Metabolikus és endokrin változások a hisztaminhiányos HDC-KO egér modellben

Metabolikus és endokrin változások a hisztaminhiányos HDC-KO egér modellben Doktori értekezés

Földes Anna

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományi Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Varga Gábor, tanszékvezető egyetemi tanár, MTA doktora Konzulens: Dr. Kovács Krisztina, tudományos tanácsadó, MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Darvas Zsuzsanna, egyetemi docens, PhD Dr. Emri Zsuzsanna, tanszékvezető egyetemi docens, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Nagy M. György, egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Tóth Sára, egyetemi docens, PhD Dr. Szarka András, egyetemi docens, PhD

Budapest 2010

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ______________________________________________________ 2 Rövidítések jegyzéke __________________________________________________ 5 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés ________________________________________ 10 1.1. A hisztamin____________________________________________________ 11 1.1.1. A hisztamin bioszintézise – a hisztidin-dekarboxiláz enzim_________ 11 1.1.2. A hisztamin funkciói_________________________________________ 13 1.1.2.1. A hisztamin szerepe az immunrendszerben __________________ 14 1.1.2.2. A hisztamin szerepe a gyomorsav termelésben________________ 14 1.1.2.3. Hisztamin a központi idegrendszerben – a hisztaminerg rendszer 14 1.1.3. A hisztamin receptorai, jelátviteli folyamatok____________________ 17 1.2. Az energiaháztartás szabályozásában résztvevők és feladataik _________ 19 1.2.1. Metabolikus szignálok – a leptin és az inzulin ____________________ 20 1.2.1.1 A leptin ________________________________________________ 20 1.2.1.2. Leptin-receptorok _______________________________________ 22 1.2.1.3. A leptin-receptor aktiválta jelátviteli utak ___________________ 24 1.2.1.4. Inzulin_________________________________________________ 26 1.2.2. A hisztamin szerepe, a hisztamin és a leptin kapcsolata az energiaháztartás szabályozásában __________________________________ 27 1.2.3. A táplálkozás szabályozásában résztvevő neuropeptidek___________ 31 1.3. A hisztamin és a szexuál szteroidok közötti összefüggés _______________ 33 1.4. HDC-/- egér modell______________________________________________ 34 2. Célkitűzés ________________________________________________________ 39 3. Módszerek ________________________________________________________ 40 3.1. Állatok _______________________________________________________ 40 3.2. Metabolikus vizsgálatok _________________________________________ 40 3.2.1. A testsúlyváltozás, és a táplálékfogyasztás nyomonkövetése ________ 41 3.2.2. A zsírszövetek vizsgálata _____________________________________ 41 3.2.3. Az energiametabolizmus közvetett mérése_______________________ 41 3.3. A vérminták elemzése ___________________________________________ 41 3.3.1. A vérvétel módja____________________________________________ 41 3.3.2. Vércukor- és inzulin-szint mérés_______________________________ 42

2

3.3.3. Kémiai meghatározások plazmából és szérumból_________________ 42 3.4. Szövetből történő hormonszint meghatározások _____________________ 43 3.5. Az elvégzett kezeléseknél használt anyagok _________________________ 43 3.5.1. L-hisztidin kezelés __________________________________________ 43 3.5.2. Leptin kezelés ______________________________________________ 43 3.6. Morfológiai vizsgálatok__________________________________________ 43 3.6.1. Zsírszövetek morfológiai vizsgálata ____________________________ 43 3.6.2. Here morfológiai vizsgálata ___________________________________ 43 3.7. Perfúzió és a szövetek kezelése ____________________________________ 44 3.8. Fehérje szintű vizsgálatok________________________________________ 44 3.8.1. Immunhisztokémia __________________________________________ 44 3.8.2. Western blot analízis ________________________________________ 45 3.9. Génexpressziós vizsgálatok_______________________________________ 46 3.9.1. In situ hibridizáció __________________________________________ 46 3.9.1.1. A szonda készítés menete _________________________________ 46 3.9.2. Northern blot analízis________________________________________ 52 3.9.2.1. RNS izolálás ____________________________________________ 52 3.9.2.2. Northern blot készítés ____________________________________ 52 3.9.3. Real-Time PCR – Valósidejű PCR _____________________________ 53 3.10. Statisztikai analízis ____________________________________________ 54 4. Eredmények ______________________________________________________ 55 4.1 HDC szonda tervezése, készítése és jellemzése _______________________ 55 4.2. HDC-/- egerek metabolikus fenotípusának jellemzése _________________ 59 4.2.1. Testsúly, zsírraktárak, energia egyensúly a HDC-/- egereknél _______ 59 4.2.2.Az energia-mobilizáló képesség vizsgálata _______________________ 62 4.2.2.1. Maghőmérséklet változása a WT és HDC-/- egereken __________ 62 4.2.2.2. Az UCP-1 mRNS és fehérje mennyisége a barna zsírszövetben __ 63 4.2.3. Vércukorszint és inzulin-szekréció _____________________________ 64 4.2.4. Az éheztetés hatására létrejövő hormonszint-változások vizsgálata __ 66 4.2.5. Leptin-expresszió összehasonlítása vad típusú és HDC-/- egerek különböző zsírszöveteiben _________________________________________ 68

3

4.2.6. Leptin-receptor (Ob-Rb) expresszió vizsgálata vad típusú és HDC-/állatok hipotalamuszában és májában _______________________________ 69 4.2.7. Morfológiai és funkcionális változások a HDC-/- egerek központi idegrendszerében ________________________________________________ 70 4.2.7.1. L-hisztidin beadását követő neuronális aktiváció _____________ 70 4.2.7.2. Hisztaminerg neuronok feltérképezése és innervációja _________ 71 4.2.7.3. A táplálkozás szabályozásában résztvevő egyes neuropeptidek génexpressziójának összehasonlítása vad típusú és hisztaminhiányos egerek hipotalamuszában______________________________________________ 73 4.2.7.4 A leptin-receptor jelátviteli útvonal egyik elemének – p-STAT3 – változása leptinnel kezelt vad típusú és HDC-/- egerekben _____________ 76 4.3. Hím HDC-/- egerek reproduktív funkciója __________________________ 79 4.3.1. Szérum hormonszintek változásai______________________________ 79 4.3.2. GnRH neuronok vizsgálata WT és HDC-/- egerekben______________ 80 4.3.3. A here morfológiájának változása hisztaminhiány hatására ________ 80 5. Megbeszélés _______________________________________________________ 82 5.1 A hisztamin hatása a táplálkozás szabályozására _____________________ 82 5.2. Az energiaháztartás szabályozásának zavara________________________ 83 5.3. Metabolikus szignálok változásai __________________________________ 85 5.4. Különbségek a vad és HDC-/- egerek leptin-érzékenységében ___________ 86 5.5. Centrális szabályozás - neuropeptidek _____________________________ 91 5.6. Hím HDC-/- egerek reprodukciós funkciójának megváltozása __________ 93 6. Következtetések ___________________________________________________ 96 Összefoglalás ________________________________________________________ 98 Summary ___________________________________________________________ 99 Melléklet __________________________________________________________ 100 Irodalomjegyzék ____________________________________________________ 102 Saját publikációk jegyzéke ___________________________________________ 119 Köszönetnyilvánítás _________________________________________________ 122

4

Rövidítések jegyzéke 3V, V3

–

harmadik agykamra

AD

–

androszteron

α-FMH

–

α-fluorometil-hisztamin

AgRP

–

agouti-related protein, agutihoz-kapcsolódó fehérje

α-MSH

–

α-melanocita stimuláló hormon

Apa I

–

egy restrikciós enzim

ARC

–

arcuatus mag

α-35S-ATP

–

adenozin 5’-[α-35S] trifoszfát

α-35S-UTP

–

uridin 5’-[α-35S] trifoszfát

BALB/c

–

egy egértörzs neve

BAT

–

brown adipose tissue, barna zsírszövet

BDNF

–

brain-derived neurotrophic factor, agyból származó neurotrofikus faktor

Bgl I

–


Bst XI

–


C57BL/6J

–


C/EBP

–

CCAAT/enhancer binding protein

cAMP

–

ciklikus adenozin-monofoszfát

CART

–

cocaine- and amphetamine-related peptide, kokain- és amfetamin-regulált transzkript

CCK

–

kolecisztokinin

CD1

–


CD1/129Sv

–


cGMP

–

ciklikus guanozin monofoszfát

CNTF

–

ciliary neutrophic factor, ciliáris neurotrofikus faktor

CREB

–

cAMP-response element binding, cAMP válasz elem kötő fehérje

CRH

–

kortikotropin releasing hormon

DAB

–

3,3’-diaminobenzidin

DAG

–

diacil-glicerol

DAO

–

diamino-oxidáz

5

db

–

leptin-receptor génje

DEPC

–

dietil-pirokarbonát

DH5α

–

egy Escherichia coli baktériumtörzs neve

DHEA

–

dehidroepiandroszteron

DHEAS

–

dehidroepiandroszteron-szulfát

DHT

–

dihidro-tesztoszteron

DIO

–

diet-induced obesity

DMH

–

dorzomedialis hipotalamusz

DVC

–

dorzalis vagusz komplex

DR

–

dorzalis rafe mag

ECL

–

entrero-kromaffin-szerű

EDCDI

–

1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid

EDTA

–

etilén-diamin-tetraecetsav

Epi

–

epididimalis

f, fx

–

fornix

FFA

–

free fatty acids, szabad zsírsavak

GAPDH

–

gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz

GAS-RE

–

gasztrin válasz elem

G-CSF

–

granulocita kolónia stimuláló faktor

GH-RH

–

growth-hormone-releasing hormone, növekedési hormont felszabadító hormon

GLP-1

–

glukagon-szerű peptid 1

GnRH

–

gonadotropin-releasing hormone /gonadotropin stimuláló hormon

GRE

–

glukokortikoid válasz elem

H1-4 receptor

–

hisztamin (1-4) receptor

HDC

–

hisztidin-dekarboxiláz

HNMT

–

hisztamin-N-metil-transzferáz

HPG

–

hipotalamusz-hipofizis-gonád tengely

HT

–

hipotalamusz

icv

–

intracerebroventricularis

IL

–

interleukin

INF-γ

–

interferon-γ

6

IP3

–

inozitol-1,4,5-trifoszfát

IPTG

–

izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid

iv

–

intravénás

Jak

–

Janus kináz

KPBS

–

kálium-foszfát puffer

LH

–

lateralis hipotalamusz

LHA

–

lateralis hipotalamikus area

LH-RH

–

Luteinizáló hormon – releasing hormon

LIF

–

leukémia inhibitor faktor

MAPK

–

mitogén–aktivált protein kináz

MC3/MC4

–

melanokortin receptor

MCH

–

melaninkoncentráló hormon

Me5

–

mesencephalicus trigeminalis mag érzékelő afferens

MTII

–

melanokortin agonista

MTu

–

medialis tuberalis mag

NcoI

–


NdeI

–


NGS

–

normál kecske szérum

neor

–

neomicin rezisztencia

NPY

–

neuropeptid Y

NsiI

–


NT

–

neurotenzin

NTS

–

nucleus tractus solitarius

OB-Ra-f

–

lerton-receptor a-f izoforma

PACAP

–

hipofízis adenilát cikláz aktiváló polipeptid

PBS

–

foszfát puffer

PCR

–

polimerase chain reaction, polimeráz láncreakció

pCRII TOPO

–

egy plazmid neve

pGEM T Easy

–

egy plazmid neve

PGK

–

phosphoglycerate kinase, foszfoglicerát kináz

PIP2

–

foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát

PKA

–

protein kináz A

7

PKC

–

protein kináz C

Pl

–

plazmid

PLC

–

foszfolipáz C

PMD

–

dorzalis premamillaris mag

PMV

–

ventralis premamillaris mag

POA

–

preoptikus area

POMC

–

proopiomelanokortin

PrRP

–

prolaktin releasing peptid

PstI

–


PTZ

–

pentiléntetrazol

PVN

–

paraventricularis mag

PVp

–

posterior periventricularis hipotalamikus mag

RER

–

durva felszínű endoplazmatikus retikulum

RIA

–

radio-immunoassay

SacI

–


SacII

–


SalI

–


sc

–

subcutan, bőrszövet alatti

SDS

–

sodium-dodecil-sulphate, nátrium-dodecil-szulfát

SOCS-3

–

suppressor of cytokine signaling-3

SON

–

supraoptic nucleus, supraoptikus mag

SP-1

–

specificity protein-1

SP6

–

egy RNS-polimeráz

SpeI

–


STAT

–

signal transducer and activator of transcription, szignál transzducer és transzkripciós aktivátor

T4

–

egy DNS-ligáz

T7

–

egy RNS-polimeráz

Taq

–

egy DNS-polimeráz

TNF-γ

–

tumor nekrózis faktor-γ

TRH

–

thyrotropin-releasing hormone / tireotropin-felszabadító hormon

Tyr

–

tirozin

8

UCP

–

uncoupling protein, szétkapcsoló fehérje, termogenin

VIP

–

vazoaktív intesztinális peptid

VMH

–

ventromedialis hipotalamikus mag

VTA

–

ventralis tegmentalis area

WHO

–

World Health Organization, Egészségügyi Világszervezet

WT

–

vad genotípus

XGal

–

5-bromid-4-klorid-3-indolil-β-D-galaktopiranozid

ZI

–

zona incerta

9

1. Bevezetés, irodalmi áttekintés Az utóbbi évtizedekben, elsősorban a fejlett országokban járványszerű méreteket öltött az elhízás. Van olyan ország (pl. Egyesült Államok), ahol a felnőtt lakosság több mint 50%-a túlsúlyos, kövér vagy extrém módon elhízott, de az egykor csak a gazdag országok privilégiumának tartott elhízottság a közepes és alacsony jövedelmű országokban is „terjed”. A WHO előrejelzése szerint, ha ez a trend tovább folytatódik, akkor 2015-re az elhízott lakosság száma elérheti a másfél milliárdot a Földön (Wickelgren I, 1998). Az elhízással kapcsolatos egészségügyi költségek jelentős összegeket emésztenek fel, ezért napjainkban a metabolizmus központi idegrendszeri és periférián működő szabályozó mechanizmusainak feltárását szolgáló kutatások ismét előtérbe kerültek. A táplálékfelvétel és az energiametabolizmus összetett, központi idegrendszeri szabályozásában számos neuropeptid és neurotranszmitter vesz részt. A regulációban központi szerepe van a hipotalamusznak, de az agytörzsi struktúráknak is jelentős szerep jut a perifériáról érkező szignálok közvetítésében, illetve a megfelelő visceromotoros válaszok kialakításában. A táplálkozással kapcsolatban az érzelmi, jutalmazási és averzív hatások is fontosak, melyek szabályozásánál jelentős a kortikális és limbikus területek modulációs szerepe. Korábban a táplálékfelvétel szabályozásában a noradrenerg, szerotoninerg, kisebb mértékben a hisztaminerg rendszert tartották főszereplőknek. A leptin felfedezése után (90-es évek) a neuropeptid szabályozás került a középpontba, ugyanakkor a két szabályozási rendszer összefüggéseivel viszonylag kevés vizsgálat foglalkozik. Modell állatunk, a hisztidin-dekarboxiláz génkiütött egér (HDC-/-) lehetőséget ad az egész életen át tartó, krónikus hisztaminhiány következményeként fellépő metabolikus fenotípus és kialakulásában szerepet játszó centrális és perifériás fiziológiai szabályozó folyamatok vizsgálatára, illetve a hisztamin szerepének vizsgálatára a szexuális magatartás, szaporodás szabályozásában is.

10

1.1. A hisztamin A hisztamin felfedezése óta közel száz év telt el. Először 1910-ben Dale és Laidlaw írta le, de a sokrétű feladatot ellátó kis molekula kutatása mind a mai napig intenzíven folyik (Dale HH és Laidlaw PP, 1910). Ezt bizonyítja Falus András szerkesztésében nemrég megjelentett angol nyelvű összefoglaló könyv is (Falus A, 2004). A hisztamin (2-(4-imidazol)-etil-amin) egy intercellulárisan és intracellulárisan ható biogénamin, mely 17 atomból áll, és molekulatömege 111 Da. Számos fontos fiziológiás és patológiás folyamatban vesz részt (Hill SJ és mtsai, 1997). Ennek oka lehet, hogy a molekula a nem kovalens kölcsönhatásaiban különféle konformációs alakzatot és ionizációs formát képes felvenni és így többféle receptor típushoz kötődhet. A hisztamin legfontosabb termelődési helye a hízósejt, ahol elsősorban lokálisan, a szekréciós vezikulumokból felszabadulva hat, de sok más sejttípus is képes a hisztamin előállítására, mint a bazofil granulociták, a gyomorfal entero-kromaffin-szerű (ECL) sejtjei és az agy hipotalamikus magvainak hisztaminerg neuronjai. A különféle helyeken termelődő hisztamin szerepe más és más: gyulladásos folyamatok, allergiás reakciók mediátora, szabályozza a gyomorsav szekréciót, hat a simaizom kontrakcióra, fokozza az erek permeábilitását, neurotranszmitter, neuromodulátor és az anyagcsere folyamatok szabályozója. Hisztaminhiányos állatoknál a hisztamin pótlását egyszerűen a hisztamin perifériára történő bevitelével nem érhetjük el, mert a vér-agy gáton történő átjutása gátolt, így nem vehet részt centrális energiametabolizmust szabályozó folyamatokban (Schwartz JC és mtsai, 1991). Előmolekulája az L-hisztidin táplálékkal történő bevitelével hiánya pótolható lehetne, ám ennek aktív hisztaminná alakításához szükséges a hisztidindekarboxiláz (HDC) enzim működése.

1.1.1. A hisztamin bioszintézise – a hisztidin-dekarboxiláz enzim A hisztamin az L-hisztidin dekarboxilálódásával keletkezik CO2 felszabadulása közben. Ezt a reakciót egyetlen enzim, a hisztidin-dekarboxiláz (HDC) enzim katalizálja (1. ábra).

11

Hisztidin dekarboxiláz Hisztidin

Hisztamin

1. ábra A hisztamin bioszintézis folyamata A HDC génje rendkívül konzervatív szekvencia, még egymástól távol eső fajokban is nagyfokú homológiát mutattak ki. A humán genomban a 15-ös, egérben a 2-es, patkányban a 3-as kromoszómán helyezkedik el, 12 exonból és 11 intronból áll (Joseph DR és mtsai, 1990; Zahnow CA és mtsai, 1991; Malzac P és mtsai, 1996). Patkány agyban, tüdőben és májban két féle mRNS-t találtak, nagyobb mennyiségben található a 3,5 kb, kisebb mennyiségben található a 2,7 kb nagyságú. Humán szövetekben egy 2,4 kb hosszúságú mRNS a leggyakoribb, de néhány humán sejtvonalon megfigyeltek 3,4 kb hosszúságú alternatív kivágódással (splicinggal) keletkező izoformát is (Yatsunami K és mtsai, 1994). Egerek esetében nem mutattak ki alternatív splicingot, az egyetlen termék egy 2,7 kb nagyságú mRNS (Suzuki-Ishigaki S és mtsai, 2000). A HDC gén kifejeződése metiláltságának fokától is függ, de autoregulációs folyamat során maga a HDC fehérje is szabályozza transzkripcióját a MAPK útvonalon keresztül (Colucci R. 2001). A HDC gén expresszióját számos szövet- és sejtspecifikus transzkripciós faktor befolyásolja. Egyes fajokban a HDC gén promóter régiója sokféle szabályozó régiót tartalmaz. Található rajta gasztrin válasz elem (GAS-RE), γ-interferon válasz elem, interleukin-6 nukleáris faktor kötőhely és glukokortikoid válasz elem (GRE) is (Joseph DR és mtsai, 1990; Hocker M és mtsai, 1996; Zahnow CA és mtsai, 1998). A HDC génről számos izoenzim expresszálódik, melyek izoelektromos pontjukban térnek el egymástól. Az izoformák poszttranszlációs módosulással: foszforilációval és/vagy proteolízissel keletkeznek. A poszttranszlációs modifikációra számos lehetőség van a HDC fehérje esetében: négy lehetséges N-glikozilációs hely, két cAMP függő proteinkináz-A foszforilációs hely van mind egér, mind patkány esetében. Az úgynevezett érési folyamat eredményeként keletkezik egy 20 kDa-nal kisebb, 53-55 kDa molekulasúlyú dekarboxiláz, mely a legtöbb sejtben homodimert képez (Joseph DR

12

és mtsai, 1990; Mamune-Sato R és mtsai, 1992; Yatsunami K és mtsai, 1995). Nem csak a HDC gén expressziójának szabályozása tűnik sejt-, ill. szövetspecifikusnak, hanem a különféle izoformák keletkezése és enzimatikus aktivitása is. A HDC protein amino-terminális része segítségével befolyásolni képes a saját transzkripcióját is (Colucci R és mtsai, 2001). Az L-hisztidin a hisztidin-dekarboxiláz enzim specifikus szubsztrátja. Mivel a hisztamin egy lépésben egyetlenegy enzim által szabályozottan szintetizálódik, a hisztidindekarboxiláz enzim gátlásának fontos szerepe volt a hisztamin szerepének kutatásában. A legszélesebb körben használt HDC enzim inhibítorok az α-metil-hisztamin és az αfluorometil-hisztidin (α-FMH), melyet az „öngyilkos” szubsztrátok közé, vagy más néven az enzim aktiválta irreverzibilis inhibítorok csoportjába sorolunk (Kubota H és mtsai, 1984). A hisztamin enzimatikus inaktivációja két alternatív úton történhet, ebben két enzim, a diamino-oxidáz (DAO) és a hisztamin N-metil-transzferáz (HNMT) enzim vesz részt. A hisztamin direkt oxidatív deaminációját az elsődleges amino csoporton a DAO enzim katalizálja, míg a hisztamin imidazol gyűrűjének metilációját a HNMT enzim végzi. A két hisztamin inaktivációjában résztvevő enzim előfordulása szövetspecifikus. HNMT enzim katalizálta hisztamin lebontás az emlősöknél főként az agyban, a gerincvelő sejtjeiben, a gyomorban, a májban, a vesében, a prosztatában, a petefészekben, a lépben és a vastagbélben található, ezzel szemben DAO katalizálja a hisztamin lebontását a bélben, a vesében és a placentában (Falus A, 2004). A HDC génkiütött egerekben a gén szinten kiiktatott HDC hatására az enzim aktivitás hiánya teljes mértékű, mely a szövetek teljes hisztaminhiányos állapotát okozza. Bár az első közlemény szerint, mely a HDC-/- egerekről szól, az agyban hisztamin található, a további kutatások ezt nem igazolták (Ohtsu H és mtsai, 2001).

1.1.2. A hisztamin funkciói A hisztaminnak számos feladata ismert, ezek közül itt csak néhányat emelnék ki.

13

1.1.2.1. A hisztamin szerepe az immunrendszerben A hisztamin elsősorban az immunrendszer működésében játszott szerepéről ismert, részt vesz a különféle immunológiai folyamatok szabályozásában. A hízósejtek és a bazofil granulociták hisztamin termelését és tárolását már régóta kapcsolatba hozták gyulladásos, allergiás folyamatokkal. A hisztamin termelésére, szecernálására számos más hematopoetikus sejtpopuláció is képes, így a monociták is, de tárolására nem alkalmasak (Dy M és Schneider E, 2004). Az azonnali túlérzékenységi reakciók (allergiás/anafilaxiás reakciók) mellett a hisztamin a szisztémás autoimmun betegségek kialakulásában is részt vesz. Számos citokin termelődésére hat, serkenti az IL-6, IL-10 expresszióját, gátolja a INF-γ, TNF-α, IL-12 expressziót, így Th2 irányú eltolódás látható a citokin mintázatban (Vannier E és mtsai, 1991; Falus A, 1993; Vannier E és Dinarello CA, 1994; Elenkov IJ és mtsai, 1998). 1.1.2.2. A hisztamin szerepe a gyomorsav termelésben Egy másik igen korán felismert hisztamin hatás a gyomorsavtermelés stimulálása. Az enterokromaffin sejtek (ECL), a gasztrointesztinális hízósejtek a fő forrásai a gyomorban felszabaduló hisztaminnak, de számos más itt levő sejt (G sejt, makrofág, bazofil leukocita, T limfocita) is termelhet hisztamint (Panula P és mtsai, 1985). Az ECL sejtek hisztamin szekrécióját számos endogén komponens szabályozza, így gasztrin, kolecisztokinin (CCK), hipofízis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (PACAP), vazoaktív intesztinális peptid (VIP), peptidYY, endotelin, adrenalin és noradrenalin is. A gyomorban megtalálható mind a négyféle hisztamin-receptor. Ezek szerepe más és más, különféle folyamatokban vesznek részt, de a legfontosabb a hisztamin 1 és 2 (H1, H2) receptor. A hisztamin H2-receptoron keresztül szabályozza a gyomorsav szekrécióját, míg a H1-receptornak fontos szerepe van a gyulladásos folyamatok közvetítésében hízósejteken. A két rendszer közötti egyensúly megbillenésére a gyomorsav termelődése fokozódik, és gyomorfekély alakulhat ki. 1.1.2.3. Hisztamin a központi idegrendszerben –a hisztaminerg rendszer A központi idegrendszerben a hisztamin neurotranszmitterként funkcionál, a hátsó hipotalamusz tuberomamillaris régiójában található hisztaminerg neuronok termelik (2. ábra). 1974-ben a hipotalamusz részleges léziójakor figyeltek fel először arra, hogy a hisztaminerg neuronok axonjai milyen sok agyterületet innerválnak, számos agyterületen HDC enzim aktivitás csökkenést találtak (Garbarg M és mtsai, 1974). Tíz

14

évvel később hisztamin és HDC immunhisztokémia segítségével határozták meg a hipotalamuszban ezen neuroncsoportok pontos helyét (Watanabe T és mtsai, 1984). Különböző központi idegrendszeri területekről retrográd jelöléssel is kirajzolták a hisztaminerg neuronokat, ezeket ekkor még homogén sejtcsoportnak gondolták (Kohler C és mtsai, 1985). A hisztaminerg neuronok a hátsó hipotalamuszban, öt jól körülhatárolt magcsoportban (E1-E5) helyezkednek el, axonjaik az egész központi idegrendszert behálózzák (Panula P és mtsai, 1984; Inagaki N és mtsai, 1988).

E4

E5

E1 E2 E3

2. ábra A centrális hisztaminerg neuronok a hátsó hipotalamuszban levő tuberomamillaris magcsoportban, öt anatómiailag egymástól elkülönülő almagban foglalnak helyet. Az almagokat a monoaminerg rendszer nomenklatúrájának megfelelően rostro-caudalis irányban E5-E1-ként nevezték el. DMH: dorsomedialis hipotalamikus mag, fx: fornix, LHA: lateralis hipotalamikus area, LM: lateralis mamillaris mag, MM: medialis mamillaris mag, MRN: mesencefalikus reticularis mag, PH: pesterior hipotalamikus mag, PMd: dorsalis premamillaris mag, PMv: ventralis premamillaris mag, PVp: posterior periventricularis hipotalamikus mag, SNr: substantia nigra, STN: subtalamikus mag, SUM: supramamillaris mag, ZI: zona incerta, V3: 3. agykamra, VTA: ventral tegmental area, Mérce: 250µm (Miklos IH és Kovacs KJ, 2003).

15

Hisztamin pozitív axonokat találhatók az arcuatus magban, a paraventricularis magban, a ventromedialis és lateralis hipotalamusz környékén és a gerincvelőben (Panula P és mtsai, 1989) (3. ábra). agykéreg

hippocampus és amygdala striatum

középvonali thalamikus területek

neurohipofizis tuberomamillaris mag ventralis tegmentalis area és substantia nigra

kisagy medulla gerincvelő

3. ábra Hisztaminerg rendszer az emberi agyban. A tuberomamillaris magból kiinduló hisztaminerg rostok behálózzák a teljes központi idegrendszert (Haas HL és mtsai, 2008). A központi idegrendszerben a hisztamin fontos szerepet játszik olyan homeosztatikus működések szabályozásában, mint az energiametabolizmus (termoreguláció) (Clark WG és Cumby HR, 1976; Yasuda T és mtsai, 2004b), a táplálékfelvétel és az anyagcserefolyamatok (Morimoto T és mtsai, 2001; Masaki T és mtsai, 2003), az alvásébrenlét ciklus (Friedman AH és Walker CA, 1968; Monti JM, 1993; Giannoni P és mtsai, 2009), és a kardiovaszkuláris kontroll (Klein MC és Gertner SB, 1983). Szerepe van még a viselkedés, a tanulás és memória-funkciók, az emóciók szabályozásában is (Huston JP és mtsai, 1997). „A hisztamin és az idegrendszer” című cikkben összefoglaló táblázat mutatja be a hisztamin-receptorok jelátviteli szabályozását, celluláris, szisztémás szerepét és a hiányuk, hibájuk következtében fellépő patofiziológiás tüneteket (Haas HL és mtsai, 2008).

16

A

hisztamin

energiaháztartás

szabályozásában

(táplálékfelvétel,

anyagcsere,

termoreguláció) betöltött szerepét a dolgozatom 1.2.2. részében tárgyalom.

1.1.3. A hisztamin receptorai, jelátviteli folyamatok Ma négy fajta sejtfelszíni hisztamin-receptort ismerünk: H1-, H2-, H3- és H4-receptort, amelyek különféle sejteken ill. egyetlen sejten is egyidőben előfordulnak. Más-más jelátviteli utakat használnak és ezzel is biztosítják a hisztamin széleskörű hatásait. A hisztamin-receptorok a G-fehérjéhez kapcsolt 7 transzmembrán doménnel bíró membránreceptorok alcsaládjába tartoznak. Az elsőként leírt receptor a H1-receptor volt, mely jelentős szerepet játszik a hisztamin immunmoduláló hatásának közvetítésében, az allergiás és az akut gyulladásos folyamatok közvetítésénél. A H1-receptorhoz kötődő hisztamin aktiválja a PIP2-DAG rendszert, amely intracelluláris Ca2+-szint emelkedést okoz, ill. beindítja a PKC-MAPK kaszkádot. A PKC-MAPK úton és a Ca2+-szint változáson keresztül aktiválódik többek között a c-fos gén is (Megson AC és mtsai, 2001). A hisztamin a kalcium/kalmodulin függő enzim által képes a H1-receptoron keresztül a NO szintetáz aktivitás stimulálására. A megemelkedett NO szint hatására növekedik a cGMP-szint is számos sejttípusban.

A

hisztamin

a

H1-receptoron

keresztül

képes

a

cAMP-szint

befolyásolására, de ez a hatás a legtöbb sejtben indirekt, más receptorokon, így hisztamin H2-, adenozin- (A2), vazoaktív intesztinalis peptid (VIP)-receptorokon keresztül jön létre (Hill SJ és mtsai, 1997). A H1-receptor deszenzitizálható ismétlődő vagy hosszantartó stimulusokkal. A deszenzitizáció dózis- és időfüggő, hatására az IP3 termelése a sejtben csökken. Ennek a receptornak szerepe van a simaizom összehúzódásban és az érpermeábilitás változásában, megtalálható az endotél sejtekben, a mellékvesevelő sejtjeinek felszínén, szívben, számos immunsejten és a központi idegrendszerben. Számos tanulmány igazolta, hogy a központi idegrendszerből származó neurális eredetű hisztamin a hipotalamusz ventromediális és paraventrikuláris magjaiban elhelyezkedő H1-receptorokon

keresztül

gátolja

a

táplálékfelvételt

és

befolyásolja

az

energiafelhasználást (Ookuma K és mtsai, 1993; Sakata T és mtsai, 1997; Morimoto T és mtsai, 1999; Masaki T és mtsai, 2004; Ohinata K és mtsai, 2004). H1-receptor antagonisták

jelenlétében

jelentősen

fokozódik

a

táplálékfelvétel,

hosszútávú

17

alkalmazásuk elhízáshoz vezethet (Roberts F és Calcutt CR, 1983). A H2-receptornak legfontosabb szerepe a gyomorsav-szekréció szabályozásában van, de a gyomor parietális sejtjein kívül megtalálható a vaszkuláris simaizom sejtekben, az adipocitákban, a bazofil és neutrofil granulocitákban, a T sejtekben, a szívben és a központi idegrendszerben is. A H2-receptor cAMP-en keresztül, a Gs-fehérje közvetítésével aktiválja a protein kináz A-t, így Ca2+-szint emelkedést okoz. A hisztamin kötődve a H2-receptorhoz tehát nem csak a PKA útvonalat aktiválja, hanem emellett egy másik, eddig nem azonosított G-fehérjén keresztül a PLC kaszkád is aktiválódik. Az említett két útvonal egymástól függetlenül aktiválódik, de hatással lehetnek egymásra (Fukushima Y és mtsai, 1996). A H3 típusú hisztamin-receptor az agy hipotalamikus és mezencefalikus magvaiban, a hisztaminerg neuronok axon terminálisain, preszinaptikusan elhelyezkedő autoreceptor. Nagy affinitású, pertussis-szenzitív G-fehérje-kapcsolt receptor, amely az adenilátcikláz enzim gátlásával fejti ki hatását, és az intracelluláris kalcium szintet csökkentve gátolja a hisztamin és más neurotranszmitterek felszabadulását. Egyik legfontosabb szerepe ennek a receptornak a H1- és H2- receptorokkal együttműködve az agyi hisztaminerg tónus modulálása. A H3-receptornak (a H1 és H2 mellett) szerepe van az alvás-ébrenlét, a tanulás-memória, a táplálék-, és a vízfelvétel, a napi ritmus, valamint a testhőmérséklet szabályozásában. Megtalálható a központi idegrendszeren kívül a perifériás idegekben (gyomor-bél traktus, tüdő, szív), az endotéliumban és az enterokromaffin sejtekben. A H3-receptor Gi- vagy Go-fehérjékhez kapcsolódik, és így a cAMP ill. MAPK szignál transzdukciós utakat aktiválja, saját szintézisét is képes gátolni az agyban (Gomez-Ramirez J és mtsai, 2002). H3 antagonisták alkalmazhatók epilepszia és a gyermekkori figyelem-hiányos hiperaktivitás szindróma (ADHD) kezelésében (Esbenshade TA és mtsai, 2008; Gemkow MJ és mtsai, 2009). A H4 típusú hisztamin-receptort 2000-2001-ben „in silico” módszerrel, szekvenciahomológia alapján fedezték fel. Részleges homológiát mutat a H3-receptorral, és farmakológiai jellemzőik is hasonlóak. Szerepe feltehetően az immunológiai folyamatok szabályozásában, a gyulladásban, az asztmánál jelentős. Erre utal expressziós mintázata is: megtalálható a csontvelőben, a tímuszban, a lépben, a perifériás fehérvérsejteken, a vékony- és vastagbélben. Hisztamin kötődése mutatható ki a membrán receptorokon kívül a sejtmagban, valamint

18

a mikroszóma-frakcióban is. Az intracellularis hisztamin kötőhely létezését bizonyítja, hogy a tamoxifen származék DPPE (N, N-dietil-2-(4-(fenil-metil) fenoxi) etánamin) azáltal gátolja a hisztamin hatását, hogy gátolja a hisztamin citokróm p450 egyes izoformáihoz való kötődését (Brandes LJ és mtsai, 1998).

1.2. Az energiaháztartás szabályozásában résztvevők és feladataik Az energiaháztartás szabályozásának számos részvevője van, ezek egy része a tápanyag felvételét, más részük az energiafelhasználást szabályozza. A metabolikus fenotípus kialakításáért felelős szabályozó kör elemei részben a periférián hatnak, részben a centrális szabályozásban vesznek részt. A folyamatban szereplő visszacsatoló mechanizmusok hibája miatt testsúlygyarapodás (leptin-, inzulin-rezisztencia) vagy anorexia jöhet létre (4. ábra).

