Epigenetické mechanismy a alergie

přehledné články

Epigenetické mechanismy a alergie Epigenetic mechanisms and allergy EVA FLÍDROVÁ, CTIRAD ANDRÝS, JAN KREJSEK

Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Ústav klinické imunologie a alergologie

SOUHRN Epigenetické regulace jsou definovány jako dědičné změny na úrovni genové exprese, které nastávají bez úpravy DNA sekvence. Mezi nejpodstatnější epigenetické mechanismy u člověka patří DNA metylace, kovalentní histonové modifikace a RNA interference. Závěry z mnoha epidemiologických a experimentálních studií naznačují, že riziko vzniku alergií a astmatu je zčásti determinováno environmentálními faktory, jež indukují epigenetické změny. Epigenetické mechanismy se uplatňují již v raném embryonálním vývoji, a proto je nutné zahájit prevenci alergie v prenatálním období. Výsledný fenotypový projev závisí na interakci genetické výbavy jedince s vnějším prostředím. Klíčová slova: alergie, astma, epigenetika, metylace

SUMMARY Epigenetic regulation is defined as inheritable changes in gene expression, without alternation in the DNA sequence. The most essential epigenetic mechanisms in mammals comprise DNA methylation, covalent histone modifications and RNA interference. Data from epidemiologic and experimental studies indicate that the risk of allergy and asthma may be determined by environmental factors inducing some epigenetic changes. Epigenetic mechanisms are pronounced in the embryonal development. Therefore, it is necessary to start with intervention to prevent allergy even in the prenatal period or in the early postnatal life. Final phenotype is the result of countless interactions between genes and environment. Key words: allergy, asthma, epigenetics, methylation

Poté, co byla v roce 2000 kompletně přečtena lidská genetická informace, chtělo by se říci, že již máme klíč k vysvětlení všech nemocí a predispozic k nim. Jak se však ukazuje, samotné pořadí nukleotidů v DNA neobsahuje veškerou dědičnou informaci a nepostačuje k objasnění výsledného fenotypu organismu. Neméně důležitý vliv na regulaci genové exprese mají totiž také environmentální interakce, jimiž se zabývá poměrně mladý obor zvaný epigenetika. Epigenetika spadá pod obor genetiky a studuje mechanismy, které dědičně ovlivňují genovou expresi beze změny primární genetické informace, tedy sekvence nukleotidů v DNA. Jedná se o výjimku z obecného pravidla, že dědičné fenotypické změny jsou způsobeny změnami v genech. Poprvé termín epigenetika použil Conrad Hall Waddington v polovině 20. století. Odvodil jej od slova epigeneze, které používal Aristotelés (výsledná forma organismu není dopředu dána, ale vzniká kreativními procesy). Waddington je autor teorie epigenetické krajiny (obr. 1), jenž zobrazuje míček jako buňku pohybující se krajinou v závislosti na podmínkách prostředí. Vlivem environmentálních faktorů může buňka změnit metabolické dráhy a vyústit tak v odlišné fenotypy (20). Prevalenční data výskytu alergií ukazují stálý nárůst ve světě i v ČR, což dokazují data ze Státního zdravotnické-

Alergie 2/2011

ho ústavu v populaci dětí a dospívajících do věku 17 let, kdy v roce 1996 dosahovala prevalence hodnoty 16,9 %, zatímco v roce 2010 již 31,2 %. Nositelů rizikových genů, tj. atopiků, je významně více (35 %) než pacientů s klinickým projevem alergie (25 %). Epigenetika nám umožňuje poodhalit některé záhady v patogenezi alergie zprostředkované protilátkami IgE, jako vnímavost k ní založenou již v prenatálním období po expozici vlivů vnějšího prostředí či variabilitu jejich fenotypů.

