruizeveld de Winter et al., 1991). Po vazbě androgenů spouští AR transkripci celé řady genů, které ovlivňují různé buněčné procesy. Správná funkce této signální dráhy je nutná nejen pro normální vývoj a funkci prostaty, ale také pro udržení homeostázy a zabránění vzniku nádorového onemocnění. Jedním z možných mechanismů, kterými se mění funkce AR, jsou 19

mutace. V počátečních fázích rozvoje rakoviny prostaty nejsou mutace v AR, které by ovlivnily jeho funkci, příliš časté (Marcelli et al., 2000). Jiná situace je u pokročilejšího stadia onemocnění, kde mutace v AR mají vliv na rozvoj metastáz a na růst nádoru nezávisle na androgenech. Mutacemi může dojít ke změně afinity nebo vazebné specifity receptoru. Ten pak může být aktivován vazbou jiného ligandu nebo jiným intracelulárním signálem (Mizokami et al., 2004).

Obr. 6: Vazba androgenů na androgenní receptor a jejich efekt na buněčné procesy (Culig a Bartsch, 2006, upraveno). Hormonální terapie může mít vliv na buňky, které nesou androgenní receptor. V nepřítomnosti androgenů dochází k regulaci inhibice jejich buněčného cyklu a indukci apoptózy. Na vznik rakovinných buněk prostaty nezávislých na přítomnosti androgenů má vliv celá řada jevů. Jedním z nich může být změna exprese anti-apoptického proteinu Bcl-2 (Raffo et al., 1995). Jeho hladina je zvýšená po hormonální léčbě u BHP (Cardillo et al., 1997). Dalším jevem, který může vznik nezávislosti na androgenech ovlivnit, je již zmíněný proces transdiferenciace, kdy se z epiteliálních buněk stanou buňky s neuroendokrinním fenotypem. To bylo popsáno například na buněčné linii LNCaP, která je senzitivní k androgenům (Yuan et al., 2006). Bylo tak experimentálně v systému in vitro prokázáno, že zamezení přístupu androgenů podporuje neuroendokrinní diferenciaci prostatických rakovinných buněk. U pacientů, u kterých došlo k regresi onemocnění po hormonální terapii, byla pozorována zvýšená hladina chromograninu A, což je charakteristický znak neuroendokrinních buněk (Berruti et al., 2005). 20

2.1.3. Interleukin-6 a jeho vliv na neuroendokrinní diferenciaci Interleukin-6 (IL-6) je prozánětlivý cytokin patřící do rodiny interleukinů, jejichž hlavní funkcí je regulace vývoje a aktivace leukocytů. Je vylučován zejména pomocnými T lymfocyty TH2, makrofágy nebo neutrofily, ale i řadou dalších buněk. Mezi jeho funkce patří například stimulace T a B lymfocytů a stimulace produkce protilátek. Ve vztahu k rakovině prostaty byla popsána zvýšená hladina IL-6 u pacientů s pokročilým stadiem rakoviny prostaty (Twillie et al., 1995). Toto zvýšení bylo spojeno s jejich vyšší úmrtností. IL-6 může sloužit jako prognostický faktor u rakoviny prostaty, neboť jeho hladina je zvýšená u pacientů s metastázami (Hoosein et al., 1995). Tato skutečnost také koreluje se zvýšenou expresí neuroendokrinních markerů, jako je například chromogranin A, ale neodpovídá hladině PSA. IL-6 se v buňce váže na transmembránový receptor, což je komplex složený ze dvou složek. První složkou je transmembránový receptor (IL-6R) o velikosti 80 kDa, který specificky váže IL-6, ale není schopen přenášet signál (Ward et al., 1994). Druhou složkou je membránový glykoprotein gp130 o velikosti 130 kDa. Ten převádí signál do buňky po vazbě IL-6 na IL-6R. Výsledný vysokoafinitní komplex je hexamer složený ze dvou molekul IL-6, dvou molekul IL-6R a ze dvou molekul gp130. IL-6 v buňce aktivuje signální dráhu JAK/STAT3 (Janusovy kinázy/signal transducer and activator of transcription3). STAT3 je protein, který reguluje genovou expresi tím, že přímo ovlivňuje transkripci. STAT3 je aktivován fosforylací, která je zvýšená u rakovinných buněk prostaty (Barton et al., 2004). Aktivace této signální dráhy se zdá být nutná pro přežití rakovinných buněk a inhibice STAT3 vede ke zvýšení procenta buněk, které podléhají apoptóze. Inhibice STAT3 je tedy významným cílem terapie nádorových onemocnění. Signální dráha IL-6 může interagovat i s jinými signálními drahami. Prostřednictvím signální dráhy STAT3 IL-6 transaktivuje AR (Yang et al., 2003). Toto vzájemné propojení může mít vliv na rozvoj nádorového onemocnění prostaty. Interakce mezi těmito drahami byla prokázána například indukcí exprese PSA po působení IL-6 na úrovni proteinu i mRNA (Hobisch et al., 1998, Lin et al., 2001). IL-6 tedy může podporovat progresi nádoru prostaty nezávisle na přítomnosti androgenů a to prostřednictvím zvýšení hladiny AR nebo zvýšením jeho aktivity. Jedním z mechanismů progrese rakovinného onemocnění nezávislého na androgenech mohou být tedy deregulace signálních drah IL-6. Další signální drahou zahrnutou v procesu přenosu signálu mezi IL-6 a AR je například dráha PI3K/Akt (phophatidylinositol-3 kináza/proteinová kináza B), jejíž aktivace může vést k potlačení transaktivace AR, nebo dráha MAPK (mitogen aktivující proteinová kináza), jejíž aktivace naopak transaktivaci AR podporuje (Yang et al., 2003). 21

Hladina IL-6 je ve zdravé tkáni velmi nízká. Jelikož je to tzv. prozánětlivý cytokin, jeho hladina stoupá během zánětu. Hladina IL-6 je vyšší u prostatické rakovinné tkáně ve srovnání s normální tkání (Giri et al., 2001). Většina IL-6 přítomného v rakovinné tkáni je sekretovaná neoplastickými epiteliálními buňkami. Vyšší hladina IL-6 je spojena i se zvýšenou hladinou IL-6R, což naznačuje existenci autokrinní smyčky. Vyšší hladina IL-6 v kostní dřeni je spojena s horší prognózou pacientů. I u pacientů s rakovinou prostaty, u nichž se rakovinné buňky staly nezávislé na přítomnosti androgenů, byla pozorována zvýšená hladina IL-6, což bylo opět spojeno s jejich horší prognózou (George et al., 2005). Interleukin-6

může

také

modulovat

samotný proces neuroendokrinní

diferenciace

prostatických rakovinných buněk, jak bylo ukázáno na buněčné linii LNCaP (Deeble et al., 2001). U buněk, které byly pod chronickým vlivem IL-6, byla detekována exprese β III tubulinu, což je jeden z markerů neuroendokrinní diferenciace. Buňky LNCaP se změnily i morfologicky, získaly fenotyp podobný neuroendokrinním buňkám.

2.2. Neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk tlustého střeva Procesem neuroendokrinní diferenciace vznikají u tlustého střeva neuroenodokrinní nádory. I když

gastrointestinální

trakt

obsahuje

značné

množství

neuroendokrinních

buněk,

neuroendokrinní tumory tlustého střeva jsou vzácné – například ve studii Bernicka a kolektivu představovaly neuroendokrinní tumory necelé 1 % všech nádorů tlustého střeva (Bernick et al., 2004). Neuroendokrinní buňky jsou roztroušeny v mukóze gastrointestinálního traktu (Klöppel a Anlauf, 2005) a jejich počet se zvyšuje u pokročilejších stádií onemocnění (Grabowski et al., 2001). Tyto buňky vylučují neurohumorální látky, kterými ovlivňují okolní prostředí i samy sebe, a to může vést ke vzniku agresivnějšího stadia onemocnění (Grabowski et al., 2002). Rozlišujeme tři subtypy neuroendokrinních nádorů tlustého střeva: neuroendokrinní karcinomy malých buněk, středních buněk a dobře diferencovaných buněk (Chejfec et al., 1988; Gould et al., 1983). Malobuněčné karcinomy jsou tvořeny buňkami o velikosti 15 až 25 µm s hustými hyperchromatickými jádry (barví se více, než je obvyklé) a řídkou cytoplazmou. Histologicky tyto buňky připomínají malobuněčný karcinom plic. Karcinomy středně velkých buněk jsou tvořeny buňkami, které jsou asi dvakrát větší, než jsou buňky malobuněčného karcinomu. V buňkách je množství cytoplazmy a velká hyperchromatická jádra. Dobře diferencované neuroendokrinní karcinomy se podobají pravým karcinoidům, což jsou malé benigní nebo maligní tumory pocházející z mukózy gastrointestinálního traktu. Dobře

22

diferencované neuroendokrinní karcinomy jsou ale vždy maligní. Jsou charakteristické mnohotvarostí, přítomností mitóz, nekróz a vaskulární invazí. Neuroendokrinní nádory se vyskytují především v pozdějších stadiích onemocnění a jejich přítomnost je spojena s nižší pravděpodobností přežívání (Saclarides et al., 1994). U rakoviny tlustého střeva je proces neuroendokrinní diferenciace mnohem méně prostudován než u rakoviny prostaty a vyžaduje proto další výzkum.

2.3. Markery neuroendokrinní diferenciace V procesu neuroendokrinní diferenciace vylučují neuroendokrinní buňky celou řadu neuropeptidů, biogeních aminů a dalších látek, kterými regulují růst, diferenciaci a sekreční aktivitu žlaznatého epitelu jak u normální, tak u nádorové prostatické tkáně. Některé z těchto faktorů jsou známy také jako tzv. markery neuroendokrinní diferenciace, které mohou být i nádorovými markery. Nádorový marker je tzv. biomarker, jehož zjednodušená definice říká, že se jedná o specifický parametr nebo vlastnost (často např. hladina konkrétního proteinu), která byla objektivně změřena a vyhodnocena jako ukazatel normálního či patologického procesu nebo farmakologické odpovědi na léčbu. Sledování změny hladiny těchto znaků tak může napomoci při diagnostice určitého nádorového onemocnění nebo při stanovení úspěšnosti léčby. Vzhledem ke složité a komplexní situaci během rozvoje nádorové patologie může docházet k situacím, kdy zvýšená hladina jednoho konkrétního markeru signalizuje rakovinné onemocnění, ale normální hladina nemusí znamenat, že pacient toto onemocnění nemá. Proto je nutné měření hladiny nádorových markerů kombinovat s dalším vyšetřením. Příklady běžně používaných nádorových markerů jsou PSA u rakoviny prostaty nebo karcinoembryonální antigen (CAE) u rakoviny tlustého střeva.

