Molekulární mechanismy diferenciace a morfogeneze Miloš Grim
Anatomický ústav 1. lékařské fakulty Univerzita Karlova v Praze
Struktura přednášky Jak byl a je studován vývoj organizmu, deskriptivní embryologie, experimentální embryologie, vývojová biologie Buněčné aktivity za vývoje: proliferace, apoptosa, migrace, epithelomesenchymová transformace buněk, diferenciace, schopnost adherovat, růst, interakce buněk Signální molekuly Transkripční faktory
Embryonální vývoj Proces, kterým z oplozeného vajíčka vzniká nový jedinec Mechanizmy embryonálního vývoje • Proliferace, migrace a diferenciace buněk • Vývoj tvaru - morfogeneze • Růst 1. Deskriptivní embryologie přinesla popis: oplození, rýhování, gastrulace, Vznik zárodečných listů: ektoderm, mesoderm, entoderm, co vzniká ze zárodečných listů, Poznání základního stavebního plánu organizmu chorda, neurální trubice, somity, somatopleura, splanchnopleura
Základní stavební plán organizmu
2. Experimentální embryologie studovala kauzalitu (otázka proč?) Mechanizmy diferenciace buněk a morfogeneze embryonální indukce, determinace, autodiferenciace a podminěná diferenciace, nerovnoměrný růst, migrace buněk - značkování, chiméry, studium regenerace Teorie poziční informace ( L. Wolpert) Metody ultrastrukturální, biochemické, histochemické a imunohistochemické postupy - řídící faktory, obtížnost jejich izolace
Embryonální chiméra japonské křepelky (Q) a bílé leghornky (C) transplantace somitu, myogenní buňky v končetině
HH 29
C
Q
C Q
QCPN Ab
ED 3 Q C
Embryonální chiméra japonské křepelky (Q) a bílé leghornky (C) – transplantace základu končetiny
Q
C C
Q
ED 17 Grim M, Halata Z. Anat Embryol 202: 401, 2000
3. Vývojová biologie (molekulární biologie + genetika + morfologie) pořadí nukleotidů kóduje molekulu proteinu, poznávání biologických dějů na úrovni genů a proteinů, vývoj studován na molekulární úrovni jako řízený děj, 1973 - techniky molekulárního klonování (klon = jakýkoliv soubor přesných kopií čehokoliv vzniklý nepohlavním rozmnožováním) izolace genů a manipulace s nimi, impakt v lékařství, prevence vrozených vad, vývoj léků, funkční genomika. a) poznání molekulárních mechanizmů mezibuněčné signalizace, b) poznání jak signály z buněčných interakci ovlivňují genovou expresi c) poznání transkripčních faktorů jako regulátorů genové exprese pochopení mechanizmů diferenciace a morfogeneze
Technika in situ hybridizace (ISH) MyoD HH 25
umožňuje prokázat přítomnost určité genové sekvence v genomu. Je založena na vzájemné afinitě komplementárních sekvencí nukleových kyselin. Uměle připravené jednovláknové sondy hybridizují s příslušným úsekem nukleové kyseliny. K jejich přípravě se používá nukleotidů značených digoxigeninem, který lze v dalším průběhu reakce vizualizovat pomocí protilátky. S komplementárně připravenou RNA (antisenssondou) tvoří mRNA stabilní hybrid a tak umožňuje prokázat mRNA vytvořenou v průběhu transkripce exprimovaného genu.
