Mykobakteriální infekce MUDr. Pavel Čermák, CSc.
Historie Starověk Egyptské mumie - TBC změny,
průkaz nukleových kys. M.tuberculosis
Evropa - postupné promoření obyvatelstva šíření a likvidace obyvatelstva ostatních Středověk kontinentů lepra
Novověk
R. Koch - objevení M.tuberculosis /BK/ BCG vakcína pandemické postižení obyvatelstva
Imunita a epidemiologie • Buněčná imunita • BCG vakcína (Bacillus Calmette Guérin) = oslabený kmen M.bovis - (očkovat?) • prevalence TBC 9,62/100 000 obyvatel v ČR • Státní dozor – 2 systémy hlášení (klinický=registr TBC a ISBT=laboratorní) • Celosvětový problém (kombinace s AIDS)
Klasifikace /celkem >80 druhů/ Obligátní patogeny
M.tuberculosis komplex: M.tuberculosis M.bovis, M.bovic BCG M.afrikanum, M.microtii Pomalu rostoucí:
Oportunní patogeny
M.avium M.intracelulare M.kansasii M.malmonese M.marinum M.scrofulaceum M.szulgai M.xenopi
M.leprae
Rychle rostoucí: M.fortuitum M.chelonae M.gordonae - většinou kontaminace z prostředí
Mikroskopická diagnostika • Ziehl-Neelsenovo barvení - oddolnost proti odbarvení kyselinami = acidorezistentní tyčky /ART/
• Fluorescenční barvení • Hodnocení 0 + ++ +++
ART nenalezeny 10 - 20 ART 21 - 100 ART více než 100 ART
Klasické kultivační techniky Dekontaminace vyšetřovaného vzorku ! Klasická kultivace: Loewenstein -Jensenova vaječná půda, Ogawowa vaječná půda, Šulova tekutá půda
3.
9.
6.
12.týden
Prodloužená kultivace množení Enterobakterie M.tuberculosis
1 cyklus 30 minut 1 den
40 cyklů 20 hodin 40 dní
Metabolické metody Průkaz rostoucích mykobakterií v uzavřeném systému /rychlá kultivace/ - detekce metabolismu
• Průkaz CO2 - radioaktivní (Bactec 460TB),
kolorimetrický (MB/BacT), fluorescenční Bactec 9240 TB
• Spotřeba O2 - MGIT 960 • Oxidoredukční potenciál - MB REDOX Negativní vzorky - kultivace 42 dní !!!
BACTEC MGIT 960 • kultivace v tekutém Middlebrookově mediu • detekce senzorem reagujícím na spotřebu O2 změnou fluorescence • kontinuální měření vyšetřovaných vzorků
Genetické metody • Hybridizace - průkaz známých sekvencí DNA • PCR ,LCR amplifikace - průkaz spec. úseků DNA sondy - rod mycobacterium, M.tbc komplex, jednotlivé druhy • AMTD - průkaz rRNA M.tuberculosis (nejvyšší citlivost) • RFLP - analýza restrikčních fragmentů DNA (poddruhové určení - epidemiologie) • amplifikace + hybridizace – rozsah 32 druhů (Hain Life science) + rychlost, vysoká specifita, sensitivita - cena, kapacitní možnosti, problematická interpretace
Chemické metody Detekce mykolových kyselin - plynová chromatografie Hmotová spektrometrie - „finger printing“ metody - spálení laserem - analýza hmotnostní spektrometrem - velmi rychlé - vysoká specifita
M. tuberculosis 2001 Celkem 62 nálezů
pozitivní
negativní
Mikroskopie pevné půdy MGIT
23(39%) 61(91,4%) 57(98,3%)
36(61%) 1(1,6%) MGIT + 1(1,7%) pevné +
genetické m.
23(92%)
2(8%) MGIT, pevné +
Průměrná doba kultivace:
pevné půdy 27,9 dne MGIT 960 12,4 dne
M. tuberculosis 2002 Celkem 50 nálezů
pozitivní
negativní
Mikroskopie pevné půdy MGIT
18(38%) 33(67%) 49(100%)
32(62%) 17(33%) MGIT + 0
genetické m.
