2008.09.26.
Vérképző szervek betegségeinek laboratóriumi diagnosztikája Vérkenet Csontvelő aspirátum (kenet+beágyazott) Csontvelő szövettan (crista biopsia) Áramlásos citometria Citogenetika/FISH Molekuláris diagnosztika
Komplex diagnosztika malignus hematológiai megbetegedésekben Klinikai dg. morfológiai dg. Immunológiai dg. citogenetikai dg. Molekuláris dg.
1
2008.09.26.
A vizsgálatok egymásra építettsége a hematológiai diagnosztikában
klinikum
morfológia
tünettan
szövettan citológia
fenotípu genotípus s immunhisztológia molekulári
immunhisztológia áramláscitometria
molekulári s vizsgálat
Áramlás citometriai panelek I. IgG izotípus kontrollok AL I. blasztok esetén
CD14 – HLA-DR – CD45
AL, MDS, CMPD, CML blasztos kr.
CD13 – CD7 – CD19
Myeloid vonal
T-sejtes vonal
B-sejtes vonal
CD15 – CD33 – CD45
CD7 – CD8 – CD4
CD20 – CD10 – CD19
CD36 – CD64 – CD45
CD5 – CD7 – CD3
CD9 – CD34 – CD19
Co – CD34 – CD45
icCD3 – CD1a – CD2
CD10 – CD38 – CD19
MPO – CD34 – CD45
(ploiditás gyerek leukémiában)
IgM – CD19 – CD45 Co – CD19 – CD45 icIgM – CD19 – CD45 (ploiditás gyerek leukémiában)
SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
2
2008.09.26.
Áramlás citometriai panelek II. IgG izotípus kontrollok Κ – λ – CD19
Ly I.
CD3 - CD8 – CD4 CD10 – CD19 – CD45 T-sejtes vonal
B-sejtes vonal
TCRα/β – TCRγ/δ – CD2
CD5 – CD23 – CD19
CD3 – CD26 – CD4
CD38 – CD56 – CD19
(Sezary szindr., Mycosis Fung. esetén)
Szűk CLL
Szűk Myeloma multiplex.
CD10 – CD19 – CD45
CD10 – CD19 – CD45
CD5 – CD23 – CD19
CD38 – CD56 – CD19
CD103 – CD22 – CD20 ha CLL Zap70 kontrollal
co– CD38 – CD19 Zap70 – CD38 – CD19 SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
A crista biopszia indikációi • • • • • • •
Punctio sicca Citopénia, hypocelluláris hematológiai betegségek Ciológiai abnormitás további vizsgálta Csontvelői infiltráció megítélése Stromareakció megítélése Kezelés monitorozása, reziduális betegség vizsgálata Immunológiai, infektológiai, onkológiai indikációk
3
2008.09.26.
Aspiratio Citológia Egyedi jelleg
Biopszia Hisztológia Struktúra
Csontvelőbiopsziás előkészítés: biopszia Yamshidi tűvel a spina iliaca post. sup területéről
4
2008.09.26.
Crista biopsiás minta feldolgozása • Fixálás (10%pufferezett formalin, min. 6 óra) • Dekalcinálás (EDTA, 1 éjszaka) • Víztelenítés • Paraffinba ágyazás • Metszés (2 (2--4 um vastagság) • Deparafinálás • Rehidrálás • Festés Feldolgozás ideje kb. 3 napi
Szövettani vizsgálatai lehetőségek csontvelőmintákon I. Szöveti összefüggések vizsgálata hagyományos festésekkel
• • • • • •
Sejtmorfológia (dysmorfológia) Sejt Sejt-- és stroma viszonya Csontvelő mennyiségi összetétele Sejtek elosztása (topográfia, sejtcsoportok) Speciális sejttípusok, zárványtestek, tárolási zavarok Csontos állományhoz, erekhez való viszony
5
2008.09.26.
Szövettani vizsgálatai lehetőségek csontvelőmintákon II. Szöveti komponensek feltüntetése speciális festésekkel
• • • • • •
Citológiai részletek, metachromasia (Giemsa) Enzimaktivitás (chloroacetát (chloroacetát--eszteráz, mieloperoxidáz) Rácsrost (reticulin, Gömöri) Kollagén (Van Gieson, picrosyrius) Vas (Berlini (Berlini--kék) Glikogén, komplex szénhidrátok (PAS)
Szövettani vizsgálati lehetőségek csontvelőmintákon III. Immunhisztokémia • Sejtes összetétel (B (B--sejt, TT-sejt, histiocyta, stb.) • Klonalitás (kappa, lambda) • Sejtkiválasztás, sejtproliferáció (bcl (bcl--2, bclbcl-6, KiKi-67) • Aberráns markerek (CD5, cyclin D1) • Terápia asszociált markerek (CD20, CD52) • Ritka sejttípusok (Hodgkin (Hodgkin--sejt, micrometastasis)
6
2008.09.26.