Mechanismy epigenetických procesů Mezi nejběžnější epigenetické mechanismy patří DNA metylace, modifikace jaderných histonů a transkripční regulace zprostředkovaná malými molekulami RNA. Metylace DNA Metylace nastává na 5. atomu uhlíku pyrimidinového kruhu cytosinu za pomoci enzymu DNA-metyltransferázy. Jako donor metylové skupiny slouží S-adenosylmethionin a výsledkem je hydrofobní modifikace DNA, metylcytosin, na který se vážou specifické DNA-vazebné proteiny s umlčujícím účinkem pro příslušné genové oblasti (18). U savců se metylace vyskytuje zejména

131

přehledné články

Obr. 1: Teorie epigenetické krajiny (Waddington). A. Míček pohybující se v krajině jako buňka, která prochází standardním životním cyklem. B. Pod vlivem environmentálních podmínek dochází k odchylce v diferenciaci buňky a vyústění do odlišného fenotypu.

v CpG repetitivních sekvencích DNA, v oblastech imprintovaných genů a inaktivovaných genů na X chromozomu u samic. Celkem je zhruba 10 % savčího cytosinu v genomu metylováno (7). Modifikace jaderných histonů Molekula DNA v jádru každé buňky je uspořádána do struktury chromatinu za pomoci oktamericky se vyskytujících forem histonů. Kromě těsného sbalení DNA se histony podílejí na regulaci genové exprese. Jejich posttranslační modifikace – metylace, acetylace, fosforylace, monoubiquitinace, sumoylace – na karboxy terminálním konci určité aminokyseliny v určitém histonu vede k transkripční aktivaci, resp. inaktivaci genu. Hovoříme o existenci tzv. histonového kódu (16). Nejvýznamnější modifikací histonů je acetylace, která podporuje zahájení transkripce genu. Metylace DNA může být asociována s metylací histonů. Mechanismus represe transkripční aktivity daného genu je ovšem rozdílný. Zatímco metylace histonů přímo mění prostorové uspořádání chromatinu, DNA metylace indukuje nábor metyl-CpG-vazebných proteinů.

DNA (zvané PREs, Polycomb response elements) mění transkripční aktivitu genů. Proteiny Polycomb patří mezi transkripční represory organizující chromatin do kondenzovaného stavu. Jejich hlavní funkcí je regulovat homeotické geny, inaktivovat chromozom X nebo umlčovat retroviry. Naproti tomu, antagonisticky působící Trithorax proteiny aktivují transkripci genů indukcí metylace a následné acetylace histonů. Zajišťují kontinuální expresi homeotických genů (19). Jiné proteiny, jako ATP-dependentní chromatin remodelující komplex SWI/SNF (SWItch/Sucrose NonFermentable), katalyzují rozvolnění, přesun či vytlačení nukleosomů a následně umožňují přístup transkripčního aparátu na DNA (5). Zajímavostí je, že na genové expresi savců se zčásti podílí také trojrozměrná struktura jádra. Chromozomy s vysokým obsahem genů a vysokou genovou aktivitou jsou orientovány více ke středu jádra. Například nádorové buňky mají jiné uspořádání chromozomů a genů než buňky standardní. Mimořádným příkladem je inaktivovaný chromozom X u samic, jenž se v jádru nachází na samém okraji (2).

Regulace epigenetických mechanismů Na patogenezi alergie a astmatu se podílejí faktory genetické i environmentální, přičemž epigenetiku můžeme považovat za jejich spojníka. Období, kdy expozice vlivům prostředí může s větší pravděpodobností způsobit