16(94%)
1(6%) MGIT, pevné +
Průměrná doba kultivace:
pevné půdy 20 dní MGIT 960 12 dní
Citlivosti na antituberkulotika 1. Standardní metoda (Grassetti) - na pevných půdách doba inkubace min. 3 týdny, problematické výsledky 2. MIC - kvantitativní, v tekutých půdách, inkubace min. 3 týdny náročné na provedení 3. Rychlé citlivosti - využití přístrojů pro metabolickou detekci růstu mykobykterií
- komerční systémy pro stanovení citlivosti: Bactec 460 TB MB/BacT MGIT960
•
Stanovení citlivosti klasickou proporční metodou a b Pevné vaječné LW
půdy s AT(a) a kontrolní bez AT(b) • kultivace 21 dní • poměr počtu kolonií x% = a x 100/b • citlivý kmen = x% menší nebo rovno 1
Metoda MGIT AST SIRE • Kritické koncentrace streptomycin - 1,0 mg/l isoniazid - 0,1 mg/l rifampicin - 1,0 mg/l ethambutol - 5,0 mg/l PZA - 100 mg/l
• Růstová kontrola 1% suspenze kmene • Délka testu 4 - 13 dní
Terapie TBC • Antituberkulotika základní: izoniazid (INH), rifampicin (RIF), pyrazinamid (PZA), streptomycin (STM), etambutol (EMB)
• Antibiotika - chinolony, aminoglykosidy, makrolidy • Cytostatika a další léky • Dlouhodobá terapie, dvou až čtyřlékové kombinace • Riziko iatrogenního poškození velmi vysoké
MDR – multidrug resistant TBC • Kmeny Being – Čína, Rusko • rezistentní na 3 a více základních antituberkulotik • šíření v zemích bývalého SSSR • výskyt i v západní Evropě • systém sledování MDR TBC • problematická terapie
Systémy hlášení TBC • Registr TBC = povinnost každého lékaře hlásit každý výskyt TBC – krajský ftizeolog – hygienická služba
• ISBT = informační systém bacilární TBC. Povinnost každé laboratoře provádějící detekci TBC hlásit pozitivní nálezy. Elektronická forma. • Provázání obou registrů. • Cíl – kontrola nad výskytem TBC. ISBT laboratoř
kraj. laboratoř
Registr TBC
kraj. ftizeolog
dohledávání kontaktů
ministerstvo zdrav. hyg. služba
Co říkají mikrobiologické metody Pozitivní mikroskopie – pacient vylučuje ART, TBC??? mykobakterie = rozvinuté onemocnění Pozitivní klasická kultivace – pacient vylučuje živé mykobykterie Pozitivní rychlá kultivace (metab. metody) – pacient vylučuje živé mykobykterie, kvantita nepřímo úměrná detekčnímu času
Co říkají genetické metody Nakultivovaný kmen – 100% spolehlivost. Z odebraného klinického vzorku pozitivní
- detekce živé bakterie, dg onemocnění - detekce NK mrtvé buňky - falešně pozitivní (chybně nastavená reakce „home made“)
negativní
- nejedná se o mykobakteriální infekci - falešně negativní (inhibitory amplifikace, jiné příčiny)
Interpretace v praxi Žena 38 let Laborantka (TBC laboratoř), osobní problémy, Podzim 2003 – pneumonie, prokázány chlamydie při kontrole na základě RTG nálezu stanovena dg TBC plic. Všechny mikrobiologické nálezy negativní. včetně PCR. 6 měsíců terapie, uznána nemoc z povolání. Problematické pracovní zařazení. Ochrana osobních údajů. Konflikt s pneumologem (nález M.kansasi).
Interpretace v praxi Žena 75 let Velmi zachovalá, štíhlá, bez závažných zdrav. problémů. Déletrvající kašel, odebráno sputum, kultivačně negativ. PCR M.tbc komplex pozitivní – uzavřeno jako TBC. Všechny další mikrobiologické výsledky negativní. Terapie v léčebně. Po terapi v pořádku.
6 měsíců v léčebně psychické trauma i pro manžela …TBC nejspíše nikdy neměla…
záhada Datum zpracování Mikroskopie Pevné půdy MGIT 960 Genetika INH STM RIF PZA EMB
sputum A 3.5.2002 neg. neg.
sputum B 3.5.2002 neg. neg.
pozitivní
pozitivní
M.TBC R R R R R
M.TBC R R R R R
Pacient A (V.J.) 80 let, muž, HK polymorbidní (ICHS,OCHPN…) opakované hospitalizace interny, GMK opakovaně vyš.na TBC vždy negat. hrudní výpotek
Pacient B (J.J.) 51 let, muž, vesnice opakovaně vyš. TRN Jičín opakovaně vyš.na TBC vždy negat, ...v minulosti TBC...
…v dalším průběhu oba pacienti opakovaně negat.včetně PCR, z hlediska TBC onem. evidentně zdrávi…..
možnosti Laboratorní chyba Kontaminace materiálů - obou jiným materiálem - jeden materiál druhým - obou jiným primárně rezistentním atyp.mykob. Chybně určená citlivost
vyloučena téměř vyloučena vyloučena opakovaně potvrzena
Pacienti byli v kontaktu Pacienti byli v kontaktu s třetí osobou
možné řešení Oba pacienti se pravděpodobně v jeden den podrobili rozdílným vyšetřením ve FN... Vyšetřovací komplexy A
společná chodba+čekárna Vyšetřovací komplexy
B
NEZNÁMÝ šiřitel multirezist. TBC
Bohouš a pivní parta Muž 48 let - „homeles“, denní abusus - úmrtí na základě prochlazení + alkohol - pitva – rozvinutá plicní TBC Infikoval své kamarády?
ANO NE
Onemocní jeho kamarádi? ...naštěstí nebyl nikdo vyšetřován moderními kultivačními metodami ani geneticky…místo po Bohoušovi obsazeno !!! KONSTRUKCE Vedro – dám si pivo – dostanu kašel – sputum na BK + genetika – a je to v…….
Závěr • jednoduchá problematika …když ji známe • edukace pregraduální, postgraduální, semináře atd. • SPOLEČNÁ interpretace kultivačních a genetických metod • úzká spolupráce mikrobiologa s klinikem