4. ábra A neuronális modell azokat az energiaegyensúly és tápanyag-raktározási felhasználási folyamatokban szerepet játszó negatív visszacsatoló mechanizmusokat veszi alapul, melyeknek hibás működése következtében testsúlygyarapodás, leptin-, illetve inzulin-rezisztencia alakul ki. 1. p periférián: Az inzulin és/vagy leptin szekréció hibája, 2. periféria és központi idegrendszer közötti kapcsolatban: adipóz és tápanyag-függő jelek hibás érzékelése a hipotalamuszban, 3. központi idegrendszerben: ezen inputokra adott hibás idegi válaszok tesznek hajlamossá a patofiziológiás elhízásra (pozitív energiamérleg) és a megnövekedett vércukorszintre és/vagy leptinszintre (Schwartz MW és Porte D, Jr., 2005).

19

1.2.1. Metabolikus szignálok – a leptin és az inzulin Az inzulin és a leptin a két legfontosabb metabolikus szignál, melyek fő feladata az energiahomeosztázis szabályozása a központi idegrendszerben, a hipotalamuszban (Figlewicz DP és Benoit SC, 2009). 1.2.1.1 A leptin A leptint a fehér zsírszövet adipocitái által termelt anorexigén faktorként írták le (Friedman JM és Halaas JL, 1998). Az 1950-es évektől kezdve sejtették egy molekula létezését, mely érzékeli a homeosztatikus állapotot és az energiaraktárak változásait és így a táplálékfelvétel és energiafelhasználás szabályozásával a zsírmennyiséget beállítja (Kennedy GC, 1953). Ezt a faktort a későbbiekben „jóllakottsági faktorként” emlegették, mivel pl. a ventromedialis hipotalamusz lézió miatt elhízott patkány keringését összekapcsolva egészséges egyedével, ez az egészséges patkány kóros fogyását eredményezte (Hervey GR, 1959). Egy elhízott egértörzs keringését összekapcsolva kontroll állatokéval a változás hasonló: az egészséges állatok fogyni kezdtek (Coleman DL, 1973). Az akkor még csak feltételezett molekula és a zsír kapcsolatára utalt, hogy a sebészeti úton eltávolított zsír hiperfágiát okozott és a zsírszövetben kompenzatórikus hiperplázia alakult ki (Faust IM és mtsai, 1977). A molekula elsődleges feladatának a kövérség megelőzését gondolták, így lett a neve leptin, mely a görög leptosz (sovány) szóból ered. A leptin molekula tényleges felfedezésére még évtizedeket kellett várni, de végül Friedman és munkatársai 1994-ben klónozták az egér leptint kódoló obese génjét (ob) és azonosították humán megfelelőjét (Zhang Y és mtsai, 1994). Az egérben a 6-os, patkányban a 4-es, emberben a 7-es kromoszómán található gén 3 exonból, 2 intronból áll. A fehérjét kódoló régió a kettes és a hármas exonokban van, promóter régióján CREB, GRE, SP-1, C/EBP válasz elemek találhatók (Gong DW és mtsai, 1996). A leptin molekula kristályszerkezetét 1997-ben írták le (Zhang F és mtsai, 1997). A helikális citokinek közé tartozik, az IL-6 citokin családdal mutat homológiát (Madej T és mtsai, 1995). Adipokinnek tekinthető, hiszen a fehér zsírszövet által termelt citokinek közé tartozik. A zsírszöveten kívül leptin termelődést írtak le a placentában, a vázizomzatban, a gyomor fundus sejtjeiben, a csontvelőben és a hipofízis sejtjeiben.

20

Az energiaraktárak helyzete határozza meg az ob gén expresszióját, a transzkripció mértéke a fehérzsírszövet mennyiségével és a zsírsejtek méretével arányos. Az elhízott egyedekben emelkedett ob mRNS mennyiséget és szérum leptinszintet találtak (Frederich RC és mtsai, 1995; Maffei M és mtsai, 1995; Considine RV és mtsai, 1996; Lonnqvist F és mtsai, 1997). Az adipociták mérete és az általuk termelt leptin egy egyeden belül arányos (Hamilton BS és mtsai, 1995). Nemi különbség van mind a zsírszövet mennyiségében, mind a szérum leptinszintben: nőstényeknél több fehér zsírszövet van és magasabb a leptinszint (Montague CT és mtsai, 1997). Prepubertás korban mind rágcsálóknál, mind embernél magasabb a szérum leptinszint, mint a későbbiekben és az ebben a korban tapasztalt leptinszint független a zsírszövet mennyiségétől, illetve a plazma triglicerid szintjétől (Devaskar SU és mtsai, 1997; Mantzoros CS és mtsai, 1997). A prepubertáskori emelkedett leptinexpresszió megelőzi a tesztoszteron- és ösztradiol-szint emelkedést és ez a gonádtengely fejlődésének egyik fontos lépése (Mantzoros CS és mtsai, 1997; Ahima RS és mtsai, 1998; Landt M és mtsai, 2000). Rágcsálókban evést követően, embereknél több napig tartó túlzott táplálékbevitel után emelkedik a keringésben a leptinszint (Saladin R és mtsai, 1995; Harris RB és mtsai, 1996; Kolaczynski JW és mtsai, 1996), ugyanakkor a leptinszint csökkenése minden fajban az éhezés kezdetétől számított órákon belül bekövetkezik (Boden G és mtsai, 1996; Harris RB és mtsai, 1996). Az inzulin és a glukokortikoidok fokozzák, a pajzsmirigy hormonok és a tesztoszteron csökkentik a leptin mennyiségét. Az

ob

gén

mutációi

testhőmérsékletük

extrém

csökken,

elhízáshoz

illetve

vezetnek,

különféle

az

metabolikus

állatok és

hiperfágok,

neuroendokrin

rendellenességekben szenvednek. Inzulin- és kortikoszteron-szintjük megnövekszik, hipogonadizmus következtében sterilek (Campfield LA és mtsai, 1995; Pelleymounter MA és mtsai, 1995). Az ob/ob (C57B1/6J) egerekben bekövetkezett pontmutáció következtében csonka polipeptid keletkezik és így szisztémás hipoleptinémia alakul ki, melynek következménye az elhízás. Emberben igen ritka az ob gén mutációja, de találtak cisztein/treonin cserét okozó mutációt, mely mutáció megegyezik az ob/ob egérben találttal. Az ob génmutációt hordozó embereknél a korábban már az ob/ob egerekben megfigyelt hiperinzulinémia, hiperglikémia, emelkedett kortikoszteron-szint és csökkent testhőmérséklet nem

21

figyelhető meg (Montague CT és mtsai, 1997; Strobel A és mtsai, 1998). Bőr alá adott humán rekombináns metionil-leptin (r-metHuLeptin) kezelést követően a betegek testtömeg indexe a felére csökkent 18 hónap alatt, ami a nagy mennyiségű zsír csökkenéséből ered, fizikai aktivitásuk megnőtt, tesztoszteron-, luteinizáló hormon(LH) és kortizol-szintjük megemelkedett és a lipoprotein-szintek helyre álltak. A kezelést követően az agyukat vizsgálva voxel-based morfometriával kimutatták, hogy az anterior gyrus cingulatus, a kisagy és az agykéreg parietális szürkeállománya megnövekedett (Licinio J és mtsai, 2004; Matochik JA és mtsai, 2005). 1.2.1.2. Leptin-receptorok A leptin-receptort (Ob-R) 1995-ben Tartaglia és munkatársai expressziós klónozási stratégiát alkalmazva egér choroid plexusból klónozták (Tartaglia LA és mtsai, 1995). A leptin-receptor

génjét

már

korábban

db

génnek

nevezték

el

utalásként

a

hiányában/mutációjakor kialakuló diabéteszre. A leptin-receptor az I-es típusú citokin receptor családba tartozik, melynek tagja az interleukin-6 (IL-6), a leukémia inhibitor faktor (LIF), a granulocita kolónia stimuláló faktor (G-CSF), és a glikoprotein-130 receptor is (Taga T és mtsai, 1989; Larsen A és mtsai, 1990; Kishimoto T és mtsai, 1994). A leptin-receptor leptin hiányában is homodimert (esetlegesen heterodimert) alkot, amelyben a leptin kötődésekor ligand aktiválta konformáció változás jön létre (Devos R és mtsai, 1997). Az Ob-R mRNS legalább 6-féle leptin-receptor izoformát kódol, melyek többsége alternatív hasítással keletkezik (Lee GH és mtsai, 1996; Wang MY és mtsai, 1996). Az egyes változatok C terminálisukban különböznek egymástól. A leghosszabb, teljes hosszúságú izoforma az Ob-Rb. A ma ismert izoformák közül öt rendelkezik transzmembrán doménnel, ezek az Ob-Ra-d és f izoformák, melyek citoplazmatikus doménje különböző hosszúságú. Az Ob-Re izoformából hiányzik a transzmembrán és a citoplazmatikus régió is, ez tehát a szolubilis receptor. Az

Ob-Rb

hosszú

izoforma,

nagy

mennyiségben

található

az

agyban,

a

hipotalamuszban. Jelentős mRNS expressziót mutattak ki az arcuatus magban (ARC), a dorsomedialis hipotalamuszban (DMH), ventromedialis hipotalamuszban (VMH), és a ventrális premamilláris magban (PMV). Kimutatták még a periventriculáris hipotalamikus magban és a lateralis hipotalamikus areaban (LHA), ugyanakkor kisebb mennyiségben a paraventricularis magban (PVN) is (Mercer JG és mtsai, 1996; Fei H és

22

mtsai, 1997; Elmquist JK és mtsai, 1998). Tehát elsősorban olyan helyeken figyelték meg expresszióját, ahol a táplálékfelvételt, étvágyat és az energiaegyensúlyt befolyásoló neuropeptidek és neurotranszmitterek termelődnek (Elmquist JK és mtsai, 1999; Sahu A, 2003, 2004) (5. ábra).

5.ábra Leptinérzékeny Leptinérzékeny elhelyezkedése.

idegsejtek

idegsejtek találhatóak a arcuatus mag, a dorzomediális, ventromedialis és periventrikularis hipotalamikus magvak területén. Pe, periventrikularis mag; LH, lateralis hipotalamusz; VMH, ventromedialis hipotalamusz; ARC, arcuatus mag; 3V, harmadik agykamra (Franklin KBJ és Paxinos G, 1997).

Számos hipotalamuszon kívüli területen is találtak Ob-Rb mRNS expressziót: a talamuszban, a Purkinje sejtekben, a cerebellum granuláris sejtjeiben, piriform cortexben, a ventralis tegmentalis areaban (VTA), az agytörzsben az NTS és a DMV területén (Guan XM és mtsai, 1997; Elmquist JK és mtsai, 1998; Mercer JG és mtsai, 1998; Burguera B és mtsai, 2000; Myers MG és mtsai, 2008). Az extrahipotalamikus területeken vitatott a hosszú izoformáról átíródó fehérje jelenléte. A rövidebb hosszúságú Ob-Ra izoforma is nagy mennyiségben expresszálódik az agyban, főként a choroid plexusban és a hajszálerekben mutatták ki (Tartaglia LA és mtsai, 1995; Mercer JG és mtsai, 1996; Bjorbaek C és mtsai, 1998b), ahol szerepe lehet a leptin vér-agy gáton való átjutásában (Hileman SM és mtsai, 2000). A fak/fak patkányban, melyben nincs Ob-Ra receptor izoforma, a cerebrospinális folyadékban csökkent leptin koncentráció mérhető a vad típushoz képest (Kastin AJ és mtsai, 1999). Ez az izoforma a legtöbb periférián lévő szövetben megtalálható. Az ob-Ra box1 doménen keresztül vesz részt a leptin internalizációjában és degradációjában (Uotani S

23

és mtsai, 1999). Kimutatták vesében is, ahol a leptin kiválasztásában játszhat szerepet (Iida M és mtsai, 1996; Merabet E és mtsai, 1997). Az Ob-Re izoforma, melyből hiányzik a transzmembrán domén, szolubilis receptorként funkcionál. Humán mintákban nem találták meg mRNS-ét, így a feltételezések szerint a membránkötött formákból ektodomén „vedléssel” jöhet létre (Maamra M és mtsai, 2001; Ge H és mtsai, 2002). Szerepe igen fontos, a vérben keringve megköti a leptint, és így szabályozza a stabilitását, elérhetőségét (Huang L és mtsai, 2001; Landt M és mtsai, 2001; Yang G és mtsai, 2004). A cerebrospinális folyadékban nem találtak Ob-Re izoformát (Landt M és mtsai, 2000). 1.2.1.3. A leptin-receptor aktiválta jelátviteli utak A leptin-receptor saját tirozin kináz doménnel nem rendelkezik, így jelátviteli útvonalhoz citoplazmatikus kinázokat köt, melyek főként a Janus-kináz (Jak) család tagjai. A teljes hosszúságú leptin-receptor más, a családba tartozó citokin-receptorokhoz hasonlóan három konzervatív régiót, a prolin-gazdag box1-et és két kevésbé konzervatív box2 és box3 régiót tartalmaz. A Jak-kinázok kötéséhez és aktiválásához a box1 (esetlegesen box2) és a környező intracelluláris aminosavak szükségesek (Ghilardi N és Skoda RC, 1997; Banks AS és mtsai, 2000; Kloek C és mtsai, 2002). A box3 régión szükséges a STAT (signal transducer and activator of transcription) szignál transzdukciós útvonal aktiválásához, mert az itt levő Tyr1138

kötődésen keresztül

foszforilálódik a STAT. Így ez a jelátviteli útvonal csak a teljes hosszúságú leptinreceptor, az Ob-Rb esetében működik. A Ob-Rb-hez kötődő leptin hatására a STAT-3 fehérje kötődik a Tyr1138-hoz, majd a JAK2 foszforilálja, disszociál és dimerizálódik (homo- vagy heterodimert képezve) a citoplazmában. A foszforilált, aktív forma bejut a sejtmagba, ahol a transzkripció szabályozásában vesz részt. A Tyr1138 szerepét bizonyítja, hogy az Ob-Rb Tyr1138 génkiütött egerek elhíztak és hiperfágok lettek (Bates SH és mtsai, 2003) (6. ábra). Leptin adásának hatására a Jak-STAT szignál transzdukciós útvonal működését mutatták ki a hipotalamuszban, a zsírszövet, a máj és izom sejtjeiben, a gyomor mukózasejtjein, a petesejtekben, a méhnyálkahártyán, a here csírasejtjeiben és a placentában.

24

6. ábra Leptin aktiválta jelátviteli útvonal a leptin-receptor hosszú izoformán (Ob-Rb) a hipotalamuszban (Zhang Y és Scarpace PJ, 2006). Leptin adásakor Ob-Rb receptor függő szignalizációt a hipotalamuszban és néhány extrahipotalamikus területen mutattak ki (5. ábra). A hipotalamusz területén gyors és robosztus STAT3 aktivációt figyeltek meg (Hubschle T és mtsai, 2001; Hosoi T és mtsai, 2002; Munzberg H és mtsai, 2003) és a cFos fehérje is indukálódott (Elmquist JK és mtsai, 1997; Elias CF és mtsai, 2000). A jelölődött területek nagy része átfed az ObRb mRNS expresszióval, így átfedés van az ARC, DMH, VMH, LHA, PMN, és a PVN területeken. A hipotalamuszon kívül leptin hatására cFos ill. STAT3 immunreaktivitást mutattak ki a dorzalis rafe mag (DR), a periaqueduktális szürkeállomány (PAG), parabrachiális mag (PBN) és a NTS területén is. Leptin-rezisztencia alakulhat ki a megemelkedett leptinszint következtében fellépő receptorszám csökkenéstől. Idős korban hiperleptinémiával együtt kialakul a leptinrezisztencia is, melynek oka a receptorok számának csökkenése. Emellett idős elhízott rágcsálókban kimutatták, hogy a STAT3 aktiválódása gyengül. Ennek hátterében nem csak a receptor mennyiségi csökkenése, hanem a Jak-STAT jelátviteli útvonal fokozott gátlása, a SOCS (Suppressor of Cytokine Signalling, citokin szignalizációt gátló) molekula mennyiségének emelkedése is szerepet játszik (Scarpace PJ és mtsai, 2001; Peralta S és mtsai, 2002). A SOCS-3 molekula a leptin szignalizáció leptin indukálta inhibitora, a Jak-STAT jelátviteli útvonalat a Jak foszforilációján keresztül akadályozza. A SOCS-3 gén

25

promóter régióján megtalálható a STAT3 DNS-kötőhely (Auernhammer CJ és mtsai, 1999). Az Or-Rb receptor STAT3-kötőhely hiányos állatokban csökkent a leptin indukálta SOCS-3 mRNS expresszió (Banks AS és mtsai, 2000). A leptin-rezisztencia oka lehet SOCS-3 fehérje indukciója vagy állandó jelenléte, így a táplálékfelvétel szabályozásában szerepet játszó neuronok leptinre nem reagálnak (Bjorbaek C és mtsai, 1998a). A leptin hatására más jelátviteli útvonalak is aktiválódhatnak, ezek közül a legfontosabb a MAPK (mitogén-aktivált protein kináz) útvonal. A MAPK útvonalat a SHP-2/ GRB-2 komplex aktiválja. A komplex kétféle módon aktiválódhat: részint a receptor megfelelő helyéhez, részint a receptor-kötött Jak-okhoz kapcsolódva. A Jak segítette jelátvitelhez az intracelluláris részre nincs szükség, így folyhat a jelátvitel a Ob-Ra receptoron keresztül is. A MAPK szignál transzdukciós kaszkád aktiválódását kimutatták a hipotalamuszban, a májban és a zsírszövetben. 1.2.1.4. Inzulin Csakúgy mint a leptin, az inzulin is fontos metabolikus szignál az agyban. A pankreász által termelt inzulin volt az első olyan hormon, amelyről kimutatták, hogy az agyba jutva befolyásolni képes a központi idegrendszeren keresztül a testsúlyt, az energia felvételt csökkenti (Woods SC és mtsai, 1979; Baura GD és mtsai, 1993). Mind az inzulin-szekréció, mind a vér, illetve az agy inzulin szintje egyenes arányban áll a zsír mennyiségével. Az elhízott állatok és emberek alap inzulin szintje magasabb és táplálékfelvételkor több inzulint szecernálnak, mint normál súlyú társaik (Bagdade JD és mtsai, 1967). Az inzulin mennyisége igen gyorsan változik, már a táplálék felvétel közben nő a szintje és éhezésre vagy más energia igényes folyamatra csökken. Egy nagyon gyors szignál, és a glükóz stimulálta inzulin-szekréció szintje egyenes összefüggésben van a zsír mennyiségével. A glukóz indukálta inzulin emelkedés csak addig tart, amíg emelkedik a glukóz szintje a vérben, mert az inzulin féléletideje csupán 2-3 perc. Az elhízott egyéneknél inzulin-rezisztencia alakul ki ami II-es típusú cukorbetegséget okoz, és ma már népbetegségnek számít (Benoit SC és mtsai, 2004). Inzulin-receptor, illetve az inzulin-receptor mRNS-e megtalálható a táplálkozás szabályozásában fő jelentőséggel bíró arcuatus magban. Jelenlétét bizonyítja, hogy kísérletes körülmények között a harmadik agykamrába adott inzulin csökkentette az NPY expresszióját az arcuatus magban (Schwartz MW és mtsai, 1992).

26

Fontos megemlíteni, hogy bizonyos esetekben a leptin alkalmas lehet az inzulinrezisztencia, illetve a diabétesz enyhítésére, mivel fokozza az inzulin érzékenységet és megóv az inzulin túltermelődésétől. Egerekben és patkányokban is leptin adását követően megnövekedett inzulinérzékenységet észleltek, melynek hatására mind a glukózfelvétel, mind a glukózforgalom megnövekedett (Kamohara S és mtsai, 1997; Ceddia RB és mtsai, 2002).

1.2.2. A hisztamin szerepe, a hisztamin és a leptin kapcsolata az energiaháztartás szabályozásában A hisztamin szerepét az energiaháztartás szabályozásában már évtizedekkel ezelőtt felismerték, így pl. már a 70-es években leírták Clark és munkatársai a termoregulációban játszott szerepét, icv hisztamin kezelés hatására macskáknál hipo-, majd hipertermiát figyeltek meg (Clark WG és Cumby HR, 1976), bár a mechanizmus pontos leírása még ebben az évtizedben is zajlik (Masaki T és mtsai, 2001a; Yasuda T és mtsai, 2004b). A hisztamin szervezetbeni mennyiségének változtatására lehetőség van a táplálékkal bevitt L-hisztidin mennyiségének változtatásával. A patkányok részére biztosított tápban az L-hisztidin mennyiségének növelése (2.5-5%-ra) jelentős mértékű testsúly csökkenéshez vezetett (Kasaoka S és mtsai, 2004). Az intraperitoneálisan, ill. a 3. agykamrába icv adott L-hisztidin dózisfüggő módon csökkentette a táplálékfelvételt, és ez a hatás előzetesen adott intraperitonealis FMH kezeléssel részben kivédhető volt (Yoshimatsu H és mtsai, 2002a). A hisztamin táplálékfelvételre kifejtett hatásának egyik első bizonyítéka az antidepresszánsok, antipszichotikumok adását követően kialakuló mellékhatás, az étvágyfokozódás és a testtömeg növekedés. A hatást a gyógyszerek H1- receptor blokkoló hatásával magyarázták (Hill SJ és Young M, 1978; Taylor JE és Richelson E, 1980; Russ MJ és Ackerman SH, 1988). Ezt támasztja alá, hogy H1 agonisták csökkentik, míg antagonisták fokozzák a táplálékfelvételt (Ookuma K és mtsai, 1989; Lecklin A és mtsai, 1998). A hisztamin több szinten is befolyásolja az anyagcserét. Centrálisan a hisztaminnak jelentős szerepet tulajdonítanak a fehér zsírszövet mennyiségi regulációjában, és részvétele egyértelmű a lipid metabolizmusban és az energiaforgalom szabályozásában

27

is. Izolált sejteken már az 1970-es években leírták a hisztamin lipolítikus hatását (Nakano J és Oliver RD, 1970). Grund és munkatársai kutyáknak és önkénteseknek intravénásan hisztamint adtak, mely következtében a szabad zsírsav- és glicerin-szint a vérben kétszeresére emelkedett. A hatás H2- receptor agonistákkal részben blokkolható volt (Grund VR és mtsai, 1976). A centrálisan adott hisztamin ugyancsak növeli a szérum szabad zsírsav szintjét (Bugajski J és Janusz Z, 1981; Tsuda K és mtsai, 2002). A hisztaminmetabolizmust gyorsítja az éhezés következtében fellépő glükózhiány, az inzulin szint megváltozása ill. a környezet hőmérsékletének emelkedése (Fujimoto K és mtsai, 1990; Oohara A és mtsai, 1994; Sakata T és mtsai, 1994). A korábbi irodalmak a hisztamin mennyiségi változása következtében fellépő testtömeg gyarapodás/csökkenés okaként a fehér zsírszövet mennyiségi változását, ezen belül is inkább a visceralis zsírszövet, és nem a bőr alatti zsírdepók mennyiségi változását említik (Masaki T és mtsai, 2001a; Kasaoka S és mtsai, 2004). Ezt alátámasztja, hogy mind az „autofeedback” H3-receptor antagonista, mind az L-hisztidin adását követően a fehér zsírszövetben gyorsul a lipolízis. Elektrofiziológiai mérések azt mutatták, hogy a hipotalamikus hisztaminerg neuronok a szimpatikus tónus növelésével, illetve a βadrenoreceptorok aktivációján keresztül szabályozzák a periférián a lipid metabolizmust (Brown RE és mtsai, 2001; Tsuda K és mtsai, 2002; Yoshimatsu H és mtsai, 2002b). Hisztamin (L-hisztidin) hatására a zsírszövetekben elinduló lipolízis ellentmond annak, hogy míg alacsony zsírtartalmú diétán tartott H1- receptor hiányos egerek epididimalis zsírszövet mennyiségében nem volt különbség a kontroll állatokhoz képest, addig a magas zsírtartalmú diétán tartott egerek esetében a receptor deficiens állatok fehér zsírszövet mennyisége szignifikánsan nagyobb gyarapodást mutatott. Ennek oka a H1receptor hiányos egereknél a leptin indukálta táplálékfelvétel-gátlás csökkenése lehet (Masaki T és mtsai, 2001b). Intraperitoneálisan adott leptin glicerin- és szabad zsírsavszint emelő hatásának elsődleges okaként is a centrális H1- és β-adrenerg receptorokon, illetve valószínűleg a β3-receptorokon keresztüli hisztamin hatást nevezték meg (Shen J és mtsai, 2007). Fontos megemlíteni, hogy hisztamint minden olyan sejt szintetizál – ha különböző mennyiségben is –, amely HDC-t expresszál, így az L-hisztidin nem csak neuronális prekurzora a hisztaminnak. A periférián az idegsejtek körül elhelyezkedő hízósejtekből felszabaduló különböző mediátorok (köztük a hisztamin is) idegi aktivitást okoznak (Falus A és Kovacs KJ, 2002).

28

Régóta ismert a hisztamin szerepe az energiaháztartást szabályozó folyamatokban és a leptin felfedezése után megindultak a kutatások a két molekula közötti lehetséges összefüggések irányába. A leptin és a hisztamin közötti kapcsolat kétirányú, de feltehetően közvetett, hiszen a hisztaminerg neuronok lokalizációs helye, a tuberomamillaris régióban lévő sejtcsoport nem érzékeny leptinre (Hakansson ML és mtsai, 1998). A hisztamin táplálékfelvételre, jóllakottságra gyakorolt hatása nem volt ismeretlen már a leptin felfedezése előtt sem, de a leptin szerepének tisztázása teremtette meg a kapcsolatot a zsírszövet mennyisége és az ezzel összefüggő táplálékfelvétel mértéke között, amelynek egyik köztes eleme lehet a hisztamin. A tuberomamillaris régióban található hisztaminerg neuronok szinte minden olyan agyi területre kivetülnek, amely érintett az energiahomeosztázis szabályozásában. A leptin táplálékfelvételre és energiaháztartásra gyakorolt hatását részben a hisztaminerg neuronok közvetett aktiválásával fejti ki. Patkány icv 3. agykamrájába adott leptin fokozta a hisztamin-metabolizmust, növekedett a hisztamin metabolit telemetil-hisztamin mennyisége az agyban. Ugyanakkor a HDC gén expressziója nem változott, így a leptin nem a katalizátor enzim mennyiségét növelte, hanem poszttranszlációs módosítás, ill. a hisztamin-metabolizmus révén hatott. Éheztetett patkányok esetében a leptin csökkentette a hipotalamuszban a hisztamin szintjét, növelte a tele-metil-hisztamin/hisztamin arányt. Előzetes szintetikus hisztamin agonistával

(α-fluoro-metilhisztidin)

történő

kezelés

meggátolta

a

leptin

táplálékfelvételt csökkentő hatását (Yoshimatsu H és mtsai, 1999). A leptin hatásának közvetítésében a hisztamin-receptorai közül valószínűleg a H1- és H3-receptorok érintettek. A H1- receptor génkiütött (H1R-KO) egereknek ugyan emelkedik a leptinszintje a szérumban, de hatását nem tudja kifejteni, az állatok elhíznak, fokozódik a táplálék indukálta zsírlerakódás. Ezen egerek esetében a leptin indukált

csökkent

táplálékfelvétel

és

csökkent

zsírmennyiség

kevésbé

volt

megfigyelhető, mint a vad típusú kontrollok esetében (Masaki T és mtsai, 2001b). Lecklin és mtsai icv leptin kezelés hatását vizsgálva nem tapasztaltak változást a hipotalamusz hisztamin koncentrációjában, és a H1-receptorok blokkolása sem befolyásolta a leptin metabolikus hatását, így arra a következtetésre jutottak, hogy a leptin táplálékfelvétel és testtömeg szabályozása nem közvetlenül a hipotalamusz hisztaminerg neuronjain keresztül történik (Lecklin A és mtsai, 2000). A kísérleti

29

körülmények azonban eltérőek voltak, mint Masaki és mtsai esetében, akik hosszabb idő elteltével mérték a koncentrációkat, és az állatok kaptak enni a kísérlet előtt. Mivel a leptin anorexigén hatása hosszan tartó, megkérdőjelezték a többi tanulmányban közölt rövidebb idő után mért különbségek biológiai relevanciáját. Ugyanakkor elképzelhető, hogy a rövid idejű hisztamin változás hosszan tartó hatásokat idéz elő az általa beidegzett területeken, így ez az érvelés nem feltétlenül helytálló. A H3 génkiütött egereket fokozott táplálékfelvétel, megnövekedett zsírlerakódás és csökkent energiafelhasználás jellemzi. Az állatok leptin és inzulin szintje emelkedett, leptin- és inzulinrezisztensek, továbbá csökkent a hipotalamikus hisztamin koncentráció és fokozott a hisztamin átalakulás (Takahashi K és mtsai, 2002). Mivel a H3 antagonisták alapvetően fokozzák a hisztamin kibocsátást és gátolják a táplálékfelvételt, ezek a tapasztalatok meglepőek voltak (Attoub S és mtsai, 2001). Ennek oka lehet, hogy az autoreceptorok hiánya nincs hatással a hisztamin kiáramlás csökkenésére, és emiatt a szintetizáló kapacitás kimerül, így az idegvégződésnél hisztaminhiányhoz vezető állapot alakul ki. A leptin és a hisztamin közötti kapcsolatot számos leptinhiányos, leptin-receptor sérült, hisztamin-receptor génkiütött egéren elvégzett kísérlet eredménye támasztja alá. Súlyosan elhízott ob/ob ill. db/db fenotípusú egerek esetében agyba adott hisztamin hatására csökkent a zsírfelhalmozódás és az UCP család expressziója, így ellensúlyozva a leptin hiány következményeit. Ob/ob egerek esetében csökkent hisztaminforgalmat mértek, de ez leptin adagolásával helyreállt. A db/db egerek agyában mind a hisztamin, mind a tele-metil hisztamin koncentrációja csökkent a vad típushoz képest (Yoshimatsu H és mtsai, 1999). Krónikus (7 napon át tartó) icv hisztamin kezelés hatására csökkent a táplálék felvétel és szignifikáns testsúly csökkenés volt tapasztalható mind a DIO mind a db/db fenotípusú egereknél (Masaki T és mtsai, 2001a). A leptin-hisztamin kapcsolat teljes feltárásához hozzájárulnak a HDC-/- egereken végzett kísérletek. A rendelkezésre álló irodalmi adatok alapján a leptin és a hisztamin közti összefüggés bizonyított, mely szerint a leptin részben a centrális hisztamin regulációján keresztül fejti ki hatását az agyban. Azonban a sokszor ellentmondásos adatok miatt és a pontos szabályozási mechanizmus megismerése érdekében további vizsgálatok szükségesek.

30

1.2.3. A táplálkozás szabályozásában résztvevő neuropeptidek A táplálkozás szabályozásában résztvevő neuropeptideket két nagy csoportba oszthatjuk: a táplálékfelvételt növelő és az energiafogyasztást csökkentő orexigén, és az ezekkel ellentétes hatású anorexigén neuropeptidekre (Berthoud HR, 2002; Sahu A, 2004) (I. táblázat). A táblázatban említetteken kívül szerepe van a katekolaminoknak, a szerotoninnak, a szexuálszteroidoknak és a glukokortikoidoknak is az energiaháztartás szabályozásában. A szignálok összegzésének elsődleges központja a hipotalamusz. I. táblázat A táplálékfelvétel és energia-metabolizmus szabályozásában résztvevő peptidek (Sahu A, 2004) Orexigén NPY AgRP MCH Orexin Ghrelin Galanin GH-RH Dinorfin β-endorfin

Anorexigén αMSH (POMC) CART CRH /Urokortin TRH CCK NT Glukagon-szerű-peptid 1 (GLP-1) YY peptid CNTF BDNF Inzulin Leptin Neuropeptid K (NPK) PrRP Neuromedin B és Neuromedin U Szomatosztatin Oxitocin Bombezin Enterosztatin IL-1 Anorektin

A legintenzívebben kutatott neuropeptidek a neuropeptid Y (NPY) és a proopiomelanokortin (POMC), melyek hatása ellentétes a táplálkozás szabályozásában. Az arcuatus magban található NPY neuronok az NPY mellett agouti-related proteint

31

agutihoz kapcsolódó fehérjét, (AgRP) is expresszálnak. Az AgRP protein szintén orexigén neuropeptid, a melanokortin receptorokon (MC3/MC4) hat és az α-MSH endogén antagonistája (Schwartz MW és mtsai, 2000). Ismételt vagy folyamatos centrális NPY vagy AgRP infúzió növeli a táplálékfelvételt, a testtömeget és a zsír mennyiségét (Stanley BG és mtsai, 1986; Zarjevski N és mtsai, 1993; Korner J és mtsai, 2003). Ugyan az NPY génkiütött egerek normál fenotípust mutattak, de az NPY gén kiütése ob/ob egerek esetében csökkenti a táplálékfelvételt és az elhízást (Erickson JC és mtsai, 1996a; Erickson JC és mtsai, 1996b). Az NPY-hoz hasonlóan orexigén hatása van a lateralis, posterior hipotalamuszban termelődő orexinnek (Backberg M és mtsai, 2002) és a melanin-koncentráló hormonnak (MCH) is (Shimada M és mtsai, 1998). Az orexin felfedezése még csak 10 éve történt, de már jelentős irodalom foglalkozik vele. A két orexigén peptid, az NPY és az orexin szabályozása ellentétes. Ezt bizonyítja, hogy mind mRNS szintjük, mind receptoraik száma ellentétes irányba változik fa/fa (elhízott) ill. FA/FA (normál súlyú) Zuker patkányokban (Beck B és mtsai, 2001). A TM neuronok sűrűn beidegzettek orexint tartalmazó axonokkal és az alvási-ébrenléti kísérletek is kimutatták, hogy funkcionális kapcsolat (cFos immunreakció) van közöttük (Eriksson KS és mtsai, 2001) azóta is számos kísérlet bizonyította ezt (Beck B, 2000). A hipotalamusz nucleus arcuatusában az NPY/AgRP neuronokkal ellentétes hatású neuronok a POMC neuronok, melyek a melanokortinokon keresztül csökkentik a táplálékfelvételt és a testsúlyt. A melanokortinok a POMC-ból hasítódnak ki, pl. az αMSH, mely a melanokortin receptorokhoz kötődik. Nem specifikus melanokortin agonista (MTII) kezeléssel dózisfüggő módon erőteljes táplálékfelvétel gátlás érhető el. Az α-MSH kezelés erőteljes metabolikus hatását figyelték meg. Jelentősen csökkenti a szérum inzulin szintet mind hiperinzulinémiás leptinhiányos, mind normál egerekben (Fan W és mtsai, 1997). A melanokortin receptor (MC4) sérült emberek és egerek elhízottak (Huszar D és mtsai, 1997; Cone RD, 1999). Az arcuatus magban a POMC neuronok a POMC mellett kokain és amfetamin-szabályozott transzkript (cocaine and amphetamine-regulated transcript, CART) peptidet koexpresszálnak (Kristensen P és mtsai, 1998; Thim L és mtsai, 1998). Patkányoknál CART icv beadása dózisfüggő módon csökkentette a táplálékfelvételt, és az állatok viselkedése is megváltozott (elfeküdtek, remegtek, alvásidejük megváltozott, nem mosakodtak). Ugyanakkor a

32

hipotalamusz magjaiba (ARC, VMH, PVN, LH, SON) kis koncentrációban alkalmazott CART növelte a táplálékfelvételt (Abbott CR és mtsai, 2001; Kong WM és mtsai, 2003). A CART kettős hatására utal az is, hogy míg a homozigóta CART génhibás állatok táplálékfogyasztása magas zsírtartalmú diéta mellett nőtt, addig a heterozigóta állatok esetében a táplálékfelvétel szignifikánsan csökkent a kontrollhoz képest (Asnicar MA és mtsai, 2001). A hipotalamusz nucleus arcuatusában mind az NPY, mind a POMC neuronok expresszálnak leptin-receptort, de a leptin hatása ezen sejtcsoportokra ellentétes hatású: a leptin serkenti a POMC-t és gátolja az NPY neuronokat (Elmquist JK, 2001).