Malé molekuly RNA Poměrně nedávno (1998) dvojice Craig Mello a Andrew Fire objevila schopnost malých molekul RNA (siRNA) potlačit genovou expresi posttranskripčním mechanismem, který vede k degradaci nebo translační represi specifické mRNA. Tento jev byl nazván RNA interference (3). Pokud se v buňce objeví dlouhé dvouvláknové vlákno RNA, jež může vznikat transkripcí inverzní repetice, syntézou druhého vlákna na základě jednovláknového templátu či virovou produkcí, je RNA endonukleázou Dicer štěpeno na fragmenty o délce 21–22 nukleotidů. Na ty se váže RNA-indukovaný umlčovací komplex (RNAinduced silencing complex, RISC) zahrnující proteiny s ribonukleázovou aktivitou, RNA vazebnými motivy a RNázovou aktivitou, nutné pro naštěpení nebo inhibici translace homologní mRNA (obr. 2). siRNA tak vyvolávají dědičné posttranskripční umlčování genů. Ostatní mechanismy Pokud se zabýváme dalšími epigenetickými mechanismy, je třeba zmínit proteinové komplexy skupiny Polycomb a Trithorax, které vazbou na regulační úseky

132

Obr. 2: Schéma RNA interference. dsRNA, dvouvláknová RNA, RISC, RNA-indukovaný umlčovací komplex, siRNA, malá molekula RNA.

Alergie 2/2011

přehledné články epigenetické modifikace, zahrnuje zejména etapu prenatální a časné dětství. V tomto časovém úseku je fenotyp organismu nejvíce variabilní a vnímavý k environmentálním změnám. Dochází k predeterminaci fyziologických a metabolických pochodů a tím i predispozic k nemocem (15). Genomový imprinting, umlčení genů Mezi prenatální epigenetické mechanismy řadíme genomový imprinting, jenž způsobuje, že některé geny v organismu jsou přednostně exprimovány buď z paternálně, nebo maternálně zděděného chromozomu. Ač komplexní mechanismus umlčení jedné z alel není ještě zcela znám, předpokládá se, že imprinting nastává inaktivací alely daného genu od jednoho rodiče metylací DNA již při gametogenezi a raném embryonálním vývoji. Známým příkladem imprintingu je tzv. teorie rodičovského konfliktu. Setkávají se v ní dvě protichůdné priority rodičů. V zájmu matky je, aby její vyvíjející se dítě bylo spíše drobnější postavy, dobře prošlo porodními cestami, neohrozilo její život a mohla znovu otěhotnět. Proto exprese genu H19 inhibující prenatální růst probíhá maternálně, zatímco u otce nastává imprinting alely pro tento gen. Otec preferuje, aby dítě přišlo na svět co nejsilnější a mělo dobré předpoklady pro přežití a brzké osamostatnění. Gen Igf2 (inzulinový růstový faktor), který podporuje prenatální růst, je exprimován z otcovské alely a u matky je umlčen. Pokud dojde k chybnému imprintingu a gen H19 je inaktivován na obou alelách, zatímco exprese genu Igf2 probíhá na paternálním i maternálním chromozomu, je výsledkem postižení plodu tzv. Beckwith-Wiedemannův syndrom. Ten je charakterizovaný nadměrným růstem v prenatálním vývoji (makrosomie, makroglosie, defekty břišní stěny) a zvýšeným rizikem nádorů dětského věku – Wilmsova tumoru a hepatoblastomu. U člověka je zatím známo asi 50 genů, které podléhají genomovému imprintingu. Dalšími adepty jsou geny exprimované při atopii a astmatu. Výsledky zkoumání naznačují, že genetický polymorfismus od matky je děděn s větší pravděpodobností než od otce. Například pozitivní asociace mezi zvýšenou hladinou IgE v krvi rodičů a zvýšenou hladinou IgE v pupečníkové krvi novorozence byla potvrzena pouze u matky (12). Rovněž riziko vzniku astmatu do 5 let dítěte výrazně vzrůstalo, pokud tímtéž onemocněním trpěla matka, nikoliv otec (11). Zdá se, že mateřský fenotyp nemoci může během těhotenství zprostředkovat odpověď plodu na environmentální vlivy a zvýšit náchylnost k astmatu. Dieta Jedni z nejdůležitějších regulátorů epigenetických mechanismů dědičné informace jsou látky přijímané ve stravě. Jak ukázaly některé studie na myších, již prenatální přísun živin má vliv na výsledný fenotyp. U myšího modelu Agouti byla sledována barva srsti potomstva v závislosti na skladbě potravy březí samice. Barva srsti se odvíjí od míry metylace DNA. Čím více je DNA metylována, tím tmavší barva srsti je. Standardní složení stravy vyústilo k variabilně zbarvenému potomstvu – od nemetylovaných žlutě zbarvených myší přes skvrnité až po me-