In situ hybridizace (ISH) mRNA VEGF v řezech v kombinaci s imunohistochemickým průkazem endothelu krevních cév
Nanka et al. al. Dev Dyn 235:723, 2006
Využití reportérového genu lacZ ke studiu buněk neurální lišty Wnt1-lacZ ED 9.5
Xgal
Bgal
SieberSieber-Blum, M. Grim, Grim, Y.F. Hu, Hu, and V. Szeder: Szeder: Dev. Dev. Dyn. 231: 258, 2004
Cre-lox systém: trvalá exprese reportérového genu v buňkách neurální lišty myš Wnt1-cre / +
myš R26R / + loxP
Cre-rekombináza Wnt1 promotor (specifický pro neurální lištu)
STOP β-gal R26R promotor (ubikvitérní)
Wnt1-cre / R26R myš loxP
loxP
STOP R26R promotor
β-gal
Cre-rekombináza rozpozná loxP a vystřihne označený STOP
loxP
β-gal β-galaktozidáza je exprimována konstitutivně
Buněčné aktivity za vývoje: • proliferace - dělení buněk, trvale se obnovující buněčné populace, statické populace • diferenciace buněk - využití genetické informace různým způsobem, embryonální kmenová buňka (totipotentní), orgánové kmenové buňky (pouze (multipotentní) • epithelo-mesenchymová transformace • migrace - buňky se mohou pohybovat. • schopnost adherovat • buněčná smrt - apoptosis • růst organizmu– růst velikosti a počtu buněk, růst objemu mezibuněčné hmoty. Základní uspořádání organismu vzniká ve velmi malém měřítku. Růst miniaturu zvětšuje do dospělé velikosti, vyžaduje regulaci genové aktivity.
Proliferující buňky ve vlasových folikulech (zeleně)
Apoptosis
Halata et al. al. Anat Embryol 209: 335, 2005
Epithelo-mesenchymová transformace buněk neurální lišty
B.M. Carlson (1999)
ISH mRNA Slug
Prep. Prep. M. Pleschnerová Pleschnerová, Anat. . ú stav 1. LF UK Anat
HH 10
Migrace buněk (embryonální buňky během gastrulace, buňky neurální lišty, germinální buňky, myogenní buňky, atd.) • aktinový motor generuje pohyb buněk • permisivní contact-guidance + chemorepelentní molekuly Permisivní prostředí: na trasách migrace fibronectin, laminin, kolagen IV, v interstitiu hyaluronová kyselina, na povrchu buněk integriny Chemorepelentní prostředí (proteoglykany, chondrotinsulfát Parakrinní signální systémy migrace • Scatter factor /c-met receptor • Steel factor (stem cell factor) / Kit protein c-kit gen koduje transmembránový tyrosin kinasový receptor Steel gen koduje jeho ligandu Steel factor • Stromal derived factor 1/ jeho CXCR4 receptor
Migrace buněk - buňky neurální lišty
in vivo
in vitro
Sítě filament aktinu - červeně, jádra - modře (buňky in vitro)
Prep. E. Krejčí, Anat. ústav 1. LF UK
Permisivní contact-guidance migrujících buněk neurální lišty
fibronektin •
tenascin
HNK-1
Piebaldism (defekty pigmentace, sterilita, anemie) mutace KIT genu a podobná mutace Kit genu u myši Gilbert SF: Developmental biology, 6th Edit., 2000
Mnohobuněčný organizmus: koordinovaný klon buněk se stejnou genetickou výbavou (genomem), ale rozdílnou diferenciací jeho buněk. Vznik mnohobuněčného organizmu je podmíněn schopností jeho buněk využít genetickou informaci různým způsobem, t.zn. vytvořit cca 200 typů specializovaných buněk. Genom však neobsahuje návod k realizaci prostorového uspořádání buněk. Neobsahuje topografickou mapu, neobsahuje informaci k poskládání buněk do určitého tvaru. K realizaci tohoto úkolu je nutný dialog mezi buňkami. Tento dialog (interakce buněk) je zprostředkován molekulami na jejich povrchu a v mezibuněčném materiálu. Interakce buněk jsou zdrojem signálů. Buňky na ně reagují změnou genové exprese = epigenetické faktory vývoje.
