Methodeontwikkeling voor de bepaling van trimethylamine in vis

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015

Methodeontwikkeling voor de bepaling van trimethylamine in vis

Leen De Brabandere Promotors: Prof. Dr. ir. Mia Eeckhout en Dr. ir. Katia De Wasch Tutor: Willem Demolder

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015

Methodeontwikkeling voor de bepaling van trimethylamine in vis

Leen De Brabandere Promotors: Prof. Dr. ir. Mia Eeckhout en Dr. ir. Katia De Wasch Tutor: Willem Demolder

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie

Auteursrechtelijke bescherming De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis. Leuven, mei 2015

De promotor,

De copromotor,

Prof. Dr. ir. Mia Eeckhout

Dr. ir. Katia De Wasch

De begeleider,

De auteur,

MSc. Willem Demolder

Leen De Brabandere

Woord vooraf Graag zou ik iedereen willen bedanken die me geholpen en ondersteund hebben in het realiseren van deze masterproef. Eerst en vooral wil ik mijn begeleider Willem Demolder danken voor zijn begeleiding tijdens het experimenteel werk en zijn verbeteringen in de masterproef. Met vragen kon ik altijd bij hem terecht. Het was voor mij een fijne samenwerking. Daarnaast wil ik Dr. Ir. Katia De Wasch bedanken voor het inhoudelijk nalezen van de masterproef en haar leerrijke opmerkingen. Verder gaat mijn dank uit naar Prof. Dr. Ir. Mia Eeckhout voor het opvolgen en nalezen van deze masterproef. Ook wil ik graag het personeel van de chromatografische afdeling van laboratorium ECCA danken. Zij zorgden voor een aangename sfeer in het labo en met praktische vragen kon ik steeds bij hen terecht. Ten slotte wil ik mijn dank betuigen aan mijn vrienden en ouders voor hun morele ondersteuning en aanmoediging tijdens het afgelopen jaar. Leen De Brabandere Leuven, mei 2015

Samenvatting Eén van de doelstellingen van deze thesis is om te onderzoeken welke methodes gebruikt worden voor de viskwaliteit te beoordelen. Trimethylamine (TMA), totale vluchtige stikstofbase (TVB-N) en biogene amines (BA) zijn chemische indicatoren voor visversheid. Een tweede doelstelling is deze 3 indicatoren te vergelijken op vlak van de wetgeving, hun toxiciteit en analysemethodes. Laboratorium ECCA gebruikt een colorimetrische methode om TMA te bepalen. Deze methode heeft veel nadelen. Een statische headspace gaschromatografie-massaspectrometrie methode werd ontwikkeld om TMA te bepalen in vis. De GC-condities werden geoptimaliseerd op 1,5 ml/min voor de snelheid van het draaggas en 70 °C voor de initiële kolomtemperatuur. Een eerste Youden ruggedness trial toonde aan dat 2 factoren (volume NaOH en mengkracht) de belangrijkste parameters waren die de TMA-respons beïnvloedden. Een tweede test gaf aan dat ook de concentratie NaOH een significant effect had. Met deze methode werd een gemiddelde recovery van 95 % bekomen en de standaarddeviatie was 36 %. De voorgestelde methode werd beperkt gevalideerd in termen van lineariteit, precisie, juistheid, detectielimiet (LOD) en bepalingsgrens (LOQ). De ijklijn was kwadratisch in het bereik van 10-100 ppm voor TMA. De LOD en LOQ waren respectievelijk gelijk aan 24 en 48 ppm. De herhaalbaarheid (R.S.D.) was 2,96 %. De reproduceerbaarheid (R.S.D.) getest op 2 niveau’s (20 en 50 ppm), waren respectievelijk gelijk aan 30 % en 36 %. De juistheid was 25,47 %. De resultaten van deze validatie geven aan dat de voorgestelde methode nog niet geschikt is voor TMA-kwantificatie in vis.

Kernwoorden: trimethylamine, totale vluchtige stikstofbase, biogeen amine, vis, statische headspace gaschromatografie-massaspectrometrie

Abstract One of aims of this thesis is to investigate which methods are used to evaluate fish quality. Trimethylamine (TMA), total volatile basic nitrogen (TVB-N) and biogenic amines (BA) are chemical indicators for fish freshness. A second aim is performing a comparison of this 3 indicators on legislation, toxicity and analytical methods. Laboratory ECCA uses a colorimetric method to determine TMA. This method suffers from a lot of disadvantages. A static headspace gas chromatography–mass spectrometry method was developed to monitor TMA in fish. GC conditions were optimized at a carrier gas velocity of 1,5 ml/min and an initial column temperature of 70 °C. A first Youden ruggedness trial showed that 2 factors (volume NaOH and shaking power) were the most important parameters to affect the response of TMA. A second trial showed that also the NaOH concentration had a significant effect. With this method a mean recovery of 95 % was obtained and the standard deviation was 36 %. For the method proposed in this work, only a limited validation took place. The calibration graph was quadratic in the range 10-100 ppm for TMA. The detection limit (LOD) and the quantification limit (LOQ) were calculated to be 24 and 48 ppm respectively. The repeatability (R.S.D.) was found to be 2,96 %. The reproducibility (R.S.D.) testing at 2 levels (20 and 50 ppm), was found to be, respectively, 30 % and 36 %. The accuracy was 25,47 %.The results of this validation indicate that the proposed method is not yet suitable for quantification of TMA in fish.

Keywords: trimethylamine, total basic volatile nitrogen, biogenic amine, fish, static headspace gas chromatography–mass spectrometry

Inhoudsopgave Auteursrechtelijke bescherming ................................................................................................. 7 Woord vooraf ............................................................................................................................. 8 Samenvatting .............................................................................................................................. 9 Abstract .................................................................................................................................... 10 Inhoudsopgave ......................................................................................................................... 11 Lijst met figuren en tabellen..................................................................................................... 13 Lijst met afkortingen ................................................................................................................ 15 Inleiding ................................................................................................................................... 17 1 Literatuurstudie ..................................................................................................................... 18 1.1 Viskwaliteit ..................................................................................................................... 18 1.1.1 Evaluatie van de viskwaliteit ................................................................................... 18 1.1.1.1 Sensorische analyse ........................................................................................... 19 1.1.1.2 Chemische analyse ............................................................................................ 20 1.1.1.2.1 Chemische indicator trimethylamine .......................................................... 20 1.1.1.2.2 Chemische indicator totale vluchtige stikstofbase ...................................... 21 1.1.1.2.3 Chemische indicator biogene amines ......................................................... 21 1.1.2 Factoren die de viskwaliteit beïnvloeden ................................................................. 22 1.2 Vergelijkende studie tussen trimethylamine, biogene amines en totale vluchtige stikstofbase...................................................................................................................... 25 1.2.1 Wetgeving ................................................................................................................ 25 1.2.2 Toxiciteit .................................................................................................................. 28 1.2.3 Analysemethodes ..................................................................................................... 29 1.3 Trimethylamine .............................................................................................................. 33 1.3.1 Voorkomen trimethylamine ..................................................................................... 33 1.3.2 Vorming trimethylamine in vis ................................................................................ 33 1.3.4 Analysemethodes voor trimethylamine te bepalen in vis ........................................ 34 1.3.4.1 AOAC Official Method 971.14 ......................................................................... 34 1.3.4.2 Gaschromatografie ............................................................................................ 35 1.3.4.3 Flow injectie gasdiffusie ................................................................................... 38 1.3.4.4 Capillaire elektroforese ..................................................................................... 39 2 Experimentele studie ............................................................................................................. 40 2.1 Inleiding .......................................................................................................................... 40 11

2.2 Materiaal en methode ..................................................................................................... 42 2.2.1 Chemicaliën, reagentia en standaardoplossingen .................................................... 42 2.2.2 Headspace GC-MS analyse ...................................................................................... 42 2.2.3 Youden ruggedness trial .......................................................................................... 43 2.3 Resultaten en discussie ................................................................................................... 46 2.3.1 Optimalisatie van headspace GC-MS ...................................................................... 46 2.3.1.1 Optimalisatie staalvoorbereiding en statische headspace condities .................. 46 2.3.1.2 Optimalisatie chromatografische condities ....................................................... 49 2.3.2 Interne standaard ...................................................................................................... 51 2.3.3 Recovery’s ............................................................................................................... 53 2.3.4 Beperkte validatie van de voorgestelde methode ..................................................... 54 2.3.4.1 Lineariteit .......................................................................................................... 55 2.3.4.2 Detectielimiet en bepalingsgrens....................................................................... 55 2.3.4.3 Precisie .............................................................................................................. 57 2.3.4.4 Juistheid ............................................................................................................. 59 2.3.5 Verkennende testen met de interne standaard trimethyl-d9-amine.......................... 60 Conclusie .................................................................................................................................. 63 Referentielijst ........................................................................................................................... 65

12

Lijst met figuren en tabellen Figuur 1: Verschil tussen uiterlijke kenmerken van verse en bedorven Baars (How fresh is your fish?, 2007) ...................................................................................................... 19 Figuur 2: Evolutie van het TMA-gehalte in heek bij ijs (*) en bij 6-8 °C (◊) (Baixas-Nogueras et al., 2002) .............................................................................................................. 23 Figuur 3: Effect van bewaartemperatuur (ijs: * en 6-8 °C: ◊) op de som van histamine, putricine, tyramine en cadaverine (BAI) (Baixas-nogueras et al., 2002) ................ 23 Figuur 4: Evolutie van het TMA-gehalte in kopvoorn bij bewaring op 15 °C (Li et al., 2004) ................................................................................................................................. 24 Figuur 5: Lineair verband tussen de KIM-score en de bewaarduur (Lougovois et al., 2003) . 24 Figuur 6: Omzetting TMAO in TMA in spierweefsel van vis (Devlieghere et al., 2011) ....... 34 Figuur 7: Invloed van pH op responsfactor van TMA en andere componenten bij HS-GC-FID (Maris et al., 1999)................................................................................................... 36 Figuur 8: Invloed van temperatuur op responsfactor van TMA en andere componenten bij HSGC-FID (Maris et al., 1999) .................................................................................... 37 Figuur 9: Invloed van zout op responsfactor van TMA en andere componenten bij HS-GCFID (Maris et al., 1999) ........................................................................................... 37 Figuur 10: Schematische voorstelling van een flow injectie gasdiffusie (Baixas-Nogueras et al., 2001) .................................................................................................................. 38 Figuur 11: Elektroferogram van een tandbaars (Lista et al., 2001) .......................................... 39 Figuur 12: Proefopzet masterproef ........................................................................................... 41 Figuur 14: Asymmetriefactor bepalen (Dolan, 2003) .............................................................. 50 Figuur 15: Ijklijn van TMA ...................................................................................................... 55 Figuur 16: Ijklijn van TMA met interne standaard trimethyl-d9-amine .................................. 61

Tabel 1: Grenswaarden voor histamine in visserijproducten (Verordeningen (EG) nr. 1441/2007 en (EG) nr. 1019/2013) ............................................................................ 26 Tabel 2: Grenswaarden voor TVB-N in visserijproducten (Verordeningen (EG) nr. 1022/2008, (EG) nr. 2074/2005 en (EG) nr. 853/2004) ............................................. 28 Tabel 3: Analysetechnieken uit de literatuur voor BA, TMA en TVB-N ................................ 31 Tabel 4: Design en berekeningen bij de eerste Youden ruggedness trial ................................. 44 Tabel 5: Design en berekeningen bij de tweede Youden ruggedness trial ............................... 45 Tabel 6: Effect van de factoren op de TMA-respons bij de eerste Youden ruggedness trial ... 46 Tabel 7: T-waarden voor het effect van elke factor op de TMA-respons bij de eerste Youden ruggedness trial .......................................................................................................... 48 Tabel 8: Effect van de factoren op de TMA-respons bij de tweede Youden ruggedness trial . 48 Tabel 9: T-waarden voor het effect van elke factor op de TMA-respons bij de tweede Youden ruggedness trial .......................................................................................................... 49 Tabel 10: Herhaalbaarheid van methode zonder en met aangepaste GC-condities ................. 50 Tabel 11: Recovery’s van TMA met correctie en zonder correctie van IS .............................. 52 Tabel 12: Recovery’s van TMA ............................................................................................... 54 Tabel 13: LOD en LOQ van GC-MS analyse van TMA ......................................................... 56 13

Tabel 14: Herhaalbaarheid van GC-MS analyse van TMA ..................................................... 57 Tabel 15: Reproduceerbaarheid van GC-MS analyse van TMA ............................................. 58 Tabel 16: Juistheid van GC-MS analyse van TMA ................................................................. 60 Tabel 17: Recovery’s bekomen bij de methode met interne standaard trimethyl-d9-amine.... 61 Tabel 19: LOD en LOQ van GC-MS analyse van TMA met IS trimethyl-d9-amine .............. 62

14

Lijst met afkortingen AOAC

association of analytical communities

BA

biogeen amine

BAI

biogene amine index

BTB

broomthymolblauw

CE

capillaire elektroforese

ECL

electrochemiluminescentie

DMA

dimethylamine

DVB/CAR/PDMS

dovinylbenzeen/carboxeen/polydimethylsiloxaan

ECCA

enviromental consulting and chemical analysis

FA

formaldehyde

FIA

flow injectie analyse

FID

vlamionisatie detector

FIGD

flow injectie gasdiffusie

GC

gaschromatografie

HPLC

hoge performantie vloeistofchromatografie

HS

headspace

SPME

solid-phase microextractie

IC

ionenuitwisselingschromatografie

IS

interne standaard

KIM

kwaliteit index methode

MS

massaspectrometer

NPD

stikstof-fosfor detector

OPA

ortho-ftaalaldehyde

PDMS/DVB

polydimethylsiloxaan/dovinylbenzeen

RSD

relatieve standaarddeviatie

SIM

selected ion monitoring 15

TEA

triethylamine

TLC

dunne laag chromatografie

TMA

trimethylamine

TMAO

trimethylamine N-oxide

TVB-N

totale vluchtige stikstofbase

UHPLC

ultra hoge performantie vloeistofchromatografie

16

Inleiding Het waarborgen van de kwaliteit van voeding is belangrijk voor zowel producent als consument. Vis is net als andere verse levensmiddelen een bederfbaar product en ondergaat vanaf de vangst reeds veranderingen die uiteindelijk voor bederf zorgen. Tijdens visbederf worden trimethylamine (TMA), dimethylamine (DMA) en ammoniak vrijgesteld die samen het totale vluchtige stikstofbase gehalte (TVB-N) geven. Ze zorgen voor de typische bederfgeur aanwezig in vis verschillende dagen na de vangst. Ook niet-volatiele componenten zoals biogene amines (BA) kunnen gevormd worden tijdens het bewaren van de vis. Een vergelijkende studie van TMA, TVB-N en BA’s werd uitgevoerd op vlak van wetgeving, toxiciteit en analysemethodes. Dit was een doelstelling van de masterproef. Een andere doelstelling was nagaan hoe de viskwaliteit kan beoordeeld worden. Laboratorium ECCA voert analyses van leefmilieu en voedingsmiddelen uit op vraag van de overheid of van bedrijven. Analyses voor zowel TMA, BA’s als TVB-N worden op routinebasis uitgevoerd in het labo. De huidige methode die laboratorium ECCA toepast voor de bepaling van TMA is een colorimetrische methode. Nadelen van deze methode zijn: lage analytische gevoeligheid, interferentieproblemen en tijdrovend. Bovendien vormt picrinezuur een mogelijk gevaar voor explosie. Picrinezuur wordt bewaard in water. Bij langdurige bewaring kan het water verdampen en gaat picrinezuur kristalliseren. In droge toestand is deze stof schokgevoelig en ontstaat een explosiegevaar. De derde doelstelling van deze masterproef was dan ook het ontwikkelen van een nieuwe methode voor de bepaling van TMA in vis om de nadelen van de huidige methode weg te werken.