Alergie 2/2011

tylované myši tmavé barvy. Dieta bohatá na prekurzory S-adenosylmethioninu (cholin, kyselina listová, betain) vedla k potomstvu s výrazně tmavší barvou osrstění čili vyšší hladinou metylace DNA (21). Hollingsworth a kol. dále objevili, že u potomstva je tato dieta asociována se zvýšenou produkcí IgE protilátek a chemokinů, nárůstem hyperreaktivity dýchacích cest a zvýšenou koncentrací eozinofilů v plicní laváži (6). Tato zjištění na myším modelu in utero vedou k závěru, že nadbytek donorů metylových skupin v potravě způsobuje změny v DNA metylaci a následně změny v genové expresi, které zvyšují riziko alergií dýchacích cest a tato predispozice je zčásti přenášena na další generaci. Znečištění ovzduší Intrauterinní environmentální vliv na pozdější rozvoj alergií a astmatu mají také polutanty v ovzduší. Zejména prenatální expozice tabákovému kouři je spojována s omezením respirační funkce plic, dušností a zvýšeným rizikem vzniku astmatu nejen v dětském věku, ale i v dospělosti (1,13). Dále vystavení plodu polycyklickým aromatickým uhlovodíkům, jejichž zdrojem jsou emise z motorů vozidel, elektráren a dalších spalovacích procesů a jsou přítomny v tabákovém kouři, významně navýšilo dýchací potíže u dětí ve věku dvou let (14). Polycyklické aromatické uhlovodíky mají schopnost vázat se na DNA, měnit genovou expresi a trojrozměrnou strukturu chromatinu. Práce zabývající se konkrétními látkami, které po intrauterinní expozici mohou postnatálně podpořit rozvoj alergie, se začínají teprve objevovat. Th1 vs. Th2 regulace Při alergických onemocněních je jasně prokázána polarizace CD4+ pomocných T-lymfocytů do subtypu Th2, charakterizovaného sekrecí cytokinu IL-4, jenž napomáhá aktivovat B-buňky a podporuje tvorbu protilátek třídy IgG4 (neutralizující) a IgE (následně se účastní alergických procesů). Naopak, při diferenciaci do subtypu Th1 je produkován IFNγ inhibující vývoj Th2-buněk. Právě na regulaci exprese IFNγ epigenetickými mechanismy se zaměřují recentní studie při polarizaci Th-lymfocytů. Jones a kol. zdokumentovali, že během Th2 diferenciace podstupuje promotor IFNγ metylaci de novo. Nejznatelněji byla metylována oblast v pozici -53 ležící proximálně od startovacího místa transkripce, což je vysoce konzervované místo napříč druhy. CpG metylace brání v navázání transkripčních faktorů c-Jun a CREB, které jsou vyžadovány pro genovou expresi IFNγ během Th1 polarizace, čímž nedochází k expresi IFNγ a vývoj do subpopulace Th1 je znemožněn (8). Naopak pokud se nashromáždí dostatek acetylovaných histonů v konzervovaném regionu promotoru IFNγ, ulehčí se navázání transkripčního faktoru STAT4, a tím dochází k usměrnění do Th1 linie. Zdá se, že transkripce IFNγ je zčásti determinována aktivitou histonových acetyláz, deacetyláz a metyltransferáz v místě promotoru. Také přemístění nukleosomů za pomoci remodelujícího komplexu SWI/ SNF a vytvoření tak více otevřené topografie DNA vy-