1.3. A hisztamin és a szexuál szteroidok közötti összefüggés A hisztaminnak szerepe van mind a szexuális magatartás, mind a szaporodás szabályozásában. Az irodalomban centrális és perifériás hatásokra is találunk adatokat. Hisztamin centrális adására a hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely (HPG) aktiválódik, nagy dózisa ovulációt okoz. A hatás az anterior hipotalamusz LH-RH neuronjain keresztül jön létre, direkt hisztamin hatás nem figyelhető meg a hipofízis gonadotrop hormon (LH, FSH) szekréciójára. Bár a centrális hisztamin valószínűleg nincs befolyással a bazális LH szintre, hatással van az ösztrogén kiváltotta LH kiáramlásra. Ösztrogén kezelt ovariektomizált patkányoknak icv adott H1- receptor antagonista (Mepiramin) gátolja, H2- receptor antagonista (ranitidin) nem befolyásolja az LH kiáramlást (Knigge U és mtsai, 1985; Horno NM és Alvarez EO, 1991). Fénymikroszkópos szinten hisztaminerg rostok figyelhetők meg az LH-RH neuronokkal kapcsolódva mind axo-szomatikusan, mind axo-dendritikusan és a hisztamin immunpozitív

sejtek

76%-a

tartalmaz

α-ösztrogén-receptort.

Mindezekből

feltételezhető, hogy az ösztrogén pozitív feedback hatására létrejövő LH szekréciót a tuberomamilláris magban lévő ösztrogén érzékeny hisztaminerg neuronok közvetítik (Fekete CS és mtsai, 1999). Míg az ösztrogén és a progeszteron fokozza az LH-RH stimulált LH szekréciót, addig az androgének inkább gátolják ezt a folyamatot (Knigge U és mtsai, 1990; Knigge U és Warberg J, 1991). Még nem ismert, hogy in vivo a hisztamin direkt stimulálja-e a GnRH neuroszekretoros neuronok GnRH szekrécióját, de egy immortalizált GnRH sejtvonalon (GT1-1) H1-

33

receptor antagonistával (Mepiramin) blokkolható a GnRH hormon szekréció (Noris G és mtsai, 1995). Ugyancsak a GnRH-hisztamin kapcsolatra utal, hogy a klinikumban használt GnRH antagonisták egy része jelentős hisztamin kiáramlást okoz, így használatuk korlátozott (Padula AM, 2005). Csupán néhány irodalmi adat bizonyítja a hisztamin és a szteroidok kétirányú direkt, illetve indirekt kapcsolatát a periférián. Mind a hisztamin képes a szteroidmetabolizmus egyes elemeinek szabályozására, ill. a szteroidok szekréciójának befolyásolására, mind a szteroidok képesek befolyásolni a hisztamin szintézisét, szekrécióját és hatását (LaBella FS és mtsai, 2000). A periférián a hisztamin és a női nemi hormonok (progeszteron, ösztrogén) szintje, szekréciója között kapcsolat áll fent (Bodis J és mtsai, 1993; Paria BC és mtsai, 1998; Bodis J és mtsai, 2002). A hisztamintesztoszteron között is kapcsolat all fent, a hisztamin in vivo fokozza a tesztoszteron szintézisét aranyhörcsögök Leydig-sejtjeiben (Mayerhofer A és mtsai, 1989).

1.4. HDC-/- egér modell Egy hisztaminhiányos egértörzs jó modellként szolgál in vitro megfigyelések megerősítésére, biológiai relevanciájának felderítésére és a hisztamin in vivo hatásainak tanulmányozására. Mivel az emlősökben a hisztamin szintézisét egyetlen enzim, a hisztidin-dekarboxiláz katalizálja, ezért ezen gén kiütésével hisztaminhiányos állatot hozhatunk létre. A hisztaminhiányos, HDC-génkiütött egeret kanadai és japán kutatók a Semmelweis Egyetem Genetikai Sejt- és Immunbiológiai Intézetével közösen hozták létre (Ohtsu H és mtsai, 2001). A hisztidin-dekarboxiláz gén 5-ös és 9-es exonok közé eső, 2,4 kb hosszúságú szakaszát cserélték ki egy fordított, PGK promóter hajtotta neomycinfoszfotranszferáz génre (PGK-neor). A 129Sv derivált E14 ES sejt DNS-ben cserélték ki az 5. exon SpeI enzim vágóhelye és a 9. exon Pst I enzim vágóhelye közötti szakaszt. Ez null mutációt eredményezett, mivel a gén ezen szakasza felelős a PLP koenzim kötőhelyének kialakításáért, hiányában az enzim funkcióképtelen. A homológ rekombináción átesett ES sejtek kiválogatása PCR-rel történt, amit Southern blottal két lépésben erősítettek meg. A homozigóta mutációt hordozó egerekben a HDC transzkriptumot sem lehet detektálni, így a neomycin (neo) kazetta beillesztése nem egy

34

funkcióképtelen fehérje létrejöttét eredményezte, hanem a beillesztés a transzkripciót is megakadályozta (7. ábra).

7. ábra A HDC génkiütés terve (Ohtsu H és mtsai, 2001) Az így létrehozott hisztaminhiányos állatok genetikai háttere CD1 kültenyésztett egértörzs. Kísérleteinket ilyen genetikai hátterű egereken végeztük. A Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt-és Immunbiológiai Intézete létrehozott egy BALB/c HDC-/egértörzset is a vad típusú BALB/c és a CD1 HDC-/- egértörzs keresztezésével. A BALB/c beltenyésztett egértörzset elsősorban immunológiai vizsgálatokban használják. Az irodalomban leírt hisztaminhiányos egerekkel folytatott kísérletek bizonyos különbségeket mutatnak az egerek genetikai hátterének (BALB/c, CD1) különbözősége miatt. Annak ellenére, hogy a hisztamin ennyire központi fontosságúnak látszik az „élethez”, a HDC enzim hiánya nem összeegyeztethetetlen az élettel. A hisztamin sokrétűségét mutatja, hogy hiányában az egerek fenotípusa számos területen tér el a vad típustól. A hisztamin táplálékból történő felvétele is lehetséges, így alacsony hisztamin tartalmú diétán tartva ezeket az egereket, szöveteikben a hisztamin koncentráció igen alacsony, gyakorlatilag nulla (bár az agyban nyomokban kimutatták), így élettani szerepe nincs (Ohtsu H és mtsai, 2001). A hisztaminhiányos állatok homozigóta keresztezéssel fenntarthatók és a heterozigóta állatok keresztezésével kapott arányok mendeli eloszlást mutatnak. Annak ellenére, hogy a HDC-/- egérek fertilisek és a születések mendeli eloszlást mutattak, a reprodukciós képességük csökkent. A HDC-/- egerek homozigóta keresztezésénél a paroztatást követő pár napban csak kis százalék lesz vemhes. Hisztaminmentes tápon

35

tartás esetén a HDC-/- nőstény egerek 80%-ban egy hónapon belül sem lettek vemhesek. HDC-/- nőstényeket pároztatva vad típusú hím egerekkel, a pároztatás hatékonysága megegyezett a vad típusú egereknél megfigyeltekkel. Ebből következtethető, hogy a megváltozott reprodukciós képesség hátterében a hímek megváltozott szexuális viselkedése áll (Par G és mtsai, 2003). A HDC-/- egerekben a H1- receptor expressziója nem változott. A H2 hisztaminreceptor expresszió csökkent, de a változás kompenzálható volt exogén hisztamin adásával. A hisztaminmentes diétán tartott HDC-/- egerek agy, gyomor, ileum, szív, máj és bőr szövetmintáiban jelentős mértékű H2- receptor expresszió csökkenést figyeltek meg (Fitzsimons CP és mtsai, 2001). A várakozásoknak megfelelően a hisztaminhiányos egerek immunfenotípusa jelentősen megváltozott. Mind a korábbi irodalmi adatok, mind a HDC-/- egérrel folytatott kísérletek arra utalnak, hogy a hisztamin jelenléte az immunregulációt Th2 irányba tolja el. A vad típushoz képest a HDC-/- egerek normálistól eltérő allergiás bőrreakciót és más immunreakciót mutattak, hízósejtjeik eltérő morfológiájúak, számuk és a sejtek granuláltsága csökkent (Ohtsu H és mtsai, 2001; Ohtsu H és Watanabe T, 2003). Ez utóbbi jelenség a rendellenes mieloid ontogenezisre és az alacsony c-kit expresszióra vezethető vissza, mely bizonyítja a hisztamin szerepét a hematopoetikus sejtek differenciálódásában is (Wiener Z és mtsai, 2001). A hisztaminhiányos állatokban fokozódott a sejtközvetített immunreakció, így ovalbuminnal kiváltott asztma modellben a tüdőszövetben nőtt a Th1 jellegű (IL-12) és csökkent a Th2 típusú (IL-1, IL-4, IL-9, IL-13, IFN-γ) citokinek bioszintézise. Ugyanakkor a kemokinek felszaporodása is kimutatható volt, mely szintén Th1 irányba tolja el az immunválaszt. Hisztaminhiányában az asztma jelentősen enyhébb volt, az eozinofil sejtek bevándorlása a tüdőbe csökkent, a tüdőszövet sejtösszetétele is megváltozott, kevesebb eozinofil granulocita található (Kozma GT és mtsai, 2003). A hízósejtekben IL-9 hatására számos citokin indukálható, de hisztaminhiányos egerekben sokkal kevesebb Th2 típusú citokin (IL-4, IL-10 és IL-13) keletkezik, mint a genetikailag nem módosított egerek esetében. A gén kiütött állatokban az IL-6 indukálhatósága gyengébb volt, ugyanakkor az IL-6 receptor expressziója megnövekedett (Horvath BV és mtsai, 2002). Ugyanezt kapták mukóza sejtekben Klausz és munkatársai Helicobacter pylori fertőzés esetén (Klausz G és mtsai, 2004). HDC-/- egerek segítségével leírták, hogy az E. coli fertőzéses

36

peritonitisz modell fontos mediátora a hisztamin, amely a baktériumok eliminációját késlelteti (Hori Y és mtsai, 2002). A gyomorsav szekréció szabályozásában a hisztamin szerepét bizonyítja, hogy hisztaminhiányos egerekben az alap gyomorsav szekréció a kontrollhoz képest alacsony, de exogén hisztamin beadását követően kétszeresére emelhető. Hosszútávú hisztaminhiány eredményeként mukóza hiperplázia, hipokloridia és hipergasztrinémia alakul ki (Tanaka S és mtsai, 2002; Nakamura E és mtsai, 2004). Exogén gasztrin kezelést követően a HDC-/- egerekben hipergasztrinémia alakul ki, és mind gasztrinerg, mind kolinerg stimulációra csökken a gyomorsav szekréció (Hunyady B és mtsai, 2003). A hisztamin szerepe meghatározó a gasztrin indukálta gyomorsav szekrécióban, hatását valószínűleg a cAMP szint emelésével fejti ki (Nakamura E és mtsai, 2004). A gyomor nyálkahártya membráján a H2-receptor kötési Bmax értéke hisztaminhiányos egereknél magasabb (Tanaka S és mtsai, 2002). A hisztaminhiány az egerek csontképzésében is jelentős változásokat okozott. A HDC-/egerekben nagyobb csontsűrűséget mértek, a csontvastagság megnövekedett, a csontképződés fokozódott, jelentősen csökkent az oszteoklasztok száma. Az ovariektómia-indukált oszteoporózissal szemben (50%-kal) a HDC-génkiütött állatok védettebbek voltak. Ennek hátterében az oszteoklasztok gátlása és a kalcitriol szintézis fokozódása áll (Fitzpatrick LA és mtsai, 2003). Centrális hisztamin-hatások vizsgálatainál is számos eltérést találtak a két genotípus között. A tartós hisztaminhiányos állapot megváltoztatta az állatok viselkedését, alvásébrenlét ciklusukat, ébrenléti idejük jelentősen rövidült (Parmentier R és mtsai, 2002). A HDC-/- egerek lokomotoros aktivitása lényegesen redukálodott, cirkadián ritmusuk megváltozott, az „óra gének” (mPer1, mPer2) expressziója az agykéreg és a striatum területén csökkent (Abe H és mtsai, 2004). A különféle memória tesztekben eltérő eredménnyel teljesítettek a hisztaminhiányos állatok, mint a vad típusúak. A hisztaminhiányos egerek a negatív megerősítésen alapuló vízi útvesztőben jobban, míg a nem megerősített kapcsolaton alapuló tárgyfelismerési tesztben gyengébben teljesítettek, mint vad típusú társaik (Dere E és mtsai, 2003). A génkiütés következtében csökkent a felfedező magatartás nyílt porond tesztnél, de normális viselkedést mutattak „novel environment” (újszerű környezet) teszten, szorongást mutattak a módosított emelt keresztpalló teszten (Dere E és mtsai, 2004). Hasonló kísérleteket végeztek

37

Acevedo és munkatársai fiatal és felnőtt korú nőstény állatokon és azt találták, hogy a hisztaminhiányos egerek hipoaktivitást mutattak, szorongtak, rosszabbul teljesítettek vízi útvesztő tesztben, bár úszásuk nem lassult, és a rotoros kísérletekben is rosszabbul teljesítettek, mint vad típusú társaik. Nemi eltérést mutatkozott a tárgy felismerés, a vízi útvesztő és a rotor kisérletek a hisztaminhiányos állatok esetében (Dere E és mtsai, 2004; Acevedo SF és mtsai, 2005). A PTZ (pentilén tetrazol) indukálta kindling kialakulása gyorsabb volt a HDC-/- állatoknál (Chen Z és mtsai, 2003), míg az amygdaloid kindling hasonló eredményt hozott (Hirai T és mtsai, 2004). Kokainnal kezelt HDC-/- egerek esetében is kimutatták, hogy csökkent a „felfedező” magatartásuk, de hiperaktívak. Ezek a kísérletek nem támasztják alá a hisztamin jutalmazó, „reward” magatartás gátlásában játszott szerepét (Brabant C és mtsai, 2007). A mi kísérleteinkkel párhuzamosan más kutatócsoportok is végeztek kísérleteket hisztaminhiányos egereken a hisztamin homeosztázis (táplálékfelvétel, táplálkozás szabályozásás,

energiametabolizmus)

szabályozásában

betöltött

szerepének

vizsgálatára, a hisztaminhiány kompenzatórikus folyamatainak felderítésére. Ezeket az eredményeket a megbeszélés fejezetben tárgyalom, eredményeinkkel összevetve.

38

2. Célkitűzés A hisztaminerg neuronok kimutatására szolgáló, in situ hibridizációs hisztokémiai módszernél alkalmazott szonda készítése. Hisztaminhiányos, hisztidin-dekarboxiláz (HDC) génkiütött egér metabolikus fenotípusának jellemzése. ¾ Tápanyagfelvétel, testtömeg, zsírmennyiség változás meghatározása ¾ Metabolikus szignálok szintjének meghatározása vérben A hisztamin funkcionális jelentősége az energiaháztartás szabályozásában a HDC-/egerek metabolikus fenotípusának kialakulásában szerepet játszó szabályozó mechanizmusok meghatározásával. ¾ Energiamobilitási képesség vizsgálata ¾ Az inzulin és a leptin rendszer vizsgálata ¾ A leptinszint/ leptin-rezisztencia vizsgálata •

Leptin-expresszió vizsgálata hisztidin-dekarboxiláz génkiütött és vad típusú egér epididimalis-, subcutan- és barna zsírszövetében

•

Lerton-receptor (Ob-Rb) expresszió mérése hipotalamuszban és májban

•

A leptin-receptor működőképességének, a Jak-STAT szignáltranszdukciós útvonalnak vizsgálata STAT3 foszforiláció alapján

¾ A hisztaminerg neuronok feltérképezése ¾ L-hisztidin adását követő neuronális aktiváció vizsgálata ¾ Orexigén (NPY, orexin) és anorexigén (POMC) neuropeptidek expressziós vizsgálata hipotalamuszban A hisztamin reproduktív folyamatokban betöltöltött szerepének vizsgálata hím hisztidin-dekarboxiláz

(HDC)

génkiütött

egér

reproduktív

funkciójának

vizsgálatával. ¾ Androgén hormonszintek mérése ¾ Az agyi GnRH neuronok vizsgálata ¾ A here morfológiai leírása

39

3. Módszerek 3.1. Állatok A kísérleteinkhez felnőtt, hím CD1/129Sv genetikai hátterű egereket használtunk. Mind a hisztidin-dekarboxiláz génkiütött (HDC-/-), mind a vad típusú (WT) állatokat standard laboratóriumi körülmények között tartottuk 22±1oC egyenletes hőmérsékletű, 12 órás fény/sötét ciklusú (megvilágítás: 6-18 óráig) szobában. Az egerek legalább három hónapos korukig az Intézetünkben megszokott tápot (19% fehérje, 3,5% zsír; Ssniff Spezialdiäten Gmbh, Németország) kapták, de a kísérleteket megelőzően legkésőbb a kísérlet kezdete előtt egy héttel hisztaminmentes (<0,6 nmol hisztamin/g táp, 17,5% fehérje, 5,15% zsír; Altromin, Németország) diétára tértünk át mindkét genotípusnál. A HDC-/- állatokat Ohtsu és mtsai (Ohtsu H és mtsai, 2001) állították elő. 129Sv derivált E14 ES sejt DNS-ben cserélték ki a HDC gén ~2.4 kb szakaszát: az 5. intron Spe I enzim vágóhelytől a 9. exon Pst I enzim vágóhelye között szakasznak a helyébe helyezték el az ún. PGR -neor kazettát. A kísérletek előtt az állatok genotipizálása a farokból izolált genomiális DNS mintákból történt PCR alkalmazásával. A felhasznált primerek a következők voltak: HDC forward: 5'-AGT GAG GGA CTG TGG CTC CAC GTC GAT GCT-3' HDC reverse: 5'-TAC AGT CAA AGT GTA CCA TCA TCC ACT TGG-3'; neor forward: 5'-AAA CAT CGC ATC GAG CGA GCA CGT ACT CGG-3' neor reverse: 5'-ATG TCC TGA TAG CGG TCC GCC ACA CCC AGC-3' Az állatok tartása és a kísérletek a 86/609 ECC nemzetközi rendeletnek, valamint a 243/98 sz. kormányrendeletben előírtaknak megfelelően történtek, a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Állatkísérletekért felelős Bizottságának felügyeletével, a Budapesti Fővárosi Állategészségügyi és Élelmiszer Ellenőrző Állomás engedélye alapján (13/1999 FVM).

3.2. Metabolikus vizsgálatok A metabolikus tesztekhez az állatokat a koprofágia megelőzésére egyedileg, rácsos aljzattal ellátott ketrecekben helyeztük el.

40

3.2.1. A testsúlyváltozás, és a táplálékfogyasztás nyomonkövetése Mind a HDC-/-, mind a WT egerek testsúly gyarapodását az anyától történő elválasztásukat követően hetente, az állatok feldolgozásáig követtük. A rendszeres testsúlymérések a hét ugyanazon napján történtek. Mértük az elfogyasztott táp mennyiségét és az egerek folyadékfogyasztását is. A táplálék feldolgozásának hatékonyságát, az ún. „kalorikus efficiencia” értéket a következő képlet segítségével számoltuk ki. testsúly növekmény (g) Kalorikus efficiencia= -----------------------------------------------------tápanyagfogyasztás (g) X a táp kalória ekvivalencia értéke (kJ/g)

3.2.2. A zsírszövetek vizsgálata Az altatást vagy a gerinc széthúzását (cervical dislocation) követően a különféle zsírszövetek

(bőrszövet

alatti-,

epididimalis-,

és

barna

zsírszövet)

tömegét

milligrammos pontossággal határoztuk meg. A bőrszövet alatti, subcutan zsír vastagságát tolómérővel (Oditest, Kroeplin Längenmesstechnik, Németország) mértük le az állat hátánál. A szöveteket eltávolítás után rögtön fagyasztottuk, és -70oC-on tároltuk.

3.2.3. Az energiametabolizmus közvetett mérése Az energiafelhasználás indirekt vizsgálatára az állatokat egyesével, rácsos aljú ketrecben 5 órán keresztül éheztettük, majd hideg szobába (4 oC) helyeztük. Félóránként 90 percen át mértük az egerek rektális hőmérsékletét. Testtömegüket az éheztetést megelőzően, a hideg stressz előtt és után is mértük.

3.3. A vérminták elemzése 3.3.1. A vérvétel módja Az éterrel elkábított egerekből heparinozott üveg kapillárison (1682micro,Vitrex) keresztül gyűjtöttünk szemzugból, a vénás plexusból kis mennyiségű vért. A vérvételek mind az éheztetett, mind az etetett állatok esetében reggel 9-11 óra között történtek. A vérmintákat 2 µl 20% EDTA-t tartalmazó, jégen hűtött műanyag Eppendorf csövekbe gyűjtöttük. A vérvételt követően a mintákat legrövidebb időn belül lecentrifugáltuk és a plazmát a mérések elvégzéséig –20 oC-on tároltuk. Nagyobb mennyiségű vért az állatok dekapitálásával nyertünk.

41

3.3.2. Vércukor- és inzulin-szint mérés A vércukorszinteket 1-1 csepp vérből glükóz-oxidáz reakción alapuló reagens-csíkkal határoztuk meg, a színreakciót One TOUCH® Glükóz Monitorral (Lifescan, Milpitas, CA) detektáltuk, előzetes kalibráció után. A glükóz tolerancia tesztet megelőzően az állatokat 18 órán keresztül éheztetettük, majd intraperitoneálisan 1 mg/g testsúly dózisban D-glükózt adtunk. A vérvétel szemzugból történt, a glükóz adását megelőzően, majd a beadást követően 30., 60.,és 120. percben. Ugyanezen

vérmintákból,

melyeket

Eppendorfba

gyűjtöttünk,

Mouse

Insulin

Ultrasensitive ELISA kit (DRG Instrument GmbH, Marburg, Németország) segítségével a plazma inzulin-szintet is meghatároztuk. Inzulin teszt esetén intraperitoneálisan 1 U/kg testsúly inzulin (Actrapid NHge, Novo Nordisk, Dánia) adását követően nem éheztetett állatokon mértük a vércukorszinteket. A mérés közvetlenül a beadást megelőzően, majd az inzulin beadását követően 15., 30., 60. perc elteltével, szemzugból nyert egy-egy csepp vérből történt.

3.3.3. Kémiai meghatározások plazmából és szérumból II. táblázat A mérésekhez használt kittek. Leptin

Kortikoszteron

Quantikine M Mouse Leptin Immunoassay kit (R&D

Systems, Minneapolis, MN) OcteaiaTM ELISA kit (Immunodiagnostic Systems Ltd, Boldon, UK)

Triglicerid

GPOL-PAP kit (Roche, Svájc)

Koleszterin

CHOD-PAP kit (Roche, Svájc)

HDL

HDL-Chol kit (Randox, Anglia)

Tesztoszteron

Ösztradiol

humán 125I RIA kit (IZINTA, RK-61M, Budapest) humán elektrokemilumineszcens immunkitElecsys (Roche, Svájc)

42

Minden mérési módszer esetében a gyártó által megadott, a kit leírásában szereplő utasításokat követtük és a mérési határokat betartottuk.

3.4. Szövetből történő hormonszint meghatározások Szövetből – here és mellékvese – történő szteroid mérések esetén a szöveteket homogenizáltuk, di-klór-metánnal extraháltuk, majd papír kromatográfiával választottuk el a szteroidokat, hogy a különféle szteroidok közötti esetleges keresztreakciókat kiküszöböljük a RIA mérések során. Nagy specificitású antiszérumokat használtunk, a RIA intra- ill. interassay variációs koefficiense 7%-16%, ill. 5%-11% volt.

3.5. Az elvégzett kezeléseknél használt anyagok 3.5.1. L-hisztidin kezelés A hipotalamikus neuronális hisztamin koncentráció megnövelése érdekében L-hisztidint (0,1 mg/g testsúly 0,2 ml fiziológiás sóoldatban (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) adtunk 2,5 órával az állatok perfúzióját megelőzően (200 mg, 24 h).

3.5.2. Leptin kezelés Leptint 1 mg/kg testsúly, ill 5 mg/kg testsúly koncentrációban, 0,2 ml fiziológiás sóoldatban adtunk intraperitoneálisan a perfúziót megelőzően 30 vagy 120 perccel.

3.6. Morfológiai vizsgálatok 3.6.1. Zsírszövetek morfológiai vizsgálata Az epididimalis és a barna zsírszövet morfológiai vizsgálatához a szöveteket tömegmérést követően egy éjszakán át Bouin’s fixálóban fixáltuk, dehidráltuk és paraffinba ágyaztuk. Szánkamikrotómmal 10 µm-os metszeteket készítettünk, melyeket hematoxilin-eozin festéssel festettünk.

3.6.2. Here morfológiai vizsgálata Fénymikroszkópos vizsgálatainkhoz a testist paraffinba ágyaztuk, metszettük és hematoxilin-eozinnal festettük. A here elektronmikroszkópos vizsgálatához egy kis darab szövetet 16 órán át fixáltunk Karnowsky fixálóval, majd két órán át poszt-fixáltuk ozmium-tetroxiddal, majd Araldite-ba ágyaztuk.

43

3.7. Perfúzió és a szövetek kezelése Az állatokat intraperitoneálisan adott 50 mg/ testsúly kg pentobarbitállal (Nembutal, Phylaxia-Sanofi) közvetlenül perfúzió előtt túlaltattuk. A tűt a mellkas megnyitása után a szív csúcsánál megvágva vezettük be. Az ereket az aortán keresztül fiziológiás sóoldattal átmostuk, majd 20 percen keresztül 50-100 ml jéghideg paraformaldehides fixálóval (4% paraformaldehid, 0,1M borát pufferben, pH: 9,5) áramoltattuk át. Az állatokból kiemelt agyakat 4 oC-on 3 órán át 10%-os cukros fixálóban utófixáltuk, majd egy éjszakán át 10%-os cukros foszfát pufferben (0,1 M) tároltuk. Az agyból frontális síkban, fagyasztó mikrotómon 20-25 µm-es metszeteket készítettünk, melyeket fagyálló folyadékban (0,05 M nátrium-foszfát puffer, pH=7,2; 30% etilénglikol; 20% glicerin) gyűjtöttünk és felhasználásig -20 oC-on tároltunk. A hisztamin immunhisztokémia erősítése érdekében az állatoknak a perfúzió előtt 2 órával ip L-hisztidint injektáltunk. Hisztamin immuncitokémia esetén az L-hisztidin beadását követően, Wang és mtsa által leírt módszert módosítva (Wang QP és Nakai Y, 1996) perfundáltuk az egereket. A fiziológiás sóoldattal történt átmosást követően 30 ml 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimiddel (4% EDCDI, 0,1 M foszfát pufferben), majd 50 ml 2%-os paraformaldehiddel, 20 ml 4%-os EDCDI oldattal és 100 ml 4%-os paraformaldehiddel perfundáltunk.

3.8. Fehérje szintű vizsgálatok 3.8.1. Immunhisztokémia Immunhisztokémiai vizsgálatokat szabadon (közös tálcában) úszó metszeteken végeztük. A fagyálló folyadék eltávolítására KPBS oldatban (0,1 M K-foszfát puffer, pH=7,2) mostuk a metszeteket, majd az endogén peroxidáz gátlására 0,3%-os H2O2 oldatot alkalmaztunk. Az aspecifikus fehérjekötések elkerülése végett egy órán keresztül 2%-os normál kecskeszérummal (NGS) inkubáltunk. A primer antitesttel 2472 órán át 4 oC-on inkubáltunk. Ezt követte a szekunder ellenanyaggal (biotinilált antirabbit, 1:1000, Vector, azidos (0,05%) primer higítóban (0,3%-os Triton-X-100, KPBS oldatban oldva), majd az avidin-biotin komplexszel (Vectastain Elite kit, Vector, Burlingame, CA) történő inkubáció 1-1 órán keresztül, szobahőmérsékleten. A lépések között KPBS oldattal mostuk a szöveteket. A diaminobenzidines reakció előtt Naacetáttal (0,1 M, pH=6) kezeltük a szöveteket, az előhívásnál kromogénként 3,3’-

44

diaminobenzidint (0,5 mg/ml DAB, Sigma) használtunk, és a reakció erősségét nikkelammónium-szulfáttal (1,5%) intenzifikált peroxiddal (0,03%) hívtuk elő. A metszeteket króm-timsós zselatinnal (1%) fedett tárgylemezre húztuk, majd dehidrálás után DePeXszel (SERVA) fedtük le. A p-STAT3 immunhisztokémiai reakciót Münzberg és mtsai leírása alapján (Munzberg H és mtsai, 2003) végeztük. Az úsztatott metszeteket 1%-os NaOH-val, 1%-os H2O2vel, 0,3%-os glicin oldattal és 0,03%-os SDS oldattal előkezeltük, és ezután 3%-os kecskeszérummal inkubáltuk egy órán át. A normál szérumos kezelést követően az úsztatott metszeteken a fentebb leírt immunhisztokémiai protokollt követtük. Immuncitokémiához használt antitestek: Az antitesteket primer higítóban (KPBS, 0,003% Triton X-100, Na-azid) használtuk. c-Fos: Nyúlban, a humán c-Fos fehérje N-terminális fragmentje ellen termeltetett ellenanyag (#sc-52, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Ez az antitest a cég leírása alapján nem ad keresztreakciót sem FosB-vel sem Fra-2-vel. Használt munkahigítás: 1:20000, inkubációs idő: 4 oC-on 48-72 óra. Hisztamin: Nyúlban termeltetett, hemocianiddal és karbodiimiddel konjugált hisztamin elleni antitest (Dr. P. Panula, Turku, Finnország). Használt munkahigítás: 1:50000, inkubációs idő: 4 oC-on 48-72 óra. p-STAT3: Nyúlban termelt monoklonális antitest (Tyr705) (D3A7, Cell Signaling). Nem ad keresztreakciót p-EGFP-vel, sem más tirozinon foszforilált STAT proteinnel. Használt munkahigítás: 1:3000, inkubációs idő: 4 oC-on 24 óra.

3.8.2. Western blot analízis Western blot segítségével határoztuk meg a barna zsírszövet UCP-1 fehérje szintjét. A barna zsírszövetet kloroform:metanol (2:1 arányú) elegyében extraháltuk, majd ugyanezzel a keverékkel háromszor mostuk. A mintákat vákuum bepárlón beszárítottuk, 1 ml desztillált vízben vettük fel, majd ultrahanggal homogenizáltuk. A fehérje koncentrációját BCA reagens (Sigma, Budapest) segítségével határoztuk meg. A mintákhoz 3 ml acetont adtunk, -70

o

C-on fagyasztottuk, majd centrifugálva

precipitáltuk. A barna zsírszövetből így kivont és vákuum szárított fehérjét minta pufferben (0,0625 M Tris-HCl, 2% SDS, 10% glicerin, 5% 2-merkaptoetanol, pH=6,8) vettük fel, úgy, hogy a végkoncentráció 2 µg/µl fehérje legyen.

45

A mintákat 12%-os akrilamid gélen méret szerint elválasztottuk, majd semi-dry blot készülék segítségével nitrocellulóz membránra vittük. 1%-os tejporos (sovány, amerikai) blokkolást követően olyan nyúlban termelt UCP-1 antitestet (1:1000; Barbara Cannon, Stockholm University, Stockholm, Svédország) használtunk, mely nem ad keresztreakciót UCP-3 fehérjével. A láthatóvá tételt ECL plus kit (Pierce Biotechnology, USA) segítségével, a hívásidő optimalizálásával végeztük.

3.9. Génexpressziós vizsgálatok 3.9.1. In situ hibridizáció 3.9.1.1. A szonda készítés menete Doktori munkám részeként elkészítettük az egyik általunk in situ hibridizációhoz használt szondát (HDC szonda). A tervezés és készítés menete az Eredmények fejezet részeként kerül tárgyalásra. Itt olyan módszertani részletek szerepelnek, melyek részletesebb tárgyalást kívántak. RNS izolálás, cDNS készítés, fragment előállítása PCR segítségével A szondához RNS-t preparáltunk. Esetünkben WT hím CD1/129Sv hátterű egereket dekapitáltunk, majd hipotalamuszukat gyorsan, szárazjégen fagyasztottuk, és ebből RNS-t izoláltunk (lsd. módszerek: RNS preparálás). A degradáció mértékének megállapításához az RNS mintákat gélben méret szerint elválasztottuk. A nem degradálódott mRNS-ről ún. komplementer DNS-t (cDNS) szintetizáltunk, az átírásához reverz transzkriptáz enzimet (Qiagen) használtunk. A reverz transzkriptáz enzimnek többféle enzimatikus aktivitását is felhasználtuk a cDNS szintetizálásához, melyek a következők: RNS függő DNS-polimeráz, hibrid függő exoribonukleáz (RNáz H; az RNS:DNS hibridből csak az RNS emésztése történik meg) és DNS függő DNS polimeráz. Az általunk felhasznált kit: Omniscript Transcriptase kit (Qiagen) volt és oligo dT primert használtunk. A cDNS minőségét β-aktin PCR-rel ellenőriztük. A β-aktin a sejtekben konstitutívan expresszálódik és nagy mennyiségben van jelen. A felhasznált primer pár: actin_for: 5’-AGC TGA GAG GGA AAT CGT GC-3’ actin_rev: 5’-GAT GGA GGG GCC GGA CTC AT-3’

46

A cDNS-ről „touch down PCR” alkalmazásával megfelelő mennyiségű HDC PCR fragmentet kaptunk. Ebben a reakcióban Pfu polimeráz enzimet használtunk, így tompa vége keletkezett a fragmentnek. A fragmentre Taq polimeráz segítségével poly-A „farkat” tettünk, mely segítségével a pGEM-T Easy Vector plazmidba könnyen ligálható. HDC_for: 5’-GAG GCA GGT GAC TCC AAA TG-3’ HDC_rev: 5’ –AAA TCA AGC CAG CCT TCT CC-3’ PCR fragment izolálása az agaróz gélből A DNA extraction kit (Fermentas) segítségével „nyertük ki” a HDC DNS fragmentet az agaróz gélből, megtisztítottuk a PCR reakcióból még jelen levő dNTP, primer és enzim maradványoktól és betöményítettük. A szondánk méret szerinti elválasztása TAE (40 mM Tris-acetát, 1 mM EDTA, pH=8) agaróz gélben történt (a TBE puffer gátolhatja a DNS üveghez kötődését.) A PCR termékekkivágása a gélből minimális UV használat mellett történt. A kit leírás alapján, módosított Vogelstein & Gillespie protokoll szerint dolgoztunk. PCR fragment ligálása plazmid vektorba A HDC PCR fragment ligálása pGEM-T Easy vektorba történt, T4 DNS ligáz segítségével, mivel a PCR fragmentünk poly-T végekhez „tapasztható” (8. ábra). Ez a plazmid hordozza az ampicillin rezisztencia gént, alkalmas a rekombinánsok felismerésére az ún. kék/fehér szelekció réven (a PCR termék LacZ génbe épül be), számos enzim hasítóhelyét hordozza a ligáló hely közelében és tartalmaz ellentétes irányultságú T7 és SP6 RNS polimeráz transzkripciós promótert (és „initiation site”-ot), mely lehetővé teszi az in vitro transzkripciót. Ez utóbbi szükséges az in situ hibridizációhoz használt jelölt szondánk (próbánk) elkészítéséhez.