2.3.1. Markery neuroendokrinní diferenciace rakoviny prostaty U rakoviny prostaty je běžně používaným markerem sérová hladina PSA. Jelikož ale u některých případů nemusí hladina PSA vždy indikovat rakovinné onemocnění nebo její měření není přesné, hledají se další přesnější markery. Sledování změny exprese těchto znaků je využíváno ve výzkumu procesů spojených s neuroendokrinní diferenciací, v budoucnu by však také mohly napomáhat při diagnostice nádorového onemocnění, určování prognózy a způsobu léčby pacienta. Mezi nejznámější a často používané neuroendokrinní markery, kterým bude dále věnována pozornost, patří chromogranin A a neuron-specifická enoláza. Zmínka bude také o tubulinu β III a N-kadherinu jako možných neuroendokrinních markerech. 23

Chromogranin A (CgA) je prvním identifikovaným členem rodiny graninů. Graniny se nacházejí společně s peptidovými hormony a neuropeptidy uvnitř sekrečních granul a mají důležitou funkci při tvorbě těchto granul a formování a hromadění sekrečních produktů (Ozawa a Takata, 1995). Chromogranin A je společně s neuron-specifickou enolázou nejčastěji používaným znakem neuroendokrinní diferenciace. Existuje prokázaný vztah mezi hladinou CgA v séru a velikostí neuroendokrinního nádoru (Nobels et al., 1997). Hladina CgA v séru odpovídá neuroendokrinní aktivitě rakovinných buněk prostaty (Ranno et al., 2006). Klinické použití jiných znaků je často omezeno jejich nestabilitou, která vyžaduje speciální zacházení a uskladňování. Naproti tomu CgA je poměrně stabilní a může být měřen v séru nebo plazmě a skladován při pokojové teplotě delší dobu. Zvýšená hladina tohoto markeru je často pozorována u pacientů s rakovinou prostaty, kteří neodpovídají na hormonální léčbu (Berruti et al., 2005). Zde je vyšší exprese CgA spojena se špatnou prognózou. Zvýšená hladina tohoto znaku se může vyskytovat také u neuroblastomu nebo u malobuněčného karcinomu plic (Nobels et al., 1997). Vyšší hladina CgA se nevyskytuje jen u neuroendokrinních nádorů, ale také například u onemocnění, kdy dochází k selhání ledvin (ƠConnor et al., 1989). Neuron-specifická enoláza (NSE, γ enoláza) je jedním z pěti izoenzymů glykolytického enzymu 2-fosfo-D-glycerát hydrolázy (enolázy). Enoláza se účastní procesu glykolýzy, kde katalyzuje reverzibilní přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát za přítomnosti hořečnatých iontů. Tento enzym je přítomen u všech organismů. Enzym enoláza je homodimer nebo heterodimer tvořený ze tří podjednotek. Podjednotka α se nachází ve většině tkání, podjednotka β jen ve svalech a podjednotka γ se vyskytuje v neuronech a v normálních a nádorových neuroendokrinních buňkách (Rider a Taylor, 1975). NSE je často používaným markerem neuroendokrinní diferenciace. Měření znaků neuroendokrinní diferenciace, jakými jsou CgA nebo NSE, v krvi pacientů poskytuje přesnější představu o stavu neuroendokrinního nádoru a může také odpovídat celkové populaci primárních rakovinných buněk a s nimi spojených metastáz. U pacientů trpících rakovinou prostaty, u nichž jsou přítomny metastázy a kteří podstoupili hormonální terapii, je vyšší hladina NSE spojena s horší prognózou (Kamiya et al., 2003). Specificita měření množství NSE v séru při diagnostice neuroendokrinních tumorů je nižší než specificita měření hladiny CgA v séru (Nobels et al., 1997). Sledování hladiny NSE jako znaku vývoje tumoru se používá nejen u rakoviny prostaty, ale například také u pacientů s neuroblastomem nebo rakovinou plic. Zvýšená hladina NSE však není spojena jen s neuroendokrinními nádory, ale je sledována například také u nervových onemocnění a při poškození nervové tkáně. Příkladem je Creutzfeld-Jakobova choroba, kdy se 24

stanovuje hladina NSE v séru nebo v cerebrospinální tekutině, kde se za normálního stavu nevyskytuje (Xiao et al., 2006). U této choroby slouží detekce zvýšené hladiny NSE především k časné diagnostice. Tubulin β III je užitečný znak nádorů neuronového původu (Dráberová et al., 1998). Protein tubulin, který je hlavní složkou mikrotubulů, je tvořen podjednotkami α a β. Mikrotubuly jsou zahrnuty v celé řadě buněčných procesů, jakými jsou například mitóza, buněčný pohyb a vnitrobuněčný transport. Celkem existuje sedm izotypů β podjednotky tubulinu. Exprese izotypu β III je charakteristická pro buňky neuronového původu (Burgoyne et al., 1988). N-kadherin je členem rodiny kadherinů, které jsou důležité v procesu migrace buněk. Účastní se mezibuněčné adheze, diferenciace, embryogeneze, migrace nebo přenosu signálu (Derycke a Bracke, 2004). N-kadherin je exprimován v různých tkáních během časného vývoje. V dospělosti je jeho exprese přítomna v nervové tkáni, sítnici, endoteliálních buňkách, fibroblastech, osteoblastech, mezenteliu, myocytech, chrupavce končetin, oocytech, spermiích a Sertoliho buňkách. Kadheriny kontrolují rovnováhu mezi adhezí a invazí buněk. Hladina exprese N-kadherinu bývá vysoká u pokročilého stadia rakoviny prostaty, zatímco v normální prostatické tkáni tento typ kadherinu nemusí být vůbec přítomen (Tomita et al., 2000). Navíc byla exprese N-kadherinu pozorována u těch nádorových buněk, u nichž došlo k poklesu exprese E-kadherinu. Snížená hladina E-kadherinu a zvýšená exprese N-kadherinu je spojena s progresí karcinomu prostaty a s tzv. epiteliálním-mesenchymálním přechodem (Tran et al., 1999). N-kadherin zprostředkovává méně stabilní mezibuněčnou adhezi a umožňuje rakovinným buňkám migraci a invazi do jiných tkání a orgánů. To má vliv na rozvoj rakovinného onemocnění a vznik metastáz. Výše uvedené markery jsou jen příklady používané k detekci neuroendokrinní diferenciace nebo neuroendokrinních nádorů. Přednostně jsou používány CgA a NSE. Detekce N-kadherinu a tubulinu β III se v současné době využívá především v experimentálních studiích. Na začátku roku 2007 byla publikována práce o secretagoginu jako novém neuroendokrinním markeru v lidské prostatě (Adolf et al., 2007). Secretagogin je protein vázající vápenaté ionty. V neuroendokrinních buňkách se nenachází v sekrečních granulích jako CgA nebo NSE, ale vyskytuje se v cytoplazmě a v jádře. Exprese secretagoginu koreluje s expresí NSE a CgA.

25

2.3.2. Markery neuroendokrinní diferenciace rakoviny tlustého střeva Neuroendokrinní buňky se vyskytují také v epitelu tlustého střeva, kde mohou tvořit až 2 % z celkové buněčné populace. I když neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk tlustého střeva není tolik prozkoumaným jevem a neuroendokrinní nádory tlustého střeva nejsou tak časté, jsou i zde zavedeny určité znaky pro detekci neuroendokrinní diferenciace. Tyto látky pocházejí ze dvou typů sekrečních váčků neuroendokrinních buněk. Jsou to sekreční granula a malé synaptické váčky. Charakteristickým proteinem, který je vylučován ze sekrečních granulí, je CgA (Smith a Winkler, 1967), zatímco faktorem vylučovaným z malých synaptických váčků je synaptophysin (Sudhof a Jahn, 1991). Také NSE bývá užívána jako marker neuroendokrinní diferenciace u rakoviny tlustého střeva (Bernick et al., 2004). Zvýšená hladina CgA odpovídá agresivnějšímu stavu nádoru a horší prognóze pacienta (Grabowski et al., 2001; Grabowski et al., 2002). Zvýšená exprese CgA na úrovni mRNA i proteinu byla zjištěna i u rakoviny gastrointestinálního traktu ve srovnání s normální tkání (Kidd et al., 2006). Stanovení hladiny CgA je metoda schopná identifikovat rakovinné buňky gastrointestinálního traktu jak u metastáz v játrech, tak v lymfatických uzlinách. Dalším významným markerem neuroendokrinní diferenciace u rakoviny tlustého střeva je membránový glykoprotein synaptophysin, který se účastní procesu exocytózy (Edelmann et al., 1995). Jelikož je prvním izolovaným a klonovaným membránovým proteinem synaptických váčků, používá se ke sledování pohybu těchto váčků a ke studiu průběhu exocytózy (Valtorta et al., 2004). Exprese synaptophysinu koreluje u rakoviny tlustého střeva s expresí CgA (Grabowski et al., 2001). Synaptophysin je zřejmě citlivějším markerem než CgA, neboť s využitím imunohistochemických metod bylo prokázáno více buněk pozitivních pro synaptophysin než pro CgA. I zde platí, že zvýšená hladina tohoto proteinu je spojena s horší prognózou (Grabowski et al., 2004).

2.3.3. Další možné markery neuroendokrinní diferenciace Kromě výše zmíněných markerů existují i další látky exprimované neuroendokrinními buňkami, jejichž exprese tak může být spojena s rozvojem procesu neuroendokrinní diferenciace. Následující výčet látek je zde uveden také proto, že součástí bakalářské práce je re-analýza dat z databáze Oncomine a u níže uvedených markerů byla sledována změna genové exprese u nenádorové, primární nádorové a sekundární nádorové tkáně prostaty a tlustého střeva (kapitola 5.1.). • Gastrin-releasing peptid je lidský homolog neuropeptidu bombesinu. Je to neuropeptid vylučovaný v prostatické rakovinné tkáni. Je exprimován v primární rakovinné tkáni prostaty a v 26

tkáni získané z rakoviny prostaty metastazující do lymfatických uzlin (Ishimaru et al., 2002). Nádorové tkáně s buňkami, které exprimují gastrin-releasing peptid, jsou charakteristické vyšší hodnotou Gleasonova skóre a mají větší potenciál pro tvorbu metastáz. Avšak exprese gastrinreleasing peptidu ne vždy odpovídá expresi NSE, což znamená, že produkce gastrin-releasing peptidu rakovinnými buňkami nemusí být vždy spojena s neuroendokrinní diferenciací. Prostatická tkáň exprimuje receptory pro bombesin/gastrin releasing peptid. Aplikace antagonistů bombesinu u rakoviny prostaty by mohla napomoci léčení tohoto onemocnění (Abrahamsson, 1999). • Somatostatin je peptid produkovaný neurony, neuroendokrinními buňkami, zánětlivými a imunitními buňkami. Somatostatin indukuje inhibiční procesy v centrální nervové soustavě, kde působí jako neurotransmiter (Pintér et al., 2006). Somatostatin je hlavním inhibitorem produkce neuroendokrinních hormonů a jeho analogy se používají pro léčbu syndromů spojených s výskytem nádoru (Abrahamsson, 1999). Aplikace analogů somatostatinu vede k zpomalení růstu nádoru. Receptory pro somatostatin jsou zřejmě exprimovány jak normálními, tak rakovinnými neuroendokrinními buňkami. • Neuropeptid Y je polypeptid, který je přítomen v centrálním i periferním nervovém systému. Je exprimován v normální i rakovinné tkáni, které exprimují také jeho receptor Y1-R. Neuropeptid Y má vliv na proliferaci buněk. U buněčné linie LNCaP odvozené od rakoviny prostaty, která je citlivá na přítomnost androgenů, snižuje neuropeptid Y proliferaci, zatímco u buněčné linie PC3, která je na androgenech nezávislá, proliferaci podporuje (Ruscica et al., 2006). • Cholecystokinin je peptidový hormon produkovaný epiteliálními buňkami střeva a neurony. Ve střevě se účastní procesu zažívání. Receptory pro cholecystokinin (CCK1 a CCK2) jsou přítomny v centrálním nerovém systému. Na receptor CCK2, jehož exprese bývá zvýšená u rakoviny tlustého střeva, se může kromě cholecystokininu vázat také gastrin. Aktivace CCK2 může vést ke zvýšené proliferaci rakovinných buněk tlustého střeva (Colucci et al., 2005). • Amino acid dekarboxyláza je protein účastnící se syntézy serotoninu. Je přítomna jak v nervové tkání, kde působí jako neurotransmiter, tak například v játrech, ledvinách nebo gastrointestinálním traktu, kde působí jako nespecifický dekarboxylační enzym. Amino acid dekarboxyláza nebo také L-dopa dekarboxyláza se může vázat na androgenní receptor a zvyšovat tak jeho transkripční aktivitu (Wafa et al., 2003). • Histidin dekarboxyláza je jedním z enzymů dekarboxylačního systému. Je také klíčovým enzymem syntézy histaminu. Ten v buňce účinkuje přes své čtyři receptory. Histidin dekarboxyláza je možným markerem neuroendokrinní diferenciace, jak bylo popsáno u 27

malobuněčného karcinomu plic (Matsuki et al., 2003). Exprese histidin dekarboxylázy odpovídá expresi jiných markerů neuroendokrinní diferenciace a na jejím základě je možné rozlišit tumory bez neuroendokrinní diferenciace a neuroendokrinní tumory plic. Hladina histidin dekarboxylázy je zvýšená i u jiných typů nádorů. Zvýšená aktivita histidin dekarboxylázy a vyšší obsah histaminu odpovídá u rakoviny kolorekta přítomnosti metastáz v lymfatických uzlinách anebo jiných vzdálených metastáz (Cianchi et al., 2005). • Tryptophan hydroxyláza je jedním z enzymů, které se účastní syntézy serotoninu. Tryptophan hydroxyláza 1 je exprimována v celé řadě periferních tkání, jako je například střevo nebo kůže, zatímco tryptophan hydroxáza 2 je exprimována výhradně v neuronech. Serotonin stejně tak jako jeho receptory jsou exprimovány neuroendokrinními buňkami (Vashchenko a Abrahamsson, 2005). • Receptory serotoninu jsou přítomny v membránách buněk řady tkání včetně tkáně prostatické. Použití antagonistů těchto receptorů vedlo k omezení růstu buněčných linií odvozených od karcinomu prostaty. Aplikace těchto antagonistů by mohla být významná z hlediska léčby především u stadia rakoviny prostaty, kdy nádor již neodpovídá na hormonální léčbu (Abrahamsson, 1999). • Kalcitonin je neuropeptid produkovaný mimo jiné i primárními epiteliálními buňkami prostaty. Receptor pro kalcitonin je exprimován epitelem prostaty. In vitro i in vivo studie ukazují, že kalcitonin je schopen stimulovat angiogenezi u rakoviny prostaty přímým působením na endoteliální buňky, které exprimují receptor podobný receptoru pro kalcitonin (calcitonin receptor-like receptor) (Chigurupati et al., 2005).