17

1 Literatuurstudie 1.1 Viskwaliteit 1.1.1 Evaluatie van de viskwaliteit De kwaliteit van de vis vermindert vanaf de visvangst. Er treden veranderingen op in de kleur, het aroma en de textuur van de vis (Li et al., 2004). Viskwaliteit omvat o.a. de diëtische kwaliteit van vis, de commerciële kwaliteit, de biologische conditie, de hygiënische kwaliteit en de visversheid (Aspecten van de kwaliteitsbepaling van vis, 1999). De voedingswaarde van de vis geeft de diëtische kwaliteit weer. Consumenten kunnen eisen stellen aan de vis die ze consumeren. Dit wordt commerciële kwaliteit genoemd. Zo verkiezen sommige consumenten een graatloze visfilet. De samenstelling en textuur van de vis zijn afhankelijk van de jaarlijkse geslachtscyclus. Door deze cyclus kan bijvoorbeeld het eiwit- en watergehalte variëren tijdens het jaar. Dit is de biologische conditie van de vis. De hygiënische kwaliteit heeft te maken met pathogenen, visziekten, parasieten, toxische vissen, fysische verontreinigingen, additieven en contaminanten. De kwaliteitsparameter, visversheid, wordt beschouwd als het belangrijkste criterium voor viskwaliteit (Li et al., 2004; Alasalvar et al., 2001). Vanaf de visvangst begint de vis te bederven. Kort na de dood van de vis wordt visbederf vooral veroorzaakt door autolytische enzymen (Pacheco-aguilar et al., 2000). Enzymen betrokken bij glycolyse en ATP afbraak maar ook de proteolytische enzymen in het spijsverteringsstelsel zijn belangrijk (Aspecten van de kwaliteitsbepaling van vis, 1999). Tijdens het bewaren gaat het visbederf voornamelijk veroorzaakt worden door de microbiële activiteit. Shewanella putrefaciens wordt vaak vermeld in de literatuur (Kyrana & Lougovois, 2002; Papadopoulos et al., 2003). Naast dit bacterieel bederf treden ook chemische wijzigingen op in het spierweefsel die leiden tot visbederf (Li et al., 2004). Chemische reacties zoals vetoxidatie dat tot ranzigheid leidt, gebeuren trager bij verse gekoelde vis (Romero-González et al., 2012). Om de belangrijkste kwaliteitsparameter, visversheid, te evalueren zijn verschillende methodes beschikbaar. De versheidsgraad kan bepaald worden met chemische methoden. Hierbij worden o.a. volatiele en niet-volatiele amines die ontstaan zijn tijdens het bederfproces, gekwantificeerd (Anderson, 2008). Daarnaast zijn er ook nog microbiologische en fysische methodes beschikbaar die echter niet besproken werden in deze masterproef. De belangrijkste methode blijft echter de sensorische analyse om de versheid van de vis te bepalen en dus de viskwaliteit te schatten (Sant’Ana et al., 2011; Alasalvar et al., 2001).

18

1.1.1.1 Sensorische analyse

In de eerste dagen na de vangst zijn sensorische analyses geschikt om de versheid van de vis te bepalen (Béné et al., 2001). Deze kwalitatieve test is gebaseerd op de evaluatie van verschillende criteria (bv. aroma en kleur). Geur is één van de voornaamste parameters (Béné et al., 2001; Wu et al., 2014). Officiële schema’s die opgesteld zijn door de Europese Commissie, kunnen gebruikt worden voor de sensorische analyse. Verordening (EG) nr. 2406/96 bevat beoordelingsschema’s voor o.a. magere en vette vis waarmee de vis ondergebracht wordt in één van de versheidsklassen extra, A of B. Bij elk beoordelingsschema worden verschillende parameters nagegaan bijvoorbeeld de huid, het slijm op de huid en de kieuwen (Aspecten van de kwaliteitsbepaling van vis, 1999). Ook de ogen van de vis worden beoordeeld. In Figuur 1 is een duidelijk verschil waar te nemen in de ogen en de huidskleur van de verse en bedorven baars (How fresh is your fish?, 2007). Nog een andere belangrijke sensorische methode is de Kwaliteit Index Methode (KIM). Hierbij wordt aan de verschillende uiterlijke kenmerken van de vis (huid, ogen, slijm,…) een score van 0 (goed) tot 3 (slecht) gegeven (Viskwaliteit, z.j.). De totale KIM-score wordt bekomen door de scores van de versheidskenmerken op te tellen. Sensorische analyses worden gekenmerkt door een lage kost en eenvoudigheid (Chan et al., 2006; Papadopoulos et al., 2003). De testpersonen dienen getraind te worden om onderscheid te kunnen maken tussen bedorven en verse vis. Ondanks deze trainingen en ervaringen blijft subjectiviteit een groot nadeel van deze test (Chan et al., 2006; Pena-Pereira et al., 2010). Daarom wordt er gezocht naar objectieve methodes die kunnen gebruikt worden wanneer resultaten van de sensorische analyse twijfelachtig zijn (Pons-Sánchez-Cascado et al., 2006; Baixas-Nogueras et al., 2001; Romero-González et al., 2012).

Figuur 1: Verschil tussen uiterlijke kenmerken van verse en bedorven Baars (How fresh is your fish?, 2007) 19

1.1.1.2 Chemische analyse

Verschillende chemische methodes kunnen aangewend worden om de visversheid te beoordelen. Bepalinig van het totale vluchtige stikstofbase gehalte (TVB-N) is hierbij een vaak toegepaste methode (Romero-González et al., 2012). De som van trimethylamine (TMA), dimethylamine (DMA) en ammoniak geeft het TVB-N gehalte weer (Béné et al., 2001; Baixas-nogueras et al., 2002). Er zijn ook chemische methodes ontwikkeld die enkel het TMA-gehalte in vis bepalen. Kwantificatie van biogene amines (BA’s) en de K-waarde berekenen zijn andere mogelijke bederftesten. Vanaf de vangst van de vis treedt er enzymatische afbraak van ATP op waarbij adenosine difosfaat (ADP), adenosine monofosfaat (AMP) en inosine monofosfaat (IMP) gevormd worden. In het verdere afbraakproces onstaan ook inosine (Ino) en hypoxantine (Hx) (Özogul et al., 2000). De K-waarde geeft weer hoe ver deze ATP-afbraak gevorderd is en wordt berekend met volgende formule (Alasalvar et al., 2001): [𝐼𝑛𝑜]+[𝐻𝑥]

K-waarde = [𝐴𝑇𝑃]+[𝐴𝐷𝑃]+[𝐴𝑀𝑃]+[𝐼𝑀𝑃]+[𝐼𝑛𝑜]+[𝐻𝑥] x 100 Bij zeebrasem is waargenomen dat de K-waarde hoog is wanneer de sensorische kwaliteit laag is (Alasalvar et al., 2001). Chemische analyses vereisen ervaren werknemers. De meetapparatuur kan kostelijk zijn en een lange analysetijd is mogelijk (Lougovois et al., 2003). In de volgende paragrafen wordt meer informatie gegeven over TVB-N, TMA en BA als chemische bederfindicatoren. 1.1.1.2.1 Chemische indicator trimethylamine

Bij bederf van zoutwatervissen en sommige zoetwatervissen is de accumulatie van TMA groot (Baixas-nogueras et al., 2002). Li et al. (2004) vermelden dat TMA soms tot 95 % van het totale aminegehalte in de vis kan bedragen. De typische bederfgeur van vis is voornamelijk afkomstig van deze component (Baixas-nogueras et al., 2002). Alasalvar et al. (2005) vermelden dat volatiele componenten die een grote bijdrage leveren aan het visaroma geschikt zijn als indicator van visversheid. De viskwaliteit kan als excellent beschouwd worden wanneer het TMA-gehalte in de vis lager bedraagt dan 10 ppm volgens het criterium van Castell (Li et al., 2004; Veciana-Nogues et al., 1996). Bij het begin van het bederfproces is de TMA-concentratie laag in de vis en wordt door Anderson (2008) gesuggereerd om een andere methode te gebruiken. 20

1.1.1.2.2 Chemische indicator totale vluchtige stikstofbase

Het TVB-N gehalte meten is een alternatief om de versheid van de vis te beoordelen (Béné et al., 2001). Dit gehalte is zoals het TMA-gehalte evenzeer laag in het begin van de bewaarperiode van de vis. In vers gevangen vis die weinig of geen trimethylamine N-oxide (TMAO) bevat, kan TVB-N als kwaliteitsparameter genomen worden (Huss, 1988). Zo ontstaat er bijvoorbeeld een accumulatie van ammoniak bij garnalen, inktvissen en kraakbeenvissen (Huss, 1988). In vers gevangen vis ligt het TVB-N gehalte tussen 50 en 200 ppm (Taliadourou et al., 2003). De kwaliteit van zeilvis wordt als middelmatig beschouwd wanneer het gemeten TVB-N gehalte ligt tussen 46 en 250 ppm (Anderson, 2008). Bij zeilvis begint het bederf bij TVB-N gehaltes die gelegen zijn tussen 250 en 365 ppm (Anderson, 2008). Castro et al. (2006) zijn van mening dat een sensorische methode beter de versheid in Europese zeebaars bepaalt dan deze methode. In deze vis is Shewanella putrefaciens niet het belangrijkste bederfmicro-organisme. Bederf kan hier ontstaan door de aanwezigheid van Pseudomona species. Deze bacterie is niet in staat om TMAO te reduceren waardoor het TVB-N gehalte laag blijft tijdens het bederfproces. Voor Europese zeebaars (Dicentrarchu labrax) zou TVB-N geen goede chemische bederfindicator zijn (Kyrana & Lougovois, 2002; Papadopoulos et al., 2003). 1.1.1.2.3 Chemische indicator biogene amines

BA’s zijn niet-vluchtige organische basen. Er is interesse in de analyse van deze amines vanuit toxicologisch standpunt maar ook om de viskwaliteit te bepalen (Pons-SánchezCascado et al., 2006). BA’s zijn gerelateerd met bederf (Rezaei et al., 2007). In verse vis komen BA’s voor als gevolg van endogene enzymactiviteit (Baixas-nogueras et al., 2002). De concentraties zijn echter laag. Agmatine, cadaverine en putricine zijn voorbeelden hiervan. Tijdens de bewaarperiode verhoogt de concentratie van de BA’s (histamine, tyramine, putrescine, cadaverine,…) in vis als gevolg van microbiële decarboxylatie van vrije aminozuren (Romero-González et al., 2012; Gong et al., 2014; Önal, 2007; Dadáková et al., 2009). Indien de visversheid geëvalueerd wordt met BA’s, zal dit hoofdzakelijk met histamine gebeuren (Baixas-nogueras et al., 2002; Anderson, 2008). Er zijn ook verschillende biogene amine indexen (BAI’s) voorgesteld. Mietz & Karmas (1977) ontwikkelden een BA-index 21

(BAI) die gelijk is aan

𝑝𝑝𝑚 ℎ𝑖𝑠𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒 + 𝑝𝑝𝑚 𝑝𝑢𝑡𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑛𝑒 + 𝑝𝑝𝑚 𝑐𝑎𝑑𝑎𝑣𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒 1+ 𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑖𝑑𝑖𝑛𝑒 + 𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑒

. Deze index is een

aanvaard criterium om de visversheid te bepalen (Baixas-nogueras et al., 2002). Wanneer deze BAI-waarde 10 ppm overschrijdt, vermindert de viskwaliteit (Mohamed et al., 2009). Voor tonijn is een andere BAI voorgesteld namelijk de som van histamine, tyrimine, putriscine

en

cadaverine

(Veciana-Nogués

et

al.,

1997).