Immunmarkerek differenciálódás szerint Blaszt fenotípus: CD34 CD117 CD72(transzferrin rec.) Tdt CG eredet:
CD--10 CD bcl bcl--6
Érett BB-sejt:
CD19 CD20 CD79 felszíni kappa, lambda
Plazmasejt:
CD138 MUM1 citoplasmat. kappa, lambda
Mono--/histiocyta: CD68 Mono lizozim T-sejt:
CD2, CD3 CD5, CD7 CD4, CD8
Megakaryocita:
CD31, CD61, VIII- faktor VIII-
Erythroid sejtek: Granulocyta: Dendritikus sejtek:
glycophorin A MPO CD21 CD23
Langerhans sejtek: S S--100 CD1a
A csontvelő biopsziás lelet fő részei • • • • • • •
Értékelhetőség Cellularitás Hemopoietikus sejtvonalak aránya Hemopoietikus aktivitás jellemzése Patológiás sejtszaporulat jellemzése Lymphoid sejtek és egyéb reaktiv jelenségek Nem hemopoietikus sejtek és folyamatok (stroma, tárolás, stb.) • Összefoglaló vélemény • Diagnózis
7
2008.09.26.
Lymphadenomegaliával jelentkező beteg anamnézise Infekció? Háziállatok ? Macskakarmolás? Gyógyszerszedés? Utazás egzotikus külföldi országba? Autoimmun betegség? Szexuális irányultság? Lymphomás beteg a családban?
Fizikális vizsgálat:
nyirokcsomó status? hepatosplenomegalia? vena cava superior syndroma?
Lymphoma klasszifikáció : WHO 2000 B sejtes tumorok prekurzor BB-sejtes tumor érett BB-sejtes tumorok T-sejtes és ?K?K-sejtes tumorok prekurzor TT-sejtes tumorok érett TT-sejtes és ?K?K-sejtes tumorok
8
2008.09.26.
Érett (perifériás) BB-sejtes tumorok B-sejtes krónikus lymphocytás leukémia /kis lymphocytás lymphoma B-sejtes prolymphocytás leukémia Lymphoplasmocitás lymphoma Splenikus marginális zóna lymphoma Hajassejtes leukémia Plazmasejtes myeloma/plasmocytoma Nodális marginális zóna BB-sejtes lymphoma Extranodális marginalis zóna BB-sejtes lymphoma MALT típus Follikularis lymphoma Köpenysejtes lymphoma Diffúz nagy BB-sejtes lymphoma Mediastinalis (thymikus) nagy BB-sejtes lymphoma Intravascularis nagy BB-sejtes lymphoma Primer effusionalis lymphoma Burkitt lymphoma Lymphomatoid granulomatosis WHO felosztás, 2000
Érett perifériás TT- és ?K?K-sejtes tumorok T-sejtes prolymphocytas leukémia T-sejtes large granularis lymphocytas leukémia Aggresszív NKNK-sejtes leukémia Adult TT-sejtes lymphoma/leukémia (HTLV1+) Extranodális NK/TNK/T-sejtes lymphoma, nasalis típus Enteropathia--típusú TEnteropathia T-sejtes lymphoma Hepatosplenikus γ/δ T-sejtes lymphoma Subcután panniculitisszerű TT-sejtes lymphoma Blastos NKNK-sejtes lymphoma Mycosis fungoides/Sezary szindróma Anaplasztikus nagysejtes lymphoma, T/0 sejtes, primér cután típus Periferiás TT-sejtes lymphoma (másképpen nem meghatározott) Angioimmunoblastos TT-sejtes lymphoma Anaplasztikus nagysejtes lymphoma, T/0 sejtes, szisztémás típus. WHO felosztás, 2000
9
2008.09.26.