28

3. Technologie microarray - principy a aplikace v nádorové diagnostice a výzkumu Rakovina je onemocnění, na jehož propuknutí může mít vliv změna exprese celé řady genů. Při výzkumu a v budoucnu i při diagnostice je tedy třeba používat takové techniky, které by umožnily komplexní analýzu změn exprese mnoha genů najednou. V oblasti výzkumu rakoviny se začala široce používat technika microarray neboli DNA čipů. Během jednoho experimentu je možné identifikovat množství genů, jejichž exprese je u rakovinného onemocnění změněna oproti expresi v nenádorové tkáni. To umožňuje hlouběji poznávat molekulární mechanismy související se vznikem a rozvojem rakovinného onemocnění, což může v budoucnu přispět i k efektivnější léčbě. Neméně důležitým cílem používání techniky microarray je identifikace tzv. specifického „otisku“ nebo také „podpisu“ nádoru. Snahou je najít takové kombinace genů, jejichž analýza povede k určení přesnější diagnózy, prognózy a léčby konkrétního nádorového onemocnění u konkrétního pacienta.

3.1. Technologie microarray Jedním z příkladů aplikace technologie microarray neboli DNA čipů je analýza rozdílů v genové expresi na úrovni transkripce. Je možné srovnávat např. zdravou a nádorovou tkáň či exprerimentálně ovlivněné a neovlivněné buněčné linie. Výsledkem takové analýzy je identifikace souboru genů, jejichž exprese je u těchto dvou vzorků odlišná. Jednoznačnou výhodou této metody je, že umožňuje analýzu velkého množství genů až celého genomu z jednoho vzorku a to v rámci provedení jednoho experimentu. Příklad jednoho z používaných principů metody microarray je schematicky znázorněn na obr. 7, který ukazuje postup při využití DNA čipů v analýze rozdílů genové exprese mezi prostatickou tkání, tkání benigní hyperplazie prostaty a normální tkání (Luo et al., 2001). Ze vzorků tkání je získána RNA, která je reverzní transkripcí přepsána do cDNA a je fluorescenčně označena. Takto označená cDNA hybridizuje s referenční sondou, která je imobilizována na speciálním sklíčku. Ke značení se používá zelená a červená fluorescenční značka. Hybridizace probíhá při vysoké teplotě, proto vazba sondy na sklíčko musí být pevná. Signál je většinou snímán laserovým skenerem, který detekuje emisní fluorescenci obou značek. Výsledný signál je složen na základě intenzity fluorescence obou barev. Dále musí být provedena normalizace dat, která kompenzuje různou úspěšnost značení a detekce fluorescenčních značek. Pomocí počítačových programů je provedena analýza výsledných dat a výstupem je srovnání exprese 29

daných genů mezi sledovanými tkáněmi (Khan et al., 1999). Další variantou k cDNA microarray je používání oligonukleotidové microarray, kdy celková RNA je amplifikována a převedena na značenou cRNA, která poté hybridizuje s oligonukleotidy imobilizovanými na sklíčku (Best et al., 2005).

Obr. 7. Princip techniky microarray použitý k analýze rozdílů genové exprese mezi tkání pocházející z rakoviny prostaty a tkání z benigní hyperplazie prostaty (Luo et al., 2001, upraveno). Na obrázku byla kontrolní cDNA značena červeně a testovaná cDNA zeleně. To znamená, že červený signál po hybridizaci reprezentuje geny, které jsou exprimované v kontrolní tkání. Naopak zelený signál reprezentuje geny, které jsou exprimované ve sledované tkáni. Žlutý signál značí geny, které se exprimují v kontrolním i testovaném vzorku. Výsledky získané pomocí metody microarray v oblasti nádorové diagnostiky mohou pomoci při odhalení molekulárních mechanismů, které vedou ke vzniku tohoto onemocnění (Rhodes a Chinnaiyan, 2005). Bylo prokázáno, že: (1) zjištěním exprese mnoha genů mohou být od sebe odlišovány nádorové tkáně a tkáně nenádorové; (2) profil genové exprese primárních nádorů 30

často může vypovídat o možném metastatickém potenciálu nádoru, reakci na léčbu nebo možnosti vyléčení; (3) heterogenní rakovinné onemocnění může být rozděleno na několik molekulárních subtypů na základě rozdílné genové exprese - například u rakoviny prsu (Perou et al., 2000). Kromě detekce genové exprese umožňuje technika microarray v kombinaci s bioinformatickými nástroji také analýzu interakcí mezi genovými produkty. Díky tomu lze komplexně studovat signální dráhy a jejich ovlivnění během rakovinného onemocnění. V současné době je tato molekulárně biologická metoda široce užívána například pro studium rakoviny prostaty (například Luo et al., 2001; Varambally et al., 2005), tlustého střeva (například Notterman et al., 2001; Zou et al., 2002) nebo rakoviny prsu (Perou et al., 2000). Použití této metody je spojeno s generovaním velkého množství dat, která jsou získána v rámci jednoho experimentu a mnohdy nejsou informačně zcela „vytěžena“. Obecnou snahou je tedy získané informace poskytnout i ostatním odborníkům. Proto vznikají databáze, které výsledky analýz genové exprese shromažďují a zpřístupňují pro další analýzu. Příkladem jsou databáze Standford Microarray Database (SMD), Gene Expression Omnibus (GEO) nebo Oncomine.

3.2. Databáze Oncomine Jak již bylo řečeno v úvodu, velké množství dat, které lze získat použitím microarray, často zůstává nevytěženo a není přístupno veřejnosti. V současné době je velkou snahou zpřístupnit proces získávání informací a také zefektivnit využití finančních prostředků vynaložených na aplikace technologie microarray. Jedním z výsledků takové snahy je internetová databáze Oncomine (www.oncomine.org). Jejím cílem je shromažďovat data ze studií analyzujících expresi genů na úrovni transkripce, zjednodušit jejich analýzu a srovnávání výsledků mezi jednotlivými studiemi a zprostředkovat tak možnost efektivně vytěžit více informací, které tyto studie skrývají. Projekt Oncomine zahrnuje tři hlavní části: (1) shromažďování dat, (2) analýzu dat a (3) vizualizaci dat. První verze databáze Oncomine byla spuštěna v říjnu roku 2003 a obsahovala 40 datových souborů ze studií, které používaly technologii microarray, a téměř 100 analýz rozdílné genové exprese. V říjnu roku 2004 byla spuštěna další verze této databáze - Oncomine 2.0. Počet analyzovaných datových souborů se zvýšil na 65 a byla také vylepšena grafika pro zobrazení analýzy genové exprese (SVG grafika - scalable vector graphic). V lednu roku 2006 byla spuštěna verze Oncomine 3.0. Na začátku roku 2007 obsahovala databáze data z více než 18 000 experimentů zabývajících se genovou expresí (Rhodes et al., 2007).V současné době má databáze Oncomine přes 10 000 registrovaných uživatelů. 31

Analýzu genové exprese je možné provádět v několika kategoriích: lze srovnávat normální tkáň s rakovinnou, různé subtypy rakoviny mezi sebou, v kategorii molekulární alterace jsou srovnávány vzorky rakoviny stejného typu, ale různého karyotypu, kategorie prognóza se zabývá změnami v expresi v závislosti na prognóze pacienta, kategorie histologické subtypy, stupně a stadia se zabývá srovnáváním vzorků na základě těchto parametrů. Poslední kategorie shromažďuje výsledky získané srovnáním rozmanitých kategorií, jako je například odpověď na léčbu, virová infekce nebo stav nějakého biomarkeru (např. estrogenový receptor). Rozdíl v expresi je stanovován statisticky, používán je Studentův t-test pro analýzu dvou kategorií a Pearsonův korelační test pro analýzu více jak dvou kategorií. Grafických výstupů je několik, jak je vidět na příkladu na obr. 8. Ve formě krabicového („box and whiskers“) grafu je zobrazena změna exprese tubulinu β III mezi dvěma kategoriemi, které byly porovnávány v rámci dané studie (Welsh et al., 2001), z níž výsledek pochází (Obr. 8A). Dále je možno zobrazit tzv. korelační mapu („heat map“), což je mapa, která zobrazuje profil exprese všech genů sledovaných v dané studii (Obr. 8B). Také lze získat seznam genů hodnocených v rámci dané studie a výsledky analýz jejich exprese. U každého grafu je vždy udána hodnota statistického testu a hladina významnosti. Je zde také citační odkaz na původní publikaci, z níž data pocházejí. A. Krabicový graf exprese tubulinu β III (Welsh et al., 2001).

Study: Welsh_Prostate Analysis: Prostate-Type Class 1: Normal Prostate (9) Class 2: Prostate Cancer (25) T-test: -4,011 P-value: 8,2*10-4

32

B. Korelační mapa exprese genů sledovaných v práci Lapointe et al. (2004)

Obr. 8. Příklad zobrazení výstupu analýzy genové exprese z databáze Oncomine. Obrázek ukazuje rozdíl v expresi tubulinu β III mezi normální a rakovinnou prostatickou tkání (Welsh et al., 2001). Dále je zobrazena korelační mapa ukazující rozdíl v expresi jednotlivých genů zahrnutých ve studii Lapointe et al. mezi třemi kategoriemi: normální tkáň (S1), rakovinná tkáň (S2) a metastázy lymfatických uzlin (S3) (Lapointe et al., 2004). Databáze Oncomine je velmi užitečný nástroj pro re-analýzu výsledků microarray prováděných v rámci výzkumu rakoviny. Umožňuje vyhledávat změny genové exprese jednotlivých genů napříč studiemi a porovnávat profil genové exprese mezi různými typy rakoviny. V této bakalářské práci byla databáze využita pro hledání změn exprese vybraných genů v souvislosti s rozvojem nádorového onemocnění prostaty a tlustého střeva. Seznam zkoumaných genů a výsledek analýzy je uveden v kapitole 4.1. a 5.