Vijftig

ppm

is

de

aanvaardbaarsheidsgrens voor tonijn (Baixas-nogueras et al., 2002). Er is een goede correlatie gevonden tussen BAI en de sensorische analyse bij koud gerookte zalm (Rezaei et al., 2007). 1.1.2 Factoren die de viskwaliteit beïnvloeden Er zijn verschillende factoren die de viskwaliteit beïnvloeden. Aan de hand van resultaten uit studies wordt het effect van de bewaartemperatuur, de bewaartijd en de vissoort beschreven. Hogere bewaartemperaturen geven aanleiding tot een hogere TMA-productie wat zorgt voor kwaliteitsachteruitgang. Bij bewaring van heek op 6-8 °C gebeurde vanaf de 10 de dag een sterke stijging in TMA, wat niet het geval was bij dezelfde vis op ijs (Figuur 2). Op dag 30 bereikte TMA een concentratie van 30 mg/100 g vis bij 6-8 °C terwijl bij 0 °C het TMAgehalte slechts 5 mg/100 g vis bedroeg (Baixas-Nogueras et al., 2002). Bewaring op ijs is meer geschikt dan bewaring op 6-8 °C om de viskwaliteit te behouden. Wanneer vis bewaard wordt op ijs bij 0 °C, stijgt de concentratie TMA traag (Baixas-Nogueras et al., 2002). Een verklaring hiervoor is dat de bacteriële reductie van TMAO tot TMA trager verloopt bij lagere temperatuur (Li et al., 2004). Li et al. (2004) vermelden dat er experimenten zijn uitgevoerd over twee jaar waarbij TMA nauwelijks in concentratie steeg bij vriestemperatuur (-20 °C). Ook de concentratie van BA’s in vis is o.a. afhankelijk van de bewaarcondities (Hu et al., 2012). Deze beïnvloeden namelijk de vermenigvuldiging van de bederfmicro-organismen en de microbiële enzymactiviteit (Baixas-nogueras et al., 2002). Figuur 3 geeft het effect van de bewaartemperatuur weer voor heek. Bij bewaring op ijs blijft de BAI, die de som is van histamine, putricine, tyramine en cadaverine, laag. Bij bewaring op 6-8 °C is er een sterkere stijging van BAI vast te stellen.

22

Figuur 2: Evolutie van het TMA-gehalte in heek bij ijs (*) en bij 6-8 °C (◊) (Baixas-Nogueras et al., 2002)

Figuur 3: Effect van bewaartemperatuur (ijs: * en 6-8 °C: ◊) op de som van histamine, putricine, tyramine en cadaverine (BAI) (Baixas-nogueras et al., 2002)

Naast de bewaartemperatuur beïnvloedt ook de bewaartijd de viskwaliteit. Hoe langer de vis bewaard wordt, hoe meer de kwaliteit gaat dalen. Zowel Figuur 2 als Figuur 4 geven weer dat de concentratie van TMA stijgt naarmate de bewaarperiode vordert. De totale KIM-score is lager naarmate de vis verser is (Viskwaliteit, z.j.). Deze score neemt toe naarmate de vis langer bewaard wordt op ijs. Lougovois et al. (2003) stelden dit lineair verband vast in hun studie bij zeebrasem (Sparus aurata) (Figuur 5).

23

Figuur 4: Evolutie van het TMA-gehalte in kopvoorn bij bewaring op 15 °C (Li et al., 2004)

Figuur 5: Lineair verband tussen de KIM-score en de bewaarduur (Lougovois et al., 2003)

De TMA-productie kan ten slotte ook verschillen naargelang de vissoort. In de studie van Chan et al. (2006) werd een lager TMA-gehalte aangetroffen bij tandbaars dan bij de grijze zeebaars. Zo bedroeg het TMA-gehalte bijvoorbeeld na 28 dagen bewaren bij 0 °C 27,5 mg N/100 g vis in grijze zeebaars en 11,8 mg N/100 g vis in tandbaars. Bij de laatstgenoemde vis zal het visbederf trager optreden.

24

1.2 Vergelijkende studie tussen trimethylamine, biogene amines en totale vluchtige stikstofbase 1.2.1 Wetgeving Wat de BA’s betreft, voorziet de Europese wetgeving enkel normen voor histamine. Tabel 1 geeft deze weer (Verordeningen (EG) nr. 1441/2007 en (EG) nr. 1019/2013).

25

Tabel 1: Grenswaarden voor histamine in visserijproducten (Verordeningen (EG) nr. 1441/2007 en (EG) nr. 1019/2013)

26

Tot op heden bestaat er nog geen wetgeving rond TMA. Visverwerkende bedrijven zijn echter geïnteresseerd in de TMA-concentratie om de viskwaliteit te kunnen garanderen voor hun klanten. De bedrijven waarvoor laboratorium ECCA de TMA-bepaling uitvoert, stellen een maximale grenswaarde van 20 ppm voorop. In de Europese Unie is een grenswaarde vastgelegd voor het gehalte TVB-N in visserijproducten (Verordeningen (EG) nr. 1022/2008 en (EG) nr. 2074/2005). De visserijproducten worden opgedeeld in vier categorieën waarvan de grenswaarde voor TVB-N verschilt (Tabel 2). De officiële methode voor bepaling van het TVB-N gehalte in visserijproducten is stoomdestillatie. De procedure staat beschreven in hoofdstuk 3 van Verordening (EG) nr. 2074/2005. De routinemethodes voor het TVB-N gehalte te bepalen in visserijproducten zijn een microdiffusiemethode beschreven door Conway en Byrne (1933), een directe destillatiemethode beschreven door Antonacopoulos (1968) en een destillatie van een met trichloorazijnzuur eiwitvrij gemaakt extract (Comité van de Codex Alimentarius voor vis en visserijproducten (1968)).

27

Tabel 2: Grenswaarden voor TVB-N in visserijproducten (Verordeningen (EG) nr. 1022/2008, (EG) nr. 2074/2005 en (EG) nr. 853/2004) Vissoort

1

Sebastes spp., Helicolenus dactylopterus,

Grenswaarde TVB-N

Verordening

(mg stikstof/ 100g vlees)

(EG) nr.

25

2074/2005

30

2074/2005

35

2074/2005

60

1022/2008

Sebastichthys capensis 2

Soorten die behoren tot de familie Pleuronectidae (met uitzondering van de heilbot: Hippoglossus spp.)

3

Salmo salar, soorten die behoren tot de familie Merlucciidae, soorten die behoren tot de familie Gadidae

4

Visserijproducten die rechtstreeks gebruikt worden voor de bereiding van visolie voor menselijke consumptie *

* De grondstoffen voor de bereiding van visolie voor menselijke consumptie moeten (Verordening (EG) nr. 853/2004): a) afkomstig zijn van inrichtingen, inclusief vaartuigen, die erkend of geregistreerd zijn overeenkomstig Verordening (EG) nr. 852/2004 of overeenkomstig deze verordening; b) afgeleid zijn van visserijproducten die geschikt zijn voor menselijke consumptie en voldoen aan de bepalingen van deze sectie; c) onder hygiënische omstandigheden worden vervoerd en opgeslagen; d) zo spoedig mogelijk worden gekoeld en moeten op een temperatuur welke die van smeltend ijs benadert, worden gehouden. Indien de grondstof echter voldoet aan de eerste drie punten a), b) en c), mogen de lidstaten in afwachting van specifieke Gemeenschapswetgeving hogere grenswaarden vaststellen voor bepaalde soorten (Verordening (EG) nr. 1022/2008).

1.2.2 Toxiciteit Hoge concentraties TMA zijn toxisch voor de mens, maar zijn precursor TMAO is dit niet (Lund et al., 2000). Bij de mens wordt TMA in de lever geoxideerd tot TMAO door trimethylamine oxidase (Seibel & Walsh, 2002). Blootstelling aan te hoge dosissen TMA verwekt oogirritatie, huidirritatie en ernstige ademhalingsproblemen die tot de dood kunnen leiden (Chien et al., 2000). De meeste auteurs geven aan dat de concentratie van TMA in de vis niet hoger zou mogen zijn dan 10-15 mg per 100 g vis. De voorgestelde maximumlimiet voor heek is 5 mg per 100 g vis. Boven deze limieten is de vis volgens hen niet meer aanvaardbaar voor menselijke consumptie (Veciana-Nogues et al., 1996; Baixas-Nogueras et 28

al., 2002). TMA kan omgezet worden naar kankerverwekkende N-nitrosamines (Chan et al., 2006; Li et al., 2004; daCosta et al., 1990). TVB-N bevat hoofdzakelijk TMA, DMA en ammoniak. Hoge dosissen ammoniak zijn toxisch voor mens. DMA is een precursor van N-nitrosamines (Chan et al., 2006, daCosta et al., 1990). Hoge concentraties van BA’s kunnen ook toxicologische effecten bij de mens veroorzaken o.a. hoofdpijn, misselijkheid, veranderingen in bloeddruk of ademhalingsproblemen (Gong et al., 2014). Histamine intoxicatie komt het meest voor (Sagratini et al., 2012). Vissoorten die behoren tot de familie Scrombridae en Scomberesocideae o.a. makreel, tonijn, sardien (Kim et al., 2009; Dadáková et al., 2009; Sagratini et al., 2012) kunnen leiden tot deze intoxicatie. Putrescine en cadaverine zijn secundaire amines die de toxiciteit van histamine kunnen versterken (Önal, 2007). Zoals bij TMA en DMA kunnen ook carcinogene nitrosamines gevormd worden (Silla Santos, 1996). Deze ontstaan door reactie van nitriet met bepaalde BA’s (putrescine, spermine, spermidine, agmatine of cadaverine) (Önal, 2007; Kim et al., 2009; Sagratini et al., 2012). 1.2.3 Analysemethodes Verschillende analysetechnieken zijn beschikbaar voor TMA, BA’s en TVB-N te bepalen (Tabel 3). Gaschromatografie (GC) wordt vaak als analysemethode gebruikt bij TMA, terwijl bij BA’s de kwantificatie frequent gebeurt door hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC). Een verklaring hiervoor is dat TMA een vluchtige component is en BA’s niet-vluchtig zijn. Doordat BA’s geen chromoforen hebben, is pre-kolom of post-kolom derivatisering vereist bij een UV- of een fluorescentie detector (Önal, 2007; Önal et al., 2013; De Mey et al., 2012; Simat & Dalgaard, 2011). Bij derivatisatie kunnen onstabiele derivaten ontstaan en problemen optreden met herhaalbaarheid. De meest gebruikte derivatisatiereagentia zijn dansylchloride (dansyl-Cl) en ortho-ftaalaldehyde (OPA). OPA reageert enkel met primaire amines tot weinig stabiele derivaten (Önal, 2007; Saaid et al., 2009; Park et al., 2010). Dansyl-Cl kan ook reageren met primaire amines, maar kan daarnaast nog stabiele derivaten vormen met secundaire amines (Önal, 2007; Saaid et al., 2009). Er zijn reeds veel derivatisatiereagentia ontwikkeld voor primaire en secundaire amines, maar voor tertiaire amines (zoals TMA) is er nog veel onderzoek nodig. In de literatuur wordt dunne laag chromatografie (TLC) vermeld om BA’s te bepalen maar niet voor TMA of TVB-N. In vergelijking met HPLC wordt TLC gekenmerkt door zijn 29

eenvoudigheid en snelle analyse (Lapa-Guimarães & Pickova, 2004). Daarnaast worden ook ionenuitwisselingschromatografie (IC) en ultra hoge performantie vloeistofchromatografie (UHPLC) vermeld om BA’s te kwantificeren. Een andere analysetechniek is capillaire elektroforese (CE), maar deze wordt weinig gebruikt voor de bepaling van BA’s (Önal et al., 2013). Flow injectie analyse (FlA) wordt vaak aangewend om het TMA-gehalte en TVB-N te bepalen. Voor deze twee bepalingen met FIA is er een verschil bij de uitvoering. BaixasNogueras et al. (2001) bepaalden het TMA-gehalte en TVB-N in mediterrane heek (Merluccius merluccius). Voor de TMA-analyse werd voorafgaand aan alkalisatie formaldehyde (FA) toegevoegd aan het extract. Dit gebeurde niet voor TVB-N omdat daarbij ook primaire en secundaire amines worden bepaald. De overige procedure is hetzelfde voor beide bepalingen. Stoomdestillatie wordt ook vaak toegepast voor het TVB-N gehalte te bepalen.

30

Tabel 3: Analysetechnieken uit de literatuur voor BA, TMA en TVB-N

31

32

1.3 Trimethylamine 1.3.1 Voorkomen trimethylamine TMA is een vluchtig tertiair amine. Onderzoek in levensmiddelen is vaak gericht op TMAbepaling in vis en zeevruchten (Shim & Hee Baek, 2012). TMA is ook bepaald in urine en in lucht (Mills et al., 1999; Chien et al., 2000; Namiésnik et al., 2003; Rampfl et al., 2008). Onderzoekers stelden de aanwezigheid van TMA voor het eerst ook vast in spinazie, kool en sla bij alkalische pH (Shim & Hee Baek, 2012). 1.3.2 Vorming trimethylamine in vis De vorming van TMA in het spierweefsel van de vis wordt schematisch voorgesteld in Figuur 6 (Devlieghere et al., 2011). Het bacterieel enzym, trimethylamine N-oxide reductase, reduceert TMAO tot TMA. Na de vangst daalt TMAO in de dode vis door geleidelijke omzetting naar TMA. De omzetting van TMAO naar TMA is afhankelijk van zowel pH, temperatuur alsook de vissoort. Pons-Sánchez-Cascado et al. (2006) vermelden dat 7,2-7,4 de optimale pH is voor deze reductie en dat de typische pH van verse vis rond 6,0 ligt. De temperatuur speelt ook een rol in de omzetting van TMAO. Bij diepvriesbewaring gebeurt er geen bacteriële reductie omdat de bacteriën geremd worden in hun groei. Onderzoek van Veciana-Nogues et al. (1996) toont aan dat de hoeveelheid TMA niet toeneemt wanneer de vis gedurende twee jaar bewaard werd bij een diepvriestemperatuur van -20 °C. Endogene enzymen zijn wel actief bij diepvriestemperatuur en reduceren TMAO tot DMA en FA (Lin & Hurng, 1985; Li et al., 2009). Tot slot speelt ook de vissoort een cruciale rol in de omzetting van TMAO naar TMA. De meeste zoetwatervissen bevatten geen TMAO (Chung & Chan, 2009). Bij zoutwatervissen bestaat de niet-proteïne stikstoffractie voor het grootste deel uit TMAO dat vooral voorkomt in het spierweefsel. Het is een osmoregulator. De hoeveelheid TMAO hangt af van de vissoort. Binnen elke vissoort is het gehalte TMAO ook nog afhankelijk van de visgrootte, de leeftijd, het seizoen en de habitat (Lin & Hurng, 1985; Chung & Chan, 2009; Seibel & Walsh, 2002). Hoe hoger het initieel gehalte TMAO in de vis, hoe hoger het TMA-gehalte zal zijn.