Signální molekuly (růstové faktory, cytokiny, hormony, neurotransmitery) působí mezi buňkami a indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů. a) mají své specifické receptory a signální dráhu, v cytoplasmatické membráně. Receptory mají nitrobuněčnou složku zajišťující přenos signálu do jádra, které odpovídá změnou genové exprese b) za vývoje jsou zodpovědné za mechanizmus embryonální indukce: lokální signalizace určují, které typy buněk se budou diferencovat na určitém místě a v určitém čase c) In vitro –lokální embryonální signalizaci lze nahradit složením media - přidáním růstových faktorů a signálních molekul lze cíleně navodit proliferaci a diferenciaci buněk
Diferenciace buněk neurální lišty
Signální molekuly na trasách migrace buněk neurální lišty indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů: nediferencované multipotentní buňky jsou postupně transformovány v sady bipotentních a unipotentních buněk s lokálně specifickou identitou
Typy buněk, které se diferencují z neurální lišty v oblasti trupu
B.M. Carlson (1999)
HNK-1
Neurony spinálních ganglií, autonomních ganglií, eneterické neurony, Schwannovy buňky, melanocyty, buňky dřeně nadledvin
Další typy buněk, které se diferencují z neurální lišty pouze v hlavové oblasti
Ectomesenchym: osteoblasty, fibroblasty, chondroblasty, Jiang et al., Dev Biol 241:106, 2002
• Sonic hedgehog (Shh) nejsilněji působící dosud známá molekula odpovědná za embryonální indukci. Shh je jednak vázán na povrch buněk, které ho tvoří, Prep.: Prep.: H Kolesová Kolesová jednak je část jeho molekuly proteolyticky odštěpována a difunduje do okolí. Uvolňuje se např. z primitivního uzlu, z chorda dorsalis, z bazální ploténky neurální trubice, ze zóny polarizační aktivity základu končetiny. Shh podmiňuje např. ventralizaci neurální trubice, dorsoventrální polaritu somitů, polarizaci končetiny..
• Kostní morfogenetický protein (BMP) původně izolován z tvořící se kosti jako faktor stimulující osteogenezu, je však tvořen i v základech celé řady dalších orgánů, kde se uplatňuje jako induktivní signál v průběhu jejich vývoje, ovlivňuje buněčnou odpověď na jiné růstové faktory. • Wnt glykoproteiny - určují polaritu ambrya, podmiňují dorzalizaci, • Růstové faktory více než 100 proteinů produkovaných řadou různých buněk; stimulují proliferaci buněk, jejich diferenciaci a přežívání, působí na buňky, které mají příslušné receptory, většinou se uplatňují jako lokální mediátory, některé přítomny i v cirkulaci. Příklady: NGF EGF PDGF FGF VEGF TGFbeta
Transkripční faktory proteiny jejichž společnou vlastností je schopnost vazby na specifické sekvence DNA - promotory a enhancery. Působí v jádře jako regulátory genové exprese, většinou iniciují transkripci, je známo více než 100 TF • Hox geny, homeotické geny (homeosis = přeměna jedné části segmentálně uspořádaného úseku těla ve druhou), výskyt u všech eukaryotických organizmů • Pax geny - 9 genů, exprese zejména v axiálních strukturách • MyoD, myf-5, mrf-4, myogenin geny myogenních determinačních faktorů Tbx5 - gen identity horní končetiny, jeho mutace u člověka: Holtové-Oramův syndrom Ptx1 - gen identity dolní končetiny
Homeosis = přeměna jedné části segmentálně uspořádaného úseku těla ve druhou
Exprese genu Pax-3 za myogeneze
Pax3 mutace u myši (splotch mutace) Sp1H/+
ED 13.5
Sp1H/ Sp1H
Franz T et al., al., Anat. Anat. Embryol. Embryol. 187: 153, 1993
Pax3 mutace u člověka: Waardenburgův syndrom (defekty pigmentace, defekty svalů končetin, kardiovaskulární defekty, hypertelorismus, rozštěp patra
Myostatin a jeho vývojový význam
Mutace genu pro myostatin: nadměrná proliferace svalových buněk
Blokáda receptoru pro myostatin, Nadexprese folistatinu, antagonisty myostatinu