33

4. Materiál a metody 4.1. Analýza dat z databáze Oncomine Veřejně dostupná databáze Oncomine (www.oncomine.org) byla použita k analýze exprese vybraných genů, jejichž produkty jsou spojeny obecně s neuroendokrinní diferenciací. Exprese byla sledována na základě dat ze studií používajících technologii microarray. Prakticky jsou výstupem výsledků jednotlivých analýz v databázi Oncomine krabicové grafy udávající rozdíl v expresi mezi dvěma stanovenými kategoriemi (kapitola 3.2). U každé analýzy je také uveden výsledek statistického testu a hladina významnosti. Za statisticky významný rozdíl byl považován výsledek s hodnotou P<0,05. Pro přehlednost jsou v této práci tímto způsobem získané výsledky prezentovány formou tabulek. V databázi byly geny vyhledávány podle svých oficiálních zkratek (http://www.gene.ucl.ac. uk/nomenclature). V rámci této práce byly sledovány tyto geny: •

neuron-specifická enoláza (ENO2)

•

chromogranin A (CHGA)

•

tubulin β III (TUBB III)

•

N-kadherin (CDH2)

•

somatostatin (SST)

•

neuropeptid Y (NPY)

•

cholecystokinin (CCK)

•

gastrin-releasing peptid (GRP)

•

gastrin-releasing peptid receptor (GRPR)

•

serotonin receptor (5HT1a)

•

somatostatin receptory (SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5)

•

kalcitonin receptor (CALCR)

•

neuropeptid Y receptor 1, 2 (NPY1R, NPY2R)

•

histamin receptory (HRH1, HRH2, HRH3, HRH4)

•

tryptophan hydroxyláza (TPH1, TPH2)

•

amino-acid

dekarboxyláza (DDC,

dopa karboxyláza,

dekarboxyláza) •

histidin dekarboxyláza (HDC)

34

aromatická

L-amino-acid

4.2. Detekce vybraných markerů neuroendokrinní diferenciace u in vitro kultivované buněčné linie LNCaP 4.2.1. Kultivace buněčné linie LNCaP in vitro Buněčná linie LNCaP je linie izolovaná z metastatické léze adenokarcinomu prostaty. Byla získána v roce 1977 z metastázy v levé supraklavikulární lymfatické uzlině od padesátiletého pacienta s rakovinou prostaty. Buňky byly získány z Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ). Buňky produkují prostatický specifický antigen (PSA) a prostatickou kyselou fosfatázu, exprimují estrogenový a androgenní receptor a odpovídají na přítomnost 5-alfa-dihydrotestosteronu, který u nich stimuluje produkci kyselé fosfatázy a modulaci růstu (Horoszewicz et al., 1983). Buňky byly kultivovány na plastových kultivačních miskách (TPP, Švýcarsko) v termostatu Cytoperm Heraeus, kde byla udržována teplota 37 oC a atmosféra 5% CO2 při 95% vlhkosti vzduchu. Buňky byly vysévány v hustotě 2×104/cm2 povrchu kultivační misky. Jako kultivační médium bylo použito RPMI 1640 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) s NaHCO3 (2 g/l, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) s přídavkem antibiotik penicilinu (Duchefa Biochemie B.V., Haarlem, Nizozemí, 100.000 U/l) a streptomycinu (Duchefa Biochemie B.V., 100 mg/l) a 10 % fetálního bovinního séra (PAA, Německo). V případě studia neuroendokrinní diferenciace v závislosti na nepřítomnosti androgenů bylo použito kultivační médium s přídavkem 5 % tzv. „charcoal stripped“ séra (CS), které neobsahuje androgeny. Buňky byly pasážovány jednou za týden a jednou během týdne bylo vyměněno médium.

4.2.2. Fixace a barvení buněk propidium jodidem pro účely měření buněčného cyklu Do analýzy buněčného cyklu byly zahrnuty jak buňky, které rostly adherentně, tak případné buňky uvolněné a plovoucí v kultivačním médiu. Z povrchu kultivační misky byly buňky uvolněny působením PBS s 0,05% EDTA a trypsinu (0,25% w/v trypsin/0,53mM EDTA v PBS). Po oplachu nesterilním PBS (0,17M NaCl, 3mM KCl, 4mM Na2HPO4 × 12 H2O, 2mM KH2PO4, pH 7,2) a centrifugaci (200g, 5 min, 4 oC) byly buňky rozsuspendovány ve 200 µl PBS a fixovány ve 4 ml 70% ethanolu nejméně 30 minut ve 4 oC. Po fixaci byl ethanol odstraněn, buňky byly centrifugovány (200g, 5 min, 4

o

C), opláchnuty nadbytkem PBS a znovu

centrifugovány (200g, 5 min, 4 oC). Pro účely barvení bylo použito 200 až 300 µl Vindelova roztoku, který obsahuje propidium jodid (20 µg/ml) a RNasu A (DNase free, 5 U/ml, SigmaAldrich Corp., St. Louis, MO, USA), dále 1M Tris (pH 8), 0,1% Triton X-100, 20mM NaCl a destilovanou vodu. Buněčný cyklus byl měřen na základě měření intenzity fluorescence 35

průtokovým cytometrem (FACSCaliburTM, Becton Dickinson, San Jose, California, USA, argonový laser, excitace při 488 nm) a pomocí softwaru CellQuest Pro. Výsledné procentuální zastoupení buněk v jednotlivých fázích bylo analyzováno programem ModFit 3.1 (Verity Software House, Topsham, California, USA).

4.2.3. Příprava proteinových extraktů Za účelem přípravy proteinových extraktů bylo z kultivačních misek odsáto medium, buňky byly opláchnuty PBS (4 °C) a misky byly zamraženy v -80 oC. Příprava celobuněčných proteinových extraktů probíhala na ledu. K lyzi buněk byl použit tzv. RIPA pufr (50mM Tris, pH 7,4, 1% NP-40, 0,25% deoxycholát sodný, 150mM NaCl) s inhibitorem proteáz (protease inhibitor coctail PIC, koncentrace 40 µl na 1 ml RIPA pufru, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA). Použité množství lyzačního roztoku záviselo na velikosti kultivační nádoby, množství buněk a buněčné denzitě. Pro zvýšení výtěžku byl extrakt z povrchu kultivační misek seškrabán mechanicky. Po inkubaci 15 min na ledu byly lyzáty sonikovány (3 × 5 s, Sonifier® B-12, Branson Ultrasonic Corp, Danbury, CT, USA) a odstředěny na mikrocentrifuze. Poté byl odebrán supernatant, v němž byla stanovena koncentrace proteinů prostřednictvím „DC protein assay kit” (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Vzorky byly pomocí lyzačního pufru naředěny na stejnou koncentraci. Poté byl ke vzorkům přidán 3× koncentrovaný vzorkovací pufr (240mM Tris, pH 6,8, 3% dodecylsulfát sodný (SDS), 30% glycerol, 16% merkaptoethanol, 0,06% bromfenolová modř) ve výsledné koncentraci 1× koncentrovaný. Po inkubaci ve vodní lázni (10 min, 90 oC) byly vzorky uchovávány v -80 oC.

4.2.4. Metoda „western blot“ Vzorky proteinů připravené podle protokolu v kapitole 4.1.3. byly separovány v 10% nebo 12%

polyakrylamidovém

gelu

(MQ

voda,

Tris+EDTA

pH

8,8

nebo

pH

6,8,

akrylamid:bisakrylamid 37,5:1, N,N,N´N – tetramethylethylendiamin TEMED, amonium persulfát) metodou SDS-PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza). Nanášeno bylo vždy stejné množství proteinů, zpravidla 15 µg. Z gelu byly rozdělené proteiny přeneseny na PVDF membránu (Millipore Millipore Corp., Bedford, MA, USA) metodou mokrého přenosu. Jako pufr byl použit 1× koncentrovaný Towbin pufr (250mM Tris, 1,92M glycin, 1% SDS, 20% methanol, destilovaná voda; zásobní roztok 10× koncentrovaný). Přenos probíhal při 400 mA po dobu 1 hodiny. Poté byly membrány blokovány při pokojové teplotě 1 hodinu v 1× koncentrovaném TBS (137mM NaCl, 20mM Tris, pH 7,2, zásobní roztok 10× koncentrovaný) obsahujícím 0,05% 36

Tween 20 a 5 % odtučněného sušeného mléka. Tento roztok byl také používán pro ředění primárních i sekundárních protilátek. Membrány byly inkubovány přes noc při 4 oC s primárními protilátkami proti NSE (NSE-P1, sc-21738, Santa Cruz Biotechnology, Inc, 1:500), CgA (Ch-A (H-300): sc-13090, Santa Cruz Biotechnology, Inc, 1:500) nebo β-actinu (A5441, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA, 1:8000), jehož detekce sloužila pro ověření nanášení stejného množství proteinů. Druhý den byly membrány opláchnuty 3 × 10 minut v TBS-Tween a inkubovány 1 hodinu s příslušnou sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Při detekci NSE a β-actinu byla použita protilátka anti-mouse IgG (NA 931, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK, 1:4000), při detekci CgA protilátka anti-rabbit IgG (NA 934, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK, 1:4000 ). Poté byly membrány opláchnuty 3 × 10 minut TBS-Tween a vyvolány pomocí chemiluminiscenční soupravy ECL+ (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) nebo Pierce West Pico (Pierce, Rockford, IL, USA). K detekci signálu byly použity rentgenové filmy (AGFA Gevaert N.V., Belgie). β-actin byl vyvolán pomocí ECL (1.roztok: destilovaná voda, 1M Tris-HCl pH 8,5, coumaric acid, luminol; 2.roztok: destilovaná voda, 1M Tris-HCl pH 8,5, 30% peroxid vodíku). Nakonec byly membrány nabarveny 0,15% amidočerní a odbarveny směsí kyselina octová:methanol:voda (objemové poměry 1:3:6). Úprava jasu a kontrastu naskenovaných filmů byla provedena pomocí softwaru Adobe Photoshop 7.0, denzitometrické hodnocení výsledků pomocí AIDA Image Analyser.

37

5. Výsledky 5.1. Analýza výsledků exprese vybraných markerů neuroendokrinní diferenciace z databáze Oncomine Databáze Oncomine byla použita ke srovnávací analýze dat pocházejících ze studií na zdravých a nádorových tkáních tlustého střeva a prostaty. Analýza probíhala u předem vybraných genů, jejichž produkty jsou exprimovány neuroendokrinními buňkami a změna jejich exprese je spojena s procesem neuroendokrinní diferenciace a s případnou progresí onemocnění. Byly analyzovány tyto geny: neuron-specifická enoláza, chromogranin A, N-kadherin, tubulin β III, neuropeptid Y, gastrin-releasing peptid, cholecystokinin, histidin dekarboxyláza, amino acid dekarboxyláza, somatostatin, tryptophan hydroxyláza 1, 2, gastrin-releasing peptid receptor, serotonin receptor, somatostatin receptor 1, 2, 3, 4, 5, kalcitonin receptor, neuropeptid Y receptor 1, 2, histamin receptor 1, 2, 3, 4. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 1 až 4. Tabulky obsahují jen geny, u nichž byl nalezen statisticky významný rozdíl v genové expresi mezi danými dvěma kategoriemi. Geny, jejichž exprese byla také sledována, ale u nichž nebyly získány žádné výsledky, jsou uvedeny vždy pod příslušnou tabulkou společně s citacemi prací, z nichž použité výsledky pocházejí. Tabulky č. 1 a 2 udávají výsledky analýzy genové exprese u rakoviny prostaty, tabulky č. 3 a 4 udávají výsledky analýzy u rakoviny tlustého střeva. Pro oba druhy rakovinného onemocnění byla sledována změna v expresi příslušného genu mezi nenádorovou a primární nádorovou tkání (tabulky č. 1 a 3) a mezi primární a sekundární nádorovou tkání s metastázami (tabulky č. 2 a 4). Jak je patrné z uvedených tabulek, vybrané geny se ve své expresi s ohledem na typ tkáně významně liší. U každých dvou srovnávaných kategorií existují dvě skupiny genů - u jedné dochází s rozvojem rakovinného onemocnění k růstu, u druhé k poklesu exprese konkrétních genů. U rakoviny prostaty byla nalezena skupina genů, jejichž exprese je zvýšená u primární nádorové tkáně ve srovnání s nenádorovou tkání. Mezi tyto geny patří například tubulin β III a N-kadherin, které jsou považovány za obecné znaky neuroendokrinní diferenciace. Tubulin β III se tedy ukazuje jako možný marker rozvoje rakovinného onemocnění. Zvýšení exprese bylo pozorováno také u gastrin-releasing peptidu, což odpovídá jeho možnému vlivu na rozvoj rakovinného onemocnění, neboť gastrin-releasing peptid v nádorové tkáni prostaty podporuje expresi genů účastnících se angiogeneze, která je součástí procesu tvorby metastáz (Levine et al., 2003). Analýza ukázala také pozitivní korelaci mezi expresí amino acid dekarboxylázy a rozvojem nádorového onemocnění. Amino acid dekarboxyláza má schopnost transaktivovat 38

androgenní receptor (Wafa et al., 2003). Transaktivace androgenního receptoru nezávislá na androgenech je spojena s rozvojem nádorového onemocnění prostaty a s rozvojem procesu neuroendokrinní diferenciace.