33

CH3-CHOH-COOH (melkzuur) + (CH3)3-NO (TMAO) TMAO-reductase CH3-CO-COOH (pyruvaat) + (CH3)3-N (TMA) + H2O

Figuur 6: Omzetting TMAO in TMA in spierweefsel van vis (Devlieghere et al., 2011)

1.3.4 Analysemethodes voor trimethylamine te bepalen in vis In de literatuur zijn verschillende methodes te vinden voor TMA-bepaling in vis. De meest gebruikte methode is gebaseerd op de colorimetrische methode van Dyer (Dhaouadi et al., 2007). Daarnaast is de GC-techniek ook populair (Li et al., 2009). Volgende chemische methodes bestaan voor TMA-bepaling: -

colorimetrische methode (Gou et al., 2010; Kyrana & Lougovois, 2002);

-

GC met vlamionisatie detector (FID) (Baixas-nogueras et al., 2002; Li et al., 2004; Veciana-Nogues et al., 1996; Armenta et al., 2006) of massaspectrometer (MS) (Chung & Chan, 2009; Chan et al., 2006; Mitchell et al., 2002; Duflos et al., 2006; Wu et al., 2014; Ganeko et al., 2008; Miyasaki et al., 2011);

-

FIA met spectrofotometrische (Sadok et al., 1996; Ruiz-Capillas & Horner, 1999; Baixas-nogueras et al., 2001) of potentiometrische detectie (Adhoum et al., 2003);

-

CE (Li & Lee, 2007; Timm & Jørgensen, 2002; Lista et al., 2001);

-

IC (Li et al., 2009).

1.3.4.1 AOAC Official Method 971.14

Een colorimetrische meting die gebaseerd is op de methode van Dyer, is de AOAC officiële methode 971.14 voor de kwantificatie van TMA in vis. In deze methode worden verschillende stappen onderscheiden: een vloeistof-vloeistof extractie van TMA met tolueen, drogen van de tolueenlaag met Na2SO4 en de vorming van een gekleurd complex door toevoeging van picrinezuur (Pena-Pereira et al., 2010). De concentratie wordt bepaald door de absorptie van het gele complex te meten bij een golflengte van 410 nm (Lin & Hurng, 1985). Nadelig aan deze methode is de lage analytische gevoeligheid. Hierdoor kan de concentratiebepaling pas enkele dagen na de vangst gebeuren. De concentratie van TMA in de vis is dan hoog genoeg voor detectie (Pena-Pereira et al., 2010). Primaire en secundaire amines kunnen ook reageren met picrinezuur ter vorming van een gekleurd complex waardoor een overschatting van het TMA-gehalte kan optreden. Toevoeging van FA tijdens de extractie 34

kan deze interferentie verminderen (Pena-Pereira et al., 2010). In tegenstelling tot HPLC en GC kan er bij deze methode geen gelijktijdige bepaling gebeuren van verschillende componenten (Li et al., 2009). Andere nadelen verbonden aan deze analyse zijn tijdrovend en het gebruik van toxische organische solventen (Dhaouadi et al., 2007). 1.3.4.2 Gaschromatografie

TMA is een amine met een laag moleculair gewicht (59,11 g/mol). Amines met een laag moleculair gewicht zijn moeilijk te analyseren door hun hoge vluchtigheid (Li et al., 2004). GC is ideaal voor de scheiding van vluchtige componenten en dus ook geschikt voor TMAbepaling. Deze techniek kan TMA gelijktijdig bepalen met andere volatiele amines zoals DMA (Kataoka, 1996; Namieśnik et al., 2003). Tegenwoordig wordt headspace solid-phase microextractie (HS-SPME) vaak gebruikt in combinatie met een GC-analyse voor bepaling van vluchtige componenten. SPME heeft als voordeel dat het gebruik van een organisch solvent vermeden wordt. Verder is het een eenvoudige en snelle techniek (Béné et al., 2001). SPME is ontstaan in het begin van de jaren 90. Bij HS-SPME wordt een gecoate vezel geplaatst in de dampruimte van de vial. Deze vezel absorbeert vluchtige componenten waaronder TMA. Daarna gebeurt desorptie van de componenten door de vezel te verhitten in de injectiekamer van de GC. Om te zorgen dat TMA gemakkelijker in de dampfase van de vial overgaat, worden base en zout toegevoegd aan het staal. Door toevoeging van KOH of NaOH wordt de pH hoger dan de pK a van TMA (9,87) waardoor TMA niet meer geïoniseerd is (Shim & Baek, 2012; Chan et al., 2006). Chan et al. (2006) stelden vast dat de ideale concentratie van NaOH 15 M bedraagt om interferentieproblemen bij het visstaal te vermijden. Er zijn al meerdere vezels uitgetest voor TMA-bepaling.

Shim

&

Baek

(2012)

concludeerden

dat

een

polydimethylsiloxaan/dovinylbenzeen (PDMS/DVB) vezel en een DVB/carboxeen/PDMS (DVB/CAR/PDMS) vezel de hoogste extractie efficiënties opleveren. Hetzelfde resultaat werd bekomen bij een andere studie (Chan et al., 2006). Optimalisatie van de extractietemperatuur, de extractietijd, de pH en de ionensterkte van het visstaal zijn beschreven in meerdere studies (Li et al., 2004; Chan et al., 2006). Headspace technieken zijn bij GC succesvol toegepast om volatiele componenten in vis te concentreren (Alasalvar et al., 2005; Mitchell et al., 2002). Bij een statische headspace analyse ontstaat een evenwichtsinstelling van analiet i tussen de dampfase en de oplossing waarbij de verdelingsconstante K gegeven wordt door CiL/CiG (CiL en CiG zijn de analietconcentraties bij evenwicht respectievelijk in de oplossing en de dampfase van de vial). 35

Maris et al. (1999) bepaalden alifatische amines waaronder TMA in een waterig staal met HSGC-FID/NPD. Ze hebben hierbij belangrijke parameters van een statische headspace techniek besproken o.a. de pH, de vialtemperatuur en de ionensterkte. Deze drie parameters beïnvloeden namelijk K. Figuur 7 geeft het effect van pH weer op de responsfactor van de alifatische amines. Op de x- en y-as worden respectievelijk de pH en de responsfactor (F) weergegeven. Naarmate de pH stijgt, gaat de responsfactor van TMA toenemen. Ook de responsfactoren van diethylamine, butylamine, propylamine en pyridine nemen toe.

Figuur 7: Invloed van pH op responsfactor van TMA en andere componenten bij HS-GC-FID (Maris et al., 1999)

Hetzelfde fenomeen wordt waargenomen bij een temperatuurstijging van de vial. In Figuur 8 wordt TMA voorgesteld door het tweede staafje en dit bij de verschillende vialtemperaturen. Bij de figuur staan ook de kookpunten van de componenten vermeld. TMA heeft een veel lager kookpunt (2,9 °C). De vialtemperatuur verhoogt sterk de responsfactor wanneer deze het kookpunt van component benadert en overschrijdt.

36

Figuur 8: Invloed van temperatuur op responsfactor van TMA en andere componenten bij HSGC-FID (Maris et al., 1999)

NaCl werd als zout gebruikt voor de invloed van de ionensterkte te bestuderen. Dit zout wordt gekenmerkt door een hoge oplosbaarheid en chemische inertie (Maris et al., 1999). Vanaf het moment dat de oplossing verzadigd is aan zout, beïnvloedt verdere zouttoevoeging de responsfactor niet meer en blijft ze constant (Figuur 9). Dezelfde vaststellingen werden bekomen bij de studie van Tsukioka et al. (1993).

Figuur 9: Invloed van zout op responsfactor van TMA en andere componenten bij HS-GCFID (Maris et al., 1999) 37

1.3.4.3 Flow injectie gasdiffusie

Een flow injectie analyse waarbij de scheiding gebeurt met een gaspermeabel membraan, wordt flow injectie gasdiffusie (FIGD) genoemd. Deze techniek wordt voorgesteld in Figuur 10. De standaarden of de visstalen bekomen na een zure extractie, worden geïnjecteerd via een injectieklep. Aan deze zure geïnjecteerde oplossing wordt met een peristaltische pomp FA en een base toegevoegd waardoor gasvormig TMA ontstaat. Dit gas gaat diffunderen door het gaspermeabel membraan en zorgt daar voor een pH-stijging van de broomthymolblauw (BTB) oplossing. De kleur van de indicator BTB verandert hierdoor en wordt sprectrofotometrisch gekwantificeerd. Sadok et al. (1996) gebruikten FIA voor TMA-determinatie in vis. De gebruikte FA concentratie, 120 g/l, was te laag om interferentie van ammoniak, primaire en secundaire amines te voorkomen. Slechts een deel van deze amines gaat dan reageren met FA ter vorming van niet-volatiele producten. Daardoor kon er in deze studie geen TMA-bepaling gebeuren bij lage TMA-concentratie in vis met een hoog TVB-N gehalte (Ruiz-Capillas et al., 1999). Later werd de concentratie van FA (200 g/l) in deze methode van Sadok et al. (1996) aangepast om TMA-determinatie te optimaliseren (Ruiz-Capillas et al., 1999).

Figuur 10: Schematische voorstelling van een flow injectie gasdiffusie (Baixas-Nogueras et al., 2001) 38

1.3.4.4 Capillaire elektroforese

CE-UV kan niet toegepast worden bij TMA-bepaling omdat TMA weinig absorbeert in het UV-gebied. Derivatisatie van tertiaire moleculen is moeilijk (Li & Lee, 2007). CE-met een indirecte UV detectie is wel mogelijk voor TMA-bepaling. Zo voerden Timm & Jørgensen (2002) een studie uit op kabeljauw waarin o.a. TMA bepaald werd met CEindirecte UV detectie. In deze studie werd kopersulfaat gebruikt als achtergrondion. Het achtergrondion dient een gelijkaardige mobiliteit te bezitten als de analieten. Daarnaast is het nodig dat het achtergrondion een hoge absorptie vertoont bij de gekozen golflengte. De analieten absorberen echter niet bij deze golflengte waardoor het signaal van de detector daalt. Voor deze CE-analyse werd de pH door een buffer constant gehouden op drie zodat de analieten waaronder TMA geladen zijn en kunnen migreren in het elektrisch veld. Lista et al. (2001) deed een studie op tandbaars ook met CE-indirecte UV. Het bekomen elektroferogram wordt weergegeven in Figuur 11 waarbij piek 1 TMA voorstelt.

Figuur 11: Elektroferogram van een tandbaars (Lista et al., 2001)

Ook CE-electrochemiluminescentie (CE-ECL) kan gebruikt worden voor TMA-bepaling in vis. Het werd toegepast in de studie van Li & Lee (2007) waarbij een goede scheiding bekomen werd tussen TMA en andere laag moleculaire amines. De gevoeligheid van ECL is hoger dan bij indirecte UV-detectie (Li & Lee, 2007).

39

2 Experimentele studie 2.1 Inleiding In de literatuur zijn verschillende methodes beschreven om TMA te kwantificeren (zie paragraaf 1.3.4). GC is een techniek die in laboratorium ECCA beschikbaar is, terwijl FIA en CE niet. Voor deze masterproef werd dan ook geopteerd voor het gebruik van GC. Met GCFID werden verscheidene testen uitgevoerd. FID zorgde echter voor te weinig selectiviteit ten gevolge van matrixinterferentie. Door headspace GC-MS te gebruiken werd de selectiviteit verbeterd en de matrixinterferentie verminderd. Headspace zorgt voor makkelijke staalvoorbereiding. Een schematisch overzicht van de proefopzet is weergegeven in Figuur 12.