47

8. ábra pGEM-T Easy vektor sematikus képe a ligálóhely környékén található enzimatikus vágási helyekkel. Felhasznált kit: pGEM-T Easy Vector Systems (Promega). A leghatékonyabb ligálás érdekében T4 DNS ligáz enzimmel 3:1 ligálandó PCR termék és pGEM-T Easy Vektor közötti arányt használtunk. Transzformálás, plazmid DNS bejuttatása E. coliba A transzformáláshoz az Escherichia coli DH5α baktériumtörzset használtuk. A kompetens sejtekhez a plazmid DNS-t 10-50 ng mennyiségben adtuk (30 perces kezelés jégen), majd hősokk kezelést alkalmaztunk (1 perc 42 oC és utána újra 0 °C, jégen). A baktérium tenyészetet egy órán át SOC médiumban, 37 oC-on rázatva növesztettük. A baktériumok szélesztése különböző koncentrációkban ampicillines LB lemezekre, XGal és IPTG hozzáadásával történt. Kék/fehér szelekcióval olyan egyedi telepeket választottunk, melyek nagy valószínűséggel hordozzák a fragmentünket tartalmazó plazmidot. DNS izolálás plazmidból: miniprep és midiprep módszerek A plazmidot hordozó baktérium felnövesztése folyadék kultúrában történt. A szélesztett lemezről fogpiszkálóval egy-egy fehér (azaz LacZ gén tartalmazza a PCR terméket)

48

telepet emeltünk le és 37 oC-on, egy éjszakán át szaporítottuk a baktériumot ampicillint tartalmazó ~2 ml LB rázatott (250 rpm) kultúrában. A plazmid tisztításához a Wizard Plus Minipreps DNA-Purification System kit-et (Promega) használtunk. Nagy ozmolaritású oldat (50 mM gükóz, 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA) hatására a baktériumok sejtfala szétesik. A plazmid DNS kinyerésére az ún. SDS-lúgos (alkalikus) lízis módszert alkalmaztuk, mely alapja, hogy a cirkuláris plazmid DNS és a kromoszomális DNS különböző denaturációs és renaturációs tulajdonságokkal rendelkezik. Lúgos közegben (pH=11) mind a plazmid, mind a kromoszómális DNS denaturálódik. Ezt követő gyors neutralizáció hatására a kromoszómális DNS oldhatatlan aggregátumot képez, míg a plazmid DNS oldatban marad. Jégen a neutralizáció során a kromoszómális DNS mellett a nagy molekulatömegű RNS és a kálium/SDS/fehérje/membrán komplex is precipitálódik, így centrifugálással, majd szűréssel elválasztható a szolubilis plazmid DNS és az aggregátum. A plazmid enzimatikus emésztésével határoztuk meg a beépülés irányát. Olyan enzimet választottunk, mely belehasít a PCR fragmentünkbe és különböző nagyságúra hasítja a különböző irányban beépült PCR terméket tartalmazó plazmidot. Ahhoz, hogy az in situ hibridizációhoz megfelelő mennyiségű HDC fragmentet tartalmazó plazmidot kapjunk, a plazmidot hordozó baktériumtenyészetet nagyobb mennyiségben (100 ml LB-ben) növesztettük fel. Ún. „midiprep” segítségével nyertük ki és tisztítottuk a plazmidot. A plazmid izolálásának elve megegyezik a miniprepnél említettekkel. Az így nyert nagyobb mennyiségű plazmid egy részét in situ hibridizációhoz a megfelelő enzimmel linearizáltuk. Az in situ hibridizációhoz a kérdéses intron vagy exon szekvenciát is tartalmazó transzkripciós vektorokat linearizáltuk és in vitro transzkripció során RNS polimerázzal (T3, T7, SP6) antisense irányba írtuk át. A szonda jelölése, készítés menete Szondáinkat uridin 5’-[α-35S] trifoszfáttal (α-35S-UTP-vel, α-35S-ATP-vel, ill. ezek kombinációjával) jelöltük (NEN, USA). Jelölésenként 50-100 µCi α-35S-UTP-t (vagy ATP-t) vákuumbepárlón szárítottunk be, ehhez RNáz inhibítort és DTT jelenlétében jelöletlen nukleotid keveréket (2 mM-2 mM; rGTP, rATP, rCTP) adtunk, majd RNSpolimeráz segítségével a DNS templátról (250 ng/µl) ribonukleotid szondát

49

készítettünk. A jelölt szonda radioaktivitását szcintillációs spektrofotométeren (LKB Wallach, USA) mértük. A próbát hibridizációs oldatban (50% formamid; 0,3 M NaCl; 10 mM TrisHCl, pH 8; 1 mM EDTA, pH=8; 1x Denhardt’s oldat; 10% dextrán szulfát; 0,5 mg/ml élesztő tRNS). 1x107 dpm/ml koncentrációban vettük fel, és -70 oC-on tároltuk. Max. 2-3 hétig használtunk egy-egy próbát a jelölést követően. A hibridizáció menete A perfundált állatokból származó metszetekből a fagyálló folyadékot KPBS-es mosással távolítottuk el, 4%-os bóraxos fixálóval utófixáltuk, majd ismételten KPBS-sel mostuk. A metszeteket szilánnal (3-amino-propiltrietoxiszilán) bevont tárgylemezre húztuk, és egy éjszakán keresztül száradni hagytuk. A hibridizációt és az autoradiográfiát Simmons és mtsai leírása alapján végeztük (Simmons DM és mtsai, 1989; Spangelo BL és mtsai, 1994). Röviden összefoglalva: a metszeteket proteináz-K oldatban (10 mg/ml proteináz-K, 50 mM TrisHCl, pH=8; 5 mM EDTA) emésztettük, acetiláltuk és dehidráltuk (50%, 70%, 95%, 100% etanol sor). A tárgylemezekre 107 dpm/ml radioaktivitású próbát (100 µl) pipettáztunk, a metszeteket fedőlemezzel fedtük és 5658oC hőmérsékleten egy éjszakán keresztül végeztük a hibridizációt. Másnap RNáz-Aoldattal (10 mg/ml RNáz-A; 0,5 M NaCl; 10 mM TrisHCl, pH=8; 1 mM EDTA, pH=8) elbontottuk a nem, illetve részlegesen hibridizált RNS-t, majd fokozatosan csökkentve a sókoncentrációt (SSC oldatban; 1x SSC: 0,15 M NaCl, 15 mM nátrium-citrát puffer, pH=7) a nem specifikus, false hibrideket magas hőmérsékletű mosással elimináltuk, majd a metszeteket ismételten dehidráltuk. A poszthibridizációs lépések után a lemezeket száradni hagytuk, majd 24-48 órára Amersham β Max filmet vagy Image Plate lemezt raktunk rá. A filmet D-76 hívóban hívtuk elő. Az Image Plate lemezt FLA-3000 Phosphoimager készüléken, BAS Reader (3.01) segítségével olvastuk le, és a készülék saját programjával (AIDA) értékeltük. A mikroszkópon történő értékeléshez a metszeteket zsírtalanítottuk (96%, 100% etanol, xilol) és sötét szobában NTB-2 (Kodak) emulzióval vontuk be. Az emulziós lemezeket az előhívásig fénytől elzárva, 4 oC-on tartottuk. A lemezeket D-19 hívóval hívtuk elő, 3,5 perces hívási időt alkalmazva. A kiértékelést szemikvantitatív denzitometriás analízissel végeztük az NIH Image software felhasználásával. Világos látótérben Nissl-festéssel jelöltük ki az értékelendő szubdiviziókat, majd sötét látótérben mértük a denzitást.

50

Felhasznált szondák (próbák) HDC ribonukleotid próba I: 543bp PCR-fragmentet klónoztak pCRII TOPO (Invitrogen) plazmidba (Dr. Liposits laboratóriuma). Az antisense ribopróbához a plazmidot EcoRI-el (Not I) enzimmel linearizáltuk és SP6 RNS-polimerázzal szintetizáltuk meg a próbánkat. HDC ribonukleotid próba II: Ezt a plazmidot én készítettem. A HDC gén 121-650 bp közti szakaszát klónoztuk pGEM T Easy vektorba. Az antisense ribopróbához a plazmidot Pst I enzimmel linearizáltuk és T7 RNS-polimerázzal szintetizáltuk meg a próbánkat. A sense ribopróbához a plazmidot Sac II enzimmel linearizáltuk és SP6 RNS polimerázzal szintetizáltuk a saját próbánkat. GnRH ribonukleotid próba: A teljes patkány GnRH cDNS-ből 330 bp fragmentet klónoztak p65T7 plazmindba. Az antisense ribopróbához a plazmidot BamHI-el enzimmel linearizáltuk és az így kapott templátról T3 RNS polimerázzal szintetizáltuk meg a próbánkat. A POMC gén 926 bp hosszúságú fragmentjét tartalmazó plazmid Dr. J Eberwine laboratóriumából (University of Pennsylvania, PA, USA) származik. A POMC cDNS 1337 nukleotidját pBluescript vektorba klónozták. A plazmidot Hind III restrikciós enzimmel hasítottuk és T3 RNS-polimerázzal (Promega) szintetizáltuk

35

S UTP-vel

jelölt antisense ribopróbákat. Az NPY ribonukleotid próba: Az NPY ribonukleotid próba készítéséhez használt plazmidot Dr. S. Sabol (NHLBI, Bethesda, MD, USA) bocsájtotta rendelkezésünkre. A preproNPY cDNS teljes, 511 bázispárt tartalmazó szakaszát klónozták a Bluescript (Stratagene, USA) transzkripciós vektor EcoRI helyére. A plazmidot PvuII restrikciós enzimmel linearizáltuk és ezt használtuk az in vitro transzkripcióhoz, melyben az antisense próbát T3 RNS-polimeráz (Promega) enzimmel jelöltük. Orexin ribonukleotid próba: Az orexin ribopróba készítéséhez használt plazmid P. Sawchenko (Salk Institute, város, CA, USA) laboratóriumából származott. Az orexin

51

cDNS 290 bázispárt tartalmazó szakaszát klónozták a Bluescript II SK+/- (Stratagene, USA) transzkripciós vektor EcoR I- BamH I hasítóhelyek közé. A plazmidot EcoR I restrikciós enzimmel linearizáltuk és T3 RNS polimerázzal (Promega) szintetizáltunk 35

S UTP-vel jelölt antisense ribopróbákat.

3.9.2. Northern blot analízis 3.9.2.1. RNS izolálás A barna zsírszövetből Chomczynski-féle módszerrel (Chomczynski P és Sacchi N, 1987) izoláltunk RNS-t. A meghatározott tömegű szövetet savas guanidin-tiocianát oldatban (4 M guanidin-tiocianát; 25 mM Na-citrát; pH=7; 0,5% szarkozil; 0,1M 2merkaptoetanol) üvegpotterrel homogenizáltuk (100 mg szövet/1 ml oldat). Az RNS oldatot először fenol, majd fenol/kloroform keverékével, végül kloroformmal extraháltuk. A vizes fázisból az RNS-t izopropanolos precipitálással nyertük ki, az RNS oldatot egytized térfogat 3 M nátrium-acetáttal (pH=5,2) és két térfogat izopropil alkohollal -20ºC-on kicsaptuk (min. 1 óra), majd centrifugáltuk (10 perc, 13000 rpm, 4ºC). Az RNS csapadékot 70%-os alkohollal mostuk, majd újra centrifugáltuk. Az alkohol

leszívása

után

az

Eppendorf-cső

alján

kapott

fehér

csapadékot

vákuumszárítóban szárítottuk. Az RNS csapadékot annyi DEPC-tal (dietil-pirokarbonát) kezelt desztillált vízben oldottuk, hogy végkoncentrációja 1-3 µg/µl legyen. 3.9.2.2. Northern blot készítés Először 20 µg teljes RNS-t méret szerinti választottunk szét, 1,2%-os agaróz és 8%-os formaldehid tartalmú denaturáló gélen. A méret szerint elválasztott RNS-eket kapilláris transzferrel Hybond N (Amersham, Nagy-Britannia) típusú membránra vittük át és UV besugárzással irreverzibilisen a membrán felületéhez kötöttük. A deoxicitidin 5’-[α-32P] trifoszfáttal (32P-dCTP) (Izotóp Intézet) radioaktívan jelölt specifikus kettősszálú DNS fragmenteket

(Multiprime

Labeling

Kit,

Amersham,

Nagy-Britannia)

„keresőmolekulákként”, szondákként („próba”) használtuk annak eldöntésére, hogy a vizsgált RNS (UCP-1) a barna zsírszövet mintákban milyen mennyiségben van jelen. A filtereket 42 ºC-on 4 órán keresztül előhibridizáltuk (50v/v% formamid, 6x SSC, 5x Denhardt oldat, 0,5% SDS, 50 mM nátrium-foszfát puffer, 100 µl (10 mg/ml) t-RNS, 10 µl (10 mg/ml) poliU-homopolimer, 75 µl (10 mg/ml) denaturált lazac-sperma DNS), majd a radioaktív szondák jelenlétében 10 ml hibridizációs oldatban 42 ºC-on egy

52

éjszakán át hibridizáltattuk. A radioaktív szondákat 0,5-1x 106 cpm/ml koncentrációban alkalmaztuk. A filtereket szobahőmérsékleten kétszer mostuk: 5 percig 2x SSC/0,1% SDS oldattal, majd 30 percig 68 °C-on 0,2x SSC/0,1% SDS oldattal. Mosás után a filtereket folpackba csomagoltuk és kazettában, röntgen filmet (Sigma, Kodak XAR, USA) ráhelyezve, -70 ºC-on több napig exponáltuk. A filmeket előhívás után a géldokumentációs kiértékelésekhez

rendszer a

segítségével

ScionImage

digitalizáltuk.

képanalizáló

programot

A

denzitometriás

(ScionImage,

Scion

Corporation) használtuk. Felhasznált szondák (próbák) UCP-1 szonda: A patkány UCP-1 680 bp cDNS fragmentet klónoztak Bluescript SK+ plazmidba (Barbara Cannon, Stockholm University, Stockholm, Svédország), amit Bgl II, Pst I (Promega) enzimmel vágtunk ki.

β-aktin szonda: 498 bp PCR termék, mely a patkány komplett aktin cDNS 690bp1188bp közti szakaszát tartalmazza forrás: (gi|38648901|gb|BC063166.1|) actin_for: 5’-AGC TGA GAG GGA AAT CGT GC-3’ actin_rev: 5’-GAT GGA GGG GCC GGA CTC AT-3’

3.9.3. Real-Time PCR – Valósidejű PCR Vizsgálatainkban Real-Time PCR technikával mértük a háromféle zsírszövet: az epididimalis, a subcutan és a barna zsírszövet leptin-expresszióját, valamint a hipotalamusz és máj leptin-receptor expresszióját a szövetekben található mRNS mennyisége alapján. Ez a módszer kvantitatív méréseket tesz lehetővé, szemben a hagyományos PCR-rel. A mérésekhez az állatok zsírszöveteiből, a hipotalamuszból és a májból RNS-t izoláltunk. A vizsgálandó szöveteket a dekapitálás után gyorsan, RNáz mentes eszközökkel preparálva, szárazjégre emeltük ki. Felhasználásig a –70 oC-on tároltuk. RNS izolálása A Sigma protokollnak megfelelően adott mennyiségű szövetet arányos mennyiségű TRI (SIGMA) reagenssel homogenizáltunk, majd kloroform és izopropanol adásával történt az RNS kicsapása, a protokollban leírtak szerint. Az RNS minőségét minden alkalommal gélelektroforézissel ellenőriztük.

53

cDNS készítés Az RNS mintákból reverz transzkiptázzal, ribonukleáz inhibítor jelenlétében, PCR készülékben állítottunk elő cDNS-t (RevertAid First Strand cDNS Kit, Fermentas). Az alkalmazott programban 25 °C-on, 10 percig (primer kapcsolódás), 42 °C-on 60 percig (átíródás) és 70 °C-on 10 percig (leállítás) folyt a cDNS készítése. PCR reakció A kapott cDNS-ből a vizsgálandó génexpresszió mennyiségi mérését Taq-man próba használatával végeztük, ABI PRISM 7700 Sequence Detector System készülékben, 96lyukú plate-en (Applied Biosystem, Branchburg, NJ, USA). Az ABI saját leírása (User Bulletin #2) alapján készítettük elő a mintákat és értékeltük az eredményeket. A folyamat paraméterei a következők voltak: 50 °C 2 perc, 95 °C 10 perc, majd 40 ciklusban 95 °C 15 másodpercig és 60 °C 1 percig. Endogén referenciaként a GAPDH expresszióját vettük alapul. A küszöbérték (ciklusszám, Ct) azt mutatja meg, hogy az mRNS amplifikáció hányadik ciklusban ért az exponenciális fázisba. A GAPDH ciklusszám-átlagát vontuk ki a vizsgált szövethez tartozó cikluszám-átlagból (∆Ct), majd ehhez számoltunk standard deviációt (SD; SD=√(S12+S22)). Rövid, 150 bp-nál kisebb PCR termékek esetében az exponenciális szakaszon véve a küszöbértéket a következő képletet használtuk: 2-∆∆Ct (lásd melléklet).

3.10. Statisztikai analizis A statisztikai analízishez a STATISTICA 6.0 programcsomag ANOVA (analysis of variance) programját használtuk. Több esetben (súly méresek, in situ hibridizációs hisztokémiai értékek), ahol csak két csoportot hasonlítottunk össze, az egyes csoportok közti szignifikancia ellenőrzése t-próbával történt, több csoport összehasonlításánál pl. Real-Time PCR vizsgálatoknál, enzim méréseknél ANOVA-t, és azt követő Dunnett post hoc tesztet alkalmaztunk. Az előkezeléseket (inzulin, glukóz) követő sorozatos vérvételek esetében ismételt méréses varianciaanalízist használtunk. Amennyiben pérték kisebb volt, mint 0,05, akkor szignifikánsnak tekintettük az adatsorok közti eltérést.

54

4. Eredmények 4.1 HDC szonda tervezése, készítése és jellemzése HDC primerek megtervezése Az egér HDC gén teljes mRNS és teljes cDNS szekvenciája megtalálható a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide internetes adatbázisban, száma: gi|4008135|gb|AF109137.1|AF109137[4008135]. Ez alapján terveztük meg szondánkat (próbánkat), és úgy választottuk meg, hogy több fajra is használható legyen, így az egéren kívül patkány, illetve humán mintán is elvégezhető legyen az in situ hibridizáció. Ehhez a BLAST program segítségével homológia vizsgálatot készítettünk az egér, a patkány és a humán HDC mRNS-ek között. Az egér HDC gén 121-650 bp közötti szakaszát választottuk, amely nagyfokú homológiát mutatott a patkány és emberi mRNS génszakasszal. A kiválasztott cDNSszakaszra Primer3 programmal terveztünk primereket (http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi),

és

ezeket

Primer

Finder

(http://arep.med.harvard.edu/cgi-bin/PrimerFinder/) program segítségével ellenőriztük. Kiválasztott primereink a következők voltak: HDC_for: 5’-GAG GCA GGT GAC TCC AAA TG-3’; Tm 59.4 oC HDC_rev: 5’ –AAA TCA AGC CAG CCT TCT CC-3’; Tm 57.3 oC Az oligoprimereket a MWG Biotech AG szintetizálta. A primer párral határolt próba 529 bp hosszúságú. Vad típusú, CD1/129Sv hátterű hím egerek hipotalamuszából RNS-t izoláltunk. Az RNS méret szerinti elválasztáskor megjelenő két sáv (band) a legnagyobb mennyiségben jelen lévő RNS-ek mennyiségi aránya (2:1), ill. a diszkrét sávok elkülönülése igazolja, hogy az RNS nem degradálódott (9. ábra).

9. ábra Az RNS minőségének vizsgálata gélelektroforézissel. RNS méret szerinti elválasztásakor a legnagyobb mennyiségben jelenlévő 28S és 18S RNS-ek jól láthatók. Ezek mennyiségi aránya és a diszkrét sávban (band) láthatósága mutatja, hogy nincs degradáció.

55

Az mRNS mintákról átírt komplementer DNS (cDNS) minták PCR vizsgálata során kontrollként β-aktin kifejeződését mértük. Kapott eredményeinkben a cDNS jó minőségét jelzi, hogy a sejtváz-fehérje stabilan expresszálódik a mintáinkban (10. ábra).

10. ábra A cDNS minőségének ellenőrzése WT hím CD1/129Sv hátterű egerekben A gélen történt molekulasúly szerinti elválasztás alapján a várt közel 500 bp-os PCR terméket megkaptuk β-aktin primerek felhasználásával (1%-os agaróz gél). Az így ellenőrzött cDNS-mintákból touch down PCR alkalmazásával megfelelő mennyiségű HDC PCR fragmentet szintetizáltunk. A keletkezett termék körülbelül 500 bp hosszúságú, minőségét agaróz gélen ellenőriztük (11. ábra).

11. ábra A touch down PCR alkalmzásával szintetizált HDC fragmentek minőségi ellenőrzése agaróz gélen. Az általunk tervezett primerek felhasználásával egyetlen, kb. 500 bp hosszúságú termék keletkezett (1%-os agaróz gél). A HDC DNS-fragmentet kivágtuk az agaróz gélből, és DNA extraction kit segítségével megtisztítottuk. A HDC PCR fragment ligálása pGEM-T Easy vektorba történt, T4 DNS-ligáz enzim segítségével, a GEM-T Easy Vector Systems (Promega) protokoll leírása alapján. A HDC fragmentet tartalmazó plazmidot kompetens E. coli DH5α baktérium törzsbe transzformáltuk. A telepeket ampicillint tartalmazó (Xgal-t és IPTG-t is tartalmazó) lemezen növesztettük. A további munkához kék/fehér szelekcióval olyan egyedi telepeket választottunk, melyek nagy valószínűséggel hordozzák a HDC fragmentünket tartalmazó plazmidot is. A valószínűsíthetően HDC PCR-fragmentet tartalmazó plazmidot hordozó baktériumok felnövesztése LB folyadék kultúrában történt, majd a plazmid DNS-t úgynevezett Minipreppel tisztítottuk. Gélelektroforézissel ellenőriztük a beépülés megtörténtét (12. ábra).

56

12. ábra A HDC-fragment plazmidba épülésének ellenőrzése gélelektroforézissel. A kontrollként használt „üres”, inzertet nem tartalmazó plazmid (Pl) mérete kisebb, mint a fragmentet is tartalmazó plazmidok mérete. A 12 és 17 számú plazmidba nem történt meg a beépülés. Futtatás 1,2%-os gélen történt (M: molekulasúly marker). A HDC PCR-termék plazmidba történő beépülése két irányban lehetséges. A sikeres beépülések közül pár darabot kiválasztottunk és beépülés irányának megállapításához enzimatikus emésztéssel hasítottuk a plazmidot, úgy választva enzimet, hogy a HDC PCR fragmentünket is vágja (13. ábra). Az emésztés eredményét gélelektroforézissel ellenőriztük (14. ábra). BclI 3492 SphI 3433 BglI 3391 ScaI 3314

SpeI 5 Pv uII 280 SapI 335

3002 Pv uII 3078 SacII Av aI 3064 Sty I NcoI BglI BglI SphI AatII ApaI T7 Pv uII 2844 2966 BglI 2783 lacZ1

25 PstI AccI HincII SalI SacI BstXI 52

SP6 lacZ2

NaeI 2646 fi DraIII 2540

b-lac BsaI 1418 BglI 1465 XmnI 1946 ScaI 1829

13. ábra A HDC PCR-terméket tartalmazó plazmid a Bgl I enzimmel történt enzimatikus hasítás hatására a beépülés irányának megfelelően különböző hosszúságú DNS darabokra vágódik. A képen látható plazmid 1318 bp, 206 bp, 3 bp, 414 bp és 1606 bp nagyságú fragmentekre esik szét. A fordított irányú fragment beilleszkedés esetén Bgl I enzimmel történt vágásakor 1318 bp, 206 bp, 3 bp, 157 bp és 1863 bp nagyságú fragmenteket kaptunk. A sötétkék vonal jelzi a HDC PCR fragment beépülési helyét, a zöld vonalak a BglI emésztési helyeket.

57

20

21

Pl

M

2000bp 1500bp 500bp 200bp

14. ábra Plazmidunk vágása Bgl I enzimmel. A futtatási kép bizonyítja, hogy a 20-as számú plazmidban a HDC PCR fragment beépülése ellentétes irányultságú, mint a 21-es számú plazmidban (12. ábra 21-es minta irányát mutatja). Pl: vágatlan plazmid, M: molekulasúly marker. A molekulasúly szerinti elválasztás 1,2% agaróz gélen történt.

A BglI enzimmel történt vágási kép azt is megmutatja, hogy a HDC in situ hibridizációhoz használva a 20-as számú plazmidról sense szondát (próbot) kapunk, ha SP6 RNS-polimerázt használunk, és antisenset, ha T7 RNS-polimerázzal íratjuk át, ugyanakkor a 21-es számú plazmidról sense szondát (próbot) kapunk, ha T7 RNS polimerázt használunk, és antisenset, ha SP6 RNS polimerázzal íratjuk át. Az SP6 RNS polimerázzal dolgozva a plazmidot hasíthatjuk ApaI, AatII, NcoI vagy SacII enzimekkel, ill. T7 RNS-polimerázzal dolgozva a plazmidot hasíthatjuk SpeI, PstI, SalI, NdeI, SacI, BstXI, vagy NsiI enzimekkel, hogy szondánkat megkapjuk. A hisztaminerg neuronok kimutatása egér hipotalamuszban in situ hibridizációs hisztokémiával történt. Azért, hogy in situ hibridizációhoz megfelelő mennyiségű HDC fragmentet tartalmazó plazmidot kapjunk, a plazmidot tartalmazó baktériumokat nagyobb mennyiségben (100 ml LB-ben) növesztettük fel. A plazmidot ún. „midiprep” segítségével nyertük ki és tisztítottuk meg. A plazmidokat az in situ hibridizációhoz a megfelelő enzimmel emésztettük (PstI vagy SacII). Az antisense szondákkal végzett hibridizációnál a WT állatoknál a tuberomamillaris régióban HDC mRNS expressziót mutattunk ki. Az adott területen kapott pozitív reakció jól megfeleltethető az irodalomból ismert immunhisztokémiai reakcióval jelölődő területeknek. A sense szondával végzett kísérletek minden esetben eredménytelen hibridizációt mutattak. A kontrollként használt RN-ázos emésztést alkalmazva szintén nem kaptunk jelet.

58

A homozigóta HDC-/- állatok agymetszetein az általunk készített antisense szondával végzett in situ hibridizációs hisztokémiával a tuberomamillaris régióban HDC mRNS expresszió nem mutatható ki (15. ábra). 15. ábra HDC mRNS expresszió a tuberomamillaris régióban vad típusú (WT) és HDC-/- állatban. ArcP, nucleus arcuatus posterior; PMv, nucl. premamillaris ventralis; f, fornix; V3, harmadik agykamra. A HDC mRNS expresszió teljes hiánya figyelhető meg a HDC-/-egerek esetén. A mérce 200 µm-t jelöl.

4.2. HDC-/- egerek metabolikus fenotípusának jellemzése 4.2.1. Testsúly, zsírraktárak, energia egyensúly a HDC-/- egereknél A testsúly gyarapodását az elválasztást követően heti súlyméréssel ellenőriztük. Az egerek 10 hetes koráig nem figyelhető meg jelentős különbség a hisztaminhiányos és a kontroll állatok testsúlyában (10. hét: WT: 32,54±1,46 g, HDC-/-: 32,54±4,13 g; n=9; p=0,48). Később a HDC-/- állatok esetében jelentősebb súlygyarapodás figyelhető meg, 16 hetes korban már 13%-kal nagyobb a súlyuk, mint a kontroll állatoké (WT: 34,74 ± 2,16 g, HDC-/-: 39,38 ± 5,71 g; n=8; p= 0,022), és 30 hetes korukban a HDC-/- állatok már súlyosan elhízottak a vad típushoz képest (WT: 39,10 ± 1,90 g, HDC-/-: 46,40 ± 2,31 g; n=5; p= 0,0026) (16. ábra).

16. ábra WT és HDC-/-egerek testsúlygyarapodási görbeje Normál, standard tápon tartott hím kontroll (WT) és hisztaminhiányos (HDC-/-) állatok súlygyarapodási görbéje 6-35 hetes koruk között. Minden egyes ponthoz 5-10 állat tartozik.

59

Az állatok metabolikus paramétereinek részletesebb vizsgálatához 13 hetes hím egereknél egy héten keresztül naponta követtük a testsúlygyarapodásukat, és a táplálékfelvételüket, majd kiszámoltuk a kalorikus efficiencia értéket. A HDC-/- egerek testtömege annak ellenére gyorsabban gyarapodott (WT: 0,74 ± 0,3 g / hét vs. HDC-/-: 2,1 ± 0,58 g / hét) (17.A ábra), hogy kevesebb tápot fogyasztottak a vad típushoz képest (WT: 43,2 ± 1,52 g/ hét vs. HDC-/-: 40,8 ± 1,36 g / hét) (17.B ábra), így a kalorikus efficiencia értékük is szignifikánsan magasabb a kontroll csoporthoz viszonyítva (17.C ábra).

17. ábra A. 13 hetes WT és HDC-/- hím egerek testsúlygyarapodása egy hét alatt. n=10/csoport,*p <0.01 B. 13 hetes WT és HDC-/- hím egerek kumulatív táp fogyasztása egy hét alatt. n=10/csoport. C. A WT és HDC-/- egerek kalorikus efficiencia értéke. Ezt az értéket a súlygyarapodásból (A), az elfogyasztott tápanyagból (B) és a táp kalória tartalmából származtatjuk, szignifikánsan (*p<0,01) magasabb a kalorikus efficiencia értek a HDC-/- egerek esetében, n=10/csoport.

60

Az állatok boncolásánál megfigyeltük, hogy a HDC-/- egerek elhízása az epididimalis zsírszövet gyarapodásának tudható be. Méréseink szerint az epididimalis fehér és az interscapularisan elhelyezkedő barna zsírszövet mennyisége nőtt meg szignifikánsan a hisztaminhiányos állatokban (18.A ábra). Az epididimalis fehér zsírszövet szignifikáns mennyiségi növekedésével párhuzamosan a zsírszövet szerkezeti változáson is keresztülment, a sejtek mérete szignifikánsan megnőtt (WT: 329,75 ± 25,26 µm2, HDC-/-: 551,15 ± 25,56 µm2) (18.B ábra). A barna zsírszövet mennyiségi növekedésekor hisztológiai változást nem tapasztaltunk. Ugyancsak nem tapasztaltunk változást a bőralatti zsírdepók mértékében (WT: 1,18 ± 0,3 mm,HDC-/-: 1,07 ± 0,2 mm).

18. ábra Zsírszövetek mennyiségi összehasonlítása és fénymikroszkópos képe felnőtt WT és HDC-/- egerek esetében A. 12 hetesnél idősebb egereket vizsgálva, mind az epididimalis fehér zsírszövet, mind a barna zsírszövet mennyisége szignifikánsan (*p<0,01) megnőtt a hisztaminhiányos állatok esetében. n=16/csoport B. Fénymikroszkópos képek mutatják be a fehér zsírszövet szerkezetét három hónapos állatok esetében. A hisztaminhiányos (HDC-/-) egerek zsírszövetében a zsírsejtek mérete megnőtt, a zsírsejtek között sokkal kevesebb makrofág található, mint a kontroll állatoknál. A fekete nyíl a hízósejteket mutatja, a mérce 100 µm-t jelöl.

61

4.2.2.Az energia-mobilizáló képesség vizsgálata 4.2.2.1. Maghőmérséklet változása a WT és HDC-/- egereken A metabolizmus indirekt tanulmányozására ad lehetőséget a Forbes és munkatársai által javasolt protokoll, mely szerint az egereket 5 órán keresztül éheztetjük és mérjük a testsúlyváltozást. Ötórányi éheztetés következtében az állatok testsúlya 6-9%-al csökkent. Szignifikáns különbséget azonban nem tapasztaltunk a hisztaminhiányos és a kontroll állatcsoport között (WT: 2,41 ± 0,25 g, HDC-/-: 2,95 ± 0,45 g). Indirekt módon mérhetjük az energiamobilizálás képességét, ha az idő függvényében mérjük a hideg környezet hatására bekövetkező termoregulációs választ. A HDC-/- ill. vad

típusú

egerek

maghőmérsékletében

standard

körülmények

között,

szobahőmérsékleten nem volt különbség (WT: 37,50 ± 0,34oC; HDC-/-: 37,49 ± 0,29oC). Az 5 órán keresztül éheztetett egereket 4 oC-os szobába helyezve, maghőmérsékletüket félóránként mértük. 90 perc elteltével szobahőmérsékleten mért értknél szignifikánsan jobban lecsökkent maghőmérséklet a hisztaminhiányos állatoknál, mint a kontroll egerek esetében (WT: -1,34 ± 0,40 oC; HDC-/-: -3,82 ± 1,02 oC). Eredményeink azt mutatják, hogy hideg hatására a HDC-/- egerek kevésbé tudnak energiát (hőt) mozgósítani, mint a vad típusú kontroll állatok (19. ábra).

19. ábra Maghőmérséklet változása a WT és HDC-/- egereken hideg hatására A HDC-/- egerek hőmérséklete gyorsabban csökkent hideg hatására és 90 perccel a hidegszobában való elhelyezést követően már szignifikánsan (*p<0,01) alacsonyabb volt, mint a kontroll csoportnak. n=10/csoport

62

4.2.2.2. Az UCP-1 mRNS és fehérje mennyisége a barna zsírszövetben Az energiamobilizálási képességet jellemzi az uncoupling protein-1 (UCP-1, termogenin) mennyisége. Northern blot technikával kimutattuk, hogy standard laboratóriumi körülmények között (szobahőmérsékleten, normál tápon) tartott egerek esetében nincs különbség az UCP-1 gén expresszióban a hisztaminhiányos és a kontroll csoportba tartozó egerek között (20.A, B ábra). Western blot analízissel is látható, hogy a normál körülmények között tartott két állatcsoport barna zsírszövetében található UCP-1 fehérje mennyisége nem mutat szignifikáns különbséget (20.C ábra). A 18 órán keresztül hideg környezetben (4 oC) tartott állatoknál az UCP-1 mRNS mennyisége mind a HDC-/-, mind a kontroll állatok esetében növekedést mutatott. A hideg hatására növekedett UCP-1 mRNS mennyisége, a WT állatoknál mintegy háromszor nagyobb volt, mint a HDC-/- egerek esetében (20.A,B ábra). 20. ábra A. Reprezentatív northern blot kép az UCP-1 génexpresszióról. Azonos mennyiségű barna zsírszövet RNS-t (β-actin kép) vizsgálva standard körülmények között az UCP-1 mRNS mennyisége a két állatcsoportban azonos, hideg hatására (4oC, 18h) az UCP-1 gén expresszió megnövekedett. B. A standard körülmények közötti (22±1oC) UCP-1 mRNS mennyiségét 100%-nak véve, 18 órás hideg hatására a barna zsírszövetben a kontroll állatokban mért UCP-1 mRNS mennyisége 420%-os emelkedést mutatott, míg a hisztaminhiányos állatoknál ez az emelkedés 100%-os volt. n=35/csoport (*p<0,01, +p<0,01) C. Reprezentatív western blot kép az UCP-1 fehérje kifejeződéséről WT és HDC-/- egerek esetén. Standard körülmények (22±1oC) között tartott egerek esetében nincs szignifikáns különbség az UCP-1 fehérje barna zsírszövetben mért mennyiségében a két állatcsoportban.