tubulin β III neuropeptid Y gastrin-releasing peptid histamin receptor 2 tryptophan hydroxyláza 2 amino acid dekarboxyláza gastrin-releasing peptid receptor histamin receptor 1 neuron-specifická enoláza histidin dekarboxyláza N-kadherin cholecystokinin neuropeptid Y receptor 1

nenádorová tkáň

primární nádorová tkáň

použité studie









     

[3],[4],[5]



     

 







[3]

[6] [1],[5],[8] [3],[4],[6] [3],[9] [7]

[2],[8] [1],[3],[7],[9] [1],[2],[3] [1] [4] [4],[6] [7]

Tabulka č.1. Výsledky analýzy genové exprese vybraných genů z databáze Oncomine u nenádorové a primární nádorové prostatické tkáně. Kromě výše uvedených genů byly dále analyzovány: chromogranin A, somatostatin, serotonin receptor, somatostatin receptor 1,2,3,4,5, kalcitonin receptor, neuropeptid Y receptor 2, histamin receptor 3,4, tryptophan hydroxyláza 1. U těchto genů však nebyla nalezena žádná data do hodnoty P<0,05. Použité studie: [1] Lapointe et al., 2004; [2] Dhanasekaran et al., 2001; [3] Varambally et al., 2005; [4] Welsh et al., 2001; [5] Ramaswamy et al., 2001; [6] Singh et al., 2002; [7] Luo et al., 2001; [8] LaTulippe et al., 2002; [9] Yu et al., 2004. Dalším možným markerem neuroendokrinních buněk je histidin dekarboxyláza. Její exprese odpovídala expresi dalších markerů neudoendokrinní diferenciace u malobuněčného karcinomu plic. Analýza exprese histidin dekarboxylázy umožňovala rozlišit neuroendokrinní nádory a nádory bez neuroendokrinní diferenciace (Matsuki et al., 2003). Na základě analýzy dat z databáze Oncomine je patrné, že u prostatické tkáně je exprese histidin dekarboxylázy vyšší u nenádorové tkáně než u primární nádorové tkáně, avšak u sekundární nádorové tkáně exprese vzrůstá, což by naznačovalo její úlohu v neuroendokrinní diferenciaci a korelaci s rozvojem rakoviny prostaty stejně jako u malobuněčného karcinomu plic. Podobný trend ukázal i výsledek analýzy u NSE, jejíž zvýšená exprese je charakteristickým znakem neuroendokrinní diferenciace. V analyzovaných studiích byla exprese NSE u primární nádorové tkáně nižší než u tkáně zdravé, ale u sekundární nádorové tkáně se její exprese zvyšuje, což může ukazovat na 39

spojení exprese NSE s neuroendokrinní diferenciací a tvorbou metastáz. Překvapivě se nepodařilo prokázat významnou změnu v expresi na úrovni transkripce jednoho ze známých markerů neuroendokrinní diferenciace prostaty – CgA. Na úrovni proteinů je přitom popsáno, že hladina CgA je zvýšena u pacientů s takovým stádiem nádoru prostaty, kdy nádor již není citlivý k aplikované hormonální léčbě (Berruti et al., 2005).

neuron-specifická enoláza tubulin β III N-kadherin gastrin-releasing peptid amino acid dekarboxyláza histidin dekarboxyláza neuropeptid Y receptor 1 histamin receptor 1 neuropeptid Y cholecystokinin histamin receptor 4 tryptophan hydroxyláza 2 gastrin-releasing peptid receptor

primární nádorová tkáň

sekundární nádorová tkáň









     

       







použité studie [2] [3] [3] [1],[3],[5],[9] [3] [3] [9] [1],[2],[3] [9],[10] [3] [3] [10] [9] [9]

Tabulka č.2. Výsledky analýzy genové exprese vybraných genů z databáze Oncomine u primární a sekundární nádorové prostatické tkáně. Kromě výše uvedených genů byly analyzovány: chromogranin A, somatostatin, serotonin receptor, somatostatin receptor 1,2,3,4,5, kalcitonin receptor, neuropeptid Y receptor 2, histamin receptor 2,3, tryptophan hydroxyláza 1. Exprese těchto genů se mezi srovnávanými skupinami významně nelišila. Použité studie: [1] Lapointe et al., 2004; [2] Dhanasekaran et al., 2001; [3] Varambally et al., 2005; [5] Ramaswamy et al., 2001; [9] Yu et al., 2004; [10] Vanaja et al., 2003. Výsledky v tabulkách č. 3 a 4 naznačují, že úloha neuroendokrinní diferenciace nádorových buněk tlustého střeva nemusí být tak zásadní, jako je tomu u rakoviny prostaty. Nižší počet studií, které byly využity, ale neumožňuje jednoznačnou interpretaci. Také u rakoviny tlustého střeva se ukazuje korelace exprese tubulinu β III s rozvojem rakovinného onemocnění, neboť jeho exprese je vyšší u primární nádorové tkáně ve srovnání s nenádorovou tkání. Avšak u sekundární nádorové tkáně je exprese nižší. Naopak exprese N-kadherinu je nižší u primární nádorové tkáně ve srovnání s normální, avšak zvyšuje se u sekundární nádorové tkáně ve srovnání s primární, což by ukazovalo možnou úlohu N-kadherinu v procesu rozvoje neuroendokrinní diferenciace a tvorby metastáz. To již bylo popsáno u rakoviny prostaty, kde 40

zvýšená exprese N-kadherinu byla spojena s tzv. epiteliálním-mesenchymálním přechodem, což je jeden z faktorů ovlivňujících metastatický potenciál rakovinných buněk (Tran et al., 1999). Jako zajímavý se jeví výsledek analýzy exprese gastrin-releasing peptidu, která také stoupá s rozvojem nádorového onemocnění. Aberantní exprese gastrin-releasing peptidu byla detekována u rakoviny tlustého střeva většinou na úrovni mRNA (Carroll et al., 2000). Tato zvýšená exprese bývá spojena s výskytem mutantního receptoru GRP-R, což zamezuje vazbě peptidu. Ve srovnání s primární nádorovou tkání je u sekundární nádorové tkáně tlustého střeva vyšší exprese tryptophan hydroxylázy, která se účastní tvorby serotoninu. Překvapivě u nádoru tlustého střeva analýza ukázala, že exprese NSE je nižší u sekundární nádorové tkáně ve srovnání s primární nádorovou tkání. Použití technologie microarray, umožňující komplexní expresní analýzu genů najedou, je velkým přínosem pro studium celé řady onemocnění. Relativně rychlá a uživatelsky vstřícná analýza dat pomocí databáze Oncomine je efektivním nástrojem pro získání informací o genové expresi v různých typech normální a nádorové tkáně z již provedených studií. Tento typ re-analýzy již existujících experimentálních dat může pomoci při plánování dalších studií a experimentů nutných pro objasnění funkční úlohy konkrétních genů a jejich produktů v karcinogenezi.

histamin receptor 2 amino acid dekarboxyláza tubulin β III gastrin-releasing peptid gastrin-releasing peptid receptor chromogranin A somatostatin receptor 2

nenádorová tkáň

primární nádorová tkáň





   

   





použité studie [11],[12] [13] [5],[13] [5],[14] [5] [12] [13] [13]

Tabulka č.3. Výsledky analýzy genové exprese vybraných genů z databáze Oncomine u nenádorové a primární nádorové tkáně tlustého střeva. Kromě výše uvedených genů byly analyzovány: neuron-specifická enoláza, N-kadherin, somatostatin, neuropeptid Y, cholecystokinin, serotonin receptor, somatostatin receptor 1,2,3,4,5, kalcitonin receptor, neuropeptid Y receptor 1,2, histamin receptor 1,3,4, tryptophan hydroxyláza 1,2, histidin dekarboxyláza. Exprese těchto genů se mezi srovnávanými skupinami významně nelišila. Použité studie: [5] Ramaswamy et al., 2001; [11] Alon et al., 1999; [12] Notterman et al., 2001; [13] Graudens et al., 2006; [14] Zou et al., 2002.

41

N-kadherin tryptophan hydroxyláza 2 gastrin-releasing peptid neuron-specifická enoláza tubulin β III histamin receptor 1 amino acid dekarboxyláza

primární nádorová tkáň

sekundární nádorová tkáň




    

  






použité studie [15] [13] [5] [13] [13] [13] [15] [13]

Tabulka č.4. Výsledky analýzy genové exprese vybraných genů z databáze Oncomine u primární a sekundární nádorové tkáně tlustého střeva. Kromě výše uvedených genů byly analyzovány: chromogranin A, somatostatin, neuropeptid Y, cholecystokinin, gastrin-releasing peptid receptor, serotonin receptor, somatostatin receptor 1,2,3,4,5, calcitonin receptor, neuropeptid Y receptor 1,2, histamin receptor 2,3,4, tryptophan hydroxyláza 1, histidin dekarboxyláza. Exprese těchto genů se mezi srovnávanými skupinami významně nelišila. Použité studie: [5] Ramaswamy et al., 2001; [13] Graudens et al., 2006; [15] Bittner et al., 2005.

5.2. Exprese vybraných markerů neuroendokrinní diferenciace u buněčné linie LNCaP kultivované in vitro Cílem této části práce bylo zavést model neuroendokrinní diferenciace u in vitro kultivované buněčné linie LNCaP, který by mohl být dále využíván pro studium tohoto procesu.

Obr. 9. Schéma znázorňující uspořádání pokusu sledování exprese vybraných markerů neuroendokrinní diferenciace u buněčné linie LNCaP.

42

Buněčná linie LNCaP byla vyseta v hustotě 2 × 104 buněk na cm2 Petriho misky o ploše dna 60 cm2. Pro účely měření buněčného cyklu byly buňky vysety na Petriho misky o ploše dna 21 cm2. Jako kultivační médium bylo použito médium RPMI 1640 s 10 % FBS. Po dvou dnech bylo u části buněk vyměněno medium za čerstvé médium RPMI 1640 s přídavkem 10 % FBS. Tyto buňky byly použity jako kontrola. U ostatních buněk bylo standardní kultivační médium vyměněno za médium s přídavkem 5 % CS (Obr. 9). V čase 2, 4, 8 a 16 dní po výměně média byly buňky sbírány a fixovány pro účely měření buněčného cyklu nebo použity na přípravu proteinových extraktů pro analýzu proteinové exprese. Během pokusu byly kontrolní buňky kultivované v médiu s 10 % FBS jednou týdně pasážovány a jednou týdně bylo vyměněno médium. U buněk, které byly pěstovány v médiu s 5 % CS, bylo během kultivace dvakrát týdně vyměněno médium za čerstvé.

Obr. 10. Výsledky analýzy exprese NSE a CgA u buněčné linie LNCaP po dlouhodobé kultivaci v médiu s 5 % CS. Byla sledována exprese NSE a CgA. Jako kontrola nanesení stejného množství proteinů byla sledována hladina β-actinu. Čísla pod obrázky udávají poměr optické denzity sledovaného proteinu k β-actinu a jsou vztažené ke kontrolnímu vzorku (2 dny).

43

A) 10% FBS G0/G1 fáze – 70.38 % G2/M fáze – 8.17 % S fáze – 21.45 % frekvence

5% CS G0/G1 fáze – 88.07 % G2/M fáze – 10.67 % S fáze – 1.26 % frekvence

propidium iodid (FL2-A)

propidium iodid (FL2-A)

B) Buněčný cyklus 100 90 80 % buněk

70 60 50 40 30 20 10 0 0

2

4

8

16 dny

G0/G1 fáze G2/M fáze S fáze

Obr. 11. Výsledky měření buněčného cyklu metodou průtokové cytometrie. A) reprezentativní histogramy výsledků měření buněčného cyklu – vlevo buňky kultivované 8 dní v médiu s 10 % FBS, vpravo buňky LNCaP kultivované 8 dní v médiu s 5 % CS. Červená oblast grafu znázorňuje buňky v G0/G1 fázi, zelená oblast jsou buňky v G2/M fázi, oblast mezi nimi představuje v buňky S fázi buněčného cyklu. B) graf zobrazující průchod buněk LNCaP buněčným cyklem během kultivace v médiu s 5 % CS. Jako kontrola v čase 0 brány hodnoty pro LNCaP kultivované 2 dny v médiu s 10 % FBS.