A BB-sejtes nem nem--Hodgkin lymphomák klinikai felosztása Prognosztikus csoportok
B-Sejtes
Mérsékelt malignitású (indolens)
Krónikus lymphoid leukémia (CLL) Waldenström macroglobulinaemia Hajas sejtes leukémia (HSL) Splenikus marginális zóna lymphoma Follicularis lymphoma Grade II-II Plasmocytoma/myeloma
Mérsékelten agresszív lymphomák
Köpenysejtes lymphoma Follicularis lymphoma Grade III
Agresszív lymphoma
Diffúz nagynagy-B-sejtes NHL
Nagyon agresszív lymphomák
Prekurzor B B-- Lymphoblastos lymphoma/ALL Burkitt lymphoma
A lymphomák prognosztikai csoportosításának alapja Szövettani vizsgálat A betegség stádiumának meghatározása
Nyak— Nyak —mellkas és hashas-kismedence CT Csontvelőbiopszia Nemzetközi prognosztikai index (IPI score) kiszámítása
10
2008.09.26.
a „rituximab-éra „
A CD20 antigén, mint az immunterápia célpontja Őssejt Pre-PreB sejt
éretlen B sejt
Pre-B sejt
érett B sejt sIgM
HCR
HCR
HCR κR/D
Activált B sejt sIgM +D
Plasma sejt sIgM sIgG sIgA IgM IgG IgA
HCR λ R/D
Antigén independens
Antigén dependens
CD20 expresszió Malignitások: Precursor B-sejt leukémiák
B-sejtes lymphomák/CLL
M. Waldenström/ myeloma
11
2008.09.26.
CHOP versus CHOP+ rituximab diffúz nagy B-sejtes lymphomában (DLBCL)
Coiffier et al, N Engl J Med 236, 346, 2002
MabThera: Egér/humán kiméra monok monoklon loná ális anti antitest test Kiméra IgG
1
Variábilis régió (egér) egér) specifikusan kötődik a CD20CD20-hoz
Humá Hum án κ konstans régi gió ó
Humá Hum án
pre--B- és B-sejtek pre CD20 molekulájához kötődik
12
2008.09.26.
B-CLL: mérsékelt malignitású NHL
Perif vér flow citometria CD5+/CD19+ sejtek
Monomorph lymphoid csontvelőinfiltrátum CLL-ben
CLL-ben
13
2008.09.26.
CLL diagnosztikára vonatkozó ajánlások
NCI 1996
Fizikális vizsgálat Teljes vérkép, ly morfológia, reticulocyta Felszíni markerek • a fő sejtpopul.B-markerekre +(CD19, CD20,CD23) és CD5+ • a B sejtek monoklonálisak, vagy kappa vagy lambda expresszióval • a sejtfelszíni immunglobulinok denzitása alacsony • Elkülönítendő kórképek T-CLL prolymphocytás leukémia hajas sejtes leukémia és variáns formája Splenikus lymphoma villosus lymphocytákkal LGL-sejtes leukémia non-Hodgkin lymphomák leukémiás fázisa (folliculus centrum sejtes vagy MCL)
CD19+
Malignus B sejt
CD20+ CD52+
14
2008.09.26.
Új prognosztikai (a kórjóslatot elősegítő) tényezők a lassú és a gyors kórlefolyású esetekben
Kétféle B sejttípus elkülönítése sejtfelszíni tulajdonságok
pl. CD 38 ZAP70
citogenetikai eltérések
pl. 1717-es kromoszóma egyik karjának hiánya
Diagnózis : -morfológia -flow cytometria
Prognosztikai értékelés : -Klinikai stádium -Interfázis FISH -IgVH mutációs státusz -ZAP-70 -CD38
Mikor történjék CLL-ben az új prognosztikai markerek meghatározása CLL-ben?
Fiatal(abb) CLL-es betegen a diagnóziskor
Alacsony, közepes és magas kockázat
15
2008.09.26.
Hajas sejtes leukémia (HSL) Incidencia:
3 eset / millió lakos / év
Klinikum:
splenomegalia nincs tapintható lymphadenomegalia
Vérkép:
- pancytopenia, - monocytopenia, - hajas sejtek aránya kicsi → kimutatás: buffy coat készítményben
Immunológia:
CD103+, CD19+, CD21–, FMC-7+, CD11c+
16
2008.09.26.
Myeloma multiplex: diagnosztika
Süllyedés, vérkép Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet)
csontröntgenek csontvelővizsgálat
17
2008.09.26.
Diagnosztika myeloma multiplexben
Süllyedés, vérkép
M-komponens kimutatása fehérje elektroforézissel
Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat
Diagnosztika myeloma multiplexben
Süllyedés, vérkép
Lytikus csontelváltozások
Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat
18
2008.09.26.