133

přehledné články tváří příležitost pro navázání transkripčních faktorů a zahájení genové exprese IFNγ (22). DNA metylace, resp. demetylace hraje význačnou úlohu v kontrole Th2 cytokinové odpovědi a stabilizuje vývoj do této větve. Když dojde k aktivaci naivních T-lymfocytů a polarizaci k Th2 vývoji, na promotoru genu pro IL-4 nastává demetylace, která rozvolňuje dvoušroubovici DNA a usnadňuje kontakt transkripčních faktorů s vláknem (9). V jiné práci byla popsána demetylace kontrolní oblasti (rad50 hypersensitive site 7, RHS7), kde je regulována exprese dalších cytokinů IL-5 a IL-13, indukujících Th2 odpověď (10). Důkazy z in vitro experimentálních studií nám dokazují, že vývoj Th2 fenotypu u atopiků může být výsledkem pozměněné DNA metylace a histonové acetylace v regulačních oblastech genů důležitých pro diferenciaci funkčně odlišných subsetů T-lymfocytů.

Závěr Nashromážděná fakta nepochybně dokazují, že epigenetika zprostředkovává interakce mezi komplexní genovou výbavou a prostředím a souvisí se vznikem alergie a astmatu. Jasná asociace byla prokázána mezi polutanty ovzduší, tabákovým kouřem a vznikem atopie. Přesto je třeba provést longitudinální kohortové studie k prozkoumání vnímavosti epigenetických regulací v čase na další vlivy prostředí. Fenotypové změny způsobené epigenetickými mechanismy se dědí nemendelovsky a vyznačují se vysokou dynamičností a reverzibilitou. Aktivita našich genů není při narození určena jednou provždy, ale mění se pod diktátem vlivů vnějšího prostředí, např. složení stravy, fyzické aktivity, kontaktu s toxickými látkami. Jako příklad můžeme uvést závěry ze studie genetika Estellera a kol., v které prověřovali DNA 80 párů jednovaječných dvojčat (věkové rozmezí 3–84 let). Při zkoumání epigenetických modifikací DNA dvojčat bylo objeveno, že v útlém dětství jsou prakticky stejné, zatímco v padesáti letech jsou rozdíly třikrát větší. Vyústění shodného genotypu jednovaječných dvojčat (totožné pořadí tří miliard nukleotidů v DNA) do odlišných fenotypů se dá vysvětlit proběhlými epimutacemi (4). Mezi nejvýznamnější epigenetické mechanismy modifikující funkci genů patří u savců metylace DNA, acetylace histonů a RNA zprostředkovaná transkripční regulace. V současnosti se objevují snahy ve farmakologickém výzkumu ovlivnit epigenetické faktory a zasáhnout do genové exprese genů podílejících se na alergických procesech. Mezi takové modulátory patří antisense jednovláknové oligonukleotidy, které aktivují RNázy a blokují ribozomy, nebo siRNA (RNAi imunoterapie) potlačující expresi molekul asociovaných s alergiemi (17). Zejména v USA se dále rozvíjí nový obor nutrigenetika, jenž zkoumá dopad chemických látek obsažených v potravě na genom jedince. Díky zkoumání vlivů environmentální epigenetiky na zdraví jedince se opět rozšířily naše vědomosti o možnostech vzniku nemocí a do budoucna lze počítat se zavedením preventivních opatření již v prenatálním věku.

134

Nastává doba, kdy hranice mezi geneticky a environmentálně podmíněnou variabilitou jsou stírány. Poděkování: Práce byla podpořena Výzkumným záměrem č. MSM0021620812 a Specifickým vysokoškolským výzkumem 2011-260906, MŠMT ČR. Autoři děkují paní Haně Kotlandové za grafickou realizaci obrázků.