44

Metodou „western blot“ byla stanovena změna proteinové exprese NSE (48 kDa) a CgA (6880 kDa) jako markerů neuroendokrinní diferenciace. Ta byla navozena kultivací buněčné linie LNCaP v médiu s 5 % CS, které neobsahuje androgeny, na jejichž přítomnost je buněčná linie LNCaP citlivá. Jak je vidět na obr. 10, kultivací v médiu s 5 % CS došlo ke zvýšení exprese NSE, což je obecný marker neuroendokrinní diferenciace. Zvýšení je patrné už po dvou dnech kultivace buněk v mediu s 5 % CS ve srovnání s kontrolou. Nejvyšší exprese NSE bylo dosaženo po šestnácti dnech kultivace v médiu bez androgenů, kdy nárůst byl trojnásobný. Dalším sledovaným markerem byl CgA. Exprese tohoto znaku byla detekována, avšak ani dlouhodobá kultivace buněk v médiu bez androgenů nevedla k výrazné změně v expresi CgA. V rámci pokusu byl sledován také tubulin β III, jehož expresi se v tomto uspořádání experimentu u buněk LNCaP nepodařilo zachytit. Součástí pokusu bylo i stanovení vlivu kultivace v médiu bez androgenů na průchod buněk buněčným cyklem. Buňky byly fixovány a jejich zastoupení v jednotlivých fázích buněčného cyklu bylo stanoveno pomocí průtokového cytometru na základě detekce obsahu DNA. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 11. Ve srovnání s kontrolními buňkami kultivovanými v 10% FBS se buňky kultivované v 5% CS hromadí v G0/G1 fázi buněčného cyklu, v G2/M fázi je procento buněk srovnatelné s kontrolou a významně nižší je množství buněk v S fázi buněčného cyklu. Zastoupení buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu se ustálilo po osmi dnech kultivace v 5% CS a mezi výsledky získanými měřením osmého a šestnáctého dne kultivace již není významný rozdíl. Cílem praktické části této práce bylo ustanovit model kultivace buněčné linie LNCaP in vitro, který by umožňoval v další fázi studovat možnosti modulace neuroendokrinní diferenciace. Jak je vidět z výsledků, dlouhodobá kultivace buněk LNCaP v médiu s 5 % CS vedla k navození neuroendokrinní diferenciace, což se potvrdilo zvýšením exprese NSE. Zároveň je ukázáno, že buňky dlouhodobě kultivované v médiu bez androgenů zastavují svůj buněčný cyklus v G0/G1 fázi a jejich zastoupení v S fázi buněčného cyklu výrazně klesá.

45

Závěr Rakovina prostaty a tlustého střeva patří mezi onemocnění s vysokou incidencí nejen v České republice, ale také ve světě. Proto je cílem mnoha vědeckých studií získat poznatky o mechanismech, které se účastní vzniku a rozvoje těchto onemocnění, a na jejich základě navrhnout nové možnosti chemoprevence a terapie. Protože je karcinogeneze komplexní proces, je potřeba poznat a definovat jednotlivé faktory, které jsou v tomto procesu klíčové. Rozvoj

rakoviny

prostaty

je

spojen

s procesem

neuroendokrinní

diferenciace.

Neuroendokrinní buňky zapojené v tomto procesu mohou prostřednictvím látek, které vylučují, ovlivňovat okolní prostředí nádoru a podporovat tak progresi onemocnění. Komplikací, kterou neuroendokrinní diferenciace u rakovinných buněk prostaty způsobuje, je skutečnost, že neuroendokrinní buňky přestávají být senzitivní k běžně aplikované anti-androgenní léčbě a nepodléhají apoptóze. Naopak buněčné klony, které mohou z neuroendokrinních buněk vznikout, pravděpodobně začnou opět intenzivně proliferovat a mohou tvořit metastázy. Pravděpodobnost vyléčení pacienta v takovém stadiu onemocnění je výrazně nižší. Jedním z přístupů, jak monitorovat průběh onemocnění či účinnost léčby, by mohlo být sledování markerů neuroendokrinní diferenciace například v séru nebo tkáních pacienta. Možný potenciál v oblasti léčby skrývá aplikace antagonistů a inhibitorů růstových mediátorů produkovaných neuroendokrinními buňkami. Klíčovým předpokladem pro účinné zásahy do procesu neuroendokrinní diferenciace je poznání signálních drah, které k ní vedou. Z toho pohledu může být zásadní signální dráha prozánětlivého cytokinu IL-6, který může významně podporovat progresi nádoru prostaty prostřednictvím indukce neuroendokrinní diferenciace. Modulace signální dráhy IL-6 zahrnující Jak/STAT3 nebo aplikace inhibitorů jednotlivých složek dráhy by mohly vést k účinné chemoprevenci i zpomalení progrese onemocnění. V porovnání s nádorovým onemocněním prostaty je proces neuroendokrinní diferenciace u rakoviny tlustého střeva mnohem méně popsaný. Také frekvence neuroendokrinních nádorů tlustého střeva je nižší než u rakoviny prostaty. Přesto i zde je neuroendokrinní diferenciace spojena s rozvojem agresivnějšího typu nádorového onemocnění. Je zde však nutný další výzkum pro objasnění funkční spojitosti tvorby neuroendokrinních nádorů tlustého střeva a progresí onemocnění. V poslední době se v oblasti výzkumu exprese genů zahrnutých do procesů spojených s rakovinným onemocněním využívá technologie microarray. Odhalení genů nebo skupin genů,

46

jejichž exprese je během rakovinného onemocnění změněna, pomůže objasnit některé mechanismy, které by mohly mít vliv na jeho progresi. Závěrem lze shrnout, že proces neuroendokrinní diferenciace má významnou úlohu zejména v rozvoji nádorového onemocnění prostaty. Poznání mechanismů, které jsou spojeny se vznikem a rozvojem tohoto procesu a objasnění signálních drah, které jsou v něm zapojeny, by mohlo vést k efektivnímu upravení dnes běžně užívané hormonální terapie, případně k aplikaci jiného, účinnějšího typu léčby.

47

Literatura •

Abrahamsson, P.-A. 1999. Neuroendocrine cells in tumour growth of the prostate. Endocr.-Relat. Cancer 6: 503-519.

•

Adolf, K., Wagner, L., Bergh, A., Stattin, P., Ottosen, P., Borre, M., BirkenkampDemtröder, K., Ørntoft, T.F. and Tørring, N. 2007. Secretagogin is a new neuroendocrine marker in the human prostate. Prostate 67: 472-484.

•

Alon, U., Barkai, N., Notterman, D.A., Gish, K., Ybarra, S., Mack, D. and Levine, A.J. 1999. Broad patterns of gene expression revealed by clustering analysis of tumor and normal colon tissues probed by oligonucleotide arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6745-6750.

•

Barton, B.E., Karras, J.G., Murphy, T.F., Barton, A. and Huang, H.F. 2004. Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) activation in prostate cancer: Direct STAT3 inhibition induces apoptosis in prostate cancer lines. Mol. Cancer Ther. 3: 11-20.

•

Bernick, P.E., Klimstra, D.S., Shia, J., Minsky, B., Saltz, L., Shi, W., Thaler, H., Guillem, J., Paty, P., Cohen, A.M. and Wong, W.D. 2004. Neuroendocrine carcinomas of the colon and rectum. Dis. Colon. Rectum. 47: 163-169.

•

Berruti, A., Mosca, A., Tucci, M., Terrone, C., Torta, M., Tarabuzzi, R., Russo, L., Cracco, C., Bollito, E., Scarpa, R.M., Angeli, A. and Dogliotti, L. 2005. Independent prognostic role of circulationg chromogranin A in prostate cancer patiens with hormonerefractory disease. Endocr.-Relat. Cancer 12: 109-117.

•

Best, C.J., Gillespie, J.W., Yajun, Y., Chandramouli, G.V., Perlmutter, M.A., Gathright, Y., Ericsson, H.S., Georgevich, L., Tangrea, M.A., Duray, P.H., González, S., Velasco, A., Linehan, W.M., Matusik, R.J., Price, D.K., Figg, W.D., Emmert-Buck, M.R. and Chuaqui, R.F. 2005. Molecular alterations in primary prostate cancer after androgen ablation therapy. Clin. Cancer Res. 11: 6823-6834.

•

Bittner, M. 2005. A Windows of the dynamics of biological switches. Nat. Biotechnol. 23: 232-237.

•

Burgoyne, R.D., Cambray-Deakin, M.A., Lewis, S.A., Sarkar, S. and Cowan, N.J. 1988. Differential distribution of β-tubulin isotypes in cerebellum. EMBO J. 7: 23112319.

•

Cardillo, M., Berchem, G., Tarkington, M.A., Krajewski, S., Krajewski, M., Reed, J.C., Tehan, J., Ortega, L., Lage, J. and Gelmann, E.P. 1997. Resistance to apoptosis

48

and up regulation of Bcl-2 in benign prostatic hyperplasia after androgen deprivation. J. Urol. 158: 212-216. •

Carroll, R.E., Ostrovskiy, D., Lee, S., Danilkovich, A. and Benya, R.V. 2000. Characterisation of gastrin-releasing peptide and its receptor abberantly expressed by human colon cancer cell lines. Mol. Pharmacol. 58: 601-607.

•

Cianchi, F., Cortesini, C., Schiavone, N., Perna, F., Magnelli, L., Fanti, E., Bani, D., Messerini, L., Fabbroni, V., Perigli, G., Capaccioli, S. and Masini, E. 2005. The role of cyclooxygenase-2 in mediating the effects of histamine on cell proliferation and vascular endothelial growth factor production in colorectal cancer. Clin. Cancer Res. 11: 6807-6815.

•

Collins, A.T. and Maitland, N.J. 2006. Prostate cancer stem cells. Eur. J. Cancer 42: 1213-1218.

•

Colucci, R., Blandizzi, C., Tanini, M., Vassalle, C., Breschi, M.C. and Del Tacca, M. 2005. Gastrin promotes human colon cancer cell growth via CCK-2 receptor-mediated cyclooxygenase-2 induction and prostaglandin E2 production. Br. J. Pharmacol. 144: 338-348.

•

Culig, Z. and Bartsch, G. 2006. Androgen axis in prostate cancer. J. Cell. Biochem. 99: 373-381.

•

De La Taille, A., Vacherot, F., Salomon, L., Druel, C., Gil Diez de Medina, S., Abbou, C., Buttyan, R. and Chopin, D. 2001. Hormone-refractory prostate cancer: a multi-step and multi-event process. Prostate Cancer P. D. 4:204-212.

•

De Marzo, A.M., Platz, E.A., Sutcliffe, S., Xu, J., Gronberg, H., Drake, C.G., Nakai, Y., Isaacs, W.B. and Nelson, W .G. 2007. Inflammation in prostate carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer 7: 256-269.

•

Deeble, P.D., Murphy, D.J., Parsons, S.J. and Cox, M.E. 2001. Interleukin-6- and cyclic AMP-mediated signaling potentiates neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate tumor cells. Mol. Cell. Biol. 21: 8471-8482.

•

Delongchamps, N.B., Singh, A. and Haas, G. P. 2006. The role of prevalence in the diagnosis of prostate cancer. Cancer Control 13: 158-168.

•

Derycke, L.D. and Bracke, M.E. 2004. N-cadherin is the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. Int. J. Dev. Biol. 48: 463-476.

•

Dhanasekaran, S.M., Barrette, T.R., Ghosh, D., Shah, R., Varambally, S., Kurachi, K., Pienta, K.J., Rubin, M.A. and Chinnaiyan, A.M. 2001. Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. Nature 412: 822-826. 49

•

Dráberová, E., Lukáš, Z., Ivanyi, D., Viklický, V. and Dráber, P. 1998. Expression of class III β-tubulin in normal and neoplastic human tissue. Histochem. Cell. Biol. 109: 231-239.

•

Dušek, L., Mužík, J., Kubásek, M., Koptíková, J., Žaloudík, J. and Vyzula, R. 2005. Český národní webový portál epidemiologie nádorů (online). Masarykova univerzita, dostupný z WWW: http://www.svod.cz.