40

Figuur 12: Proefopzet masterproef 41

2.2 Materiaal en methode 2.2.1 Chemicaliën, reagentia en standaardoplossingen Een stockoplossing van TMA (450.000 ppm) werd aangekocht bij Sigma-Aldrich. Een waterige werkoplossing met een concentratie van 500 ppm TMA werd hiervan bereid. De standaardoplossingen 10, 20, 50, 75 en 100 ppm TMA werden vervolgens aangemaakt door een geschikte verdunning van deze werkoplossing. Een NaOH oplossing (7,5 M) werd bekomen door NaOH (40 g/mol), verkregen bij VWR, op te lossen in gedestilleerd water. Natriumchloride werd verkregen bij Sigma-Aldrich. De interne standaarden die werden uitgetest (propylamine, tolueen-d8, hexaan-d14, triethylamine en trimethyl-d9-amine), werden ook verkregen bij Sigma-Aldrich. 2.2.2 Headspace GC-MS analyse De standaarden die geïnjecteerd werden om de ijklijn op te stellen, werden verkregen door 5 ml TMA-standaardoplossing, respectievelijk 10, 20, 50, 75 en 100 ppm, in een vial te brengen samen met 1 g NaCl en 1 ml van een 7,5 M NaOH-oplossing. Voor een visstaal voor te bereiden werd 2,5 g vis in een 20 ml Agilent headspace vial afgewogen. Hieraan werd 1 g NaCl en 3,5 ml van een 7,5 M NaOH-oplossing toegevoegd. Door spiken van 50 µl van een 2020 ppm en een 5050 ppm TMA-standaardoplossing in een totaal volume van 5 ml werd respectievelijk een standaardadditie van 20 ppm en 50 ppm in de vial bekomen. Dit komt overeen met 40 ppm en 100 ppm TMA op staalniveau. Veertig ppm TMA op staalniveau betekent dat 2,5 g vis 100 µg TMA bevat. De vial bevat dan 100 µg TMA in 5 ml totaal volume, wat gelijk is aan 20 ppm TMA op vialniveau. Vijf ml gedestilleerd water werd toegevoegd aan een vial die 1 g NaCl en 1 ml van een 7,5 M NaOH-oplossing bevat. Dit wordt de procedureblanco genoemd. De analyses werden uitgevoerd op een Agilent 6890N gaschromatograaf voorzien van een Agilent 5973N quadrupool massaspectrometer. De gebruikte statische headspace was een Agilent G1888 headspace autosampler uitgerust met een 1 ml sample loop op 120 °C. In de headspace oven werd de vial krachtig geschud gedurende 10 min op 70 °C. De temperatuur van de transferlijn en de split/splitless injector werden respectievelijk ingesteld op 130 °C en 150 °C. Een deel van de dampruimte werd geïnjecteerd in een CP-Select 624 CB kolom (25 m lengte × 0,15 mm i.d. × 0,84 μm filmdikte; Agilent Technologies). Als draaggas werd helium gebruikt met een constante stroomsnelheid van 1,5 ml/min. De GC oventemperatuur 42

was isothermaal op 70 °C gedurende 1 min. Daarna steeg de temperatuur met 30 °C/min tot 250 °C. De MS-condities waren: MS bron: 230 °C, MS Quad: 150 °C en de scansnelheid: 20 scans/s. Er werd gewerkt met de selected ion monitoring (SIM) mode. De m/z waarden die gebruikt werden voor bevestiging van TMA zijn 42, 58 en 59. Voor kwantificatie van TMA werd m/z 59 gebruikt. De totale analysetijd per staal bedraagt 20 min. 2.2.3 Youden ruggedness trial Een Youden ruggedness trial laat toe om met acht experimenten het effect van zeven factoren op kwantitatieve resultaten te onderzoeken. Uit alle mogelijke factoren worden alleen die factoren gekozen waarvan verwacht wordt dat ze een invloed kunnen hebben op het kwantitatieve resultaat. Voor elke factor worden twee niveaus vastgelegd. Bij elk experiment verandert het niveau van vier factoren (Ofitserova et al., 2009). Wanneer de factor kwantitatief is, wordt +1 gebruikt bij een hoog niveau en -1 voor een laag niveau (AbdelFattah et al., 2012). Bij een kwalitatieve factor heeft de toekenning van +1 en -1 aan de twee niveaus geen speciale betekenis. Het effect van de volgende zeven factoren op de TMA-respons werd onderzocht met een Youden ruggedness trial: staalvolume (A= 1,25 g en a= 2,5 g), temperatuur van de headspace oven (B= 60 °C en b= 90 °C), hoeveelheid zout (C= 1 g en c= 2 g), volume NaOH (D= 3,5 ml en d= 5 ml), incubatietijd in de headspace oven (E= 5 min en e= 10 min), concentratie NaOH (F= 15 M en f= 7,5 M) en mengkracht (G= hard en g= zacht) (Tabel 4). Van elke factor zijn ook de twee niveaus weergegeven. Bij het invullen van de niveaus is er een fout gebeurd. De niveaus van vijf factoren (staalvolume, temperatuur headspace oven, hoeveelheid zout, volume NaOH en incubatietijd) werden namelijk niet ingevuld volgens de conventie waarbij de hoogste waarde onder +1 en de laagste waarde onder -1 genoteerd worden. Dit had echter geen invloed op de resultaten. Bij de acht experimenten werd telkens de piekoppervlakte van TMA bepaald en genormaliseerd t.o.v. het gemiddelde van de TMA-piekoppervlaktes van de acht experimenten (X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 en X8). Het effect van elke factor (EA, EB, EC, ED, EE, EF en EG) werd afzonderlijk bepaald door het verschil te nemen van het gemiddelde van de metingen bekomen bij het ene niveau (+1) en het gemiddelde van de metingen bekomen bij het andere niveau (-1) van die factor.

43

Tabel 4: Design en berekeningen bij de eerste Youden ruggedness trial

Ook de t-waarde werd voor elk effect berekend met de formule (Guidelines, 2009): t = ( Ei √𝑛 )/( SD . √2 ) Hierbij stelt n het aantal factoren voor en SD is de standaarddeviatie die op 20 werd geschat. Met deze t-test kon bepaald worden of de variatie in een bepaalde factor een significante invloed had op de TMA-respons. De berekende t-waarde, tberekend, werd hiervoor vergeleken met

de

kritische

t-waarde,

tkritisch=

2,45

(6

vrijheidsgraden

en

97,5

%

betrouwbaarheidsinterval). Als tberekend groter is dan tkritisch, dan is de methode gevoelig voor 44

verandering in deze factor. Wanneer tberekend echter kleiner is dan tkritisch, zal het effect van deze factor minder groot zijn op de TMA-respons. Om de bekomen resultaten te bevestigen werd een tweede Youden ruggedness trial uitgevoerd. Het is mogelijk om minder dan zeven factoren te veranderen, maar er dienen nog steeds acht experimenten uitgevoerd te worden (Guidelines, 2009). De test werd uitgevoerd met volgende parameters: mengkracht (A= hard en a= zacht), vissoort (B= tonijn en b= zalm), concentratie NaOH (C= 15 M en c= 7,5 M), volume NaOH (D= 3,5 ml en d= 5 ml) en hoeveelheid zout (E= 1 g en e= 2 g) (Tabel 5). Tabel 5: Design en berekeningen bij de tweede Youden ruggedness trial

45

2.3 Resultaten en discussie 2.3.1 Optimalisatie van headspace GC-MS Om de voorgestelde methode voor TMA-bepaling te optimaliseren werd het effect van verschillende parameters op de TMA-respons bestudeerd. Het betrof enerzijds het effect van de staalvoorbereiding en de statische headspace condities bij constante GC-condities, anderzijds het effect van variabele GC-condities. 2.3.1.1 Optimalisatie staalvoorbereiding en statische headspace condities

Tabel 6 toont de resultaten van de eerste Youden ruggedness trial die werd uitgevoerd. Normaalgezien wanneer het effect van een factor een positieve of een negatieve waarde is, betekent dit dat de factor respectievelijk een positieve of negatieve invloed heeft op de TMArespons. Hoe groter de absolute waarde is, hoe sterker de factor de TMA-respons beïnvloedt. Bij de interpratie van de resultaten werd rekening gehouden dat de niveaus van vijf factoren (staalvolume, temperatuur headspace oven, hoeveelheid zout, volume NaOH en incubatietijd) niet werden ingevuld volgens de conventie waarbij de hoogste waarde onder +1 en de laagste waarde onder -1 genoteerd worden. Zo is het effect van volume NaOH gelijk aan 42,50. Ondanks dat dit een positieve waarde is, betekent dit toch een negatieve invloed op de TMArespons. Dit komt omdat onder +1 de laagste waarde van volume NaOH geplaatst werd (3,5 ml) i.p.v. de hoogste waarde (5 ml). Volume NaOH en mengkracht zijn de twee factoren die het grootste effect hebben op de TMA-respons. Het effect van volume NaOH en het effect van de mengkracht zijn respectievelijk gelijk aan 42,50 en 32. Tabel 6: Effect van de factoren op de TMA-respons bij de eerste Youden ruggedness trial

46

Uit de t-test volgde dat het volume NaOH en de mengkracht significante variabelen zijn (tberekend ≥ tkritisch = 2,45) (Tabel 7). De andere parameters zijn niet-significant (tberekend < tkritisch = 2,45). Het volume base vertoonde een negatieve invloed op de TMA-respons. De uiteindelijke concentratie van een volatiele component in de headspace van de vial kan berekend worden met de formule Cg= C0/(Ƙ + β) waarbij Cg= concentratie van de volatiele component in de gasfase, C0= oorspronkelijke concentratie van de volatiele component in de vloeistof, Ƙ= verdelingscoëfficiënt en β= fase ratio (A technical guide, 2000). Hoe lager Ƙ en β zijn, hoe hoger de concentratie van de volatiele component in de dampfase zal zijn waardoor de respons van de volatiele component verhoogt. Een groter staalvolume zal echter niet altijd leiden tot een responstoename (A technical guide, 2000). Dit werd ook vermeld door Chen & Kott (2010). Wanneer een groter volume base wordt toegevoegd in de vial, is het dus mogelijk dat de TMA-respons niet verbetert. De mengkracht beïnvloedde de TMA-respons positief. Een mogelijke verklaring voor deze positieve invloed is dat het schudden van de vial ervoor zorgt dat de evenwichtsinstelling tussen het staal en dampfase sneller bereikt werd (Nollet & De Gelder, 2000). 7,5 M NaOH was niet-significant beter dan 15 M NaOH. Dit is in tegenstelling met wat Chan et al. (2006) vermelden namelijk dat de TMA-respons toeneemt met stijgende concentratie van NaOH en maximaal is bij gebruik van 15 M NaOH. Ook Maris et al. (1999) tonen aan dat bij stijgende pH de TMA-respons toeneemt. Uit de test volgde ook dat 1 g zout niet-significant beter was dan 2 g zout. Dit effect van de zoutconcentratie komt overeen met wat vermeld wordt in de literatuur. Er werd verwacht dat bij een toenemende zoutconcentratie de oplosbaarheid van polaire componenten vermindert en de transfer naar de headspace ruimte bevorderd wordt (A technical guide, 2000). Dit wordt het uitzoutingseffect genoemd. Maris et al. (1999) vermelden echter dat verdere zouttoevoeging bij een verzadigde zoutoplossing geen invloed meer heeft op de analietrespons. Een verzadigde zoutoplossing werd bekomen door toevoeging van minstens 0,6 g NaCl. Dit werd experimenteel vastgesteld in het labo. Statische headspace analyse is een techniek die gebaseerd is op een evenwichtsinstelling waardoor de incubatietijd een belangrijke rol speelt (Analysis, 2008). Er is voldoende tijd nodig om een evenwicht te laten instellen tussen de dampfase en het staal in de vial (Kott & Chen, 2010). Een incubatietijd in de headspace oven van 10 min was niet-significant beter dan 5 min.

47

Tabel 7: T-waarden voor het effect van elke factor op de TMA-respons bij de eerste Youden ruggedness trial

Om de bekomen resultaten uit de vorige test te bevestigen werd een tweede Youden ruggedness trial gedaan. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 8. Het grootste effect op de TMA-respons werd bekomen met de mengkracht (54,56). De concentratie van NaOH zorgde voor het tweede grootste effect (-52,92). Tabel 8: Effect van de factoren op de TMA-respons bij de tweede Youden ruggedness trial

Uit de t-test volgde dat de mengkracht en de concentratie NaOH significante parameters zijn (Tabel 9). 7,5 M NaOH was significant beter dan 15 M NaOH, wat niet overeenkomt met de literatuur. Ook hier had de mengkracht een positieve invloed op de analietrespons. In tegenstelling tot de resultaten van de eerste t-test volgde uit deze test dat toevoeging van 5 ml NaOH niet-significant beter was dan 3,5 ml NaOH. Ook hier geldde dat een lagere zoutconcentratie niet-significant beter was.

48

Tabel 9: T-waarden voor het effect van elke factor op de TMA-respons bij de tweede Youden ruggedness trial

Op basis van de bekomen resultaten uit de twee Youden ruggedness trials werden verdere experimenten uitgevoerd onder de geoptimaliseerde condities. Er werd gekozen om de hoeveelheid zout op 1 g vast te leggen. Het volume NaOH en de concentratie NaOH werden respectievelijk vastgelegd op 3,5 ml en 7,5 M. De mengkracht werd ingesteld op hard en de incubatietijd op 10 min. 2.3.1.2 Optimalisatie chromatografische condities

De snelheid van het draaggas en de initiële kolomtemperatuur zijn twee parameters die werden uitgetest. De snelheid van het draaggas werd ingesteld op 1,5 ml/min i.p.v. 1 ml/min. De initiële kolomtemperatuur werd gehouden op 70 °C i.p.v. 40 °C. Dit resulteerde in minder tailing bij de TMA-piek. De piek asymmetriefactor verminderde van 2,5 naar 2 door de aangepaste GC-condities. De asymmetriefactor werd berekend door op 10% piekhoogte de verhouding b/a te bepalen (Figuur 13). Een mogelijke verklaring voor de verminderde tailing is dat componenten sneller uit de kolom komen door de verhoogde snelheid van het draaggas (Li et al., 2009). Ten tweede door een hogere oventemperatuur toe te passen zullen adsorptie-effecten verminderen m.a.w. dit zorgt voor minder interactie tussen de component en de stationaire fase (De Zeeuw, z.j.).