63

4.2.3. Vércukorszint és inzulin-szekréció Annak eldöntésére, hogy az elhízás, illetve a zsírraktárak képzése milyen hatással van a szénhidrát-anyagcserére, glükóz terhelési tesztet végeztünk az állatokon. Az alap vércukorszint 18 órán keresztül éheztetett állatok esetében HDC-/- állatoknál valamivel alacsonyabb volt, mint a vad típusnál, de a két csoport között nincs szignifikáns különbség (WT: 4,18 ± 0,18 mM, HDC-/-: 3,83 ± 0,24 mM). Egyszeri intraperitoneálisan beadott D-glükóz (1 mg/testsúly kg) hatására a hisztaminhiányos állatok esetében már 30 perccel a beadást követően szignifikánsan magasabb volt a vér glukóz szintje, mint a vad típusú, kontroll állatoké. A glükóz beadását követően 30 perc ill. 60 perc elteltével, a megemelkedett plazma glükóz szint maximumánál, 32 ill. 30%-kal magasabb értéket mértünk (p=0,037 ill. 0,039) a hisztaminhiányos állatoknál a kontrollhoz képest (21.A ábra). Az inzulin-érzékenység vizsgálatára nem éheztetett HDC-/- és WT egereknek egyszeri alkalommal intraperitoneálisan inzulint (1 U/testsúly kg) adtunk be és mértük a vércukorszintet egy órán keresztül minden negyedórában. A nem éheztetett HDC-/egerek vércukorszintje magasabb volt a vad típushoz képest, de a különbség nem volt szignifikáns. Az inzulin hatására mind a HDC-/-, mind a WT kontroll állatok esetében csökkent a vércukorszint, a két időgörbe lefutása azonos volt és szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk a két állatcsoport között 60 perc elteltével sem (21.B ábra). Glukóz indukálta inzulinválasz vizsgálata A 18 órán keresztül éheztetett HDC-/- és WT egereknél mért inzulin értékek jelentős különbséget mutattak. A HDC-/-egerek inzulinszintje szignifikánsan magasabb volt (p<0,01). Glükóz (1 mg/testúly kg) intraperitoneális beadását követően 30 perccel mind a hisztaminhiányos állatok, mind a vad típusú állatok inzulinszintje megemelkedett, és emelkedett szinten maradt a mérés végéig (120 perc). A plazma inzulinszint maximális értéke az exogén glükóz beadását követően a kontroll (WT) csoport éheztetés utáni alapértékéhez képest 334%-kal, míg a HDC-/- állatok esetében ezen állatcsoport éheztetés utáni alapértékéhez képest 85,7%-kal emelkedett. (21.C ábra).

64

21. ábra A. Glükóz terhelési teszt eredménye WT és HDC-/-egerekben Az exogén glükóz beadását követően a görbék lefutása hasonló, de szignifikánsan magasabbra emelkedik a vércukorszint a HDC-/- állatok esetében, mint a kontroll csoportnál. n=9/csoport (30 ill 60 percnél *p<0,05) B. Inzulinérzékenységi teszt eredménye. Inzulin beadását követően az egerek vércukorszintje csökkent, mind a HDC-/-, mind a WT egereknél. A görbe lefutása mindkét csoportban hasonló, egyazon értékhez közelít. n=10/csoport C. Glükóz indukálta inzulinválasz mérése WT és HDC-/-egerekben Ip adott glükóz hatására a plazma inzulinszint megemelkedett és a megemelkedett érték szintje a beadást követő 30-120 percben szignifikánsan nem különbözött az éheztetett HDC-/- és WT egerek esetében. n=6/csoport (+p<0,01)

65

4.2.4. Az éheztetés hatására létrejövő hormonszint-változások vizsgálata A szérum leptinszintje nem éheztetett, normál tápon tartott hím egerek esetében a HDC-/- egereknél szignifikánsan magasabb, mint a WT állatoknál (WT: 0,64 ± 0,07 ng/ml, HDC-/-: 3,60 ± 0,80ng/ml). 12 órás éheztetés hatására a leptinszint felére csökkent a kontroll állatokban, ezzel szemben a hisztaminhiányos állatok esetében magas értéken maradt (WT: 0,26 ± 0,17 ng/ml, HDC-/-: 3,48 ± 0,93 ng/ml) (22.A ábra). Normál tápon tartott, nem éheztetett vad típusú és HDC-/- egerek szérum inzulin értéke között nem találtunk szignifikáns különbséget (WT: 345 ± 53 pM, HDC-/-: 361 ± 48 pM). 12 órás éheztetés hatására mindkét állatcsoportban csökkent az inzulin-szekréció, de az éheztetés utáni érték a HDC-/- egerekben szignifikánsan magasabb volt, mint a WT egerekben (WT: 11,6 ± 2,3 pM, HDC-/-: 212,5 ± 46,3 pM) (22.B ábra). A délelőtti plazma kortikoszteronszint HDC-/- egerek esetében magasabb volt, mint a WT egerekben, de ez a különbség nem bizonyult szignifikánsnak a csoporton belüli nagyobb szórás miatt (WT: 23,03 ± 7,34 ng/ml, HDC-/-: 42,68 ± 6,88 ng/ml; p=0,068). A 12 órás éheztetés hatására mindkét csoportban jelentősen, 8-10-szeresére emelkedett a kortikoszteronszint a vérben, és a két csoport nem mutatott különbséget egymástól (22.C ábra). Standard körülmények között tartott WT és HDC-/- állatok triglicerid, koleszterin és HDL szintje között szignifikáns különbség nem volt. A standard tápról áttérve és két hétig a hisztaminmentes tápon (<0,6 nmol hisztamin/g táp) tartva mindkét állatcsoportot kisebb emelkedést tapasztaltunk a szérum triglicerid és koleszterin szintekben (III. táblázat).

66

22. ábra Szérum leptin-, inzulin-, kortikoszteronszintek alap állapotban és éheztetésre WT és HDC-/-egerekben A. Szérum leptinszintek standard körülmények között tartott és éheztetett HDC-/- és WT egerekben (*p<0,01), n=6-12. B. Inzulin szintek standard körülmények között tartott és éheztetett HDC-/- és WT egerekben (*p<0,01, +p<0,01), n=6-12. C. Kortikoszteron szintek standard körülmények között tartott és éheztetett HDC-/és WT egerekben (+p<0,01), n=6-12.

67

III. táblázat A táp minősége sem HDC-/- egerek, sem WT egerek esetében nem befolyásolta jelentősen a szérum triglicerid-, koleszterin- és HDL-szinteket Standard táp

Hisztaminmentes táp

WT

HDC-/-

WT

HDC-/-

Triglicerid (mM)

2,47 ± 0,12

2,91 ± 0,32

3,35 ± 0,34

3,00 ± 0,59

Koleszterin (mM)

2,24 ± 0.17

2,17 ± 0,23

2,48 ± 0,02

2,70 ± 0,29

HDL (mM)

1,36 ± 0,20

1,31 ± 0,26

1,48 ± 0,06

1,53 ± 0,19

4.2.5. Leptin-expresszió összehasonlítása vad típusú és HDC-/- egerek különböző zsírszöveteiben A hisztaminhiányos egerekben a plazma leptinszintje, feltehetően a leptin és a hisztamin közt fennálló negatív visszacsatolás hiánya miatt, kórosan megemelkedett. Nem ismeretes azonban, hogy mi a megemelkedett leptinszint közvetlen oka. A HDC-/egerekben tapasztalt hiperleptinémia oka lehet a zsírsejtek megnövekedett leptinexpressziója. A leptin-expresszió vizsgálatához a HDC-/- és kontroll, vad típusú egerekből gyűjtöttünk epididimalis, bőrszövet alatti (subcutan) és barna zsírszövetet, és valós idejű PCR segítségével vizsgáltuk azok leptin-expresszióját. A legnagyobb mértékű leptin-expressziót az epididimalis zsírszövetben detektáltunk. A bőralatti zsírszövetben a leptin-expresszió mértéke mindkét genotípusban kisebb volt, míg a barna zsírszövet csak igen kis mértékben expresszált leptint (23. ábra). A barna zsírszövetben mért leptin mRNS értéket nézzük, akkor ez a bőralatti zsírszövetben mért érték harmada-, míg az epididimalis zsírszövetben mért érték tizenharmad része volt.

68

23. ábra Leptin-expresszió az epididimalis (epi), bőrszövet alatti (sc) és barna zsírszövetben (barna) vad típusú (WT) és hisztidin-dekarboxiláz génkiütött HDC-/állatban, a WT epididimalis zsírszövetében mennyiségéhez viszonyítva. n=5/csoport, szórás: 2-∆∆CT-2-(∆∆CT±S) A vad típusú, illetve a HDC-/- egerekből származó zsírszövetek leptin mRNS tartalma között nem volt szignifikáns különbség. Ugyanakkor megfigyelhető az a tendencia, hogy mintegy kompenzatórikus folyamat eredményeként, ahol jelentősen megnőtt a zsírszövet mennyisége, ott a leptin mRNS szintje csökkent (vö. 18. ábra). Azaz a hisztamin deficiens állatok esetében WT-ra normalizált leptin-expresszió mértéke a barna és epididimalis zsírszövetben kisebb, mint a bőrszövet alatti zsírszövetben.

4.2.6. Leptin-receptor (Ob-Rb) expresszió vizsgálata vad típusú és HDC-/állatok hipotalamuszában és májában Leptin-rezisztencia létrejöhet olyan módon is, hogy a leptin-receptorok száma és/vagy érzékenysége változik meg, illetve a jelátviteli útvonalban jön létre változás (pSTAT, SOCS3). Annak eldöntésére, hogy a HDC-/- egerek hiperleptinémiáját a receptorszám változás okozza-e, valós idejű PCR módszerrel mértük a leptin-receptor szignalizáló formáját, azaz az Ob-Rb mRNS mennyiségét vad típusú és hisztaminhiányos egerek hipotalamusz és máj szövetmintáiban. Kísérleteinkben sem a hipotalamuszból, sem a májból származó mintákban nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést a két állatcsoport között az Ob-Rb szint tekintetében (24. ábra).

69

24. ábra Leptin-receptor hosszú izoformájának (Ob-Rb) expressziója hipotalamuszban (HT) és májban, a vad típusú (WT) szövetmintában mért értékre normalizálva. n=5/csoport, szórás: 2-∆∆CT-2-(∆∆CT±S)

4.2.7. Morfológiai és funkcionális változások a HDC-/- egerek központi idegrendszerében 4.2.7.1. L-hisztidin beadását követő neuronális aktiváció A HDC gén funkcionális, központi idegrendszeri aktivitásának teszteléséhez a hisztidindekarboxiláz enzim szubsztrátját, L-hisztidint adtunk hím vad típusú és HDC-/állatoknak. Az L-hisztidin átjut a vér-agy gáton, így képes az agyi hisztamin-szintézis fokozására. Az egereknek L-hisztidint (0,1 g/testsúly kg, 0,2 ml fiziológiás sóoldatban) injektáltunk intaperitoneálisan 2-2,5 órával a perfúziót megelőzően. A neuronális aktivációt, a hipotalamusz hisztaminra érzékeny területein a c-fos gén fehérje termékének kimutatásával, c-Fos immunhisztokémiával detektáltuk. Kontrollként a vad típusú és a hisztaminhiányos egereknek PBS-t adtunk. PBS hatására mindkét állatcsoportban gyengén c-Fos pozitívan jelölődött az anterior hipotalamikus area, a lateralis hipotalamusz, a supraciasmaticus mag, a periventricularis mag, a latero-anterior

70

hipotalamikus mag és a ventromedialis mag. L-hisztidin adását követően számos c-Fos jelölt sejtet találtunk a WT állatoknál, míg ez a kezelés a HDC-/- egerek esetében nem váltott ki c-Fos-ir fokozódást. A HDC-/- egereknél elmaradt a WT állatoknál látott neuronális aktiváció a metabolikus neuropeptideket expresszáló sejtekben (az arcuatus magban, lateralis hipotalamuszban) (25. ábra). PBS

VM

WT

LHA

L-hisztidin

ARC V3

HDC-/-

c-Fos-ir

25. ábra L-hisztidin hatása az arcuatus magban és a lateralis hipotalamuszban. Szignifikánsan több neuron aktiválódott, mint a kontroll (PBS) kezelésnél. Ugyanez a kezelés HDC-/- egereknél nem váltott ki aktivációt. ARC: arcuatus mag, LHA: lateralis hipotalamusz, V3: harmadik agykamra, VM: ventromedialis mag, a mérce 250 µm-t jelöl.

4.2.7.2. Hisztaminerg neuronok feltérképezése és innervációja Az agyi hisztaminerg neuronok megjelenítésére HDC in situ hibridizációt és hisztamin immunhisztokémiát alkalmaztunk. A WT egerek esetében hasonló HDC mRNS szignált kaptunk az általunk készített szondával, mint patkányoknál, azaz a tuberomamillaris régió öt magcsoportja (E1-E5) jelölődött in situ hibridizációnál. A HDC-/- egereknél a tuberomamillaris régió hisztaminerg sejtjei hisztidin-dekarboxiláz in situ hibridizációs szignált nem mutattak (26. ábra felső sor). Vad típusú (WT) állatoknál a bal oldali immunhisztokémiai képen láthatjuk a hisztamin tartalmú neuronok jelölődését, és hogy az arcuatus mag erős hisztaminerg innervációt kap. Ez a terület tartalmazza a táplálkozás szabályozásában résztvevő neuropeptideket (POMC, NPY). Hisztamin immunhisztokémiával szintén igazoltuk, hogy HDC-/- egerek esetében az agyban hiányoznak a hisztamint tartalmazó neuronok és rostok (26. ábra).

71

HDC-/- egereknél a központi idegrendszerben hisztamint még akkor sem tudtunk kimutatni, amikor L-hisztidint előkezelést alkalmaztunk, mely kezelés a vad típusú állatokban növelte a HDC aktivitást és a hisztamin termelődését.

WT

HDC-/-

f

PMv

V3

ArcP

HDC mRNA

f PMv

V3

ArcP

DM

MTu VM

V3

Arc Hisztamin-ir

26. ábra HDC in situ hibridizáció és hisztamin immunhisztokémia A felső sorban a sötétlátóteres fényképek HDC mRNS jelölődést mutatják a WT egerek tuberomamillaris magcsoportjaiban. A HDC-/- állatok esetében nem találtunk jelölődést. A négy alsó hisztamin immunhisztokémia fénymikroszkópos kép mutatja a hisztaminerg neuronokat és rostokat a tuberomamillaris magcsoportban WT állatokban, ill. ezek teljes hiányát HDC-/- állatoknál. A képen jól látható, hogy a HDC-/- egerekben a hisztaminerg rostok teljesen hiányoznak az arcuatus magból. Arc, ArcP: arcuatus mag; DM: dorsomedialis mag; f: fornix; PMv: ventralis premamillaris mag; V3: harmadik agykamra; VM; ventromedialis mag, Mtu; medialis tuberalis mag, a mérce 200 µm-t jelöl. (Miklós Ildikó munkája)

72

4.2.7.3. A táplálkozás szabályozásában résztvevő egyes neuropeptidek génexpressziójának összehasonlítása vad típusú és hisztaminhiányos egerek hipotalamuszában A HDC-/- állatok hipotalamuszában hiányzik az erőteljes hisztaminerg innerváció, így az ott található orexigén és anorexigén neuroncsoportok megváltozott regulációja is hatással lehet a hisztaminhiányos egerek metabolikus fenotípusának kialakításában. A hisztaminhiányos állatok magas leptinszintje ugyanakkor visszahat a POMC, az NPY, valamint az orexin tartalmú idegsejtek neuropeptid génexpressziójára. Vizsgálatainkban in situ hibridizációs hisztokémiával hasonlítottuk össze az anorexigén POMC, és az orexigén NPY és orexin expressziót vad típusú és HDC-/- egerek hipotalamuszában. NPY mRNS-nek megfelelő autoradiográfiás jel a legnagyobb mennyiségben az egerek hipotalamuszában, az arcuatus magban volt detektálható (27. ábra), de értékelhető jelet kaptunk az agykéreg és a hippocampus területén is. Kiértékeléskor a PhosphoImager screen leolvasásakor született képeket használtuk fel (28. ábra), és az AIDA program segítségével határoztuk meg az arcuatus mag területén a jel erősséget. Csak az ugyanabban az időpontban leolvasott eredményeket hasonlítottuk össze egymással, és az eredményeinket minden esetben a WT jelintenzitásának százalékában fejeztük ki. Eredményeink szerint HDC-/- egerekben az NPY gén expressziója nagyobb volt, mint a WT csoportban, de a két genotípus között szignifikáns különbséget nem találtunk (WT: 100 ± 8,7%, HDC-/-: 143,5 ± 28,7%; n=5) (31.A ábra).

27. ábra Reprezentatív képek az NPY mRNS in situ hibridizációs kimutatásáról NPY mRNS kimutatása a HDC-/- egér arcuatus magjában. Radioaktív in situ hibridizációs hisztokémia detektálása fotóemulzióval bevont tárgylemezen, Nissháttérfestést mutat. A kis nagyítású képen a mérce 100 µm, a nagy nagyításon a mérce 25 µm.

73

NPY

28. ábra NPY mRNS in situ hibridizációs kép Image Plate lemezen, FLA-3000 Phosphoimager készüléken. Az ábrán jól körülrajzolhatóak a HDC-/- egérben az NPY jelölt sejtek az ARC mag területén. POMC hibridizációs jelet mind a vad típusú, mind a hisztaminhiányos egereknél a bazális hipotalamuszban a nucleus arcuatus területén, és a hipofízis közti lebenyben sikerült kimutatnunk. Egyéb agyterületeken a POMC génexpresszió mértéke nem volt számottevő (29. ábra). Kiértékelésnél a NPY in situ hibridizációs kiértékelés leírásának megfelelően jártunk el. A HDC-/- egerek POMC gén expressziója valamivel kisebb volt, de a két genotípus között szignifikáns különbség nem volt mérhető (WT: 100 ± 14,1%, HDC-/-: 74 ± 18,6%; n=8) (31.B ábra).

29. ábra Reprezentatív képek a POMC jelölődésről POMC mRNS kimutatása HDC-/- arcuatus magjában radioaktív in situ hibridizációs hisztokémia detektálása fotóemulzióval bevont tárgylemezen, Nissl háttérfestéssel történt. A kis nagyítású képen a mérce 100 µm, a nagy nagyításon a mérce 25 µm. Orexin génexpressziós jelet a lateralis hipotalamusz területén detektáltunk. A laterális hipotalamuszban az orexin génexpresszió kvantitatív vizsgálatánál az elemzést fotoemulzióval bevont tárgylemezeken végeztük (30. ábra). Az értékeléshez az NIH image programot használtuk. Szignifikáns különbséget nem sikerült kimutatni a két genotípus között (WT: 100 ± 5,7%, HDC-/-: 110,6 ± 6,3%; n=10) (31.C ábra).

74

WT

HDC-/-

30. ábra Reprezentatív képek az orexin jelölődésről Orexin mRNS jelölés a lateral hipotalamuszban. Radioaktív in situ hibridizációs hisztokémia detektálása fotóemulzióval bevont tárgylemezen, sötétlátótérben fényképezve történt. A kis nagyítású képen a mérce 200 µm, a nagy nagyításon 50 µm.

31. ábra a POMC és NPY mRNS szintjének vizsgálata az arcuatus magban ill. az orexin expressziója a lateralis hipotalamuszban. A jel intenzitását a kontroll csoportra normalizáltuk. A. NPY mRNS; n=5/csoport, B. POMC mRNS; n=8/csoport, C. orexin mRNS; n=10/csoport. Mean±SEM értéket jelölnek.

75

A fent leírt neuropeptideket ugyanazon központi idegrendszeri, hipotalamikus magcsoportokban találtuk meg WT és a HDC-/- egerekben. Az egyes neuronok sejtmagjai fölötti radioaktív jelekben sem találtunk különbséget a két állatcsoport között. 4.2.7.4 A leptin-receptor jelátviteli útvonal egyik elemének – p-STAT3 – változása leptinnel kezelt vad típusú és HDC-/- egerekben Mivel sem a leptin-expresszió, sem a leptin-receptor expressziója nem változott oly mértékben, hogy választ adhatott volna a leptin hatástalanságára modellállatunkban, felmerült annak a lehetősége, hogy a leptin-receptorok működőképességének megváltozása, a STAT-3 foszforiláció csökkenése, esetleg gyors defoszforilációja áll a HDC-/- egerek leptin rezisztenciájának hátterében. Ennek tisztázására megvizsgáltuk a HDC-/- és vad típusú egerek hipotalamuszában a leptin kezelés hatására bekövetkező STAT3 foszforiláció mértékét. Egyik fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll csoportban sem tapasztaltunk p-STAT3 immunreaktivitást (32. ábra). Az intraperitonealisan leptinnel kezelt állatoknál az arcuatus magban, a hipotalamusz ventromediális és dorzomediális magcsoportjaiban, a premamilláris régióban, valamint igen kis mértékben a lateralis hipotalamuszban figyelhettünk meg pSTAT3 immunreaktivitást, tehát az irodalomnak megfelelően a leptin-receptor expresszió helyein. 30 perccel a beadás után még csupán a nucleus arcuatusban, majd 2 óra elteltével a többi magban is megfigyelhető volt a foszforiláció. A két genotípusba tartozó, párhuzamos minták között tér- és időbeni eltérést is megfigyelhettünk, így a leptin dózisát megemeltük. A megemelt, 5 mg/testsúly kg dózis hatására a fent említett területeken egységesebb lett a festődés, sőt a dorzalis vagusz komplex (DVC) területén is p-STAT immunreaktivitást figyeltünk meg. A WT állatcsoportban szignifikánsan több p-STAT immunpozitív sejtet láttunk, mint a hisztaminhiányos egércsoportban (WT: 38,7 ± 4,6; HDC-/-: 14,3± 4,9; n=5; *p<0,01) (33. ábra).

76

32. ábra Leptin indukálta p-STAT3 immunreaktivitás a hipotalamuszban. p-STAT immunreaktív sejtmagok eloszlását mutató mikrofotók a vad típusú (WT) és hisztidindekarboxiláz knock-out (HDC-/-) egerek hipotalamuszában. A, B fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll; C, D 30 perccel a leptin beadás után perfundált egerek; E, F 2 órával a beadás után perfundált állatok. 3V, harmadik agykamra; Arc, nucl. arcuatus; DM, dorzomediális hipotalamusz; VM, ventromedialis hipotalamusz, mérce: 200 µm.

77

A

B

33. ábra Leptin indukálta p-STAT3 immunreaktivitás a dorzalis vágusz komplexben (DVC) A. p-STAT immunreaktív sejtmagok eloszlását mutató fénymikroszkópos kép az agytörzs területéről a vad típusú (WT) es a hisztaminhiányos (HDC-/-) egerekben B. A leptin kezelés hatására p-STAT immunpozitívvá váló sejtmagok száma a WT és HDC-/-egerekben

78

4.3. Hím HDC-/- egerek reproduktív funkciója 4.3.1. Szérum hormonszintek változásai A HDC-/- egereknél kétszeresére emelkedett szérum tesztoszteron-szintet mértünk a WT kontroll állatokban mért értékhez képest (WT: 7,15 ± 1,28 ng/ml, HDC-/-: 13,8 ± 2,41 ng/ml) (34. ábra). Az állatokkal hisztaminmentes tápot etetve ez a különbség fennmaradt.

34. ábra Szérum tesztoszteron koncentráció normál tápon tartott állatoknál. HDC-/egerek (n=26), WT egerek (n=23) *p<0,05 A szérum ösztradiol-szintek szignifikánsan nem különböztek a két állatcsoportban, ugyanakkor megfigyelhető, hogy a WT esetében az érték alacsonyabb (23,14 pg/ml), mint a HDC-/- egereknél (29,75 pg/ml). Testisből mért szteroidok, úgy mint a dehidroepiandroszteron-szulfát (DHEAS), dehidroepiandroszteron (DHEA), androsztendion (AD), tesztoszteron és a dihidrotesztoszteron (DHT) szintjei a HDC-/- egerekben szignifikánsan magasabbak, mint a WT állatoké, ugyanakkor a 17-OH-progeszteron szintben a két állatcsoport között szignifikáns különbség nem volt. A WT állatcsoport szteroidszintjét 100%-nak véve a HDC-/- egerekben mért értékek: DHEAS: 214%, DHEA: 329%, AD: 193%, tesztoszteron: 167%, és DHT: 155%. Ugyanakkor a mellékvesében a két állatcsoport a szteroidszintjei között szignifikáns különbséget nem találtunk.

79

4.3.2. GnRH neuronok vizsgálata WT és HDC-/- egerekben GnRH neuronok megjelenítésére in situ hibridizációt alkalmaztunk. HDC-/- egerek esetében több pozitívan jelölődött sejtet láttunk, mint a WT egyedekben, de szignifikáns különbséget csak a lamina terminális területén találtunk (WT: 14,3 ± 0,6, HDC-/-: 25,3 ± 1,76 sejt/kiválasztott terület). Ugyanakkor az egyes sejtek fölötti denzitás értékek a HDC-/- egereknél alacsonyabbak voltak, mint a WT egereknél (WT: 28,57 ± 2,72, HDC-/-: 21,25 ± 1,73) (35. ábra). WT

HDC-/-

POA 35. ábra Reprezentatív sötétlátóteres autoradiográfiás kép GnRH in situ hibridizációs jelölődésről a medián preoptikus mag szintjéről, a rostral hipotalamusz régiójában vad (WT) és a hisztaminhiányos (HDC-/-) állatoknál. Radioaktív. A mérce 1 µm-t jelöl.

4.3.3. A here morfológiájának változása hisztaminhiány hatására A here tömege a vad típusú kontroll csoportnál 7 napos és felnőtt (3 hónapos) egerek esetében is nagyobb, mint a megfelelő korú HDC-/- egereké. A 7 napos állatok esetében a különbség szignifikáns. A különbség a felnőtt (3 hónapos) állatok esetében is szembetűnő, ha a mért here súlyokat az állatok testsúlyához viszonyítjuk (IV. táblázat). IV. táblázat A here tömege és a here tömege/testtömeg arány 7 napos és felnőtt WT ill. HDC-/- egerek esetében. Here súly (mg) 7 napos

felnőtt

Here súly/ testtömeg (mg/g) 7 napos

felnőtt

WT

11,3 ± 0,1 (n=5)*

135 ± 35 (n=20)

1,58± 0,1 (n=5)*

7,08 ± 0,21(n=11)*

HDC-/-

5,7 ± 0,1 (n=6)

110 ± 29 (n=19)

1,2 ± 0,2 (n=6)

5,76 ± 0,22 (n=10)

80

Fénymikroszkópos szövettani vizsgálattal nem találtunk morfológiai eltérést a felnőtt WT és a HDC-/- egerek heréjéről készült metszetek között. A Madarász által készített elektronmikroszkópos felvétel alapján a HDC-/- egerek Leydig-sejteiben kifejezettebb durva felszínű endoplazmás retikulum (RER) membrán képletek és nagyobb számú lipidcsepp található a vad típusú egerekhez képest.

81

5. Megbeszélés 5.1 A hisztamin hatása a táplálkozás szabályozására Az elvégzett kísérletek igazolták, hogy a hisztamin fontos szerepet játszik mind a táplálkozás mind az energiaháztartás szabályozásában, és része egy összetett többkomponensű szabályozókörnek, melyben egyetlen elem hiánya nem feltétlenül vezet patofiziológiás változásokhoz. Korábban számos kísérlet végeztek, hogy vizsgálják a hisztamin táplálkozás, energiaháztartás szabályozására kifejtett hatását. Ezen kísérletek között szerepel olyan is, amelyben blokkolták a HDC-enzimet, de a már születéskor is meglévő hisztaminhiány, illetve a hiány következtében fellépő kompenzatórikus folyamatok vizsgálatára csak a hisztidin-dekarboxiláz génkiütött egértörzs létrehozása adott lehetőséget. Első megfigyeléseink között szerepelt, hogy a krónikus hisztaminhiány hatására a CD1/129Sv hátterű HDC-/- egereknél időskori elhízás figyelhető meg, ugyanakkor a korábbi, hisztamin hatását vizsgáló kísérletek eredményeivel ellentétben a felvett táplálék mennyisége nem nőtt. Fontos megjegyezni, hogy az általunk használt egértörzs genetikai háttere CD1, egy kültenyésztett egértörzs, amelyet a HDC gén kiütésekor eredetileg használtak. A genetikai háttér jelentőségét bizonyítja, hogy a BALB/c egértörzs esetében a HDC gén kiütése részben más eredményeket mutatott, így pl. ezek az állatok 4 hónapos korukban nem voltak elhízottak. A két egérpopuláción végzett kísérletek összehasonlíthatósága akadályokba ütközik, hiszen a háttér jelentőségét csak a teljesen azonos kísérleti körülmények között lehetne vizsgálni (azonos állatház, azonos táp, hisztaminmentes diéta hosszának azonossága és egyéb mérési körülmények azonossága). Az időskori elhízás egyik oka lehet a HDC-/- egereknél megfigyelt megváltozott alvásébrenlét ciklus, és a hosszabb mozgásmentes időszak is (Parmentier 2002). Az állatok életkorával a súlyuk változott, de az alvás-ébrenlét ciklusukban észlelt változás az életkorral nem korrelált, már születésüktől megvolt, így egyértelmű ok-okozati összefüggés nem mutatható ki a megváltozott alvás- ébrenlét és a megváltozott testsúly között hisztaminhiányos egereknél.

82

Jorgensen

és

munkatársai

kísérletében

a

magas

zsírtartalmú

diétán

tartott

hisztaminhiányos (C57BL/6J genetikai háttérű) állatok hajlamosabbak voltak az elhízásra, kalória-bevitelük magasabb volt és ez az idővel nem mutatott csökkenést, tehát a visszacsatolás nem működött, így az epididimalis zsírszövet mennyisége és a plazma leptin-koncentrációja is megemelkedett (Jorgensen EA és mtsai, 2006). Saját HDC-/- egér tenyészetünkben azt tapasztaltuk, hogy az elhízás elsősorban az epididimalis zsírszövet gyarapodása következtében jön létre. Már a 3-4 hónapos egerekben megváltozott a zsírszövet-tömege és az epididimalis zsírszövet szerkezete. Az irodalmi adatok a centrális hisztaminnak jelentős szerepet tulajdonítanak fehérzsírszövet mennyiségi regulációjában (Masaki T és mtsai, 2001a; Kasaoka S és mtsai, 2004) és részvétele egyértelmű a lipid metabolizmusban is (Tsuda K és mtsai, 2002; Shen J és mtsai, 2007). A hipotalamusz hisztamin tartalma jelentősen befolyásolja az elfogyasztott táplálék mennyiségét, a táplálkozás idejét és sebességét. Az FMH mikroinjekcióval különböző agyterületeken (a ventralis medialis hipotalamuszban (VMH), a paraventricularis magban (PVN), a mesencephalicus trigeminalis érzékelő afferensben (Me5), és a 3. agykamrában előidézett centrális hisztaminhiány általában növelte az elfogyasztott táplálékmennyiséget (Sakata T és mtsai, 1990; Ookuma K és mtsai, 1993; Fujise T és mtsai, 1998). A hisztamin centrális hatásai közé tartozik, hogy a H1- receptoron keresztül gátolja a táplálékfelvételt a VMH és a PVN területén (Sakata T és mtsai, 1988; Ookuma K és mtsai, 1989). Ellentétben a fent említett kísérletekkel, a hisztaminmentes tápon tartott HDC-/- egerekben a hisztaminhiány nem korlátozódik

sem egyes

agyterületekre,sem bizonyos napszakra (esti vagy reggeli órákra).

5.2. Az energiaháztartás szabályozásának zavara A hisztaminhiányos egerekben az energiaháztartás szabályozásának zavarát indirekt módon vizsgáltuk. A HDC-/- egerek táplálékfogyasztása elmarad a vad típusú állatokéhoz képest, de mindeközben a testsúlyuk, illetve a fehér zsírszövet és barna zsírszövet mennyisége is megnövekedett, így a kalorikus efficiencia értékük is szignifikánsan magasabb. Kísérleteinkben a hisztamin energiamobilizálási képességre kifejtett hatását bizonyítja, hogy a HDC-/- egerek éheztetés és hideg hatására kialakuló termoregulációs válasza sérült (rövidebb idő alatt hűlnek ki), illetve a zsírraktárak

83

mobilizálhatósági képessége is elmarad a szintén éheztetett és hidegnek kitett vad fenotípusú állatokéhoz képest. Eredményeink szerint a hisztaminhiányos egerek bizonyos kihívások hatására nem képesek az energiaraktáraikat mobilizálni, mivel a barna zsírszövetben a hidegben eltöltött idő alatt csökkent az UCP-1 expressziójának indukálhatósága. A központi idegrendszeri lipid mobilizáció vizsgálatakor megfigyelték, hogy az icv adott hisztamin hatására lipolízis következik be, a vérben megnövekszik a szabad zsírsav szint. A hatás blokkolható H1-receptor-agonistával, illetve csökkenthető H2agonistával is (Bugajski J és Gadek A, 1981). A hisztamin emberben gyengén stimulálja a bőrszövet alatti zsír lipolízisét (Carpene C és mtsai, 2001). Elektrofiziológiai mérésekkel igazolták, hogy a fehér zsírszövetet beidegző szimpatikus neuronok aktivációja is megnő (Yoshimatsu H és mtsai, 2002b). A fehér zsírszövet mobilizálásán túl a szimpatikus idegrendszer aktiválja a barna zsírszövetet is, így növeli a diéta-indukálta termogenezist és az energia hő formájában történő leadását (Sakata T és mtsai, 1991). Icv hisztamin adását követően, vagy intraperitonealis L-hisztidin kezeléskor a barna zsírszövetben jelentős szimpatikus idegi aktivitás mérhető, ami blokkolható FMH előkezeléssel (Yasuda T és mtsai, 2004a). A termogenezis a barna zsírszövetben β3-adrenoreceptoron és UCP fehérjék aktiválásán keresztül szabályozódik (Rothwell NJ és mtsai, 1981; Go AG és mtsai, 2007). A hisztamin zsírszövet beidegzésére kifejtett hatása a hipotalamusz területén belül is különböző. A 3. agykamrába, a PVN-be vagy a preoptikus areába (POA) injektált hisztamin növeli a barna zsírszövet (BAT) szimpatikus beidegzését és az UCP-1 mRNS expressziót, ezzel szemben a laterális ill. ventromediális hipotalamuszba adva a hisztamin mikroinjekciónak nincs ilyen hatása (Yasuda T és mtsai, 2004b). A hisztamin és leptin kapcsolatára utal, hogy tartós, 7 napon át tartó icv hisztamin kezelés hatására mind a leptin rezisztens DIO, mind a db/db egerek UCP-1 mRNS expressziója jelentősen megnő. Ez a megnövekedett expressziós szint jelentősen alacsonyabb a H1receptor génkiütött állatokban (Masaki T és mtsai, 2001a), tehát a két rendszer kapcsolatban lehet a H1- receptoron keresztül. Mivel a hisztamin szerepet játszik mind a periférián, a barna zsírszövetben mérhető idegi aktivitás, mind a barna zsírszövet beidegzésének centrális szabályozásában, ezért esetünkben a szimpatikus beidegzés és a hibás β-adrenerg receptor-funkció is okozhatja

84

a hideg stressz alatti UCP-1 mRNS expresszió növekedésének hiányát a HDC-/egerekben.