•

Edelmann, L., Hanson, P.I., Chapman, E.R. and Jahn, R. 1995. Synaptobrevin binding to synaptophysin: a potential mechanism for controlling the exocytotic fusion machine. EMBO J. 14: 224-231.

•

Fearon, E.R. and Vogelstein, B. 1990. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61: 759-767. in Wang, W.S., Chen, P.M. and Su, Y. 2006. Colorectal carcinoma: from tumorigenesis to treatment. Cell. Mol. Life Sci. 63: 663-671.

•

Fernandez, E., Gallus, S., La Vecchia, C., Talamini, R., Negri, E. and Franceschi, S. 2004. Family history and environmental risk factors for colon cancer. Cancer. Epidemiol. Biomarkers Prev. 13: 658-661.

•

George, D.J., Halabi, S., Shepard, T.F., Sanford, B., Vogelzang, N.J., Small, E.J. and Kantoff, P.W. 2005. The prognostic significance of plasma interleukin-6 levels in patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer: results from cancer and leukemia group B 9480. Clin. Cancer Res. 11: 1815-1820.

•

Giri, D., Ozen, M. and Ittmann, M. 2001. Interleukin-6 is an autocrine growth factor in human prostate cancer. Am. J. Pathol. 159: 2159-2165.

•

Gould, V.E., Linnoila, R.I., Memoli, V.A. and Warren W.H. 1983. Neuroendocrine components of the bronchopulmonary tract: hyperplasia, dysplasia, and neoplasms. Lab. Incest. 49: 519-537. In Saclarides, T.J., Szeluga, D. and Staren, E.D. 1994. Neuroendocrine cancers of the colon and rectum. Results of a ten-year experience. Dis. Colon Rectum 37: 635-642.

•

Grabowski, P., Schindler, I., Anagnostopoulos, I., Foss, H.D., Riecken, E.-O., Mansmann, U., Stein, H., Berger, G., Buhr, H.-J. and Scherübl, H. 2001. Neuroendocrine differentiation is a relevant prognostic factor in stage III–IV colorectal cancer. Eur. J. Gastroen. Hepat. 13: 405-411.

•

Grabowski, P., Schınfelder, J., Ahnert-Hilger, G., Foss, H.-D., Heine, B., Schindler, I., Stein, H., Berger, G., Zeitz, M and Scherübl, H. 2002. Expression of neuroendocrine markers: a signature of human undifferentiated carcinoma of the colon and rectum. Virchows Arch. 441: 256-263. 50

•

Grabowski, P., Schınfelder, J., Ahnert-Hilger, G., Foss, H.-D., Stein, H., Berger, G., Zeitz, M. and Scherübl, H. 2004. Heterogenous expression of neuroendocrine marker proteins in human undifferentiated carcinoma of the colon and rectum. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1014: 270-274.

•

Graudens, E., Boulanger, V., Mollard, C., Mariage-Samson, R., Barlet, X., Grémy, G., Couillault, C., Lajémi, M., Piatier-Tonneau, D., Zaborski, P., Eveno, E., Auffray, C. and Imbeaud, S. 2006. Deciphering cellular states of innate tumor drug responses. Genome Biol. 7: R19.1-R19.21.

•

Grobholz, R., Griebe, M., Sauer, C.G., Michel, M.S., Trojan, L. and Bleyl, U. 2005. Influence of neuroendocrine tumor cells on proliferation in prostatic carcinoma. Hum. Pathol. 36: 562-570.

•

Herber, O., Pacík, D. and Urban, M. 2005. Onemocnění prostaty. Doporučený diagnostický a léčebný postup pro všeobecné praktické lékaře. CPD-PL, Praha

•

Hobisch, A., Eder, I.E., Putz, T., Horninger, W., Bartsch, G., Klocker, H. and Culig, Z. 1998. Interleukin-6 regulates prostate-specific protein expression in prostate carcinoma cells by activation of the androgen receptor. Cancer Res. 58: 4640-4645.

•

Hoosein, N., Abdul, M., McCabe, R., Gero, E., Deftos, L., Banks, M., Hodges, S., Finn, L. and Logothetis, C. 1995. Clinical significance of elevation in neuroendocrine factors and interleukin-6 in metastatic prostate cancer. Urol. Oncol. 1:246-251.

•

Horoszewicz, J.S., Leong, S.S., Kawinski, E., Karr, J.P., Rosenthal, H., Chu, T.M., Mirand, E.A. and Murphy, G.P. 1983. LNCaP model of human prostatic carcinoma. Cancer Res. 43: 1809-1818.

•

Huang, J., Yao, J.L., Di Sant´Agnese, P.A., Yang, Q., Bourne, P.A. and Na, Y. 2006. Immunohistochemical characterization of neuroendocrine cells in prostate cancer. Prostate 66: 1399-1406.

•

Humphrey, P.A. 2004. Gleason grading and prognostic factors in carcinoma of the prostate. Modern Pathol. 17: 292-306.

•

Chejfec, G., Falkmer, S., Askenstein, U, Crimelius, L., Goud, V.E. 1988. Neuroendocrine carcinoma of the gastrointestinal tract. Pathol. Res. Pract. 183: 143-154. In Saclarides, T.J., Szeluga, D. and Staren, E.D. 1994. Neuroendocrine cancers of the colon and rectum: Results of a ten-year experience. Dis. Colon Rectum 37: 635-642.

•

Chigurupati, S., Kulkarni, T., Thomas, S. and Shah, G. 2005. Calcitonin stimulates multiple stages of angiogenesis by directly acting on endothelial cells. Cancer Res. 65: 8519-8529. 51

•

Isaacs, J.T. and Coffey, D.S. 1989. Etiology and disease proces of benign prostatic hyperplasia. Prostate Suppl. 2:33-50.

•

Ishimaru, H., Kageyama, Y., Hayashi, T., Nemoto, T., Eishi, Y. and Kihara, K. 2002. Expression of matrix metalloproteinase-9 and bombesin/gastrin-releasing peptid in human prostate cancer and their lymph node metastases. Acta Oncol. 41: 289-296.

•

Iwamura, M., Abrahamsson, P.-A., Benning, C.M., Cockett, A.T.K. and

Di

Sant´Agnese, P.A. 1994a. Androgen receptor immunostaining and its tissue distribution in formalin-fixed, paraffin-embedded section after microwave treatment. J. Histochem. Cytochem. 42: 783-788. •

Iwamura, M., Di Sant´Agnese, P.A., Wu, G., Benning, C.M., Cockett, A.T. and Gershagen, S. 1994b. Overexpression of human epidermal growth factor receptor and cerbB-2 by neuroendocrine cells in normal prostatic tissue. Urology 43: 838-843.

•

Kamiya, N., Akakura, K., Suzuki, H., Isshiki, S., Komiya, A., Ueda, T. and Ito, H. 2003. Pretreatment serum level of neuron specific enolase (NSE) as a prognostic factor in metastatic prostate cancer patients treated with endocrine therapy. Eur. Urol. 44: 309314.

•

Khan, J., Saal, L.H., Bittner, M.L., Chen, Y., Trent, J.M. and Meltzer, P.S. 1999. Expression profilig in cancer using cDNA microarrays. Electrophoresis 20: 223-229.

•

Kidd, M., Modlin, I.M., Mane, S.M., Camp, R.L. and Shapiro, M.D. 2006. Q RT-PCR detection of chromogranin A: a new standard in the identification of neuroendocrine tumor disease. Ann. Surg. 243: 273-280.

•

Klöppel, G. and Anlauf, M. 2005: Epidemiology, tumour biology and histopathological classification of neuroendocrine tumours of the gastrointestinal tract. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 19: 507-517.

•

Lam, J.S. and Reiter, R.E. 2006. Stem cells in prostate cancer development. Urol. Oncol.Semin. Orig. Investig. 24:131 –140.

•

Lapointe, J., Li, C., Higgins, J.P., van de Rijn, M., Bair, E., Montgomery, K., Ferrari, M., Egevad, L., Rayford, W., Bergerheim, U., Ekman, P., DeMarzo, A.M., Tibshirani, R., Botstein, D., Brown, P.O., Brooks, J.D. and Pollack, J.R. 2004. Gene expression profiling identifies clinically relevant subtypes of prostate cancer. Proc. Natl. Acad Sci USA 101: 811-816.

•

LaTulippe, E., Satagopan, J., Smith, A., Scher, H., Scardino, P., Reuter, V. and Gerald, W.L. 2002. Comprehensive gene expression analysis of prostate cancer reveals

52

distinct transcriptional programs associated with metastatic disease. Cancer Res. 62: 4499-4506. •

Lawson, D.A., Xin, L., Lukacs, R.U., Cheng, D. and Witte, O.N. 2007. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 104: 181186.

•

Levine, L., Lucci, J.A., III., Pazdrak, B., Cheng, J.-Z., Guo, Y.-S., Townsend, C.M., Jr. and Hellmich, M.R. 2003. Bombesin stimulates nuclear factor κB activation and expression of proangiogenic factors in prostate cancer cells. Cancer Res. 63: 3495-3502.

•

Lin, D.-L., Whitney, M.C., Yao, Z. and Keller, E.T. 2001. Interleukin-6 induces androgen responsiveness in prostate cancer cells through up-regulation of androgen receptor expression. Clin. Cancer Res. 7: 1773-1781.

•

Liu, A.Y., True, L.D., LaTray, L., Nelson, P.S., Ellis, W.J., Vessella, R.L., Lange, P.H., Hood, L. and Van Den Engh, G. 1997. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10705-10710.

•

Luo, J., Duggan, D.J., Chen, Y., Sauvageot, J., Ewing, C.M., Bittner, M.L., Trent, J.M. and Isaacs, W.B. 2001. Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasia: molecular dissection by gene expression profiling. Cancer Res. 61: 4683-4688.

•

Marcelli, M., Ittmann, M., Mariani, S., Sutherland, R., Nigam, R., Murthy, L., Zhao, Y., DiConcini, D., Puxeddu, E., Esen, A., Eastham, J., Weigel, N. and Lamb, D.J. 2000. Androgen receptor mutations in prostate cancer. Cancer Res. 60: 944-949.

•

Matsuki, Y., Tanimoto, A., Hamada, T. and Sasaguri, Y. 2003. Histidine decarboxylase expression as a new sensitive and specific marker for smal cell lung carcinoma. Mod. pathol. 16: 72-78.

•

McDonald, S.A., Preston, S.L., Lovell, M.J., Wright, N.A. and Jankowski, J.A. 2006. Mechanisms of disease: from stem cells to colorectal cancer. Nat. clin. pract. gastroenterol. hepatol. 3:267-274.

•

Mizokami, A., Koh, E., Fujita, H., Maeda, Y., Egawa, M., Koshida, K., Honma, S., Keller, E.T. and Namiki, M. 2004. The adrenal androgen androstenediol is present in prostate cancer tissue after androgen deprivation therapy and activates mutated androgen receptor. Cancer Res. 64: 765-771.

•

Nelson, W.G., De Marzo, A.M. and Isaacs, W.B. 2003. Prostate Cancer. N. Engl. J. Med. 349: 366-381.

•

Nobels, F.R., Kwekkeboom, D.J., Coopmans, W., Schoenmakers, C.H., Lindemans, J., De Herder, W.W., Krenning, E.P., Bouillon, R. and Lamberts, S.W. 1997. 53

Chromogranin A as serum mareker for neuroendocrine neoplasia: comparison with neuron-specific enolase and the α-subunit of glycoprotein hormones. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 2622-2628. •

Norat,T., Bingham, S., Ferrari, P., Slimani, N., Jenab, M., Mazuir, M., Overvad, K., Olsen, A., Tjønneland, A., Clavel, F., Boutron-Ruault, M.-C., Kesse, E., Boeing, H., Bergmann, M.M., Nieters, A., Linseisen, J., Trichopoulou, A., Trichopoulos, D., Tountas, Y., Berrino, F., Palli, D., Panico, S., Tumino, R., Vineis, P., Bueno-deMesquita, H.B., Peeters, P.H., Engeset, D., Lund, E., Skeie, G., Ardanaz, E., González, C., Navarro, C., Quirós, J.R., Sanchez, M.-J., Berglund, G., Mattisson, I., Hallmans, G., Palmqvist, R., Day, N.E., Khaw, K.-T., Key, T.J., San Joaquin, M., Hémon, B., Saracci, R., Kaaks, R. and Riboli, E. 2005. Meat, fish, and colorectal cancer risk: the European Prospective Investigation into cancer and nutrition. J. Natl. Cancer Inst. 97: 906-916.