Diagnosztika myeloma multiplexben
Süllyedés, vérkép Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat
Aspirált csontvelő: Diffúz plazmasejtes infiltráció
Diagnosztika myeloma multiplexben
Süllyedés, vérkép Fehérje elektroforézis (szérum, vizelet) csontröntgenek csontvelővizsgálat
Szövettani vizsgálat: Diffúz plazmasejtes infiltráció
19
2008.09.26.
Klinikai stádium megállapítása (Durie-Salmon, 1975) I. Stádium: A sejttömeg kicsi (0,6 x 1012/m2) II. Stádium: a kettő közt
III. Stádium: A sejttömeg nagy (1,2 x 1012/m2) haemoglobin < 100 g/L szérum kalcium > 2,6 mmol/L előrehaladott csontdestrukció monoklonális szérum IgG > 7 g / dl, IgA > 5 g/dl vizelet könnyűlánc-ürítés > 4 g / 24 óra A: szérum kreatinin <170 µmol/L (<2 mg/dl) B: szérum kreatinin >170 µmol/L (<2 mg/dl)
International Staging System of the International Myeloma Working Group Stádium β2 microglobulin serum albumin Átlagos túlélés (mg/dl) (g/dl) (hónap) I.
< 3.5
> 3.5
62
II.
< 3.5
< 3.5
44
II.
3.5 – 5.5
NA
44
III.
> 5.5
NA
29
20
2008.09.26.
Képalkotó eljárások myeloma multiplexban A betegség kiterjedtségének és súlyosságának megállapítása a diagnóziskor
Csontröntgenek
CT
Mellkasrtg (PA) Nyaki gerinc rtg (AP(APoldalirányú+nyitott szájjal) DL gerinc Humerus, femur rtg. koponya AP+oldalir. Medence AP +tüneteket okozó területek
MRI
Myelodysplasia syndroma
21
2008.09.26.
Myelodysplasia syndroma - általános jellemzők
__________________________________________ Mono- bi vagy tricytopenia a perifériás vérben A csontvelő normo-/hypercelluláris (ritkán hypoplastikus) Ineffektív hemopoezis, fokozott apoptosis A betegek egy részében akut leukémia alakul ki
Myelodysplasia syndroma - általános jellemzők _______________________________________________ Medián életkor 64 év. Éves incidencia ezen belül
4-5/100 000 az általános populációban, <50 év: 0.5/100 000, >80 év 89/100 000
?emi arány: férfi:nő=1.2:1
22
2008.09.26.
MDS- diagnózis • Anaemia • Granulopenia tünetei • Thrombocytopenia vagy thrombocytosis • + kóros, diszfunkcionáló granulocyták, thrombocyták Csontvelőkenet+cristabiopszia + citogenetika
Myelodysplasia syndroma - csontvelőkenet
Dyserythropoesis
Dysgranulopoesis
dysmemegakaryopoesis
Matolcsy, Udvardy, Kopper Hematológiai betegségek atlasza, Medicina, 2006
23
2008.09.26.
MDS- WHO klasszifikáció • Refrakter anémia (RA) • RA gyűrűs (Ring) szideroblasztokkal (RARS) • Refrakter cytopénia több rendszert érintő dysplasiával • RAEB-1 (Refrakter anaemia with excess of blasts) • RAEB-2 • MDS/MPDS • Del(5q)
Myelodysplasia syndroma- refrakter anaemia Ring (gyűrűs) sideroblastokkal
24
2008.09.26.
MDS - 5q- szindróma ___________________________________________ Anaemia, makrocytosis Thrombocytosis Jellegzetes megakar.morfológia
-Indolens klinikai lefolyás - Az AML kialakulásának esélye kicsi
International Prognostic Score System (IPSS) MDS-ben _______________________________ - A csontvelői blastaránytól - Citogenetikától és a - Citopenia mértékétől függ Ezen besorolás alapján becsülhető - a várható túlélés - az akut myeloid leukaemiává transzformálódás valószínűsége
25
2008.09.26.
International Prognostic Scoring System (IPSS) kockázati csoportok Kis score
0
AML kial.
19%
Intermed- Intermed- Nagy 1 2 0,5-1,0 1,5-2,0 2,5 v. felett 30% 33% 45%
Medián idő AL-ig Medián túlélés
9,4 év
3,3 év
1,1év
0,2 év
5,7 év
3,5 év
1,2 év
0,4 év
Heveny leukémiák
26
2008.09.26.