5.3. Metabolikus szignálok változásai A hisztamin és az inzulin, illetve a hisztamin és a leptin közötti szabályozó mechanizmus vizsgálatára is lehetőség nyílik a hisztaminhiányos HDC-/- egerek felhasználásával. A hisztaminmentes diétán tartott HDC-/- állatok inzulinszintje azonos volt a kontroll csoportéval, ugyanakkor az éheztetést követően ezen elhízott egerek inzulinszintje csökkent, de jóval magasabb szinten maradt, mint a vad típusú állatoké. Ez az emelkedett inzulinszint feltételezi az anorexigén inzulin-szignál zavarát. Erre utal az is, hogy a glükóz indukálta inzulinszint nem emelkedik a hisztaminhiányos állatokban, tehát az inzulin-érzékenységük csökkent. Ugyanakkor a HDC-/- állatokban éheztetésre kiváltható az inzulin-szekréciós válasz és a glukóz-tolerancia tesztben is emelkedett vér glükóz-szintet mértünk. A WT állatokban mért értéknél magasabbat, de adott időn belül a megemelkedett vércukorszint visszatért a normál értékre. A HDC-/- egereken végzett kísérletek megerősítik a leptin-hisztamin kapcsolat létezését és igazolják azt a feltevést, hogy a hisztamin a leptin szabályozókörének elemeként negatívan szabályozza a leptin mennyiségét a vérben. A hisztaminhiány hatására a szérum

leptinszintje

a

vérben

hatszorosára

emelkedett.

A

nagymértékben

megemelkedett szérum leptinszintet részben magyarázza az epididimalis zsírszövet jelentős tömegnövekedése, de a leptin génexpresszió egységnyi zsírszövetre vonatkoztatva nem változik meg az egyes zsírszövetekben. A leptin szintézisének legfontosabb helye a fehér zsírszövet, így joggal merül fel a magas leptinszint elsődleges okozójaként a zsírszövet mennyiségének megnövekedése. A Semmelweis Egyetemen végzett BALB/c hátterű HDC-/- egértörzsben az elhízás csak jóval idősebb korban jelenik meg, mint az általunk vizsgált CD1129Sv hátterű egerekben. Három-négy hónapos korban a hisztaminhiányos BALB/c hátterű állatok testömege és epididimalis zsírmennyisége nem tér el vad típusú társaikétól, de a vérben mért leptinszintjük már jelentősen megemelkedett, háromszorosa a vad fenotípusban mértnek, és ez a kor előre haladtával egyre nő. Ez utóbbi eredmény is arra utal, hogy jelentős szerepe van a genetikai háttérnek, de a két különböző genetikai háttéren kapott

85

eredmény összevetése azt is sugallja, hogy a vérben mért magas leptin-koncentrációnak nem csupán a megnövekedett zsírmennyiség az oka, hiszen a hisztaminhiányos BALB/c állatoknál az elhízás jelei még nem mutatkoztak, de már emelkedett leptinszintet mértek. Ugyanakkor érdemes megemlíteni, hogy a BALB/c HDC-/- egerekben a táplálékkal bejuttatott hisztamin csökkentette a megemelkedett leptinszintet, tehát a hisztaminhiány okozta leptin koncentráció növekedés diéta volt. Eredményeink más kísérleti rendszerek eredményeivel összhangban vannak. Centrálisan adott hisztamin a hiperleptinémiás db/db egerekben a leptinszintet 25%-al csökkentette (Masaki T és mtsai, 2001a). Ugyanakkor a több napos icv hisztamin adást követően mind a DIO, mind a db/db egerek esetében nem csak a szérum leptin koncentráció, hanem a ob gén expressziója is csökkent (Masaki T és mtsai, 2001a). Következtetésünk szerint a leptin szérumban mért mennyisége függ a zsírszövet mennyiségétől és a leptin-expressziójának mértékétől, illetve a leptin lebontás sebességétől, melynek pontos folyamata még nem tisztázott. A leptin gén kifejeződését elsősorban az energiaraktárak állapota határozza meg, a transzkripció mértéke arányos a zsírszövet tömegével, ill. a zsírsejtek méretével (Maffei M és mtsai, 1995). Valós idejű PCR-rel végzett méréseink alapján a vad, illetve HDC-/- egerekből származó fehér és barna zsírszövet leptin mRNS tartalma között nem volt szignifikáns különbség. Ugyanakkor a magas plazma leptinszint oka lehetett a fokozott leptin szintézisen túl a kísérleteinkben még nem vizsgált csökkent leptin lebontás (clearance) is (Wong SL és mtsai, 2004).

5.4. Különbségek a vad és HDC-/- egerek leptin-érzékenységében A leptin-érzékenységet, vagyis a leptin biológiai aktivitását több tényező is befolyásolhatja: a hozzáférhető leptin mennyisége, a jelátviteli receptorok mennyisége, a jelátviteli útvonal indukálhatósága, az útvonalban résztvevő molekulák aktivitása. A magas leptinszint ellenére a HDC-/- egerek felnőtt korukban elhíznak, tehát a központi idegrendszer feltehetően nem értesül a zsírdepók, illetve a szervezet energiaraktárainak feltöltöttségéről, azaz az anorexigén szignál ellenére tovább folyik a zsírraktározás. Részben a magas leptin-koncentráció következménye a leptin-rezisztencia. A leptin ugyan csökkenti a táplálékfelvételt és így a testtömeget, de a hiperleptinémia kialakulásával elhízás lép fel. Ennek a látszólagos ellentmondásnak oka lehet a

86

hiperleptinémia következtében kialakuló leptin-érzéketlenség, amelynek következtében a leptin nem képes kifejteni hatását, fokozódik a táplálékfelvétel, nő a zsírszövet mennyisége és így tovább nő a leptin-koncentráció. A leptinrezisztenciával kapcsolatban számos irodalmi adat ismert. A probléma eredete lehet a jelátvitelben fontos, hosszú receptor izoforma (Ob-Rb) mennyiségének csökkenése. Erre példa az időskori leptin-rezisztencia, melynek oka részben a Ob-Rb számának csökkenése, részben a leptin korral járó expressziójának emelkedése (Li H és mtsai, 1997). A leptin-receptor mutációiból származó rezisztenciák is ismertek. Érdekes, hogy a mutációk közül van olyan (pl. a Tyr 985), mely jelentős nemek közötti eltérést mutat: nőstényeknél egy autoinhibitoros szignál következtében nem híznak el ezek az egyedek (Bjornholm M és mtsai, 2007). Szelektív, neuronális leptinreceptorhiányos egerek elhíznak, és az elhízás mértéke negatívan korrelál a hipotalamusz leptin-receptor mennyiségével. Az alacsony hipotalamusz Ob-R szintű állatok plazma leptin-, glukóz-, inzulin-, és kortikoszteronszintje emelkedett. Különösen szembetűnő ez a változás a nőstény egyedeknél (Cohen P és mtsai, 2001). Kísérleteinkben a leptin-receptorok vizsgálatát az agyban a hipotalamusz területére korlátoztuk. Az irodalomból ismert erről a területről, hogy a táplálkozás szabályozásában részt vesz és itt írták le a legjelentősebb leptin-receptor expressziót is. Az Ob-Rb génexpressziós vizsgálatokból kiderült, hogy modellállatunkban a leptinreceptor hosszú izoformájának génexpressziója nem változott meg a hipotalamuszban, így a hipotalamusz leptin-receptor expressziójának változása nem indokolhatja a leptin rezisztens állapotot. Jorgensen és munkatársai C57BL/6J genetikai hátterű egerekben vad és HDC-/- genotípus között nem mutattak ki változást a hipotalamusz Ob-R mRNS expressziójában, de magas zsírtartalmú diétán tartott állatokban a hisztaminhiányos egerek Ob-R gén expressziója harmadára csökkent. Ez az állapot magyarázhatja a megnövekedett leptinszint anorexigén hatásának elmaradását (Jorgensen EA és mtsai, 2006). Érdemes még megjegyezni, hogy a valós idejű PCR segítségével végzett vizsgálataink lehetővé tették ugyan számunkra az OB-Rb mRNS expressziójának pontosabb mérését a hipotalamusz egészére, de az egyes hipotalamikus almagokban, mint pl. ARC, VMH, DMH, PMV, LHA, PVN olyan különbségek lehetségesek, amelyek tisztázása csak in situ hibridizációval lehetséges.

87

Hegyi és munkatársai eredményeivel ellentétben a periférián, a májban nem tapasztaltuk a génkiütés következményeként az Ob-Rb izoforma expressziójának csökkenését (Hegyi K és mtsai, 2004). Eredményeink különbözősége feltehetően metodikai, állattartási, és/vagy kísérleti körülmények közti eltérésekre vezethetők vissza. Az irodalomból ismert olyan állat, mely segítségével a perifériás receptor hiány vizsgálható, a centrális leptin-receptorok tökéletesen működnek, de a zsírszövetben, májban szinte teljesen működésképtelen Ob-Rb receptorok keletkeznek (Cre-Tam rendszer). Ebben az esetben is hiperleptinémia alakul ki, de elhízás, energiaháztartás-, termoregulációs zavar, valamint inzulin-rezisztencia nem következik be, tehát a centrális leptin szignalizáción kívüli tényezőknek is szerepe van az elhízás kialakulásában. Ilyen esetekben kompenzációs folyamat indul el, és a plazmában a kötött leptinszint jelentősen megemelkedik (Guo K és mtsai, 2007). A szérumban található szabad, hozzáférhető leptin koncentrációt elsősorban a szolubilis rövid izoforma (Ob-Re) mennyisége határozza meg (Murakami T és mtsai, 2001). Ezen receptorok szintjének változásával a magas leptin koncentrációból adódó hatások esetleg részben kivédhetőek, bár Ogier és munkatársai nagyszámú humán vizsgálat eredményeként azt találták, hogy túlsúlyos emberekben a szolubilis receptorok számának csökkenése fordítottan arányos a zsír mennyiségével (Ogier V és mtsai, 2002). A szolubilis receptor-leptin komplex a b izoformán keresztül gátolja a jelátvitelt, de a komplex forma nem kötődik és nem akadályozza meg a szabad leptin bekötését sem. A növekvő mennyiségű Ob-Re csökkenti a leptin hatását, így hozzájárul a lokális leptin-rezisztenciához és az elhízás kialakulásához (Chan JL és mtsai, 2002; Yang G és mtsai, 2004). A leptinhez más molekulák is képesek kötődni a vérben, pl. a clusterin és az alfa-makroglobulin, és ezek is befolyásolják a kötött-szabad leptin arányt, valamint a leptin eliminációját a vérből (Bajari TM és mtsai, 2003). Hegyi és munkatársai méréseinél a BALB/c hátterű HDC-/- egerek esetében magasabbnak bizonyult a szolubilis receptor mennyiség a szérumban. Western blot technikával tervezzük a CD1/129 hátterű egerek esetében a szolubilis receptor mennyiségi meghatározását. A periférián jelenlévő nagy mennyiségű leptin nem feltétlenül tudja befolyásolni a centrális szabályozás alatt álló folyamatokat. Ennek oka a periférián termelődő leptin bejutása a központi idegrendszerbe gátolt. A vér-agy gáton való átjutást segíti az Ob-Ra receptor izoforma, amely nagy mennyiségben található a choroid plexusban és a

88

mikroerek falában (Tartaglia LA és mtsai, 1995; Mercer JG és mtsai, 1996; Bjorbaek C és mtsai, 1998b; Hileman SM és mtsai, 2000). Ezzel szemben Kowalsky és munkatársai szerint csak Ob-Rb receptorral is létrejöhet a szignalizáció (Kowalski TJ és mtsai, 2001). Esetünkben az Ob-Ra hibás működését vagy hiányát közvetett bizonyítékok alapján zártuk ki: a leptin kezelést követően mind a vad, mind a hisztaminhiányos állatcsoportban bekövetkezett a STAT foszforiláció a hipotalamuszban, így a leptin bizonyosan átjutott a vér-agy gáton. A leptin-rezisztencia egyik kézenfekvő oka lehet a leptin-indukálta szignáltranszdukciós útvonalakban bekövetkező változás, mely megakadályozza a pontos szignalizációt, és jelátviteli módosulást okoz. A leptin-szignalizáció egyik kulcspontja a STAT foszforiláció és a foszforilált forma kötődése a leptin-receptorhoz (Hekerman P és mtsai, 2005). A központi idegrendszeri leptin-receptor STAT3-kötőhely hiánya, illetve a STAT3-fehérje mennyiségének csökkenése egerekben hiperfágiát és elhízást eredményez (Bates SH és mtsai, 2003; Gao Q és mtsai, 2007). Magas zsírtartalmú diétán tartott DIO egereknél kimutatták, hogy régióspecifikusan, csak az ARC területén csökken a STAT3-foszforiláció, de nem történik változás a VMH, DMH, PMN, NTS/DMV területeken (Munzberg H és mtsai, 2004). Ugyanakkor a terhesség alatt a VMH-ban csökken, míg az ARC-ban nem változik a leptin indukálta pSTAT3 immunpozitív sejtek száma (Ladyman SR és Grattan DR, 2005). Hegyi és mtsai BALB/c egerekben western blot technikával vizsgálták a STAT3 mennyiségét alap és tirozin-foszforilált formában, és nem találtak különbséget a HDC-/- és a vad genotípus között. Az irodalomban talált régióspecifikus eltérések, illetve a genetikai háttér különbözősége miatt szükségét éreztük annak, hogy a HDC-/- (CD1/129) egereknél immunhisztokémiai módszerek

alkalmazásával

vizsgáljuk

a

STAT-foszforilációt.

A

pSTAT3

immunhisztokémia vizsgálatok alapján elmondhatjuk, hogy a hisztaminhiányos egerek hipotalamuszában a nem tér el lényegesen a leptin-receptor hosszú izoformájának működőképessége, és a leptin hatására aktiválódott magcsoportok (arcuatus, ventromediális, dorzomediális mag) a vad típusú egereknél találtaknak megfelelőek. A STAT3-foszforiláció időgörbéje is hasonló a két állatcsoportban, bár a kisebb leptin dózis esetében a HDC-/- állatoknál enyhe késés volt megfigyelhető a jelölődésben.

89

A

leptin

indukálta

pSTAT-ot

immunhisztokémiai

reakcióval

vizsgáltuk

a

hipotalamuszon kívüli esetlegesen leptin-receptort expresszáló agyterületeket. A vad típusú és a hisztaminhiányos egerek között jelentős különbséget a dorzalis vágusz komplex terülén találtunk, ezen az agyterületen a HDC-/- egerekben pSTAT immunpozitív sejt gyakorlatilag nem található. Számos agyterületen – köztük a dorzalis vágusz komplexben is – leírták már a leptin- és az inzulin-receptor jelenlétét (Elmquist JK és mtsai, 1997; Grill HJ és Kaplan JM, 2001). Hosio és munkatársai a leptin direkt hatását is megfigyelték az agytörzsben, mert szisztémás kezelésre leptin-indukált STAT3- és SOCS3-expressziót találtak (Hosoi T és mtsai, 2002). A DVC területére patkány leptint hordozó rekombináns adeno-asszociált vírust adva megfigyelték, hogy a patkányok súlya nem növekedik, a fehérzsírszövet mennyisége csökken, és jelentősen csökken a szérumban a leptin és adiponektin koncentráció is. Ugyanakkor, ellentétben saját megfigyeléseinkkel, az inzulin- és glukóz-szint nem változik, sőt a kezelés a termoregulációs szabályozásra sincs hatással, az UPC-1 mRNS expressziója változatlan marad (Boghossian S és mtsai, 2006). A legújabb kutatások a dorzalis vágusz komplex területén leptin-receptor pozitív gliasejteket mutattak ki (Ob-Ra-c, és Ob-Rf). A főként rövid izoformát tartalmazó gliasejtek az area postrema (AP) és a nucleus tractus solitarius (NTS) határán vannak, és valószínűleg a leptin hatás agyba történő közvetítésében vesznek részt (Dallaporta M és mtsai, 2009). A leptin-rezisztencia oka lehet a leptin szignáltranszdukciós utakat gátló SOCS-fehérjék jelenléte is (Bjorbaek C és mtsai, 1998a). A táplálékfelvétel szabályozásáért felelős neuronokban a SOCS3 fokozott indukciója a leptinrezisztenciát fokozhatja. A SOCS3 mRNS és fehérje jelen van az arcuatus mag és a dorzomediális mag leptin-receptort tartalmazó sejtjeiben, függetlenül attól, hogy ezek orexigén vagy anorexigén neuropeptideket termelnek, sőt a SOCS3 molekula expresszióját leírták a DVC területén is. A hipotalamuszból ill. agytörzsből izolált RNS mintákon végzett SOCS3 PCR reakciók nem mutattak szignifikáns eltérést a vad és a HDC-/- állatcsoportok között, de a végleges igazoláshoz az irodalomban elfogadottabb valós idejű PCR reakciót tervezünk.

90

5.5. Centrális szabályozás - neuropeptidek Sok jel mutat arra, hogy a hisztaminerg neuronok kulcsszerepet játszanak a perifériás szignálok centrális szabályozásában, csak úgy mint a centrális, hipotalamikus szignálok perifériára történő eljuttatásában. A leptin hatása lehet direkt és indirekt is a hisztaminerg neuronokon, mivel a tuberomamillaris régió hisztaminerg neuronjai közül csak néhány sejt expresszál leptin-receptort (Hakansson ML és mtsai, 1998). Ugyanakkor szisztémás leptin injekciót követően ezeken a neuronokon c-fos immunhisztokémiai

jelölődés

látható.

Az

alacsony

leptin-receptorszám

miatt

feltételezzük, hogy a legtöbb hisztaminerg neuron nem direkt célpontja a leptin hatásnak, hanem a leptin főként más neuronális hálózatokon keresztül hat a hisztaminerg rendszerre (Elias CF és mtsai, 2000; Oliveira VX, Jr. és mtsai, 2005). Az általunk vizsgált HDC-/- egerek metabolikus fenotípusának megváltozásáért felelős lehet a hiányzó hipotalamikus hisztaminerg innerváció, valamint a hipotalamuszban található

orexigén

és

anorexigén

neuroncsoportok

hiperleptinémia

hatására

megváltozott leptin általi regulációja. A neuronális aktivációt a hisztaminra érzékeny területeken a hipotalamuszban a korai átíródó gének (immediate-early gene) csoportjába tartozó c-fos gén fehérje termékének kimutatásával, c-Fos immunhisztokémiával detektáltuk. Két órával az L-hisztidin adását követően a táplálkozás szabályozásában jelentőséggel bíró agyterületeken aktiválódtak a sejtek a vad típusú állatnál, de a hatás HDC-/- állatoknál elmaradt. Korábbi kísérletek alapján a leptinszint emelkedése az orexigén (NPY, AgRP, MCH) neuropeptidek expresszióját gátolja, az anorexigén (α-MSH, CRH, TRH, CART) neuropeptidek expresszióját pedig stimulálja az arcuatus magban (Thornton JE és mtsai, 1997; Schwartz MW és mtsai, 2000). Leptin-receptor megtalálható a hipotalamusz anorexigén POMC, CART, CRH neuropeptideket szintetizáló neuronjain és az orexigén NPY, MCH és orexin neuropeptideket szintetizáló neuronjain is (Cheung CC és mtsai, 1997; Baskin DG és mtsai, 1999; Hakansson M és mtsai, 1999; de Luca C és mtsai, 2005). Leírták továbbá, hogy a leptin nem csak a neuropeptidek expressziójára van hatással, hanem ezen neuropeptiek felszabadítására is. A leptinszint csökkenése mind az NPY, mind az AgRP neuropeptid felszabadítását növeli (Schwartz MW és mtsai, 2000; Breen TL és mtsai, 2005).

91

Az NPY és POMC neuronokra a leptin közvetlenül is hat. Ennek bizonyítéka, hogy ezen neuronok rendelkeznek leptin-receptorral és STAT3 foszforiláció is történik bennük (Hakansson ML és Meister B, 1998). Sőt, leptin hatására a POMC neuronok SOCS3-mat és cFos-t is expresszálnak, míg az NPY neuronokban csak SOCS3 fejeződik ki (Elias CF és mtsai, 1999). A leptin egy nem specifikus kation csatornán keresztül depolarizálja a POMC neuronokat és csökkenti a GABAerg gátló tónust a POMC sejtekben (Cowley MA és mtsai, 2001). A leptin-szenzitív neuronok a leptin hatását közvetítik a hisztaminerg rendszer felé. Így pl. α-MSH-t tartalmazó axonokról kimutatták, hogy a hisztaminerg neuronokat innerválják, axo-szomatikus, axo-dendritikus (szinaptikus) kapcsolat van közöttük (Fekete C és Liposits Z, 2003). Valószínű azonban, hogy a hisztamin túlnyomórészt nem szinaptikus kapcsolatokban szabadul fel, mert a célrégióban az axonok varikozitása jelentős, de kevés számú szinaptikus kapcsolat figyelhető meg, amely non-szinaptikus release-re utal (Diewald L és mtsai, 1997). A beidegzés kölcsönös, hisztaminerg rostok nagy számban mutathatók ki az arcuatus mag területén és a hisztamin hatással van számos hipotalamikus magban termelődő orexigén és anorexigén neuropeptid expressziójára. Miklós Ildikó munkatársam az arcuatus mag elektromikroszkópos vizsgálatakor NPY-t tartalmazó neuronok közelében hisztaminerg rostokat mutatott ki. A hipotalamuszban az orexint és a hisztamint tartalmazó neuronok kapcsolata is kölcsönös. A laterális hipotalamuszban hisztamint szintetizáló neuronok beidegzik az orexinogén neuronokat, miközben az orexin A és B posztszinaptikus receptorai aktiválásán keresztül depolarizálja a tuberomamillaris régió hisztaminerg neuronjait, növeli a tüzelési frekvenciájukat (Eriksson KS és mtsai, 2001). Mindezen sokrétű kapcsolat feltételezi, hogy a HDC-/- egerek esetében a magas leptinszint és a hipotalamuszban hiányzó - egyébként erőteljes - hisztaminerg innerváció, valamint az ott található orexigén és anorexigén neuroncsoportok esetlegesen megváltozott regulációja hatással lehet a hisztaminhiányos egerek metabolikus fenotípusára. Vizsgálataink azonban azt mutatták, hogy a sokrétű kapcsolat ellenére a hisztaminhiány nem okozott változást az arcuatus mag POMC-, NPYexpressziójában, és az orexin gén expressziója sem változott meg a laterális hipotalamuszban. Feltételezhető tehát, hogy a centrális hisztaminhiány nem ezeken a neuropeptideken és/vagy nem a hipotalamuszban fejti ki a hatását a metabolikus

92

szabályozásra. Eredményeinknek ellentmondó adatokat közöltek Jorgensen és munkatársai, akik real-time PCR segítségével vizsgálták normál tápon tartott C57BL/6J genetikai hátterű egerek NPY mRNS génexpresszióját a hipotalamuszban, és a HDC-/állatok esetében jelentős (4,3 ± 1,1-szeres) emelkedést találtak, mely megnövekedett NPY mRNS mennyiség icv orexin-A adásával nem volt fokozható. Fontos megjegyezni, hogy a teljes hisztamin-mentességet ennél a kísérletnél nem biztosították, hiszen az állatok normál tápot kaptak (Jorgensen EA és mtsai, 2005). Fontos megjegyezni, hogy a hipotalamuszban még számos táplálkozással kapcsolatos neuropeptidet termelő neuroncsoportot találunk, ezért nem állíthatjuk, hogy a hisztaminhiány a táplálkozással kapcsolatos neuropeptidek szabályozására nincs hatással.

5.6. Hím HDC-/- egerek reprodukciós funkciójának megváltozása Az első megfigyelések között szerepelt, hogy a HDC-/- egerek a születései mendeli eloszlást mutattak, ám az egerek fertilitása, szaporodása eltér a vad típusú ugyanilyen genetikai háttérrel rendelkező CD1/129Sv állatoktól (Ohtsu H és mtsai, 2001). Mint a fentebb leírtakból is láthatjuk, a hisztamin számos más biológiailag aktív anyaggal (leptin, inzulin) áll kapcsolatban a szervezetben, pl. a szteroidok közül a glukokortikoidokkal is (Oh C és Nakano K, 1988). Ennek alapján feltételeztük és vizsgáltuk a lehetséges kapcsolatot a hisztamin és a főbb androgén hormonok regulációja között. A hím HDC-/- egyedek heremérete a vad típushoz képest valamivel kisebb volt. A hisztaminhiányos állatok szérum tesztoszteron-szintje jelentős, kétszeres emelkedést mutatott a vad típushoz viszonyítva, melynek szabályozása a hipotalamusz-hipofízistesztisz regulációs rendszer megváltozásával függhet össze. A hisztamin centrális szabályozásának vizsgálataként a hipotalamusz GnRH expresszióját vizsgáltuk in situ hibridizációval. A hisztaminhiányos állatokban a centrális és perifériás HDC hiánya nem okozott szignifikáns eltérést a GnRH neuronok elhelyezkedésében. Találtunk GnRH-pozitív sejteket a rostromedialis preoptikus areában és az elülső hipotalamuszban, valamint a Broca-féle diagonális kötegben és a mediális septumban is (Levine JE és mtsai, 1991). Bár morfológiai és farmakológiai bizonyíték is van arra, hogy a hisztamin közvetve szerepet játszik a GnRH neuronok

93

szabályozásában (Noris G és mtsai, 1995; Fekete CS és mtsai, 1999), eredményeink nem támasztják alá, hogy hím HDC-/- egerek reprodukciós funkciója és szexuál-szteroid szekréciója függ a hipotalamikus GnRH expressziótól. Az expressziós szintben történt enyhe változás oka lehet a szérum tesztoszteron szint emelkedése és/vagy a hisztamin hiánya. Wiemann és munkatársai leírták, hogy tesztoszteron szint változásával nem változott a GnRH expresszió, míg más kutatók szerint a tesztoszteron stimulálja az expresszió mértékét (Park Y és mtsai, 1988; Wiemann JN és mtsai, 1990). A herében és a mellékvesében, mint a két fő tesztoszteront termelő szövetben mértük az androgén hormonok szintjét. Mayerhofer és munkatársai leírták, hogy a hisztamin stimulálja a tesztoszteron szintézist aranyhörcsögökben in vivo (Mayerhofer A és mtsai, 1989). Ezzel ellentétben saját kísérleteinkben a hisztaminhiányos egerekben is emelkedett a here szteroid szintje. A szérum tesztoszteron-szint emelkedését magyarázhatja

a

herében

jelentősen

megemelkedett

tesztoszteron-szint.

A

hisztaminhiányos állatoknál a herében megemelkedett a DHEAS, DHEA, AD, tesztoszteron és DHT koncentráció is, ugyanakkor a 17-OH-progeszteron szintje nem változott. Mindez arra utal, hogy 17-OH-pregnelolon-DHEA szinten történt az androgén szteroid szintézis felé az eltolódás. A vér tesztoszteron-szintje függ a here sejtjeiben lévő szteroidnak DHT és/vagy ösztradiol irányba történő átalakulásától csakúgy, mint a szteroid májban történő metabolizmustól (MacDonald PC és mtsai, 1979). Az ösztradiol szintézist katalizáló citokróm-P450 aromatáz enzim és a hisztamin kapcsolatát korábban leírták (Brandes LJ és mtsai, 1998; LaBella FS és mtsai, 2000). A HDC-/- állatok szérum ösztradiol szintje csak enyhén emelkedett, és a citokróm-P450 aromatáz enzim génexpressziós

szintje

is

közel

a

kontroll

szintet

mutatta.

Mindebből

arra

következtethetünk, hogy nem az aromatáz enzim hiánya okozta a megemelkedett tesztoszteron szintet, hanem inkább a HDC-/- állatok heréjében a szteroid termelődés aktivációjának

általános

növekedése

áll

a

háttérben.

Ezt

támasztja

alá

a

hisztaminhiányos állatok heréjének ultrastruktúrájában megfigyelt változás is. Az elektromikroszkópos képek alapján elmondhatjuk, hogy hisztaminnak fontos hatása van a Leydig-sejtek morfológiájára és funkciójára. A hisztamin hiánya „elzsírosodás”-hoz és a durva felszínű endoplazmás retikulum (RER) membrán képletek ultrastruktúrális változásaihoz vezet. Pap Erna és munkatársai ilyen irányban folytatott kísérletei és in

94

vitro munkájuk kimutatta, hogy a hisztamin direkt módon befolyásolja a Leydig-sejtek funkcióját és a here szteroid szintézisét (Mondillo C és mtsai, 2007). Emellett a HDC-/- egereknél megfigyelt here súlycsökkenés oka lehet a fejlődéskori hisztaminhiányos állapot is. Mind rágcsálókban, mind emberben leírták, hogy a gonád hízósejtjei hisztamint szecernálnak a herében. A fejlődésben fontos szerepet játszhat, hogy a fejletlen here hisztamin szintje magasabb, mint a kifejlett egyedeké (Zieher LM és mtsai, 1971; Nistal M és mtsai, 1984; Albrecht M és mtsai, 2005). Az egyéb fenotípusos változások oka is lehet a korai fejlődés alatti hisztaminhiányos állapot. A saját kísérleti rendszerünkben az állatok tenyésztésekor és fejlődése során normál tápon tartottuk a hisztaminhiányos egereket is, de a placenta HDC aktivitása közel ezerszerese más szervekéhez viszonyítva. Arról azonban nincs adatunk, hogy a placentán átmegy-e a hisztamin, és szinte bizonyos, hogy a hisztamin-dús diétával (normál táppal) nem lehet teljes mértékben pótolni a placentában lokálisan termelődő hisztamint, mely hiánya bizonyított a HDC-/- állatoknál.

95

6. Következtetések A hisztaminhiányos, következtetések:

HDC-/-

egereken

végzett

vizsgálatainkból

levonható

9 A hisztaminhiány következtében az energiaháztartás szabályozásának zavarát figyelhetjük meg: • Az állatok idősebb korban elhíznak, az epididimalis zsírszövet mennyisége, annak ellenére, hogy táplálékfogyasztásuk elmarad a vad típuséhoz képest, jelentősen megnő, így kalorikus efficiencia értékük emelkedik. • Hisztamin hiányában az energiamobilitás képessége sérül: hideg és éheztetés hatására a termoregulációs válaszuk nem megfelelő, illetve a zsírraktárak mobilizálási képessége is elmarad a vad típusú állatokétól. Megvizsgáltuk

a

metabolikus

fenotípus

kialakulásában

szerepet

játszó,

az

energiametabolizmus szabályozókör különböző szintjén lévő és egymással kapcsolatban álló elemeket. A periférián: 9 A HDC-/- állatoknál a hisztaminhiány következményeként metabolikus szignálok zavara figyelhető meg, feltehetően a leptin, ill. inzulin és a hisztamin között fennálló negatív visszacsatolás hiánya miatt: • Az anorexigén inzulin-szignál zavarát és az inzulin-érzékenység csökkenését tapasztaltuk, de mind a glükóz tolerancia tesztre adott válasz, mind az éheztetésre adott inzulin-szekréciós válasz a WT állatéhoz hasonló. • A vérben kórosan emelkedett leptin koncentrációt mértünk, mely éheztetés hatására sem csökkent. 9 A magas leptinszintet részben magyarázza a HDC-/- egerekben megnövekedett epididimalis zsír mennyisége. 9 A hiperleptinémia kialakulásának oka nem a leptin gén expressziójának növekedése a zsírszövetekben. A központi idegrendszerben: 9 A hiperleptinémiát nem a jelátvitelre képes hosszú izoformájú leptin-receptor expressziójának csökkenése okozza a hipotalamuszban.

96

9 A

leptin-receptor

központi

idegrendszerben

történő

működőképességének

vizsgálatakor, a JAK-STAT jelátviteli útvonalban szerepet játszó foszforilált STAT mennyiségét határoztuk meg. • A pSTAT koncentráció nem különbözött a vad és HDC-/- állatok arcuatus magjában. • Az agytörzsben, a DVC területén a HDC-/- állatoknál immunpozitív sejtet nem találtunk, így mondhatjuk, hogy részben a DVC területén levő sejtek felelősek a leptin hatás nem megfelelő közvetítéséért. 9 A hipotalamusz területén nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a táplálékfelvétel szabályozásában résztvevő anorexigén (POMC) és orexigén (NPY és orexin) neuropeptidek expressziójában a vad típusú és a HDC-/- egerek között. A szabályozó kör más elemeinek (további neuropeptidek, SOCS3, Ob-Re) vizsgálata a további kutatások feladata lesz. Ezek segítségével pontosan meghatározhatjuk a hisztaminhiányos

egér

metabolikus

fenotípusának

kialakulásáért

felelős

mechanizmusokat. A HDC-/- egerek fertilitása, szaporodása eltér a vad típusú egyedektől, mert bár az almok mendeli eloszlást mutatnak, kisebb a szaporulat és lényegesen kevesebb a sikeres szaporodások száma. Kutatásunk során vizsgáltuk a hisztamin és a főbb androgének regulációja közötti összefüggéseket. 9 Hím, hisztaminhiányos egerek vér tesztoszteron-szintje kétszer magasabb, mint vad típusú állatoké. 9 Ez a megemelkedett tesztoszteron szint együtt jár a Leydig-sejtek ultrastrukturális változásával, azok elzsírosodásával és a kifejezettebb durva felszínű endoplazmás retikulum (RER) membrán képletek kialakulásával. 9 A GnRH hipotalamikus expressziója nem tér el a két állatcsoportban, így a hím egerek megemelkedett androgén-szteroid szintje valószínűleg nem függ a HDC-/egereknél a GnRH neuronok hisztaminerg szabályozásától.

97

Összefoglalás Vizsgálatainkban

a

hisztaminnak

a

táplálékfelvétel

és

az

energiametabolizmus

szabályozásában betöltött szerepét tanulmányoztuk vad típusú (WT) és hisztamin szintézisére képtelen, hisztidin-dekarboxiláz génkiütött (HDC-/-) egereken. Megállapítottuk, hogy a hisztaminhiányos egerek idősebb korban elhíznak, viszcerális zsírszövetük mennyisége megnő, vérükben magas a leptin koncentrációja, vércukorszabályozásuk

zavart,

valamint

hideg

környezetben

képtelenek

a

megfelelő

energiamobilizálásra. A vér magas leptin koncentrációja lehet a zsírszöveti leptin-expresszió megnövekedésének eredménye, ezért real-time PCR módszerrel vizsgáltuk a leptinexpressziót WT és HDC-/- egerek különféle (epididimalis bőralatti és barna) zsírszövet mintáiban. Nem volt szignifikáns különbség a WT és a HDC-/- csoport között, tehát a magas leptinszint a megnövekedett zsírtömeggel magyarázható, és nem a leptin-expressziójának megváltozásával. Mivel emberen az elhízás magas leptin-koncentráció mellett leptinrezisztenciával jár, megvizsgáltuk a leptin-receptor szignalizáló formájának expresszióját az egerek hipotalamuszában. Ez nem különbözött a vad és a hisztamin hiányos állatok esetében. A leptin-receptor központi idegrendszerben történő hatásának vizsgálatakor, a másodlagos jelátvitelben fontos foszforilált STAT mennyiségében a táplálékszabályozásban arcuatus magban nem volt különbség a két genotípus között, ugyanakkor az agytörzsben, a dorzalis vagus komplex területén a HDC-/- állatokban nem találtunk immunpozítív sejteket. Így feltételezhető, hogy ezek a sejtek felelősek a leptin hatás hibás közvetítéséért. Mivel nagyszámú hisztaminerg végződés található az arcuatus mag orexigén (NPY, orexin) és anorexigén (POMC) neuronjainak közelében, in situ hibridizációs hisztokémiai módszerrel megvizsgálatuk, hogy vajon ezen neuropeptidek expressziója hisztaminerg szabályozás alatt áll-e. A neuropeptidek expressziós mintázatában a hipotalamusz területén nem találtunk különbséget a két genotípus között. A fentiek mellett a HDC-/- egerek fertilitása és szaporodása csökkent, emelkedett a tesztoszteron szintjük és a gén kiütött állatokban a Leydig-sejtek ultrastruktúrája is megváltozott. A fenti megfigyelések hozzájárulnak a hisztamin rendszer energiahomeosztázist szabályozó, moduláló, szerepének tisztázásához és ezzel az elhízás folyamatának jobb megismeréséhez.