•

Notterman, D.A., Alon, U., Sierk, A.J. and Levine, A.J. 2001. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res. 61: 3124-3130.

•

ƠConnor, D.T., Pandlan, M.R., Carlton, E., Cervenka, J.H. and Hslao, R.J. 1989. Rapid radioimmunoassay of circulating chromogranin A: in vitro stability, exploration of the neuroendocrine character of neoplasia, and assessment of the effects of organ failure. Clin. Chem. 35: 1631-1637.

•

Ozawa, H. and Takata, K. 1995. The granin family – ist role in sorting and secretory granule formation. Cell Struct. Funct. 20: 415-420.

•

Perou, C.M., Sørlie, T., Eisen, M.B., van de Rijn, M., Jeffrey, S.S., Rees, C.A., Pollack, J.R., Ross, D.T., Johnsen, H., Akslen, L.A., Fluge, Ø, Pergamenschikov, A., Williams, C., Zhu, S.X., Lønning, P.E., Børresen-Dale, A.-L., Brown, P.O. and Botstein, D. 2000. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 406: 747-752.

•

Pintér, E., Helyes, Z. and Szolcsányi, J. 2006. Inhibitory effect of somatostatin on inflammation and nociception. Pharmacol. Ther. 112: 440-456.

•

Raffo, A.J., Perlman, H., Chen, M.-W., Day, M.L., Streitman, J.S. and Buttyan, R. 1995. Overexpression of bcl-2 protects prostate cancer cells from apoptosis in vitro and confers resistance to androgen depletion in vivo. Cancer Res. 55: 4438-4445.

•

Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, C.-H., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., LaTullipe, E., Mesirov, J.P., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M.,

54

Lander, E.S. and Golub, T.R. 2001. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 15149-15154. •

Ranno, S., Motta, M., Rampello, E., Risino, C., Bennati, E. and Malaguarnera, M. 2006. The chromogranin-A (CgA) in prostate cancer. Arch. Gerontol. Geriatr. 43: 117126.

•

Renehan, A.G., O´Dwyer, S.T., Haboubi, N.J. and Potten, C.S. 2002. Early cellular events in colorectal carcinogenesis. Colorectal dis. 4: 76-89.

•

Rhodes, D.R. and Chinnaiyan, A.M. 2005. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat Genet. Suppl. 34:S31-S37.

•

Rhodes, D.R., Kalyana-Sundaram, S., Mahavisno, V., Varambally, R., Yu, J., Briggs, B.B., Barrette, T.R., Anstet, M.J., Kincead-Beal, C., Kulkarni, P., Varambally, S., Ghost, D. and Chinnaiyan, A.M. 2007. Oncomine 3.0: genes, pathways, and networks in a collection of 18 000 cancer gene expression profiles. Neoplasia 9: 166-180.

•

Rider, C.C. and Taylor, C.B. 1975. Enolase isoenzymes. II. Hybridization studies, developmental and phylogenetic aspects. Biochim. Biophys. Acta 405: 175-187. In Piast, M., Kustrzeba-Wójcicka, I., Matusiewicz, M. and Banaś, T. 2005. Molecular evolution of enolase. Acta Biochim. Pol. 52: 507-513.

•

Rizzo, S., Attard, G. and Hudson, D.L. 2005. Prostate epithelial stem cells. Cell Prolif. 38: 363-374.

•

Ruizeveld De Winter, J.A., Trapman, J., Vermey, M., Mulder, E., Zegers, N.D. and Van Der Kwast, T.H. 1991. Androgen receptor expression in human tissues: an immunohistochemical study. J. Histochem. Cytochem. 39: 927-936.

•

Ruscica, M., Dozio, E., Boghossian, S., Bovo, G., Martos Riaño, V., Motta, M. and Magni, P. 2006. Activation of the Y1 receptor by neuropeptide Y regulates the growth of prostate cancer cells. Endocrinology 147: 1466-1473.

•

Saclarides, T.J., Szeluga, D. and Staren, E.D. 1994. Neuroendocrine cancers of the colon and rectum: Results of a ten-year experience. Dis. Colon Rectum 37: 635-642.

•

Shariff, A.H. and Ather, M.H. 2006. Neuroendocrine differentiation in prostate cancer. Urology 68: 2-8.

•

Schalken, J.A. and Van Leenders, G. 2003. Cellular and molecular biology of the prostate: Stem cell biology. Urology 62: 11-20.

•

Singh, D., Febbo, P.G., Ross, K., Jackson, D.G., Manola, J., Ladd, C., Tamayo, P., Renshaw, A.A., D´Amico, A.V., Richie, J.P., Lander, E.S., Loda, M., Kantoff, P.W.,

55

Golub, T.R. and Sellers, W.R. 2002. Gene expression correlates of clinical prostate cancer behavior. Cancer Cell 1: 203-209. •

Smith, A.D. and Winkler, H. 1967. Purification and properties of an acidit protein from chromaffin granules of bovine adrenal medula. Biochem. J. 103: 483-492.

•

Sudhof, T.C. and Jahn, R. 1991. Proteins of synaptic vesicles involved in exocytosis and membrane recycling. Neuron 6: 665-677.

•

Študent, V., Grepl, M., Král, M., Hartmann, I. and Hrabec, M. 2006. PSA a včasná detekce karcinomu prostaty. Urol. Listy 4: 35-37.

•

Tang, D.G., Patrawala, L., Calhoun, T., Bhatia, B., Choy, G., Schneider-Broussard, R. and Jeter, C. 2007. Prostate cancer stem/progenitor cells: identification, characterization and implication. Mol. Carcinog. 46: 1-14.

•

Tanguay, S., Bégin, L.R., Elhilali, M. M., Behlouli, H., Karakiewicz, P.I. and Aprikian, A.G. 2002. Comparative evaluation of total PSA, free/total PSA, and complexed PSA in prostate cancer detection. Urology 59: 261-265.

•

Tomita, K., van Bokhoven, A., van Leenders, G.J., Ruijter, E.T., Jansen, C.F., Bussemakers, M.J. and Schalken, J.A. 2000. Cadherin switching in human prostate cancer progression. Cancer Res. 60: 3650-3654.

•

Tran, N.L., Nagle, R.B., Cress, A.E. and Heimark, R.L. 1999. N-Cadherin expression in human prostate carcinoma cell lines: An epithelial-mesenchymal transformation mediating adhesion with stromal cells. Am. J. Pathol. 155: 787-798.

•

Twillie, D.A., Eisenberger, M.A., Carducci, M.A., Hseih, W.-S., Kim, W.Y. and Simons, J.W. 1995. Interleukin-6: a candidate mediator of human prostate cancer morbidity. Urology 45: 542-549.

•

Valtorta, F., Pennuto, M., Bonanomi, D. and Benfenati, F. 2004. Synaptophysin: leading actor of walk-on role in synaptic vesicle exocytosis? Bioessays 26: 445-453.

•

Vanaja, D.K., Cheville, J.C., Iturria, S.J. and Zouny, C.Y. 2003. Transcriptional silencing of zinc finger protein 185 identified by expression profiling is associated with prostate cancer progression. Cancer Res. 63: 3877-3882.

•

Varambally, S., Yu, J., Laxman, B., Rhodes, D.R., Mehra, R., Tomlins, S.A., Shah, R.B., Chandran, U., Monzon, F.A., Becich, M.J., Wie, J.T., Pienta, K.J., Ghosh, D., Rubin, M.A. and Chinnaiyan, A.M. 2005. Integrative genomic and proteomic analysis of prostate cancer reveals signatures of metastatic progression. Cancer Cell 8: 393-406.

•

Vashchenko, N. and Abrahamsson, P.-A. 2005. Neuroendocrine differentiation in prostate cancer: implications for new treatment modalities. Eur. Urol. 47: 147-155. 56

•

Wafa, L.A., Cheng, H., Rao, M.A., Nelson, C.C., Cox, M., Hirst, M., Sadowski, I. and Rennie, P.S. 2003. Isolation and identification of L-dopa decarboxylase as a protein that binds to and enhances transcriptional aktivity of the androgen receptor using the repressed transactivatot yeast two-hybrid system. Biochem. J. 375: 373-383.

•

Wang, W.S., Chen, P.M. and Su, Y. 2006. Colorectal carcinoma: from tumorigenesis to treatment. Cell. Mol. Life Sci. 63: 663-671.

•

Ward, L., Howlett, G.J., Discolo, G., Yasukawa, K., Hammacher, A., Moritz, R.L. and Simpson, R.J. 1994. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gp-130. J. Biol. Chem. 269: 23286-23289.

•

Welsh, J.B., Sapinoso, L.M., Su, A.I., Kern, S.G., Wang-Rodriguez, J.W., Moskaluk, C.A., Frierson, H.F., Jr. and Hampton, G.M. 2001. Analysis of gene expression identifies candidate markers and pharmacological targets in prostate cancer. Cancer Res. 61: 5974-5978.

•

Wu, C. and Huang, J. 2007. Phosphatidylinositol 3-kinase-AKT-mammalian target of rapamycin pathway is essentials for neuroendocrine differentiation of prostate cancer. J. Biol. Chem. 282: 3571-3583.

•

Xiao, X.L., Han, J., Zhang, L., Chen, L., Zahng, J., Chen, X.L., Zhou, W., Jiang, H.Y., Zhang, B.Y., Liu, Y. and Dong, X.P. 2006. Protein expression of human neuronspecific enolase and its antiserum preparation. Journal of Southern Medical University (Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao) 26: 1543-1547.

•

Yang, L., Wang, L., Lin, H.-K., Kan, P.-Y., Xie, S., Tsai, M.-Y., Wang, P.-H., Chen, Y.-T. and Chang, C. 2003. Interleukin-6 differentially regulates androgen receptor transactivation via PI3K-Akt, STAT3 and MAPK, three distinct signal pathways in prostate cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 305: 462-469.

•

Yu, Y.P., Landsittel, D., Jing, L., Nelson, J., Ren, B., Liu, L., McDonald, C., Thomas, R., Dhir, R., Finkelstein, S., Michalopoulos, G., Becich, M. and Luo, J.-H. 2004. Gene expression alterations in prostate cancer predicting tumor aggression and preceding development of malignancy. J. Clin. Oncol. 22: 2790-2799.

•

Yuan, T.-C., Veeramani, S., Lin, F.-F., Kondrikou, D., Zelivianski, S., Igawa, T., Karan, D., Batra, S.K. and Lin, M.F. 2006. Androgen deprivation induces human prostate epithelial neuroendocrine differentiation of androgen-sensitive LNCaP cells. Endocr.-Relat. Cancer 13: 151-167.

57

•

Zelivianski, S., Verni, M., Moore, C., Kondrikov, D., Taylor, R. and Lin, M.-F. 2001. Multipathways

for

transdifferentiation

of

human

prostate

cancer

cells

into

neuroendocrine-like phenotype. Biochim. Biophys. Acta 1539: 28-43. •

Zou, T.-T., Selaru, F.M., Xu, Y., Shustova, V., Yin, J., Mori, Y., Shibata, D., Sato, F., Wang, S., Olaru, A., Deacu, E., Liu, T.C., Abraham, J.M. and Meltzer, S.J. 2002. Application of cDNA microarrays to generace a molecular taxonomy capable of distinguishing between colon cancer and normal cancer. Oncogene 21: 4855-4862.

internetové zdroje: •

http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature

•

http://www.maths.nottingham.ac.uk/personal/ivl/crc.html

•

http://www.oncomine.org

•

http://www.prostate-cancer-institute.org/prostate-cancer-treatment/radicalprostatectomy.html

•

http://www.svod.cz

•

http://www.prostate-cancer.org/education/staging/Dowd_GleasonScore.html ƠDowd, G.J., Veltri, R.W., Miller, M.C. and Strum, S.B. 2001. The Gleason Score: A significant biologic manifestation of prostate cancer aggressiveness on biopsy.

58