49

Figuur 13: Asymmetriefactor bepalen (Dolan, 2003) Met de aangepaste GC-condities werden vijf standaarden van 50 ppm TMA geanalyseerd. Door verhoging van de initiële kolomtemperatuur en de snelheid van helium is de herhaalbaarheid verbeterd. Onder de oude condities (40 °C en 1 ml/min) was de herhaalbaarheid 6,48 % (Tabel 10). Met de aangepaste GC-condities (70 °C en 1,5 ml/min) bedroeg de herhaalbaarheid 2,84 %. Tabel 10: Herhaalbaarheid van methode zonder en met aangepaste GC-condities

50

2.3.2 Interne standaard Een interne standaard (IS) kan toegevoegd worden om de precisie en juistheid van een methode te verbeteren (De Ridder et al., 2002). Verscheidene interne standaarden werden onderzocht: propylamine, tolueen-d8, hexaan-d14 en triethylamine (TEA). Een gekende hoeveelheid van de IS werd toegevoegd aan zowel standaarden als gespikete visstalen (respectievelijk 20 ppm en 50 ppm). Er werd een ijklijn opgesteld waarbij het TMA-signaal niet gecorrigeerd werd met de IS en één waarbij wel een correctie met de IS gebeurde. De recovery van de standaardadditie werd met beide ijklijnen bepaald. De bekomen recovery’s zijn terug te vinden in Tabel 11. Propylamine wordt in de literatuur voorgesteld om als IS te gebruiken bij TMA-analyse (Chung & Chan, 2009; Veciana-Nogues et al., 1996). In het algemeen werden met deze IS lagere recovery’s bekomen dan zonder IS. Matrixinterferentie is een mogelijke verklaring hiervoor. Bij analyse van een blanco visstaal werd een signaal waargenomen op de retentietijd van propylamine. Bij gebruik van een massaspectrometer mag de IS co-elueren met een andere component uit de vismatrix. Dit kan echter een probleem vormen wanneer deze component en de IS in dezelfde fragmenten uiteenvallen. Er zijn weinig meetbare fragmenten voor propylamine wegens de lage massa van het analiet. De verhouding van de piekoppervlaktes van TMA en de IS gaat lager zijn dan verwacht. Hierdoor wordt een lagere TMA-concentratie berekend, wat leidt tot een lagere recovery. Propylamine is bijgevolg geen geschikte IS. Hexaan-d14 en tolueen-d8 worden reeds als IS gebruikt bij andere methodes in laboratorium ECCA. Door één van deze twee componenten als IS te gebruiken, zou de implementatie van de TMA-analyse in het labo vergemakkelijkt worden. Met zowel hexaan-d14 als tolueen-d8 werden hogere recovery’s bekomen dan zonder deze IS’n. Een mogelijk verklaring hiervoor is dat het evenwicht van deze IS’n tussen de oplossing en de dampruimte in de vial te veel verschilt van het evenwicht van TMA in de vial. Daarnaast werd ook de toepasbaarheid van TEA als IS onderzocht. TEA vertoont een gelijkaardige structuur als TMA en zijn retentietijd ligt in de buurt van die van TMA. Gebruik van deze IS leidde echter ook tot hogere recovery’s. Ook hier kan het verschil in evenwichten van de analiet en de IS een mogelijke verklaring zijn. Zonder IS werden recovery’s bekomen tussen de 60 en 145 %. Dolan (2012) geeft enkele voordelen van de methode zonder IS. De analyse wordt goedkoper doordat de kost van de IS wegvalt. Daarnaast zijn de data gemakkelijker te verwerken omdat er slechts één piek dient 51

gemeten te worden in elk chromatogram. Ook kan de onzekerheid op de resultaten verkleind worden omdat de variabiliteit in de IS additie en van de IS piek in de metingen wegvallen. Tabel 11: Recovery’s van TMA met correctie en zonder correctie van IS

52

Een isotoop gelabelde component, trimethyl-d9-amine, is ook een mogelijke IS. Bij trimethyld9-amine zijn de waterstofatomen van TMA vervangen door deuteriumatomen waardoor de massa verhoogt. Het heeft dezelfde fysicochemische eigenschappen als TMA en vertoont hierdoor hetzelfde gedrag tijdens de analyse (Wieling, 2002). Nadelig aan deze IS is de hogere kostprijs in vergelijking met de andere uitgeteste IS’n. In paragraaf 2.3.5 worden verkennende testen met trimethyl-d9-amine besproken. 2.3.3 Recovery’s Bij gespikete visstalen werd de recovery berekend met de formule: Recovery (%) =

𝐶𝑔𝑒𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒𝑡𝑒 𝑚𝑜𝑛𝑠𝑡𝑒𝑟− 𝐶𝑛𝑖𝑒𝑡 𝑔𝑒𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒𝑡𝑒 𝑚𝑜𝑛𝑠𝑡𝑒𝑟

Hierbij is Cgespikete

𝐶𝑡𝑜𝑒𝑔𝑒𝑣𝑜𝑒𝑔𝑑

monster

x 100.

de concentratie van het gespikete monster, C niet-gespikete

monster

de

concentratie van het niet-gespikete monster en Ctoegevoegd is de concentratie van de standaardadditie. Tabel 12 toont de resultaten. Het gemiddelde van de bekomen recovery’s was gelijk aan 95 %. De standaardafwijking, 36 %, was echter hoog. Er is nog te veel variatie in de bekomen recovery’s. De verwachting is dat de recovery’s beter kunnen worden door een geschikte IS te gebruiken.

53

Tabel 12: Recovery’s van TMA

2.3.4 Beperkte validatie van de voorgestelde methode Een kwantitatieve analyse is nog niet mogelijk met de voorgestelde methode. Hiervoor zijn de recovery’s, die berekend werden uit eerdere testen, te variërend. Een aantal zijn te hoog en er komen ook te lage recovery’s voor (Tabel 12). Er kan echter semikwantitatief een indicatie gegeven worden van de TMA-concentratie. Er gebeurde een beperkte validatie van de voorgestelde methode ter onderbouwing van de betrouwbaarheid van de resultaten. Hierbij 54

werden volgende parameters geëvalueerd: lineariteit, precisie, juistheid, detectielimiet en bepalingsgrens. 2.3.4.1 Lineariteit

De lineariteit van de methode werd onderzocht door een standaardreeks van TMA (10 tot 100 ppm) te injecteren. De piekoppervlaktes werden uitgezet t.o.v. de concentraties van de standaarden. Dit resulteerde niet altijd in een lineaire ijklijn. Vooral bij de hogere concentraties werd een niet-lineair gedrag vastgesteld. Het verkleinen van het werkgebied leidde soms tot een lineaire ijklijn. Er werd uiteindelijk gekozen voor een kwadratische functie tussen respons en concentratie van TMA te nemen. De kwadratische ijklijn is weergegeven in Figuur 14. De vergelijking is y = -22003 x² + 5 106 x – 2 107 en de correlatiecoëfficient is gelijk aan 0,9998.

Figuur 14: Ijklijn van TMA

2.3.4.2 Detectielimiet en bepalingsgrens

De detectielimiet (LOD) is het laagst gemeten gehalte waarvan de aanwezigheid van de analiet met redelijke statistische zekerheid kan worden afgeleid (Vermaercke, 2007). De LOD is gelijk aan driemaal de standaardafwijking van de metingen. De bepalingsgrens (LOQ) wordt bepaald door de standaardafwijking van de metingen te vermenigvuldigen met zes. De LOQ wordt gedefinieerd als het laagste analietgehalte dat met redelijke statistische zekerheid kan worden gemeten (Vermaercke, 2007).

55

Gespikete visstalen werden gebruikt voor LOD en LOQ te bepalen. Tabel 13 geeft de berekeningen van LOD en LOQ weer. Zoals eerder vermeld stellen de bedrijven waarvoor laboratorium ECCA de TMA-bepaling uitvoert, een maximale grenswaarde van 20 ppm op staalniveau voorop. Hierdoor is het nodig met de voorgestelde methode een LOQ van 20 ppm of lager op staalniveau te bekomen. De LOQ was echter gelijk aan 48 ppm op staalniveau. Dit is nog te hoog om aan de vraag van de klanten te voldoen. De LOD bedroeg 24 ppm. Tabel 13: LOD en LOQ van GC-MS analyse van TMA

56

2.3.4.3 Precisie

De resultaten van metingen verschillen van elkaar (precisie) wanneer ze onder herhaalbaarheid of reproduceerbaarheid omstandigheden bekomen worden (Beernaert, 2014). Herhaalbaarheid kan gedefinieerd worden als de mate van overeenstemming tussen opeenvolgende resultaten die werden verkregen onder herhaalbaarheidscondities. Onder deze condities wordt verstaan: met dezelfde methode, bij een identiek materiaal, op hetzelfde tijdstip (of korte tussentijd), door dezelfde persoon, met dezelfde apparatuur en in hetzelfde labo (Vermaercke, 2007). De herhaalbaarheid van de methode werd bepaald door zes standaardoplossingen van 50 ppm TMA te analyseren op dezelfde dag. De relatieve standaarddeviatie (R.S.D.) werd berekend voor de herhaalde metingen (Tabel 14). Deze bedroeg 2,96 %, wat een goed resultaat is. Tabel 14: Herhaalbaarheid van GC-MS analyse van TMA

Ook de reproduceerbaarheid van de analytische methode werd geëvalueerd. Dit is de mate van overeenstemming tussen resultaten die verkregen werden met dezelfde methode bij identiek materiaal onder verschillende omstandigheden (Vermaercke, 2007). In dit onderzoek werden

op

verschillende

tijdstippen

gespikete

visstalen

geanalyseerd

om

de

reproduceerbaarheid te bepalen. Een RSD van 30 % en 36 % werd verkregen op respectievelijk concentratieniveau 20 ppm en 50 ppm (Tabel 15). De reproduceerbaarheid van 57

de voorgestelde methode is nog te laag. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de variatie in het volume dat geïnjecteerd wordt. Het is moeilijk om een exact volume gas te injecteren. Tabel 15: Reproduceerbaarheid van GC-MS analyse van TMA

58

2.3.4.4 Juistheid

De juistheid van een methode geeft weer hoe dicht het gemiddelde van een reeks metingen met de voorgestelde methode tegen de werkelijke waarde aanligt. Juistheid kan uitgedrukt wordt met de bias (Prestatiekenmerken, 2012). Dit is het verschil tussen de werkelijke waarde en de gemeten waarde (Schaubroeck, 2013). De bias kan berekend worden met standaardadditie (Beernaert, 2014). Deze mogelijke werkwijze werd toegepast omdat er geen gecertificeerd referentiemateriaal beschikbaar was. Eerst werd de procentuele relatieve bias (%bi) bepaald door de volgende formule toe te passen: 𝑔𝑒𝑚𝑒𝑡𝑒𝑛 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒−𝑤𝑒𝑟𝑘𝑒𝑙𝑖𝑗𝑘𝑒 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒 𝑤𝑒𝑟𝑘𝑒𝑙𝑖𝑗𝑘𝑒 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒

x 100.

Tabel 16 toont deze waarden waarmee vervolgens de gemiddelde relatieve kwadratensom van de bias werd berekend met %MSbias = Σ%bi²/n (Bepaling van de meetonzekerheid, 2008). Hierbij is n het aantal recovery-experimenten. De variantie van de bias, %Ubias², werd ten slotte berekend als volgt %Ubias = √%𝑀𝑆𝑏𝑖𝑎𝑠 = 25,47 %. M.a.w. 25,47 % van de metingen weken af van de werkelijke waarde 20 ppm.

59

Tabel 16: Juistheid van GC-MS analyse van TMA

Op basis van de resultaten van deze beperkte validatie volgde dat de voorgestelde methode nog onvoldoende betrouwbaar is voor TMA-kwantificatie. Er wordt echter verwacht dat de methodevalidatie wel kan gebeuren wanneer trimethyl-d9-amine als IS toegepast wordt in deze headspace GC-MS methode. Hiervoor dienen nog verdere experimenten uitgevoerd te worden. 2.3.5 Verkennende testen met de interne standaard trimethyl-d9-amine Verkennende testen werden uitgevoerd met de isotoop gelabelde IS, trimethyl-d9-amine. Vijf TMA-standaardoplossingen (respectievelijk 5, 10, 25, 50, 75 en 100 ppm) werden geïnjecteerd om een ijklijn op te stellen. Zoals bij de voorgestelde methode zonder IS werd ook hier een kwadratische ijklijn bekomen (Figuur 15). De vergelijking ervan is y = -104 x² + 0,0243 x + 0,0522 met R² = 0,9993.

60

Figuur 15: Ijklijn van TMA met interne standaard trimethyl-d9-amine Standaardaddities werden uitgevoerd en er werd nagegaan in hoeverre deze gekende toegevoegde hoeveelheid TMA teruggevonden werd in het monster. De resultaten van de recovery-test zijn weergegeven in Tabel 17. De gemiddelde recovery bedroeg 105,25 %. In vergelijking met de voorgestelde methode zonder IS is een kleinere standaardafwijking waar te nemen. De recovery’s zijn dus verbeterd door deze IS te gebruiken. Tabel 17: Recovery’s bekomen bij de methode met interne standaard trimethyl-d9-amine

Tabel 18 toont de LOD en LOQ verkregen bij gebruik van deze IS. Ook hier werden betere resultaten verkregen in vergelijking met de methode zonder IS. De LOQ is verlaagd tot 24 ppm TMA op staalniveau.