98

Summary We studied the role of histamine in the regulation of food intake and energy metabolism in wild-type (WT) mice and in histidine decarboxylase knock-out (HDC-/-) mice incapable of histamine synthesis. We observed that histamine deficient mice grow fat with age. The amount of visceral adipose tissue increases, blood leptin concentration is high, blood glucose regulation is perturbed, and mice are not capable of appropriate energy mobilization in cold environment. High blood leptin concentration may be due to an increase in leptin expression in the adipose tissue, therefore we measured leptin mRNA abundance by real-time PCR in different (epididymal, subcutaneous and brown) adipose tissue samples in WT and HDC-/- mice. There was no significant difference between WT and HDC-/- animals. Hence, higher leptin level is explained by the presence of more adipose tissue and not by a change in leptin expression. Since obesity in humans is associated with higher leptin concentrations as well as leptin resistance, we studied the expression of the signaling form of leptin receptor in the hypothalamus of mice. There was no difference between WT and histamine deficient animals. We studied the effects of leptin receptor activation on the amount of phosphorylated STAT, an important signaling component, in the central nervous system. In nucleus arcuatus there was no difference in the amount of phosphorylated STAT between the two genotypes. However, in the brainstem, within the dorsal vagal complex of HDC-/- mice, there were no immunopositive cells. Therefore, presumably these cells are responsible for mediating defective leptin action. As a great number of histaminergic synapses are present near the orexigenic (NPY, orexin) and anorexigenic (POMC) neurons of nucleus arcuatus, we used in situ hybridization to study whether the expression of these neuropeptides was under histaminergic regulation. We found no difference between the two genotypes in the expression pattern of neuropeptides in the hypothalamus. In addition, HDC-/- mice had reduced fertility and reproduction, elevated testosterone levels, and Leydig cells had ultrastructural alterations. Our observations contribute to a better understanding of the homeostatic role of the histamine system and of the development of obesity.

99

Melléklet Real-Time PCR adatainak feldolgozása – Komperatív CT-módszer Az egyenlet, amivel kiszámolhatjuk egy adott gén expressziójának az endogén referenciához normalizált és az általunk választott kalibrátorhoz viszonyított mennyiségét: 2-∆∆Ct Az egyenlet levezetése: Xn=X0 x (1+Ex)n az exponenciális szakaszon történő amplifikáció egyenlete, ahol: Xn X0 Ex n

= = = =

a vizsgált molekula száma a n-edik ciklusban a vizsgált molekula kezdeti mennyisége a vizsgált molekula amplifikációjának hatékonysága ciklusok száma

A mérés után megállapítottunk egy threshold ciklust (CT), ahol minden párhuzamosan vizsgált molekula az exponenciális fázisban volt: XT=X0 x (1+Ex)CT,x= KX

, ahol:

XT = a vizsgált molekula mennyisége a threshold ciklusban CT,X = threshold ciklus a vizsgált amplifikáció során KX = konstans Hasonló az egyenlet az endogén referencia vizsgálatára is: RT = R0 x (1+ER)Ct,r = KR RT R0 ER KR

= = = =

, ahol:

a referencia molekula mennyisége a threshold ciklusban a referencia molekula kezdeti mennyisége a referencia molekula amplifikációjának hatékonyága konstans

XT -t elosztva RT-vel egy K konstanst kapunk. XT / RT = X0 x (1+Ex)Ct,x / R0 x (1+ER)Ct,r = KX / KR = K XT és RT pontos értéke több faktortól függ: - a mérések során használt riportermolekulától (pl. TaqMan) - a szonda szekvenciafüggő fluoreszcens tulajdonságaitól - a szonda hasításának hatékonyságától - a szonda tisztaságától - a fluorescens threshold megadásától

100

Ezen okok miatt a K konstans értékének nem kell egynek lennie. Feltételezzük, hogy a vizsgált és a referencia molekulák amplifikációjának hatékonysága azonos Ex = ER = E X0 / R0 x (1+E)Ct,x-Ct,r = K vagyis X-N x (1+E)∆Ct = K

, ahol:

X-N = X0 / R0, a vizsgált molekula referenciához normalizált mennyisége ∆Ct = Ct,x-Ct,r, a vizsgált molekula és a referenciamolekula threshold ciklusának különbsége Összegezve az egyenleteket: X-N = K x (1+E)-∆Ct Utolsó lépésként egy bármely q minta XN-jét elosztjuk a kalibrátor (cb) XN-vel (esetünkben ez a párhuzamos vad típusú minta) XN,q / XN,cb = K x (1+E)-∆Ct,q / (1+E)-∆Ct,cb = (1+E)-∆∆Ct

, ahol:

∆∆Ct = ∆Ct,q- ∆Ct,cb Az Applied BioSystem által optimalizált amplikonméret esetén (≤150bp) az efficiencia 1 körüli. Ezért a vizsgált molekula mennyisége, az endogén referenciára normalizálva és a kalibrátorhoz viszonyítva: 2- ∆∆Ct A pontos számításokhoz a vizsgált molekula és a referenciamolekula amplifikációjának hatásfoka hasonló kell legyen. A standard deviáció kiszámolása: A ∆CT értékét úgy kapjuk meg, ha kivonjuk a referencia anyag CT értékét a vizsgált molekula átlag CT értékéből. A különbség összegzett standard deviációját (s) a következő egyenlettel számoltuk ki: s=√(s12+s22) vagyis az endogén kontrollhoz (háztartási génhez) viszonyított génexpressziós értékek 2- ∆∆Ct−S és 2- ∆∆Ct+S között vannak

101

Irodalomjegyzék Abbott CR, Rossi M, Wren AM, Murphy KG, Kennedy AR, Stanley SA, Zollner AN, Morgan DG, Morgan I, Ghatei MA, Small CJ,Bloom SR (2001). Evidence of an orexigenic role for cocaine- and amphetamine-regulated transcript after administration into discrete hypothalamic nuclei. Endocrinology 142(8): 345763. Abe H, Honma S, Ohtsu H,Honma K (2004). Circadian rhythms in behavior and clock gene expressions in the brain of mice lacking histidine decarboxylase. Brain Res Mol Brain Res 124(2): 178-87. Acevedo SF, Pfankuch T, Ohtsu H,Raber J (2005). Anxiety and cognition in female histidine decarboxylase knockout (Hdc(-/-)) mice. Behav Brain Res. Ahima RS, Prabakaran D,Flier JS (1998). Postnatal leptin surge and regulation of circadian rhythm of leptin by feeding. Implications for energy homeostasis and neuroendocrine function. J Clin Invest 101(5): 1020-7. Albrecht M, Frungieri MB, Gonzalez-Calvar S, Meineke V, Kohn FM,Mayerhofer A (2005). Evidence for a histaminergic system in the human testis. Fertil Steril 83(4): 1060-3. Asnicar MA, Smith DP, Yang DD, Heiman ML, Fox N, Chen YF, Hsiung HM,Koster A (2001). Absence of cocaine- and amphetamine-regulated transcript results in obesity in mice fed a high caloric diet. Endocrinology 142(10): 4394-400. Attoub S, Moizo L, Sobhani I, Laigneau JP, Lewin MJ,Bado A (2001). The H3 receptor is involved in cholecystokinin inhibition of food intake in rats. Life Sci 69(4): 469-78. Auernhammer CJ, Bousquet C,Melmed S (1999). Autoregulation of pituitary corticotroph SOCS-3 expression: characterization of the murine SOCS-3 promoter. Proc Natl Acad Sci U S A 96(12): 6964-9. Backberg M, Hervieu G, Wilson S,Meister B (2002). Orexin receptor-1 (OX-R1) immunoreactivity in chemically identified neurons of the hypothalamus: focus on orexin targets involved in control of food and water intake. The European journal of neuroscience 15(2): 315-28. Bagdade JD, Bierman EL,Porte D, Jr. (1967). The significance of basal insulin levels in the evaluation of the insulin response to glucose in diabetic and nondiabetic subjects. The Journal of clinical investigation 46(10): 1549-57. Bajari TM, Strasser V, Nimpf J,Schneider WJ (2003). A model for modulation of leptin activity by association with clusterin. The FASEB journal 17(11): 1505-7. Banks AS, Davis SM, Bates SH,Myers MG, Jr. (2000). Activation of downstream signals by the long form of the leptin receptor. J Biol Chem 275(19): 14563-72. Baskin DG, Breininger JF,Schwartz MW (1999). Leptin receptor mRNA identifies a subpopulation of neuropeptide Y neurons activated by fasting in rat hypothalamus. Diabetes 48(4): 828-33. Bates SH, Stearns WH, Dundon TA, Schubert M, Tso AW, Wang Y, Banks AS, Lavery HJ, Haq AK, Maratos-Flier E, Neel BG, Schwartz MW,Myers MG, Jr. (2003). STAT3 signalling is required for leptin regulation of energy balance but not reproduction. Nature 421(6925): 856-9. Baura GD, Foster DM, Porte D, Jr., Kahn SE, Bergman RN, Cobelli C,Schwartz MW (1993). Saturable transport of insulin from plasma into the central nervous

102

system of dogs in vivo. A mechanism for regulated insulin delivery to the brain. The Journal of clinical investigation 92(4): 1824-30. Beck B (2000). Neuropeptides and obesity. Nutrition 16(10): 916-23. Beck B, Richy S, Dimitrov T,Stricker-Krongrad A (2001). Opposite regulation of hypothalamic orexin and neuropeptide Y receptors and peptide expressions in obese Zucker rats. Biochem Biophys Res Commun 286(3): 518-23. Benoit SC, Clegg DJ, Seeley RJ,Woods SC (2004). Insulin and leptin as adiposity signals. Recent progress in hormone research 59: 267-85. Berthoud HR (2002). Multiple neural systems controlling food intake and body weight. Neurosci Biobehav Rev 26(4): 393-428. Bjorbaek C, Elmquist JK, Frantz JD, Shoelson SE,Flier JS (1998a). Identification of SOCS-3 as a potential mediator of central leptin resistance. Molecular cell 1(4): 619-25. Bjorbaek C, Elmquist JK, Michl P, Ahima RS, van Bueren A, McCall AL,Flier JS (1998b). Expression of leptin receptor isoforms in rat brain microvessels. Endocrinology 139(8): 3485-91. Bjornholm M, Munzberg H, Leshan RL, Villanueva EC, Bates SH, Louis GW, Jones JC, Ishida-Takahashi R, Bjorbaek C,Myers MG, Jr. (2007). Mice lacking inhibitory leptin receptor signals are lean with normal endocrine function. The Journal of clinical investigation 117(5): 1354-60. Boden G, Chen X, Mozzoli M,Ryan I (1996). Effect of fasting on serum leptin in normal human subjects. J Clin Endocrinol Metab 81(9): 3419-23. Bodis J, Koppan M, Kornya L, Tinneberg HR,Torok A (2002). The effect of catecholamines, acetylcholine and histamine on progesterone release by human granulosa cells in a granulosa cell superfusion system. Gynecol Endocrinol 16(4): 259-64. Bodis J, Tinneberg HR, Schwarz H, Papenfuss F, Torok A,Hanf V (1993). The effect of histamine on progesterone and estradiol secretion of human granulosa cells in serum-free culture. Gynecol Endocrinol 7(4): 235-9. Boghossian S, Lecklin A, Dube MG, Kalra PS,Kalra SP (2006). Increased leptin expression in the dorsal vagal complex suppresses adiposity without affecting energy intake and metabolic hormones. Obesity (Silver Spring) 14(6): 1003-9. Brabant C, Quertemont E, Anaclet C, Lin JS, Ohtsu H,Tirelli E (2007). The psychostimulant and rewarding effects of cocaine in histidine decarboxylase knockout mice do not support the hypothesis of an inhibitory function of histamine on reward. Psychopharmacology (Berl) 190(2): 251-63. Brandes LJ, Queen GM,LaBella FS (1998). Potent interaction of histamine and polyamines at microsomal cytochrome P450, nuclei, and chromatin from rat hepatocytes. J Cell Biochem 69(3): 233-43. Breen TL, Conwell IM,Wardlaw SL (2005). Effects of fasting, leptin, and insulin on AGRP and POMC peptide release in the hypothalamus. Brain research 1032(12): 141-8. Brown RE, Stevens DR,Haas HL (2001). The physiology of brain histamine. Prog Neurobiol 63(6): 637-72. Bugajski J,Gadek A (1981). The involvement of central histamine receptors in stressinduced responses of serum corticosterone and free fatty acids and in gastric ulcer development. Agents and actions 11(1-2): 151-5.

103

Bugajski J,Janusz Z (1981). Lipolytic responses induced by intracerebroventricular administration of histamine in the rat. Agents Actions 11(1-2): 147-50. Burguera B, Couce ME, Long J, Lamsam J, Laakso K, Jensen MD, Parisi JE,Lloyd RV (2000). The long form of the leptin receptor (OB-Rb) is widely expressed in the human brain. Neuroendocrinology 71(3): 187-95. Campfield LA, Smith FJ, Guisez Y, Devos R,Burn P (1995). Recombinant mouse OB protein: evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks. Science 269(5223): 546-9. Carpene C, Morin N, Fontana E, Visentin V, Prevot D, Marti L,Lafontan M (2001). Histamine weakly stimulates lipolysis and is poorly oxidized by amine oxidases in human subcutaneous fat cells. Inflamm Res 50 Suppl 2: S140-1. Ceddia RB, Koistinen HA, Zierath JR,Sweeney G (2002). Analysis of paradoxical observations on the association between leptin and insulin resistance. Faseb J 16(10): 1163-76. Chan JL, Bluher S, Yiannakouris N, Suchard MA, Kratzsch J,Mantzoros CS (2002). Regulation of circulating soluble leptin receptor levels by gender, adiposity, sex steroids, and leptin: observational and interventional studies in humans. Diabetes 51(7): 2105-12. Chen Z, Li Z, Sakurai E, Izadi Mobarakeh J, Ohtsu H, Watanabe T, Iinuma K,Yanai K (2003). Chemical kindling induced by pentylenetetrazol in histamine H(1) receptor gene knockout mice (H(1)KO), histidine decarboxylase-deficient mice (HDC(-/-)) and mast cell-deficient W/W(v) mice. Brain Res 968(1): 162-6. Cheung CC, Clifton DK,Steiner RA (1997). Proopiomelanocortin neurons are direct targets for leptin in the hypothalamus. Endocrinology 138(10): 4489-92. Chomczynski P,Sacchi N (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162(1): 156-9. Clark WG,Cumby HR (1976). Biphasic changes in body temperature produced by intracerebroventricular injections of histamine in the cat. J Physiol 261(1): 23553. Cohen P, Zhao C, Cai X, Montez JM, Rohani SC, Feinstein P, Mombaerts P,Friedman JM (2001). Selective deletion of leptin receptor in neurons leads to obesity. The Journal of clinical investigation 108(8): 1113-21. Coleman DL (1973). Effects of parabiosis of obese with diabetes and normal mice. Diabetologia 9(4): 294-8. Colucci R, Fleming JV, Xavier R,Wang TC (2001). L-histidine decarboxylase decreases its own transcription through downregulation of ERK activity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281(4): G1081-91. Cone RD (1999). The Central Melanocortin System and Energy Homeostasis. Trends Endocrinol Metab 10(6): 211-216. Considine RV, Sinha MK, Heiman ML, Kriauciunas A, Stephens TW, Nyce MR, Ohannesian JP, Marco CC, McKee LJ, Bauer TL,et al. (1996). Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med 334(5): 292-5. Cowley MA, Smart JL, Rubinstein M, Cerdan MG, Diano S, Horvath TL, Cone RD,Low MJ (2001). Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature 411(6836): 480-4.

104

Dale HH,Laidlaw PP (1910). The physiological action of -imidazolylethylamine. J. Physiol. (Lond.)(41): 318-344. Dallaporta M, Pecchi E, Pio J, Jean A, Horner KC,Troadec JD (2009). Expression of leptin receptor by glial cells of the nucleus tractus solitarius: possible involvement in energy homeostasis. J Neuroendocrinol 21(1): 57-67. de Luca C, Kowalski TJ, Zhang Y, Elmquist JK, Lee C, Kilimann MW, Ludwig T, Liu SM,Chua SC, Jr. (2005). Complete rescue of obesity, diabetes, and infertility in db/db mice by neuron-specific LEPR-B transgenes. The Journal of clinical investigation 115(12): 3484-93. Dere E, De Souza-Silva MA, Spieler RE, Lin JS, Ohtsu H, Haas HL,Huston JP (2004). Changes in motoric, exploratory and emotional behaviours and neuronal acetylcholine content and 5-HT turnover in histidine decarboxylase-KO mice. Eur J Neurosci 20(4): 1051-8. Dere E, De Souza-Silva MA, Topic B, Spieler RE, Haas HL,Huston JP (2003). Histidine-decarboxylase knockout mice show deficient nonreinforced episodic object memory, improved negatively reinforced water-maze performance, and increased neo- and ventro-striatal dopamine turnover. Learn Mem 10(6): 510-9. Devaskar SU, Ollesch C, Rajakumar RA,Rajakumar PA (1997). Developmental changes in ob gene expression and circulating leptin peptide concentrations. Biochem Biophys Res Commun 238(1): 44-7. Devos R, Guisez Y, Van der Heyden J, White DW, Kalai M, Fountoulakis M,Plaetinck G (1997). Ligand-independent dimerization of the extracellular domain of the leptin receptor and determination of the stoichiometry of leptin binding. J Biol Chem 272(29): 18304-10. Diewald L, Heimrich B, Busselberg D, Watanabe T,Haas HL (1997). Histaminergic system in co-cultures of hippocampus and posterior hypothalamus: a morphological and electrophysiological study in the rat. The European journal of neuroscience 9(11): 2406-13. Dy M,Schneider E (2004). Histamine-cytokine connection in immunity and hematopoiesis. Cytokine Growth Factor Rev 15(5): 393-410. Elenkov IJ, Webster E, Papanicolaou DA, Fleisher TA, Chrousos GP,Wilder RL (1998). Histamine potently suppresses human IL-12 and stimulates IL-10 production via H2 receptors. J Immunol 161(5): 2586-93. Elias CF, Aschkenasi C, Lee C, Kelly J, Ahima RS, Bjorbaek C, Flier JS, Saper CB,Elmquist JK (1999). Leptin differentially regulates NPY and POMC neurons projecting to the lateral hypothalamic area. Neuron 23(4): 775-86. Elias CF, Kelly JF, Lee CE, Ahima RS, Drucker DJ, Saper CB,Elmquist JK (2000). Chemical characterization of leptin-activated neurons in the rat brain. J Comp Neurol 423(2): 261-81. Elmquist JK (2001). Hypothalamic pathways underlying the endocrine, autonomic, and behavioral effects of leptin. Physiol Behav 74(4-5): 703-8. Elmquist JK, Ahima RS, Maratos-Flier E, Flier JS,Saper CB (1997). Leptin activates neurons in ventrobasal hypothalamus and brainstem. Endocrinology 138(2): 839-42. Elmquist JK, Bjorbaek C, Ahima RS, Flier JS,Saper CB (1998). Distributions of leptin receptor mRNA isoforms in the rat brain. J Comp Neurol 395(4): 535-47. Elmquist JK, Elias CF,Saper CB (1999). From lesions to leptin: hypothalamic control of food intake and body weight. Neuron 22(2): 221-32.

105

Erickson JC, Clegg KE,Palmiter RD (1996a). Sensitivity to leptin and susceptibility to seizures of mice lacking neuropeptide Y. Nature 381(6581): 415-21. Erickson JC, Hollopeter G,Palmiter RD (1996b). Attenuation of the obesity syndrome of ob/ob mice by the loss of neuropeptide Y. Science 274(5293): 1704-7. Eriksson KS, Sergeeva O, Brown RE,Haas HL (2001). Orexin/hypocretin excites the histaminergic neurons of the tuberomammillary nucleus. The Journal of neuroscience 21(23): 9273-9. Esbenshade TA, Browman KE, Bitner RS, Strakhova M, Cowart MD,Brioni JD (2008). The histamine H3 receptor: an attractive target for the treatment of cognitive disorders. Br J Pharmacol 154(6): 1166-81. Falus A (1993). Interleukin-6 biosynthesis is increased by histamine in human B-cell and glioblastoma cell lines. Immunology 78(2): 193-6. Falus A (2004). Histamine: Biology and Medical Aspects. Svájc, SpringMed Kiadó. Falus A,Kovacs KJ (2002). Histamine is a multicoloured player in many physiological functions; it has a significant role in regulation of white adipose tissue and food intake. Eur J Clin Invest 32(4): 221-2. Fan W, Boston BA, Kesterson RA, Hruby VJ,Cone RD (1997). Role of melanocortinergic neurons in feeding and the agouti obesity syndrome. Nature 385(6612): 165-8. Faust IM, Johnson PR,Hirsch J (1977). Adipose tissue regeneration following lipectomy. Science 197(4301): 391-3. Fei H, Okano HJ, Li C, Lee GH, Zhao C, Darnell R,Friedman JM (1997). Anatomic localization of alternatively spliced leptin receptors (Ob-R) in mouse brain and other tissues. Proc Natl Acad Sci U S A 94(13): 7001-5. Fekete C,Liposits Z (2003). Histamine-immunoreactive neurons of the tuberomammillary nucleus are innervated by alpha-melanocyte stimulating hormone-containing axons. Generation of a new histamine antiserum for ultrastructural studies. Brain research 969(1-2): 70-7. Fekete CS, Strutton PH, Cagampang FR, Hrabovszky E, Kallo I, Shughrue PJ, Dobo E, Mihaly E, Baranyi L, Okada H, Panula P, Merchenthaler I, Coen CW,Liposits ZS (1999). Estrogen receptor immunoreactivity is present in the majority of central histaminergic neurons: evidence for a new neuroendocrine pathway associated with luteinizing hormone-releasing hormone-synthesizing neurons in rats and humans. Endocrinology 140(9): 4335-41. Figlewicz DP,Benoit SC (2009). Insulin, leptin, and food reward: update 2008. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 296(1): R9-R19. Fitzpatrick LA, Buzas E, Gagne TJ, Nagy A, Horvath C, Ferencz V, Mester A, Kari B, Ruan M, Falus A,Barsony J (2003). Targeted deletion of histidine decarboxylase gene in mice increases bone formation and protects against ovariectomy-induced bone loss. Proc Natl Acad Sci U S A 100(10): 6027-32. Fitzsimons CP, Lazar-Molnar E, Tomoskozi Z, Buzas E, Rivera ES,Falus A (2001). Histamine deficiency induces tissue-specific down-regulation of histamine H2 receptor expression in histidine decarboxylase knockout mice. FEBS Lett 508(2): 245-8. Franklin KBJ,Paxinos G (1997). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. San Diego, Academic Press, Inc.

106

Frederich RC, Hamann A, Anderson S, Lollmann B, Lowell BB,Flier JS (1995). Leptin levels reflect body lipid content in mice: evidence for diet-induced resistance to leptin action. Nat Med 1(12): 1311-4. Friedman AH,Walker CA (1968). Circadian rhythms in rat mid-brain and caudate nucleus biogenic amine levels. J Physiol 197(1): 77-85. Friedman JM,Halaas JL (1998). Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature 395(6704): 763-70. Fujimoto K, Sakata T, Ookuma K, Kurokawa M, Yamatodani A,Wada H (1990). Hypothalamic histamine modulates adaptive behavior of rats at high environmental temperature. Experientia 46(3): 283-5. Fujise T, Yoshimatsu H, Kurokawa M, Oohara A, Kang M, Nakata M,Sakata T (1998). Satiation and masticatory function modulated by brain histamine in rats. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. Society for Experimental Biology and Medicine (New York, N.Y 217(2): 228-34. Fukushima Y, Asano T, Katagiri H, Aihara M, Saitoh T, Anai M, Funaki M, Ogihara T, Inukai K, Matsuhashi N, Oka Y, Yazaki Y,Sugano K (1996). Interaction between the two signal transduction systems of the histamine H2 receptor: desensitizing and sensitizing effects of histamine stimulation on histaminedependent cAMP production in Chinese hamster ovary cells. Biochem J 320 ( Pt 1): 27-32. Gao Q, Mezei G, Nie Y, Rao Y, Choi CS, Bechmann I, Leranth C, Toran-Allerand D, Priest CA, Roberts JL, Gao XB, Mobbs C, Shulman GI, Diano S,Horvath TL (2007). Anorectic estrogen mimics leptin's effect on the rewiring of melanocortin cells and Stat3 signaling in obese animals. Nature medicine 13(1): 89-94. Garbarg M, Barbin G, Feger J,Schwartz JC (1974). Histaminergic pathway in rat brain evidenced by lesions of the medial forebrain bundle. Science 186(4166): 833-5. Ge H, Huang L, Pourbahrami T,Li C (2002). Generation of soluble leptin receptor by ectodomain shedding of membrane-spanning receptors in vitro and in vivo. J Biol Chem 277(48): 45898-903. Gemkow MJ, Davenport AJ, Harich S, Ellenbroek BA, Cesura A,Hallett D (2009). The histamine H3 receptor as a therapeutic drug target for CNS disorders. Drug Discov Today 14(9-10): 509-15. Ghilardi N,Skoda RC (1997). The leptin receptor activates janus kinase 2 and signals for proliferation in a factor-dependent cell line. Mol Endocrinol 11(4): 393-9. Giannoni P, Passani MB, Nosi D, Chazot PL, Shenton FC, Medhurst AD, Munari L,Blandina P (2009). Heterogeneity of histaminergic neurons in the tuberomammillary nucleus of the rat. Eur J Neurosci 29(12): 2363-74. Go AG, Chow KH, Hwang IS,Tang F (2007). Adrenomedullin and its receptor components in adipose tissues: Differences between white and brown fats and the effects of adrenergic stimulation. Peptides 28(4): 920-7. Gomez-Ramirez J, Ortiz J,Blanco I (2002). Presynaptic H3 autoreceptors modulate histamine synthesis through cAMP pathway. Mol Pharmacol 61(1): 239-45. Gong DW, Bi S, Pratley RE,Weintraub BD (1996). Genomic structure and promoter analysis of the human obese gene. J Biol Chem 271(8): 3971-4. Grill HJ,Kaplan JM (2001). Interoceptive and integrative contributions of forebrain and brainstem to energy balance control. Int J Obes Relat Metab Disord 25 Suppl 5: S73-7.

107

Grund VR, Pollack EW,Hunninghake DB (1976). Histamine-induced lipid mobilization in humans and dogs. J Pharmacol Exp Ther 197(3): 662-8. Guan XM, Hess JF, Yu H, Hey PJ,van der Ploeg LH (1997). Differential expression of mRNA for leptin receptor isoforms in the rat brain. Mol Cell Endocrinol 133(1): 1-7. Guo K, McMinn JE, Ludwig T, Yu YH, Yang G, Chen L, Loh D, Li C, Chua S, Jr.,Zhang Y (2007). Disruption of peripheral leptin signaling in mice results in hyperleptinemia without associated metabolic abnormalities. Haas HL, Sergeeva OA,Selbach O (2008). Histamine in the nervous system. Physiol Rev 88(3): 1183-241. Hakansson M, de Lecea L, Sutcliffe JG, Yanagisawa M,Meister B (1999). Leptin receptor- and STAT3-immunoreactivities in hypocretin/orexin neurones of the lateral hypothalamus. J Neuroendocrinol 11(8): 653-63. Hakansson ML, Brown H, Ghilardi N, Skoda RC,Meister B (1998). Leptin receptor immunoreactivity in chemically defined target neurons of the hypothalamus. J Neurosci 18(1): 559-72. Hakansson ML,Meister B (1998). Transcription factor STAT3 in leptin target neurons of the rat hypothalamus. Neuroendocrinology 68(6): 420-7. Hamilton BS, Paglia D, Kwan AY,Deitel M (1995). Increased obese mRNA expression in omental fat cells from massively obese humans. Nat Med 1(9): 953-6. Harris RB, Ramsay TG, Smith SR,Bruch RC (1996). Early and late stimulation of ob mRNA expression in meal-fed and overfed rats. J Clin Invest 97(9): 2020-6. Hegyi K, Fulop KA, Kovacs KJ, Falus A,Toth S (2004). High leptin level is accompanied with decreased long leptin receptor transcript in histamine deficient transgenic mice. Immunol Lett 92(1-2): 193-7. Hekerman P, Zeidler J, Bamberg-Lemper S, Knobelspies H, Lavens D, Tavernier J, Joost HG,Becker W (2005). Pleiotropy of leptin receptor signalling is defined by distinct roles of the intracellular tyrosines. The FEBS journal 272(1): 109-19. Hervey GR (1959). The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J Physiol 145(2): 336-52. Hileman SM, Tornoe J, Flier JS,Bjorbaek C (2000). Transcellular transport of leptin by the short leptin receptor isoform ObRa in Madin-Darby Canine Kidney cells. Endocrinology 141(6): 1955-61. Hill SJ, Ganellin CR, Timmerman H, Schwartz JC, Shankley NP, Young JM, Schunack W, Levi R,Haas HL (1997). International Union of Pharmacology. XIII. Classification of histamine receptors. Pharmacol Rev 49(3): 253-78. Hill SJ,Young M (1978). Antagonism of central histamine H1 receptors by antipsychotic drugs. European journal of pharmacology 52(3-4): 397-9. Hirai T, Okuma C, Harada C, Mio M, Ohtsu H, Watanabe T,Kamei C (2004). Development of amygdaloid kindling in histidine decarboxylase-deficient and histamine H1 receptor-deficient mice. Epilepsia 45(4): 309-13. Hocker M, Zhang Z, Fenstermacher DA, Tagerud S, Chulak M, Joseph D,Wang TC (1996). Rat histidine decarboxylase promoter is regulated by gastrin through a protein kinase C pathway. Am J Physiol 270(4 Pt 1): G619-33. Hori Y, Nihei Y, Kurokawa Y, Kuramasu A, Makabe-Kobayashi Y, Terui T, Doi H, Satomi S, Sakurai E, Nagy A, Watanabe T,Ohtsu H (2002). Accelerated clearance of Escherichia coli in experimental peritonitis of histamine-deficient mice. J Immunol 169(4): 1978-83.

108

Horno NM,Alvarez EO (1991). The participation of histaminergic receptors of the rostral hypothalamus on the tonic release of luteinizing hormone (LH) in adult spayed rats under estrogen and progesterone treatment. J Neural Transm Gen Sect 83(1-2): 97-105. Horvath BV, Falus A, Toth S, Szalai C, Lazar-Molnar E, Holub MC, Buzas E, Nagy A,Fulop AK (2002). Inverse regulation of interleukin-6 (IL-6) and IL-6 receptor in histamine deficient histidine decarboxylase-knock-out mice. Immunol Lett 80(3): 151-4. Hosoi T, Kawagishi T, Okuma Y, Tanaka J,Nomura Y (2002). Brain stem is a direct target for leptin's action in the central nervous system. Endocrinology 143(9): 3498-504. Huang L, Wang Z,Li C (2001). Modulation of circulating leptin levels by its soluble receptor. J Biol Chem 276(9): 6343-9. Hubschle T, Thom E, Watson A, Roth J, Klaus S,Meyerhof W (2001). Leptin-induced nuclear translocation of STAT3 immunoreactivity in hypothalamic nuclei involved in body weight regulation. J Neurosci 21(7): 2413-24. Hunyady B, Zolyomi A, Czimmer J, Mozsik G, Kozicz T, Buzas E, Tanaka S, Ichikawa A, Nagy A, Palkovits M,Falus A (2003). Expanded parietal cell pool in transgenic mice unable to synthesize histamine. Scand J Gastroenterol 38(2): 133-40. Huston JP, Wagner U,Hasenohrl RU (1997). The tuberomammillary nucleus projections in the control of learning, memory and reinforcement processes: evidence for an inhibitory role. Behav Brain Res 83(1-2): 97-105. Huszar D, Lynch CA, Fairchild-Huntress V, Dunmore JH, Fang Q, Berkemeier LR, Gu W, Kesterson RA, Boston BA, Cone RD, Smith FJ, Campfield LA, Burn P,Lee F (1997). Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice. Cell 88(1): 131-41. Iida M, Murakami T, Yamada M, Sei M, Kuwajima M, Mizuno A, Noma Y, Aono T,Shima K (1996). Hyperleptinemia in chronic renal failure. Horm Metab Res 28(12): 724-7. Inagaki N, Yamatodani A, Shinoda K, Panula P, Watanabe T, Shiotani Y,Wada H (1988). Histaminergic nerve fibers in the median eminence and hypophysis of rats demonstrated immunocytochemically with antibodies against histidine decarboxylase and histamine. Brain research 439(1-2): 402-5. Jorgensen EA, Knigge U, Watanabe T, Warberg J,Kjaer A (2005). Histaminergic neurons are involved in the orexigenic effect of orexin-A. Neuroendocrinology 82(2): 70-7. Jorgensen EA, Vogelsang TW, Knigge U, Watanabe T, Warberg J,Kjaer A (2006). Increased Susceptibility to Diet-Induced Obesity in Histamine-Deficient Mice. Neuroendocrinology. Joseph DR, Sullivan PM, Wang YM, Kozak C, Fenstermacher DA, Behrendsen ME,Zahnow CA (1990). Characterization and expression of the complementary DNA encoding rat histidine decarboxylase. Proc Natl Acad Sci U S A 87(2): 733-7. Kamohara S, Burcelin R, Halaas JL, Friedman JM,Charron MJ (1997). Acute stimulation of glucose metabolism in mice by leptin treatment. Nature 389(6649): 374-7.

109

Kasaoka S, Tsuboyama-Kasaoka N, Kawahara Y, Inoue S, Tsuji M, Ezaki O, Kato H, Tsuchiya T, Okuda H,Nakajima S (2004). Histidine supplementation suppresses food intake and fat accumulation in rats. Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif 20(11-12): 991-6. Kastin AJ, Pan W, Maness LM, Koletsky RJ,Ernsberger P (1999). Decreased transport of leptin across the blood-brain barrier in rats lacking the short form of the leptin receptor. Peptides 20(12): 1449-53. Kennedy GC (1953). The role of depot fat in the hypothalamic control of food intake in the rat. Proc R Soc Lond B Biol Sci 140(901): 578-96. Kishimoto T, Taga T,Akira S (1994). Cytokine signal transduction. Cell 76(2): 253-62. Klausz G, Buzas E, Scharek P, Tiszlavicz L, Gyulai Z, Fulop AK, Falus A,Mandi Y (2004). Effects of Helicobacter pylori infection on gastric inflammation and local cytokine production in histamine-deficient (histidine decarboxylase knockout) mice. Immunol Lett 94(3): 223-8. Klein MC,Gertner SB (1983). Studies on the mechanism of the cardiovascular action of central injections of histamine. Neuropharmacology 22(9): 1109-15. Kloek C, Haq AK, Dunn SL, Lavery HJ, Banks AS,Myers MG, Jr. (2002). Regulation of Jak kinases by intracellular leptin receptor sequences. J Biol Chem 277(44): 41547-55. Knigge U, Thuesen B, Dejgaard A, Svenstrup B,Bennett P (1990). Histamine-induced paradoxical GH response to TRH/GnRH in men and women: dependence on gonadal steroid hormones. Acta Endocrinol (Copenh) 122(3): 354-60. Knigge U, Thuesen B, Wollesen F, Svenstrup B,Christiansen PM (1985). Effect of histamine on basal and TRH/LH-RH-stimulated PRL and LH secretion during different phases of the menstrual cycle in normal women. Neuroendocrinology 41(4): 337-41. Knigge U,Warberg J (1991). The role of histamine in the neuroendocrine regulation of pituitary hormone secretion. Acta Endocrinol (Copenh) 124(6): 609-19. Kohler C, Swanson LW, Haglund L,Wu JY (1985). The cytoarchitecture, histochemistry and projections of the tuberomammillary nucleus in the rat. Neuroscience 16(1): 85-110. Kolaczynski JW, Ohannesian JP, Considine RV, Marco CC,Caro JF (1996). Response of leptin to short-term and prolonged overfeeding in humans. J Clin Endocrinol Metab 81(11): 4162-5. Kong WM, Stanley S, Gardiner J, Abbott C, Murphy K, Seth A, Connoley I, Ghatei M, Stephens D,Bloom S (2003). A role for arcuate cocaine and amphetamineregulated transcript in hyperphagia, thermogenesis, and cold adaptation. Faseb J 17(12): 1688-90. Korner J, Wissig S, Kim A, Conwell IM,Wardlaw SL (2003). Effects of agouti-related protein on metabolism and hypothalamic neuropeptide gene expression. J Neuroendocrinol 15(12): 1116-21. Kowalski TJ, Liu SM, Leibel RL,Chua SC, Jr. (2001). Transgenic complementation of leptin-receptor deficiency. I. Rescue of the obesity/diabetes phenotype of LEPRnull mice expressing a LEPR-B transgene. Diabetes 50(2): 425-35. Kozma GT, Losonczy G, Keszei M, Komlosi Z, Buzas E, Pallinger E, Appel J, Szabo T, Magyar P, Falus A,Szalai C (2003). Histamine deficiency in gene-targeted mice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness, eosinophilia and allergen-specific IgE. Int Immunol 15(8): 963-73.