LITERATURA 1. Alati R, Al Mamun A, O‘Callaghan M, Najman JM, Williams GM. In utero and postnatal maternal smoking and asthma in adolescence. Epidemiology 2006; 17: 138-44. 2. Cremer T, Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet 2001; 2: 292-301. 3. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: 806-11. 4. Fraga MF, Ballestar E, Paz MF, Ropero S, Setien F, Ballestar ML, Heine-Suñer D, Cigudosa JC, Urioste M, Benitez J, BoixChornet M, Sanchez-Aguilera A, Ling C, Carlsson E, Poulsen P, Vaag A, Stephan Z, Spector TD, Wu YZ, Plass C, Esteller M. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102: 10604-9. 5. Hargreaves DC, Crabtree GR. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Res. 2011; 21: 396-420. 6. Hollingsworth JW, Maruoka S, Boon K, Garantziotis S, Li Z, Tomfohr J, Bailey N, Potts EN, Whitehead G, Brass DM, Schwartz DA. In utero supplementation with methyl donors enhances allergic airway disease in mice. J Clin Invest 2008; 118: 3462-9. 7. Illingworth RS, Bird AP. CpG islands--‘a rough guide‘. FEBS Lett 2009; 583: 1713-20. 8. Jones B, Chen J. Inhibition of IFN-gamma transcription by site-specific methylation during T helper cell development. EMBO J 2006; 25: 2443-52. 9. Lee DU, Agarwal S, Rao A. Th2 lineage commitment and efficient IL-4 production involves extended demethylation of the IL-4 gene. Immunity 2002; 16: 649-60. 10. Lee GR, Spilianakis CG, Flavell RA. Hypersensitive site 7 of the TH2 locus control region is essential for expressing TH2 cytokine genes and for long-range intrachromosomal interactions. Nat Immunol 2005; 6: 42-8. 11. Litonjua AA, Carey VJ, Burge HA, Weiss ST, Gold DR. Parental history and the risk for childhood asthma. Does mother confer more risk than father? Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 176-81. 12. Liu CA, Wang CL, Chuang H, Ou CY, Hsu TY, Yang KD. Prenatal prediction of infant atopy by maternal but not paternal total IgE levels. J Allergy Clin Immunol 2003; 112: 899-904. 13. Magnusson LL, Olesen AB, Wennborg H, Olsen J. Wheezing, asthma, hayfever, and atopic eczema in childhood following exposure to tobacco smoke in fetal life. Clin Exp Allergy 2005; 35: 1550-6.

Alergie 2/2011

přehledné články 14. Miller RL, Garfinkel R, Horton M, Camann D, Perera FP, Whyatt RM, Kinney PL. Polycyclic aromatic hydrocarbons, environmental tobacco smoke, and respiratory symptoms in an inner-city birth cohort. Chest 2004; 126: 1071-8. 15. Miller RL, Ho SM. Environmental epigenetics and asthma: current concepts and call for studies. Am J Respir Crit Care Med 2008; 177: 567-73. 16. Peterson CL, Laniel MA. Histones and histone modifications. Curr Biol 2004; 14: R546-51. 17. Popescu FD. Antisense- and RNA interference-based therapeutic strategies in allergy. J Cell Mol Med. 2005; 9: 840-53. 18. Santos KF, Mazzola TN, Carvalho HF. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz J Med Biol Res 2005; 38: 1531-41. 19. Schwartz YB, Pirrotta V. Polycomb silencing mechanisms and the management of genomic programmes. Nat Rev Genet 2007; 8: 9-22.

Alergie 2/2011

20. Waddington CH. The epigenotype. Endeavour 1942; 1: 18-20. 21. Wolff GL, Kodell RL, Moore SR, Cooney CA. Maternal epigenetics and methyl supplements affect agouti gene expression in Avy/a mice. FASEB J 1998; 12: 949-57. 22. Zhang F, Boothby M. T helper type 1-specific Brg1 recruitment and remodeling of nucleosomes positioned at the IFN-gamma promoter are Stat4 dependent. J Exp Med 2006; 203: 1493-505.

Mgr. Eva Flídrová Ústav klinické imunologie a alergologie Lékařská fakulta UK a Fakultní nemocnice v HK Sokolská 581 500 05 Hradec Králové e-mail: [email protected]

135