61

Tabel 18: LOD en LOQ van GC-MS analyse van TMA met IS trimethyl-d9-amine

62

Conclusie De eerste doelstelling van deze masterproef was het ontwikkelen van een nieuwe methode voor de bepaling van TMA in vis om de nadelen van de huidige colorimetrische bepaling weg te werken. Een headspace GC-MS methode werd ontwikkeld voor TMA te bepalen. Bij de ontwikkelde methode vormt de aanwezigheid van primaire en secundaire amines geen probleem meer. Deze amines kunnen namelijk fysisch gescheiden worden van TMA door GC. Dit maakt de methode specifieker en meer precies dan de huidige colorimetrische procedure. Een bijkomend voordeel is dat er meerdere componenten tegelijk kunnen geanalyseerd worden. De staalvoorbereiding is ook eenvoudiger. Er wordt geen vloeistof-vloeistof extractie van TMA met tolueen meer uitgevoerd. De staalanalyse duurt 20 minuten zodat drie stalen per uur kunnen geanalyseerd worden. De analysetijd is verkort in vergelijking met de huidige methode om TMA te bepalen. Dit komt door de eenvoudige staalvoorbereiding. Een ander groot voordeel is dat het explosieve picrinezuur niet meer nodig is bij de analyse. Ten slotte wordt met deze methode het gebruik van toxische solventen vermeden. De headspace GC-MS methode werd geoptimaliseerd door een Youden ruggedness trial uit te voeren die het effect van zeven factoren nagaat op kwantitatieve resultaten. Uit de twee uitgevoerde testen bleek dat drie factoren (mengkracht, concentratie NaOH en volume NaOH) een significante invloed hebben op de TMA-respons. De mengkracht, de concentratie NaOH en het volume NaOH werden hierdoor respectievelijk aangepast naar hard, 7,5 M en 3,5 ml. Voor verdere methodeoptimalisatie werden de GC-condities onderzocht. Adsorptie van alifatische amines zoals TMA op de stationaire fase van GC veroorzaakt tailing. Deze tailing werd verminderd door de snelheid van het draaggas op 1,5 ml/min en de initiële kolomtemperatuur op 70 °C vast te leggen. Met de aangepaste parameters werd ook een betere herhaalbaarheid van de methode verkregen. Met de geoptimaliseerde headspace GC-MS methode werd bij gespikete visstalen een gemiddelde recovery van 95 % bekomen met een standaardafwijking van 36 %. De grote variatie in de recovery’s maakte een kwantitatieve analyse met de voorgestelde methode nog niet mogelijk. Er kon echter semikwantitatief een indicatie gegeven worden van de TMAconcentratie. Een beperkte validatie van de methode gebeurde waarbij vijf validatieparameters geëvalueerd werden namelijk lineariteit, juistheid, precisie, detectielimiet en bepalingsgrens. De ijklijn van TMA was kwadratisch in het concentratiegebied van 10 tot 100 ppm. De correlatiecoëfficient was hoger dan 0,99. De methode vertoonde een goede herhaalbaarheid (2,96 %), maar was nog onvoldoende reproduceerbaar (30 % op concentratieniveau 20 ppm

en 36 % op concentratieniveau 50 ppm). De juistheid van de methode, 25,47 %, was ook nog te hoog. De detectielimiet bedroeg 24 ppm, terwijl de bepalingsgrens van de methode 48 ppm was. Op basis van de resultaten van deze beperkte validatie kon besloten worden dat de voorgestelde methode nog onvoldoende betrouwbaar was voor TMA-kwantificatie. Er wordt echter verwacht dat de methodevalidatie wel kan gebeuren wanneer trimethyl-d9-amine als interne standaard toegepast wordt in deze headspace GC-MS methode. In deze masterproef werd ook nagegaan hoe de viskwaliteit beoordeeld kan worden. Versheid vormt de belangrijkste parameter bij de beoordeling van de viskwaliteit. Er bestaan sensorische en chemische methoden voor de bepaling van deze versheid. De meeste chemische methodes bepalen ofwel het TMA-gehalte ofwel het TVB-N gehalte. Wanneer het TMA-gehalte lager is dan 10 ppm, wordt een excellente viskwaliteit bekomen. Een TVB-N gehalte dat gelegen is tussen 46 en 250 ppm komt overeen met een middelmatige viskwaliteit. Ook BA’s kunnen als chemische indicator gebruikt worden om de kwaliteit van de vis te beoordelen. Uit de vergelijkende studie tussen TMA, TVB-N en BA’s volgde dat de wetgeving enkel maximumwaarden aangeeft voor TVB-N en histamine in vis opdat de voedselveiligheid gegarandeerd zou zijn. Er bestaat dus nog geen wetgeving rond TMA. In de literatuur wordt vermeld dat het TMA-gehalte niet hoger zou mogen zijn dan 10-15 mg per 100 g vis voor aanvaardbare consumptie. Bij zowel TMA, TVB-N als BA’s kan toxiciteit vastgesteld worden bij hoge concentraties. De gebruikte analysemethodes werden ook vergeleken. Hieruit bleek dat GC frequent wordt toegepast voor TMA-analyse, terwijl dit HPLC is voor analyse van BA’s. Stoomdestillatie is een vaak gebruikte methode voor het TVB-N gehalte te bepalen. Het TMA- en TVB-N gehalte kunnen ook bepaald worden met FIA.

Referentielijst A technical guide. (2000). A technical guide for static headspace analysis using GC. (2000). Geraadpleegd op 22 maart 2015 via http://www.google.be/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCQQFj AA&url=http%3A%2F%2Fwww.researchgate.net%2Fpublictopics.PublicPostFileLoad er.html%3Fid%3D54af2871d039b13d3a8b4616%26key%3Daa2eda57-980b-444d90d20bbd74629edf&ei=IYsRVYDbN8TvaqPegKgO&usg=AFQjCNFXlUPmFzY9mt7R8Q BF14FrfeKW9A&bvm=bv.89184060,d.bGQ Abdel-Fattah, Y.R., Soliman, N.A., Yousef, S.M. & El-Helow, E.R. (2012). Application of experimental designs to optimize medium composition for production of thermostable lipase/esterase by Geobacillus thermodenitrificans AZ1. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 10, pp. 193-200. Adhoum, N., Monser, L., Sadok, S., El-Abed, A., Greenway, G.M. & Uglow, R.F. (2003). Flow injection potentiometric detection of trimethylamine in seafood using tungsten oxide electrode. Analytica Chimica Acta, 478, pp. 53-58. Alasalvar, C., Taylor, K.D.A. & Shahidi, F. (2005). Comparison of volatiles of cultured and wild sea bream (Sparus aurata) during storage in ice by dynamic headspace analysis/gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, pp. 2616-2622. Alasalvar, C., Taylor, K.D.A., Öksüz, A., Garthwaite, T., Alexis, M.N. & Grigorakis K. (2001). Freshness assessment of cultured sea bream (Sparus aurata) by chemical, physical and sensory methods. Food Chemistry, 72, pp. 33-40. Analysis. (2008). Analysis of volatile organic compounds in water using static headspaceGC/MS. (2008). Geraadpleegd op 22 maart 2015 via http://www.google.be/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCQQFj AA&url=http%3A%2F%2Fhpst.cz%2Fsystem%2Ffiles%2Fuploaded_files%2F59903285en__analysis_of_volatile_organic_compounds_in_water_using_static_headspace_gcmsd.pdf&ei=jmgSVa2eEdPaaoKpgrAN&usg=AFQjCNG3i4ta2jZAUolREcvQScVQq7 x-XQ&bvm=bv.89184060,d.d2s Anderson, A.K. (2008). Biogenic and volatile amine-related qualities of three popular fish species sold at Kuwait fish markets. Food Chemistry, 107, pp. 761-767. Armenta, S., Coelho, N.M.M., Roda, R., Garrigues, S. & De la guardia, M. (2006). Seafood freshness determination through vapour phase Fourier transform infrared spectroscopy. Analytica Chimica Acta, 580, pp.216-222. Awan, M.A., Fleet, I. & Thomas, C.L.P. (2008). Determination of biogenic diamines with a vaporisation derivatisation approach using solid-phase microextraction gas chromatography–mass spectrometry. Food Chemistry, 111, pp. 462-468. Baixas-nogueras, S., Bover-Cid, S., Veciana-Nogués, T. & Vidal-Carou, M.C. (2002). Chemical and sensory changes in mediterranean hake (Merluccius merluccius) under refrigeration (6-8 °C) and stored in ice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, pp. 6504-6510.

Baixas-Nogueras, S., Bover-Cid, S., Vidal-Carou, M.C., Veciana-Nogués, M.T. & MarinéFont, A. (2001). Trimethylamine and Total Volatile Basic Nitrogen determination by flow injection/gas diffusion in mediterranean hake (Merluccius merluccius). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, pp. 1681-1686. Beernaert, H. (2014). Meetonzekerheid: noodzakelijk, betrouwbaar, beslissend. Food, Science and Law, 3, pp. 144-161. Bekaert, K., Derveaux, S., Deloof D., Robbens, J. & Vlaemynck G. (z.j.). Viskwaliteit. Geraadpleegd op 6 februari 2015 via http://www.ilvo.vlaanderen.be/NL/Diensten-enproducten/Technische-dienstverlening/Voedings-envoedertechnologie/Viskwaliteit/dnnprintmode/true?SkinSrc=%5BL%5DSkins%2FIlvo %2Fprint&containerSrc=%5BL%5DContainers%2Filvo%2Filvo Bepaling van de meetonzekerheid. (2008). Bepaling van de meetonzekerheid voor kwantitatieve chemische analyses. (2008). Geraadpleegd op 24 april 2015 via http://www.favv.be/laboratoria/erkendelaboratoria/dienstnotas/_documents/03-112008_LAB-P-508-Meetonzekerheid-v.01_nl.pdf Béné, A., Hayman, A., Reynard, E., Luisier, J.L. & Villettaz, J.C. (2001). A new method for the rapid determination of volatile substances: the SPME-direct method. Part II. Determination of the freshness of fish. Sensors and Actuators B, 72, pp. 204-207. Castro, P., Padrón, J.C.P., Cansino, M.J.C., Velázquez, E.S., De Larriva, R.M. (2006). Total volatile base nitrogen and its use to assess freshness in European sea bass stored in ice. Food Control, 17, pp. 245-248. Chan, S.T., Yao, M.W.Y., Wong, Y.C., Wong, T., Mok, C.S. & Sin, D.W.M. (2006). Evaluation of chemical indicators for monitoring freshness of food and determination of volatile amines in fish by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. European Food Research and Technology, 224, pp. 67-74. Chien, Y.-C., Uang, S.-N., Kuo, C.-T., Shih, T.-S. & Jen, J.-F. (2000). Analytical method for monitoring airborne trimethylamine using solid phase micro-extraction and gas chromatography-flame ionization detection. Analytica Chimica Acta, 419, pp. 73-79. Chung, S.W.C. & Chan, B.T.P. (2009). Trimethylamine oxide, dimethylamine, trimethylamine and formaldehyde niveaus in main traded fish species in Hong Kong. Food Additives and Contaminants, 2, pp. 44-51. DaCosta, K.A., Vrbanac, J.J. & Zeisel, S.H. (1990). The measurement of dimethylamine, trimethylamine, and trimethylamine N-oxide using capillary gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry, 187, pp. 234-239. Dadáková, E., Krízek, M. & Pelikánová, T. (2009). Determination of biogenic amines in foods using ultra-performance liquid chromatography (UPLC). Food Chemistry, 116, pp. 365-370. De Mey, E., Drabik-Markiewicz, G., De Maere, H., Peeters, M.C., Derdelinckx, G., Paelinck, H. & Kowalska , T. (2012). Dabsyl derivatisation as an alternative for dansylation in the detection of biogenic amines in fermented meat products by reversed phase high performance liquid chromatography. Food Chemistry, 130, pp. 1017-1023.

De Ridder, F., Pintelon, R.., Schoukens, J., Navez, J., André, L. & Dehairs, F. (2002). An improved multiple internal standard normalisation for drift in LA-ICP-MS measurements. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 17, pp. 1461-1470. De Zeeuw, J. (z.j.). Peak tailing in GC trace analysis. Geraadpleegd op 22 maart 2015 via http://www.sepscience.com/Techniques/GC/Articles/486-/Peak-Tailing-in-GC-TraceAnalysis Devlieghere, F., Ragaert, P., Baert, L., Uyttendaele, M. & Debevere, J. (2011). Levensmiddelenmicrobiologie [syllabus], Universiteit Gent, Faculteit Industrieel ingenieur landbouw en biotechnologie optie voeding. Dhaouadi, A., Monser, L., Sadok, S. & Adhoum, N. (2007). Validation of a flow-injectiongas diffusion method for total volatile basic nitrogen determination in seafood products. Food Chemistry, 103, pp. 1049-1053. Dolan, J. W. (2012). When should an internal standard be used? Geraadpleegd op 23 maart 2015 via http://www.chromatographyonline.com/when-should-internal-standard-beused-0?rel=canonical Dolan, J.W. (2003). Why do peaks tail? LCGC North America, 21, pp. 612-616. Duflos, G., Coin, V.M., Cornu, M. , Antinelli, J.F. & Malle, P. (2006). Determination of volatile compounds to characterize fish spoilage using headspace/mass spectrometry and solid-phase microextraction/gas chromatography/mass spectrometry. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86, pp. 600-611. Ganeko, N., Shoda, M., Hirohara, I., Bhadra, A., Ishida, T., Matsuda, H., Takamura, H. & Matoba, T. (2008). Analysis of Volatile Flavor Compounds of Sardin (Sardinops melanostica) by Solid Phase Microextraction. Journal of Food Science, 73, pp. 83-88. Gong, X., Wang, X., Qi, N., Li, J., Lin, L. & Han, Z. (2014). Determination of biogenic amines in traditional Chinese fermented foods by reversed-phase highperformance liquid chromatography (RP-HPLC). Food Additives & Contaminants, 31, pp. 14311437. Gou, J., Xu, H., Choi, G.-P., Lee, H.-Y. & Ahn, J. (2010). Application of high pressure processing for extending the shelf-life of sliced raw squid. Food Science Biotechnology, 19, pp.923-927. Guidelines. (2009). Guidelines for performance criteria and validation procedures of analytical methods used in controls of food contact materials. (2009). Geraadpleegd op 8 mei 2015 via http://www.bfr.bund.de/cm/343/guidelines_for_performance_criteria_and_validation_pr ocedures_of_analytical_methods.pdf How fresh is your fish?. (2007). Geraadpleegd op 6 februari 2015 via http://ec.europa.eu/research/success/en/agr/0261e.html Hu, Y., Huang, Z., Li, J. & Yang, H. (2012). Concentrations of biogenic amines in fish, squid and octopus and their changes during storage. Food Chemistry, 135, pp. 2604-2611.