110

Kristensen P, Judge ME, Thim L, Ribel U, Christjansen KN, Wulff BS, Clausen JT, Jensen PB, Madsen OD, Vrang N, Larsen PJ,Hastrup S (1998). Hypothalamic CART is a new anorectic peptide regulated by leptin. Nature 393(6680): 72-6. Kubota H, Hayashi H, Watanabe T, Taguchi Y,Wada H (1984). Mechanism of inactivation of mammalian L-histidine decarboxylase by (S)-alphafluoromethylhistidine. Biochem Pharmacol 33(7): 983-90. LaBella FS, Queen GM,Brandes LJ (2000). Interactive binding at cytochrome P-450 of cell growth regulatory bioamines, steroid hormones, antihormones, and drugs. J Cell Biochem 76(4): 686-94. Ladyman SR,Grattan DR (2005). Suppression of leptin receptor messenger ribonucleic acid and leptin responsiveness in the ventromedial nucleus of the hypothalamus during pregnancy in the rat. Endocrinology 146(9): 3868-74. Landt M, Horowitz JF, Coppack SW,Klein S (2001). Effect of short-term fasting on free and bound leptin concentrations in lean and obese women. J Clin Endocrinol Metab 86(8): 3768-71. Landt M, Parvin CA,Wong M (2000). Leptin in cerebrospinal fluid from children: correlation with plasma leptin, sexual dimorphism, and lack of protein binding. Clin Chem 46(6 Pt 1): 854-8. Larsen A, Davis T, Curtis BM, Gimpel S, Sims JE, Cosman D, Park L, Sorensen E, March CJ,Smith CA (1990). Expression cloning of a human granulocyte colonystimulating factor receptor: a structural mosaic of hematopoietin receptor, immunoglobulin, and fibronectin domains. J Exp Med 172(6): 1559-70. Lecklin A, Etu-Seppala P, Stark H,Tuomisto L (1998). Effects of intracerebroventricularly infused histamine and selective H1, H2 and H3 agonists on food and water intake and urine flow in Wistar rats. Brain Res 793(1-2): 279-88. Lecklin A, Hermonen P, Tarhanen J,Mannisto PT (2000). An acute i.c.v. infusion of leptin has no effect on hypothalamic histamine and tele-methylhistamine contents in Wistar rats. Eur J Pharmacol 395(2): 113-9. Lee GH, Proenca R, Montez JM, Carroll KM, Darvishzadeh JG, Lee JI,Friedman JM (1996). Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature 379(6566): 632-5. Levine JE, Bauer-Dantoin AC, Besecke LM, Conaghan LA, Legan SJ, Meredith JM, Strobl FJ, Urban JH, Vogelsong KM,Wolfe AM (1991). Neuroendocrine regulation of the luteinizing hormone-releasing hormone pulse generator in the rat. Recent Prog Horm Res 47: 97-151; discussion 151-3. Li H, Matheny M, Nicolson M, Tumer N,Scarpace PJ (1997). Leptin gene expression increases with age independent of increasing adiposity in rats. Diabetes 46(12): 2035-9. Licinio J, Caglayan S, Ozata M, Yildiz BO, de Miranda PB, O'Kirwan F, Whitby R, Liang L, Cohen P, Bhasin S, Krauss RM, Veldhuis JD, Wagner AJ, DePaoli AM, McCann SM,Wong ML (2004). Phenotypic effects of leptin replacement on morbid obesity, diabetes mellitus, hypogonadism, and behavior in leptindeficient adults. Proc Natl Acad Sci U S A 101(13): 4531-6. Lonnqvist F, Wennlund A,Arner P (1997). Relationship between circulating leptin and peripheral fat distribution in obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord 21(4): 255-60.

111

Maamra M, Bidlingmaier M, Postel-Vinay MC, Wu Z, Strasburger CJ,Ross RJ (2001). Generation of human soluble leptin receptor by proteolytic cleavage of membrane-anchored receptors. Endocrinology 142(10): 4389-93. MacDonald PC, Madden JD, Brenner PF, Wilson JD,Siiteri PK (1979). Origin of estrogen in normal men and in women with testicular feminization. J Clin Endocrinol Metab 49(6): 905-16. Madej T, Boguski MS,Bryant SH (1995). Threading analysis suggests that the obese gene product may be a helical cytokine. FEBS Lett 373(1): 13-8. Maffei M, Halaas J, Ravussin E, Pratley RE, Lee GH, Zhang Y, Fei H, Kim S, Lallone R, Ranganathan S,et al. (1995). Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nat Med 1(11): 1155-61. Malzac P, Mattei MG, Thibault J,Bruneau G (1996). Chromosomal localization of the human and mouse histidine decarboxylase genes by in situ hybridization. Exclusion of the HDC gene from the Prader-Willi syndrome region. Hum Genet 97(3): 359-61. Mamune-Sato R, Yamauchi K, Tanno Y, Ohkawara Y, Ohtsu H, Katayose D, Maeyama K, Watanabe T, Shibahara S,Takishima T (1992). Functional analysis of alternatively spliced transcripts of the human histidine decarboxylase gene and its expression in human tissues and basophilic leukemia cells. Eur J Biochem 209(2): 533-9. Mantzoros CS, Flier JS,Rogol AD (1997). A longitudinal assessment of hormonal and physical alterations during normal puberty in boys. V. Rising leptin levels may signal the onset of puberty. J Clin Endocrinol Metab 82(4): 1066-70. Masaki T, Chiba S, Yasuda T, Noguchi H, Kakuma T, Watanabe T, Sakata T,Yoshimatsu H (2004). Involvement of hypothalamic histamine H1 receptor in the regulation of feeding rhythm and obesity. Diabetes 53(9): 2250-60. Masaki T, Chiba S, Yoshimichi G, Yasuda T, Noguchi H, Kakuma T, Sakata T,Yoshimatsu H (2003). Neuronal histamine regulates food intake, adiposity, and uncoupling protein expression in agouti yellow (A(y)/a) obese mice. Endocrinology 144(6): 2741-8. Masaki T, Yoshimatsu H, Chiba S, Watanabe T,Sakata T (2001a). Central infusion of histamine reduces fat accumulation and upregulates UCP family in leptinresistant obese mice. Diabetes 50(2): 376-84. Masaki T, Yoshimatsu H, Chiba S, Watanabe T,Sakata T (2001b). Targeted disruption of histamine H1-receptor attenuates regulatory effects of leptin on feeding, adiposity, and UCP family in mice. Diabetes 50(2): 385-91. Matochik JA, London ED, Yildiz BO, Ozata M, Caglayan S, DePaoli AM, Wong ML,Licinio J (2005). Effect of leptin replacement on brain structure in genetically leptin-deficient adults. J Clin Endocrinol Metab 90(5): 2851-4. Mayerhofer A, Bartke A, Amador AG,Began T (1989). Histamine affects testicular steroid production in the golden hamster. Endocrinology 125(4): 2212-4. Megson AC, Walker EM,Hill SJ (2001). Role of protein kinase Calpha in signaling from the histamine H(1) receptor to the nucleus. Mol Pharmacol 59(5): 1012-21. Merabet E, Dagogo-Jack S, Coyne DW, Klein S, Santiago JV, Hmiel SP,Landt M (1997). Increased plasma leptin concentration in end-stage renal disease. J Clin Endocrinol Metab 82(3): 847-50.

112

Mercer JG, Hoggard N, Williams LM, Lawrence CB, Hannah LT,Trayhurn P (1996). Localization of leptin receptor mRNA and the long form splice variant (Ob-Rb) in mouse hypothalamus and adjacent brain regions by in situ hybridization. FEBS Lett 387(2-3): 113-6. Mercer JG, Moar KM,Hoggard N (1998). Localization of leptin receptor (Ob-R) messenger ribonucleic acid in the rodent hindbrain. Endocrinology 139(1): 2934. Miklos IH,Kovacs KJ (2003). Functional heterogeneity of the responses of histaminergic neuron subpopulations to various stress challenges. Eur J Neurosci 18(11): 3069-79. Mondillo C, Falus A, Pignataro O,Pap E (2007). Prolonged histamine deficiency in histidine decarboxylase gene knockout mice affects Leydig cell function. J Androl 28(1): 86-91. Montague CT, Prins JB, Sanders L, Digby JE,O'Rahilly S (1997). Depot- and sexspecific differences in human leptin mRNA expression: implications for the control of regional fat distribution. Diabetes 46(3): 342-7. Monti JM (1993). Involvement of histamine in the control of the waking state. Life Sci 53(17): 1331-8. Morimoto T, Yamamoto Y, Mobarakeh JI, Yanai K, Watanabe T,Yamatodani A (1999). Involvement of the histaminergic system in leptin-induced suppression of food intake. Physiol Behav 67(5): 679-83. Morimoto T, Yamamoto Y,Yamatodani A (2001). Brain histamine and feeding behavior. Behav Brain Res 124(2): 145-50. Munzberg H, Flier JS,Bjorbaek C (2004). Region-specific leptin resistance within the hypothalamus of diet-induced obese mice. Endocrinology 145(11): 4880-9. Munzberg H, Huo L, Nillni EA, Hollenberg AN,Bjorbaek C (2003). Role of signal transducer and activator of transcription 3 in regulation of hypothalamic proopiomelanocortin gene expression by leptin. Endocrinology 144(5): 2121-31. Murakami T, Otani S, Honjoh T, Doi T,Shima K (2001). Influence of the presence of OB-Re on leptin radioimmunoassay. J Endocrinol 168(1): 79-86. Myers MG, Cowley MA,Munzberg H (2008). Mechanisms of leptin action and leptin resistance. Annu Rev Physiol 70: 537-56. Nakamura E, Kataoka T, Furutani K, Jimbo K, Aihara T, Tanaka S, Ichikawa A, Ohtsu H,Okabe S (2004). Lack of histamine alters gastric mucosal morphology: comparison of histidine decarboxylase-deficient and mast cell-deficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 287(5): G1053-61. Nakano J,Oliver RD (1970). Effect of histamine and its derivatives on lipolysis in isolated rat fat cells. Arch Int Pharmacodyn Ther 186(2): 339-44. Nistal M, Santamaria L,Paniagua R (1984). Mast cells in the human testis and epididymis from birth to adulthood. Acta Anat (Basel) 119(3): 155-60. Noris G, Hol D, Clapp C,Martinez de la Escalera G (1995). Histamine directly stimulates gonadotropin-releasing hormone secretion from GT1-1 cells via H1 receptors coupled to phosphoinositide hydrolysis. Endocrinology 136(7): 296774. Ogier V, Ziegler O, Mejean L, Nicolas JP,Stricker-Krongrad A (2002). Obesity is associated with decreasing levels of the circulating soluble leptin receptor in humans. International journal of obesity and related metabolic disorders 26(4): 496-503.

113

Oh C,Nakano K (1988). Inhibition by glucocorticoids of mitogen-dependent histamine biosynthesis caused by histidine decarboxylase in cultured mouse spleen cells and peritoneal adherent cells. Immunology 65(3): 433-6. Ohinata K, Shimano T, Yamauchi R, Sakurada S, Yanai K,Yoshikawa M (2004). The anorectic effect of neurotensin is mediated via a histamine H1 receptor in mice. Peptides 25(12): 2135-8. Ohtsu H, Tanaka S, Terui T, Hori Y, Makabe-Kobayashi Y, Pejler G, Tchougounova E, Hellman L, Gertsenstein M, Hirasawa N, Sakurai E, Buzas E, Kovacs P, Csaba G, Kittel A, Okada M, Hara M, Mar L, Numayama-Tsuruta K, Ishigaki-Suzuki S, Ohuchi K, Ichikawa A, Falus A, Watanabe T,Nagy A (2001). Mice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormal mast cells. FEBS Lett 502(1-2): 53-6. Ohtsu H,Watanabe T (2003). New functions of histamine found in histidine decarboxylase gene knockout mice. Biochem Biophys Res Commun 305(3): 443-7. Oliveira VX, Jr., Fazio MA, Miranda MT, da Silva JM, Bittencourt JC, Elias CF,Miranda A (2005). Leptin fragments induce Fos immunoreactivity in rat hypothalamus. Regulatory peptides 127(1-3): 123-32. Oohara A, Yoshimatsu H, Kurokawa M, Oishi R, Saeki K,Sakata T (1994). Neuronal glucoprivation enhances hypothalamic histamine turnover in rats. J Neurochem 63(2): 677-82. Ookuma K, Sakata T, Fukagawa K, Yoshimatsu H, Kurokawa M, Machidori H,Fujimoto K (1993). Neuronal histamine in the hypothalamus suppresses food intake in rats. Brain Res 628(1-2): 235-42. Ookuma K, Yoshimatsu H, Sakata T, Fujimoto K,Fukagawa F (1989). Hypothalamic sites of neuronal histamine action on food intake by rats. Brain Res 490(2): 26875. Padula AM (2005). GnRH analogues--agonists and antagonists. Anim Reprod Sci 88(12): 115-26. Panula P, Flugge G, Fuchs E, Pirvola U, Auvinen S,Airaksinen MS (1989). Histamineimmunoreactive nerve fibers in the mammalian spinal cord. Brain Res 484(1-2): 234-9. Panula P, Kaartinen M, Macklin M,Costa E (1985). Histamine-containing peripheral neuronal and endocrine systems. The journal of histochemistry and cytochemistry 33(9): 933-41. Panula P, Yang HY,Costa E (1984). Histamine-containing neurons in the rat hypothalamus. Proc Natl Acad Sci U S A 81(8): 2572-6. Par G, Szekeres-Bartho J, Buzas E, Pap E,Falus A (2003). Impaired Reproduction of Histamine Deficient (histidine-decarboxylase Knockout) Mice is Caused Predominantly by a Decreased Male Mating Behavior. Am J Reprod Immunol 50(2): 152-8. Paria BC, Das N, Das SK, Zhao X, Dileepan KN,Dey SK (1998). Histidine decarboxylase gene in the mouse uterus is regulated by progesterone and correlates with uterine differentiation for blastocyst implantation. Endocrinology 139(9): 3958-66. Park Y, Park SD, Cho WK,Kim K (1988). Testosterone stimulates LH-RH-like mRNA level in the rat hypothalamus. Brain Res 451(1-2): 255-60. Parmentier R, Ohtsu H, Djebbara-Hannas Z, Valatx JL, Watanabe T,Lin JS (2002). Anatomical, physiological, and pharmacological characteristics of histidine

114

decarboxylase knock-out mice: evidence for the role of brain histamine in behavioral and sleep-wake control. J Neurosci 22(17): 7695-711. Pelleymounter MA, Cullen MJ, Baker MB, Hecht R, Winters D, Boone T,Collins F (1995). Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science 269(5223): 540-3. Peralta S, Carrascosa JM, Gallardo N, Ros M,Arribas C (2002). Ageing increases SOCS-3 expression in rat hypothalamus: effects of food restriction. Biochem Biophys Res Commun 296(2): 425-8. Roberts F,Calcutt CR (1983). Histamine and the hypothalamus. Neuroscience 9(4): 72139. Rothwell NJ, Stock MJ,Wyllie MG (1981). Sympathetic mechanisms in diet-induced thermogenesis: modification by ciclazindol and anorectic drugs. British journal of pharmacology 74(3): 539-46. Russ MJ,Ackerman SH (1988). Antidepressants and weight gain. Appetite 10(2): 10317. Sahu A (2003). Leptin signaling in the hypothalamus: emphasis on energy homeostasis and leptin resistance. Front Neuroendocrinol 24(4): 225-53. Sahu A (2004). Minireview: A hypothalamic role in energy balance with special emphasis on leptin. Endocrinology 145(6): 2613-20. Sakata T, Fukagawa K, Ookuma K, Fujimoto K, Yoshimatsu H, Yamatodani A,Wada H (1990). Hypothalamic neuronal histamine modulates ad libitum feeding by rats. Brain Res 537(1-2): 303-6. Sakata T, Kurokawa M, Oohara A,Yoshimatsu H (1994). A physiological role of brain histamine during energy deficiency. Brain Res Bull 35(2): 135-9. Sakata T, Ookuma K, Fujimoto K, Fukagawa K,Yoshimatsu H (1991). Histaminergic control of energy balance in rats. Brain Res Bull 27(3-4): 371-5. Sakata T, Ookuma K, Fukagawa K, Fujimoto K, Yoshimatsu H, Shiraishi T,Wada H (1988). Blockade of the histamine H1-receptor in the rat ventromedial hypothalamus and feeding elicitation. Brain research 441(1-2): 403-7. Sakata T, Yoshimatsu H,Kurokawa M (1997). Hypothalamic neuronal histamine: implications of its homeostatic control of energy metabolism. Nutrition 13(5): 403-11. Saladin R, De Vos P, Guerre-Millo M, Leturque A, Girard J, Staels B,Auwerx J (1995). Transient increase in obese gene expression after food intake or insulin administration. Nature 377(6549): 527-9. Scarpace PJ, Matheny M,Tumer N (2001). Hypothalamic leptin resistance is associated with impaired leptin signal transduction in aged obese rats. Neuroscience 104(4): 1111-7. Schwartz JC, Arrang JM, Garbarg M, Pollard H,Ruat M (1991). Histaminergic transmission in the mammalian brain. Physiol Rev 71(1): 1-51. Schwartz MW,Porte D, Jr. (2005). Diabetes, obesity, and the brain. Science (New York, N.Y 307(5708): 375-9. Schwartz MW, Sipols AJ, Marks JL, Sanacora G, White JD, Scheurink A, Kahn SE, Baskin DG, Woods SC, Figlewicz DP,et al. (1992). Inhibition of hypothalamic neuropeptide Y gene expression by insulin. Endocrinology 130(6): 3608-16. Schwartz MW, Woods SC, Porte D, Jr., Seeley RJ,Baskin DG (2000). Central nervous system control of food intake. Nature 404(6778): 661-71.

115

Shen J, Tanida M, Niijima A,Nagai K (2007). In vivo effects of leptin on autonomic nerve activity and lipolysis in rats. Neuroscience letters 416(2): 193-7. Shimada M, Tritos NA, Lowell BB, Flier JS,Maratos-Flier E (1998). Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature 396(6712): 670-4. Simmons DM, Arriza JL,Swanson LW (1989). A complete protocol for in situ hybridization of messenger RNAs in brain and other tissues with radiolabeled single-stranded RNA probes. J Histotechnol 12: 169-181. Spangelo BL, deHoll PD, Kalabay L, Bond BR,Arnaud P (1994). Neurointermediate pituitary lobe cells synthesize and release interleukin-6 in vitro: effects of lipopolysaccharide and interleukin-1 beta. Endocrinology 135(2): 556-63. Stanley BG, Kyrkouli SE, Lampert S,Leibowitz SF (1986). Neuropeptide Y chronically injected into the hypothalamus: a powerful neurochemical inducer of hyperphagia and obesity. Peptides 7(6): 1189-92. Strobel A, Issad T, Camoin L, Ozata M,Strosberg AD (1998). A leptin missense mutation associated with hypogonadism and morbid obesity. Nat Genet 18(3): 213-5. Suzuki-Ishigaki S, Numayama-Tsuruta K, Kuramasu A, Sakurai E, Makabe Y, Shimura S, Shirato K, Igarashi K, Watanabe T,Ohtsu H (2000). The mouse L-histidine decarboxylase gene: structure and transcriptional regulation by CpG methylation in the promoter region. Nucleic Acids Res 28(14): 2627-33. Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T,Kishimoto T (1989). Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer, gp130. Cell 58(3): 573-81. Takahashi K, Suwa H, Ishikawa T,Kotani H (2002). Targeted disruption of H3 receptors results in changes in brain histamine tone leading to an obese phenotype. J Clin Invest 110(12): 1791-9. Tanaka S, Hamada K, Yamada N, Sugita Y, Tonai S, Hunyady B, Palkovits M, Falus A, Watanabe T, Okabe S, Ohtsu H, Ichikawa A,Nagy A (2002). Gastric acid secretion in L-histidine decarboxylase-deficient mice. Gastroenterology 122(1): 145-55. Tartaglia LA, Dembski M, Weng X, Deng N, Culpepper J, Devos R, Richards GJ, Campfield LA, Clark FT, Deeds J, Muir C, Sanker S, Moriarty A, Moore KJ, Smutko JS, Mays GG, Wool EA, Monroe CA,Tepper RI (1995). Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell 83(7): 1263-71. Taylor JE,Richelson E (1980). High affinity binding of tricyclic antidepressants to histamine H1-receptors: fact and artifact. European journal of pharmacology 67(1): 41-6. Thim L, Kristensen P, Larsen PJ,Wulff BS (1998). CART, a new anorectic peptide. Int J Biochem Cell Biol 30(12): 1281-4. Thornton JE, Cheung CC, Clifton DK,Steiner RA (1997). Regulation of hypothalamic proopiomelanocortin mRNA by leptin in ob/ob mice. Endocrinology 138(11): 5063-6. Tsuda K, Yoshimatsu H, Niijima A, Chiba S, Okeda T,Sakata T (2002). Hypothalamic histamine neurons activate lipolysis in rat adipose tissue. Exp Biol Med (Maywood) 227(3): 208-13.

116

Uotani S, Bjorbaek C, Tornoe J,Flier JS (1999). Functional properties of leptin receptor isoforms: internalization and degradation of leptin and ligand-induced receptor downregulation. Diabetes 48(2): 279-86. Vannier E,Dinarello CA (1994). Histamine enhances interleukin (IL)-1-induced IL-6 gene expression and protein synthesis via H2 receptors in peripheral blood mononuclear cells. J Biol Chem 269(13): 9952-6. Vannier E, Miller LC,Dinarello CA (1991). Histamine suppresses gene expression and synthesis of tumor necrosis factor alpha via histamine H2 receptors. J Exp Med 174(1): 281-4. Wang MY, Zhou YT, Newgard CB,Unger RH (1996). A novel leptin receptor isoform in rat. FEBS Lett 392(2): 87-90. Wang QP,Nakai Y (1996). A new fixation procedure for study of the histaminergic neurons by immunoelectron microscopy using the direct antiserum against histamine. Biotech Histochem 71(6): 311-6. Watanabe T, Taguchi Y, Shiosaka S, Tanaka J, Kubota H, Terano Y, Tohyama M,Wada H (1984). Distribution of the histaminergic neuron system in the central nervous system of rats; a fluorescent immunohistochemical analysis with histidine decarboxylase as a marker. Brain Res 295(1): 13-25. Wickelgren I (1998). Obesity: how big a problem? Science 280(5368): 1364-7. Wiemann JN, Clifton DK,Steiner RA (1990). Gonadotropin-releasing hormone messenger ribonucleic acid levels are unaltered with changes in the gonadal hormone milieu of the adult male rat. Endocrinology 127(2): 523-32. Wiener Z, Buzas E, Kovacs P, Csaba G, Szabo D, Kittel A, Pallinger E, Watanabe T, Ohtsu H, Ichikawa A, Nagy A,Falus A (2001). Highly reduced peritoneal mast cell number and decreased c-kit expression in histidine decarboxylase knock out mice. Inflamm Res 50 Suppl 2: S55-6. Wong SL, DePaoli AM, Lee JH,Mantzoros CS (2004). Leptin hormonal kinetics in the fed state: effects of adiposity, age, and gender on endogenous leptin production and clearance rates. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 89(6): 2672-7. Woods SC, Lotter EC, McKay LD,Porte D, Jr. (1979). Chronic intracerebroventricular infusion of insulin reduces food intake and body weight of baboons. Nature 282(5738): 503-5. Yang G, Ge H, Boucher A, Yu X,Li C (2004). Modulation of direct leptin signaling by soluble leptin receptor. Mol Endocrinol 18(6): 1354-62. Yasuda T, Masaki T, Chiba S, Kakuma T, Sakata T,Yoshimatsu H (2004a). L-histidine stimulates sympathetic nerve activity to brown adipose tissue in rats. Neuroscience letters 362(2): 71-4. Yasuda T, Masaki T, Sakata T,Yoshimatsu H (2004b). Hypothalamic neuronal histamine regulates sympathetic nerve activity and expression of uncoupling protein 1 mRNA in brown adipose tissue in rats. Neuroscience 125(3): 535-40. Yatsunami K, Ohtsu H, Tsuchikawa M, Higuchi T, Ishibashi K, Shida A, Shima Y, Nakagawa S, Yamauchi K, Yamamoto M,et al. (1994). Structure of the Lhistidine decarboxylase gene. J Biol Chem 269(2): 1554-9. Yatsunami K, Tsuchikawa M, Kamada M, Hori K,Higuchi T (1995). Comparative studies of human recombinant 74- and 54-kDa L-histidine decarboxylases. J Biol Chem 270(51): 30813-7.

117

Yoshimatsu H, Chiba S, Tajima D, Akehi Y,Sakata T (2002a). Histidine suppresses food intake through its conversion into neuronal histamine. Exp Biol Med (Maywood) 227(1): 63-8. Yoshimatsu H, Itateyama E, Kondou S, Tajima D, Himeno K, Hidaka S, Kurokawa M,Sakata T (1999). Hypothalamic neuronal histamine as a target of leptin in feeding behavior. Diabetes 48(12): 2286-91. Yoshimatsu H, Tsuda K, Niijima A, Tatsukawa M, Chiba S,Sakata T (2002b). Histidine induces lipolysis through sympathetic nerve in white adipose tissue. European journal of clinical investigation 32(4): 236-41. Zahnow CA, Panula P, Yamatodani A,Millhorn DE (1998). Glucocorticoid hormones downregulate histidine decarboxylase mRNA and enzyme activity in rat lung. Am J Physiol 275(2 Pt 1): L407-13. Zahnow CA, Yi HF, McBride OW,Joseph DR (1991). Cloning of the cDNA encoding human histidine decarboxylase from an erythroleukemia cell line and mapping of the gene locus to chromosome 15. DNA Seq 1(6): 395-400. Zarjevski N, Cusin I, Vettor R, Rohner-Jeanrenaud F,Jeanrenaud B (1993). Chronic intracerebroventricular neuropeptide-Y administration to normal rats mimics hormonal and metabolic changes of obesity. Endocrinology 133(4): 1753-8. Zhang F, Basinski MB, Beals JM, Briggs SL, Churgay LM, Clawson DK, DiMarchi RD, Furman TC, Hale JE, Hsiung HM, Schoner BE, Smith DP, Zhang XY, Wery JP,Schevitz RW (1997). Crystal structure of the obese protein leptin-E100. Nature 387(6629): 206-9. Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Leopold L,Friedman JM (1994). Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372(6505): 425-32. Zhang Y,Scarpace PJ (2006). The role of leptin in leptin resistance and obesity. Physiology & behavior 88(3): 249-56. Zieher LM, Debeljuk L, Iturriza F,Mancini RE (1971). Biogenic amine concentration in testes of rats at different ages. Endocrinology 88(2): 351-4.

118

Saját publikációk jegyzéke A disszertációhoz közvetlenül kapcsolódó közlemények: Fülöp AK, Földes A, Búzás E, Hegyi K, Miklós IH, Romics L, Kleiber M, Nagy A, Falus A, Kovács KJ Hyperleptinemia, visceral adiposity, and decreased glucose tolerance in mice with a targeted disruption of the histidine decarboxylase gene Endocrinology 144: 4306-4314 (2003) IF: 5.063 (megosztott elsőszerzőség) Pap E, Rácz K, Kovács KJ, Varga I, Buzás E, Madarász B, Földes A, Szalai C, Watanabe T, Ohtsu H, Ichikawa A, Nagy A, Falus A Histidine decarboxylase deficiency in gene knockout mice elevates male sex steroid production J Endocrinol 175: 193-199 (2002) IF: 2.897 Földes A, Némethy Zs, Szalay O, Kovács KJ Anaphylactoid reactions activate hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis: comparison with endotoxic reactions Brain Res Bull 52: 573-579 (2000) IF: 1.758

Poszterek: Fülöp, AK, Kovács, KJ, Hegyi, K, Földes A, Lannert, V, Szomor, A, Falus, A. (2003) Energy homeostasis related alterations in a histamine free mouse model. European Histamine Research Society Meeting, Kovacs KJ, Földes A, Fülöp, K, Falus A (2003) Metabolic phenotype of mice with targeted disruption of the hidtidine decarboxolase gene Society for Neuroscience, Annual Meeting, New Orleans, USA Hegyi, K, Toth, S, Kovacs, KJ, Földes, A, Fulop, AK, and Falus A (2004) Studying Serum Leptin, Leptin Receptor and CREB Expression In Histidine-Decarboxylase Gene Targeted Mice Keystone Symposia: Molecular Control of Adipogenesis,Canada Pintér O, Jelencsics K, Hegyesi H, Falus A, Kovács J.A, Földes A(2005) Leptin resistance in histamine deficient, histidine decarboxylase (HDC)-KO mice. Conference of Hungarian Neuroscience Society, Pécs Földes A Pintér O, Jelencsics EK, Kovács JK (2005) Leptin resistance in histamine deficient, histidine decarboxylase (HDC)-KO mice. Endocrine Society’s 87th annual Meeting, San Diego, USA

The

119

Földes A Jelencsics K, Pintér O, Kovács JK, Ladjánszky-Márkus V (2006) Leptin resistance within the brainstem of histamine deficient mice FENS, Wien Földes A, Márkus V, Kovács K (2007) Selective leptin resistance within the brainstem of histamine deficient mice 9th European Congress of Endocrinology, Budapest

A disszertációhoz közvetetten kapcsolodó közlemények: Kovács KJ, Földes A, Vizi ES C-kit (stem cell factor) affects neuronal activity, stimulates pituitary-adrenal axis and prolactin secretion in rats J Neuroimmunol 65: 133-141 (1996) IF: 3.083 Kovács KJ, Földes A, Sawchenko PE Glucocorticoid negative feedback selectively targets vasopressin transcription in parvocellular neurosecretory neurons J Neurosci 20: 3843-3852 (2000) IF: 8.502 Zelena D, Mergl Z, Foldes A, Kovacs KJ, Toth Z, Makara GB Role of hypothalamic inputs in maintaining pituitary-adrenal responsiveness in repeated restraint Am J Physiol Endocrinol Metab 285: E1110-E1117 (2003) IF: 3.828 Zelena D, Földes A, Mergl Z, Barna I, Kovács KJ, Makara GB Effects of repeated restraint stress on hypothalamo-pituitary-adrenocortical function in vasopressin deficient Brattleboro rats Brain Res Bull 63: 521-530 (2004) IF: 2.429 Zelena D, Domokos Á, Mergl Z, Barna I, Földes A, Kovács KJ, Makara GB The role of vasopressin in chronic stress-induced hypothalamo-pituitary-adrenal axis hyperactivity.: Studies on Brattleboro rats with repeated restraint. In: Levine BA (szerk.) Neuropeptide research trends. New York: Nova Biomedical Books, 2007. pp. 189-212. (ISBN:9781600216404) Nunez C, Földes A, Laorden ML, Milanes MV, Kovács KJ. Activation of stress-related hypothalamic neuropeptide gene expression during morphine withdrawal J Neurochem. 101(4):1060-71., 2007 IF: 4.451 megosztott elsőszerzőség

120

Núñez C, Földes A, Pérez-Flores D, García-Borrón JC, Laorden ML, Kovács KJ, Milanés MV. Elevated glucocorticoid levels are responsible for induction of tyrosine hydroxylase mRNA expression, phosphorylation and enzyme activity in the nucleus of the solitary tract (NTS-A2) during morphine withdrawal. Endocrinology 150: 3118-3127 (2009) IF: 4.752 I. Demeter, Á. Szűcs, O. Hegyesi, A. Földes, G.Z. Rácz, B. Burghardt, M.C. Steward, G. Varga Vectorial bicarbonate transport by Par-C10 salivary cells – a model for epithelial electrolyte secretion Journal of Physiology and Pharmacology 60, Suppl 7, 197-204 (2009) IF: 1,489 Núñez C, Martín F, Földes A, Luisa Laorden M, Kovács KJ, Victoria Milanés M. Induction of FosB/DeltaFosB in the brain stress system-related structures during morphine dependence and withdrawal. J Neurochem. 114(2):475-87. (2010) IF: 3,999 Ferenczi S, Núñez C, Pintér-Kübler B, Földes A, Martín F, Ladnyánszky Márkus V, Milanés MV, Kovács KJ. Changes in metabolic-related variables during chronic morphine treatment. Neurochem Int.;57(3):323-30. (2010) IF: 3,541

121

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Kovács Krisztinának, akitől a tudományos munkával szembeni igényességet, precizitást és alaposságot sajátíthattam el. Köszönet illeti Prof. Dr. Falus Andrást, aki mindvégig támogatott a kutatatásaim során és köszönöm a Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Tanszék munkatársainak a segítségét és együttműködését. Külön köszönet illeti Prof. Dr. Varga Gábort, az Orálbiológiai Tanszék igazgatóját, hogy lehetőséget és teret biztosított további szakmai fejlődésemhez, valamint a dolgozatom elkészítésére tett folyamatos ösztönzéséért. Köszönetemet szeretném kifejezni egykori csoportom tagjainak: Dr. Ábrahám Istvánnak, Dr. Bali Balázsnak, Dr. Darida Miklósnak, Dr. Dénes Ádámnak, Dr. Gerencsér Andreának, Dr. Miklós Ildikónak, Pintér Ottónak, Tőkési Viktóriának, Márkus Veronikának és Szalay Orsolyának, akik mindig új kérdések megválaszolása felé irányítottak és folyamatosan segítettek. Köszönöm a volt TDK hallgatómnak, Jelencsics Kirának, hogy közös munkánk során tanítva tanulhattam tőle, és azt a sok szép eredményt, amelyet együtt elértünk. Köszönettel tartozom jelenlegi munkatársaimnak: Dr. Blazsek Józsefnek, Dr. Burghardt Beátánaknak, Bori Erzsébetnek, Dr. Demeter Irmának, Dr. Hegyesi Orsolyának, Jobbágy-Óvári Gabriellának, Kálló Karolának, Dr. Kerémi Beátának, Dr. Kádár Kristófnak, Dr. Simon Györgynek, Dr. Rácz Gábornak, Dr. Nagy Krisztinának, Dr. Páska Csillának és a Semmelweis Egyetem Orálbiológiai Tanszék összes dolgozójának segítségükért és a munkára inspirálóan ható jó hangulatért. Külön köszönet illeti Dr. Szalay Katalint, Dr. Szeberényi Júliát és Dr. László Valériát disszertációm gondos átnézéséért, javításáért és a végső befejezést segítő kritikákért. Hálás vagyok családomnak és barátaimnak a megértésükért, türelmükért és támogatásukért. Köszönet az Egészségügyi Tudományos Tanácsnak (ETT) a kutatómunkám támogatásáért, ETT (2003-2005) 471/2003.

122

Metabolikus és endokrin változások a hisztaminhiányos HDC-KO egér modellben

Recommend Documents