Huss, H.H. (1988). Fresh fish – quality and quality changes. Geraadpleegd op 7 februari 2015 via https://books.google.be/books?id=50vKuTi65AC&pg=PA65&lpg=PA65&dq=the+most+commonly+used+chemical+method+for+ assessing+fish+quality+is+the+estimation+of+TMA&source=bl&ots=DnnmChYOQx& sig=Qomyb2M7qQmlJAzp7WAB3vJBpw&hl=nl&sa=X&ei=UJnbVPuyBMfIPLCegb AM&ved=0CC8Q6AEwAg#v=onepage&q=the%20most%20commonly%20used%20c hemical%20method%20for%20assessing%20fish%20quality%20is%20the%20estimati on%20of%20TMA&f=false Kataoka, H. (1996). Derivatization reactions for the determination of amines by gas chromatography and their applications in environmental analysis. Journal of Chromatography A, 733, pp.19-34. Kim, M.K., Mahb, J.H. & Hwang, H.J. (2009). Biogenic amine formation and bacterial contribution in fish, squid and shellfish. Food Chemistry, 116, pp. 87-95. Kott, L. & Chen, H.M. (2010). Experimental considerations in headspace gas chromatography. Pharmaceutical Technology, 34, pp. 76-79. Kyrana, V.R. & Lougovois, V.P. (2002). Sensory, chemical and microbiological assessment of farm-raised European sea bass (Dicentrarchus labrax) stored in melting ice. International Journal of Food Science and Technology, 37, pp. 319-328. Lange, J., Thomas, K. & Wittmann, C. (2002). C omparison of a capillary electrophoresis method with highperformance liquid chromatography for the determination of biogenic amines in various food samples. Journal of Chromatography B, 779, pp. 229-239. Lapa-Guimarães, J. & Pickova, J. (2004). New solvent systems for thin-layer chromatographic determination of nine biogenic amines in fish and squid. Journal of Chromatography A, 1045, pp. 223-232. Latorre-Moratalla, M.L., Bosch-Fusté, J., Lavizzari, T., Bover-Cid, S. & Veciana-Nogués, M.T. (2009). Validation of an ultra high pressure liquid chromatographic method for the determination of biologically active amines in food. Journal of Chromatography A, 1216, pp. 7715-7720. Li, F., Liu, H.-Y., Xue, C.-H., Xin, X.-Q., Xu, J., Chang, Y.-G., Xue, Y. & Yin, L. (2009). Simultaneous determination of dimethylamine, trimethylamine and trimethylamine-noxide in aquatic products extracts by ion chromatography with non-suppressed conductivity detection. Journal of Chromatography A, 1216, pp. 5924-5926. Li, M. & Lee, S.H. (2007). Determination of trimethylamine in fish by capillary electrophoresis with electrogenerated tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II) chemiluminescence detection. Luminescence, 22, pp. 588-593. Li, X., Zeng, Z., Zhou, J., Gong, S., Wang, W. & Chen, Y. (2004). Novel fiber coated with amide bridged-calix[4]arene used for solid-phase microextraction of aliphatic amines. Journal of Chromatography A, 1041, pp. 1-9. Lin, J.-K. & Hurng, D.-C. (1985). Thermal conversion of trimethylamine-N-oxide to trimethylamine and dimethylamine in squids. Food and Chemical Toxicology, 23, pp. 579-583. Lista, A.G., Arce, L., Ríos, A. & Valcárcel, M. (2001). Analysis of solid samples by capillary electrophoresis using a gas extraction sampling device in a flow system. Analytica Chimica Acta, 438, pp. 315-322.

Lougovois, V.P., Kyranas, E.R. & Kyrana, V.R. (2003). Comparison of selected methods of assessing freshness quality and remaining storage life of iced gilthead sea bream (Sparus aurata). Food Research International, 36, pp. 551-560. Lund, B., Baird-Parker, T.C. & Gould, G.W. (2000). Microbiological safety and quality of food. New York: Springer Science & Business Media. Maeda, T., Kim, J.H., Ubukata, Y. & Morita, N. (2009). Analysis of volatile compounds in polished-graded wheat flour bread using headspace sorptive extraction. European Food Research and Technology, 228, pp. 457-465. Mah, J.H., Han, H.K., Oh, Y.J., Kim, M.G. & Hwang H.J. (2002). Biogenic amines in Jeotkals, Korean salted and fermented fish products. Food Chemistry, 79, pp. 239-243. Maris, C., Laplanche, A., Morvan, J. & Bloquel, M. (1999). Static headspace analysis of aliphatic amines in aqueous samples. Journal of Chromatography A, 846, pp. 331-339. Mazzucco, E., Gosetti, F., Bobba, M., Marengo, E., Robotti, E. & Gennaro, M.C. (2010). High-performance liquid chromatography-ultraviolet detection method for the simultaneous determination of typical biogenic amines and precursor amino acids. Applications in food Chemistry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, pp. 127-134. Mietz, J.L. & Karmas, E. (2006). Chemical quality index of canned tuna as determined by high-pressure liquid chromatography. Journal of Food Science, 42, pp. 155-158. Mills, G.A., Walker, V., Mughal, H. (1999). Quantitative determination of trimethylamine in urine by solidphase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 723, pp. 281-285. Mitchell, S.C., Zhang, A.Q. & Smith, R.L. (2002). Chemical and biological liberation of trimethylamine from foods. Journal of food composition and analysis, 15, pp.277-282. Miyasaki, T., Hamaguchi, M. & Yokoyama, S. (2011). Change of volatile compounds in fresh fish meat during ice storage. Journal of Food Science, 76, pp. 1319-1325. Mohamed, R., Livia, S.S., Hassan, S., Soher, E. & Ahmed-Adel, E.B. (2009). Changes in free amino acids and biogenic amines of Egyptian salted-fermented fish (Feseekh) during ripening and storage. Food Chemistry, 115, pp. 635-638. Namiésnik, J., Jastrzebska, A. & Zygmunt, B. (2003). Determination of volatile aliphatic amines in air by solid-phase microextraction coupled with gas chromatography with flame ionization detection. Journal of Chromatography A, 1016, pp. 1-9. Nollet, L.M.L. & De Gelder, L.S.P. (2000). Handbook of water analysis. New York: CRC press. Ofitserova, M., Nerkar, S., Pickering, M. & Torma, L. (2009). Multiresidue mycotoxin analysis in corn grain by column high-performance liquid chromatography with postcolumn photochemical and chemical derivatization: single-laboratory validation. Journal of AOAC International, 92, pp. 15-25. Önal, A. (2007). A review: Current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods. Food Chemistry, 103, pp. 1475-1486. Önal, A., Tekkeli, S.E.K. & Önal, C. (2013). A review of the liquid chromatographic methods for the determination of biogenic amines in foods. Food Chemistry, 138, pp. 509-515.

Özogul, F., Taylor, K.D.A., Quantick, P. & Özogul, Y. (2000). Chemical, microbiological and sensory evaluation of Atlantic herring (Clupea harengus) stored in ice, modified atmosphere and vacuum pack. Food Chemistry, 71, pp. 267-273. Pacheco-aguilar, R., Lugo-Sánchez, M.E. & Robles-Burgueño, M.R. (2000). Postmortem biochemical and functional characteristic of monterey sardine muscle stored at 0 °C. Journal of Food Science, 65, pp. 40-47. Papadopoulos, V., Chouliara, I., Badeka, A., Savvaidis, I.N. & Kontominas, M.G. (2003). Effect of gutting on microbiological, chemical, and sensory properties of aquacultured sea bass (Dicentrarchus labrax) stored in ice. Food Microbiology, 20, pp. 411–420. Park, J.S., Lee, C.H., Kwon, E.Y., Lee, H.J., Kim, J.Y. & Kim, S.H. (2010). Monitoring the contents of biogenic amines in fish and fish products consumed in Korea. Food Control, 21, pp. 1219-1226. Pena-Pereira, F., Lavilla, I. & Bendicho, C. (2010). Colorimetric assay for determination of trimethylamine-nitrogen (TMA-N) in fish by combining headspace-single-drop microextraction and microvolume UV–visspectrophotometry. Food Chemistry, 119, pp. 402-407. Pons-Sánchez-Cascado, S., Veciana-Nogués M.T., Bover-Cid, S., Mariné-Font, A., Vidal Carou, M.C. (2006). Use of volatile and non-volatile amines to evaluate the freshness of anchovies stored in ice. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86, pp. 699-705. Prestatiekenmerken. (2012). Geraadpleegd op 24 april 2015 via https://esites.vito.be/sites/reflabos/2013/Online%20documenten/CMA_6_A.pdf Rampfl, M., Mair, S., Mayer, F., Sedlbauer, K., Breuer, K. & Niessner, R. (2008). Determination of primary, secondary, and tertiary amines in air by direct or diffusion sampling followed by determination with liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Environmental Science & Technology, 42, pp. 5217-5222. Rezaei, M., Montazeri, N., Langrudi, H.E., Mokhayer, B., Parviz, M. & Nazarinia, A. (2007). The biogenic amines and bacterial changes of farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) stored in ice. Food Chemistry, 103, pp. 150-154. Romero-González, R., Alarcón-Flores, M.I., Martínez Vidal, J.L. & Garrido Frenich, A. (2012). Simultaneous determination of four biogenic and three volatile amines in anchovy by ultra-high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 60, pp. 5324-5329. Ruiz-Capillas, C. & Horner, W.F.A. (1999). Determination of trimethylamine nitrogen and total volatile basic nitrogen in fresh fish by flow injection analysis. Journal of the Science of Food and Agriculture, 79, pp. 1982-1986. Ruiz-Capillas, C., Gillyon, C.M. & Horner, W.F.A. (2000). Determination of volatile basic nitrogen and trimethylamine nitrogen in fish sauce by flow injection analysis. European Food Research and Technology, 210, pp. 434-436. Saaid, M., Saad, B., Hashim, N.H., Ali, A.S.M. & Saleh M.I. (2009). Determination of biogenic amines in selected Malaysian food. Food Chemistry, 113, pp. 1356-1362. Sadok, S., Uglow, R.F. & Haswell, S.J. (1996). Determination of trimethylamine in fish by flow injection analysis. Analytica Chimica Acta, 321, pp. 69-74. Saeed, T., Khaksar, R. & Ghasemlou, M. (2011). Development and validation of an HPLC-

FLD method for rapid determination of histamine in skipjack tuna fish (Katsuwonus pelamis). Food Chemistry, 126, pp. 756-761. Sagratini, G., Fernández-Franzón, M., De Berardinis, F., Font, G., Vittori, S. & Mañes, J. (2012). Simultaneous determination of eight underivatised biogenic amines in fish by solid phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Food Chemistry, 132, pp. 537-543. Sant’Ana, L.S., Soares, S. & Vaz-Pires, P. (2011). Development of a quality index method (QIM) sensory scheme and study of shelf-life of ice-stored blackspot seabream (Pagellus bogaraveo). Food Science and Technology, 44, pp. 2253-2259. Santos, M.H.S. (1996). Biogenic amines: their importance in foods. International Journal of Food Microbiology, 29, pp. 213-231. Schaubroeck, J. (2013). Analytische chemie [syllabus], Universiteit Gent, Faculteit Toegepaste Ingenieurswetenschappen en Architectuur. Seibel, B.A. & Walsh, P.J. (2002). Trimethylamine oxide accumulation in marine animals: relationship to acylglycerol storage. The Journal of Experimental Biology, 205, pp. 297-306. Shim, J.-E. & Baek, H. (2012). Determination of trimethylamine in spinach, cabbage, and lettuce at alkaline pH by headspace solid-phase microextraction. Journal of Food Science, 77, pp. 1071-1076. Simat, V. & Dalgaard, P. (2011). Use of small diameter column particles to enhance HPLC determination of histamine and other biogenic amines in seafood. LWT – Food Science and Technology, 44, pp. 399-406. Taliadourou, D., Papadopoulos, V., Domvridou, E., Savvaidis, I.N. & Kontominas, M.G. (2003). Microbiological, chemical and sensory changes of whole and filleted Mediterranean baquacultured sea bass (Dicentrarchus labrax) stored in ice. Journal of the Science of Food and Agriculture, 83, pp. 1373-1379. Timm, M. & Jørgensen, B.M. (2002). Simultaneous determination of ammonia, dimethylamine, trimethylamine and trimethylamine-n-oxide in fish extracts by capillary electrophoresis with indirect UV-detection. Food Chemistry, 76, pp. 509518. Tsukioka, T., Ozawa, H. & Murakami, T. (1993). Gas chromatographic-mass spectrometric determination of lower aliphatic tertiary amines in environmental samples. Journal of Chromatography, 642, pp. 395-400. Veciana-Nogues, M.T., Albala-Hurtado, M.S., Izquierdo-Pulido, M. & Vidal-Carou, M.C. (1996). Validation of a gas-chromatographic method for volatile amine determination in fish samples. Food Chemistry, 51, pp. 569-513. Veciana-Nogués, M.T., Mariné-Font, A. & Vidal-Carou, M.C. (1997). Biogenic amines as hygienic quality indicators of Tuna. Relationships with microbial counts, ATP-related compounds, volatile amines, and organoleptic changes. Journal Agricultural and Food Chemistry, 45, pp. 2036-2041. Vermaercke, P. (2007). Bepaling van de meetonzekerheid voor testen op voedingsmiddelen en veevoeders. Geraadpleegd op 26 april 2015 via http://www.afsca.be/labos/vorming/_documents/2007-09-05_VormingMeetonzekerheid_nl.pdf

Vyncke, W. (1999). Aspecten van de kwaliteitsbepaling van vis. Geraadpleegd op 6 februari 2015 via http://www.google.be/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CB8Q FjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.vliz.be%2Fimisdocs%2Fpublications%2F257659. pdf&ei=VVv0VMbbLtDYasj3gJgM&usg=AFQjCNEmjc_D0s3GFbM9GBLXGB62c FojBA&bvm=bv.87269000,d.d2s Wieling, J. (2002). LC-MS-MS Experiences with Internal Standards. Chromatographia Supplement, 55, pp. 107-113. Wu, N., Gu, S., Tao, N., Wang, X. & Ji, S. (2014). Characterization of important odorants in steamed male chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) using gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry. Journal of Food Science, 79, pp. 1250-1259.