Akut leukémia- általános jellemzők • Csontvelő eredeű, nagy malignitású, klonális, heterogén betegségcsoport, • Hasonlóság mellett különböző célsejt (AML-ALL) immunfenotípus,citogenetikai eltérés, klinikai megjelenés,terápiás válasz. • Tüneteit általában nem maga a daganatsejt okozza,hanem az általa elnyomott normális vérképzés hiánya: anémia, thrombocytopenia,neutropenia
Akut leukémiák általános jellemzői • Diagnózis kritériumai: • a csontvelőben a nonerythroid elemek több mint 20%-a blast (vagy Auer pálca észlelhető.) • A blastok myeloid,monocyta,ritkán erythroid ill megakaryocyta irányú=AML, vagy B és T sejt irányú=ALL differenciálódást mutatnak. • Bi-fenotípusos: a blastok néha myeloid és lymphoid jeleket is expresszálnak
AML: - de novo ill - szekunder (myelodysplasiából vagy krónikus myeloproliferativ betegség talaján) ALL : B, T sejtes ill. érett B sejtes.
27
2008.09.26.
AML WHO felosztás
28
2008.09.26.
Akut leukémia : Általános jellemzők • Epidemiológia • AML 3 - 4 beteg/100 000 lakos/év 30 év alatt 17beteg/100 000 lakos/év 75 év felett mérsékelt férfi predominancia ALL:1,4 beteg/100 000 lakos/év(időskorban ez is emelkedik) AML/ALL= 3
Akut leukémia: prognózis
•Prognózis:általában rossz, • függ:
- életkortól, - citogenetikától, - általános állapottól 60 év alatt jó cytogenetika és jó általános állapot 80% CR és 50% gyógyulás!!
29
2008.09.26.
Akut leukémia I Általános jellemzők • Etiológia Környezeti:kémiai anyagok, sugárzás, cytostatikumok Genetikai: Down kór (22-es trisomia) Ataxia-teleangiektázia (ATM 11q 23 del).
•Akut leukémia: laboratóriumi diagnosztika •LABORATORIUMI VIZSGÁLATOK: •vérkép:
leukocytosis, blastsejtek (Auer pálca), • anemia, thrombocytopenia kémia: magas hugysav, LDH • hemostasis:DIC thrombocytopenia Citokémia:POX,Sudán fekete stb-(ma már nem jelentős
Flow Cytometria: CD 13-14-33-34 AML CD –2-3-10-19- ALL Citogenetika: konvencionális és FISH PCR:molekuláris vizsgálatok
30
2008.09.26.
Akut leukémia III leukemogenezis • A leukémiát mutációk hozzák létre: „two-hit” hipotézis - a II csoportú mutáció a sejtek érésében fontos transzkripciós faktorokat károsítja, ezáltal az érés szempontjából fontos fehérjék messengerRNS ei nem képződnek,a sejt nem tud kiérni, de még nincsen proliferációs előnye(van-vegetál) • az I. csoportú mutációk adják meg a proliferációs előnyt azáltal,hogy a sejtmembrán növekedési receptor jelátvitelét zavarják[.ligand nélküli folyamatos jelátvitel lesz • (III tip receptorok flt-3, c-kit,ill RAS,STAT rendszer aktiválódás) Egyed M: Heveny leukémiák in: Dank, Demeter (szerk): Fókuszban az onkológia, onkohematol,, 2006
II. Mutációs csoport - CBF (core binding faktor) mutációk (t 8;21) AML1-ETO Inv(16) CBFβ-MYH11 - RA receptort érintő transzlokációk t(15;17)
31
2008.09.26.
Akut leukémia csoportosítás • WHO beosztás • FAB(French-American-British) AML: M0-M7 ALL:L1- L3 • Cytogenetika: – jó prognózisú t(8;21), t(15;17), inv (16)
- neutralis progn.:normal karyotípus,8-as trisomia,del llq 23 - rossz prognózis:komplex abnormalitás, jelentős genetikai anyagvesztés stb.
Akut leukémia (AML) IV kezelés
32
2008.09.26.
Az FLT3 (fms-szerű tirozin kináz-3) gén mutációinak AML-ben prognosztikus szerepe van [FLT3 ITD]; az FLT3 gén ITD (internal tandem duplikáció) mutáció kimutatása: DNS-mintából fluoreszcens PCR-t követő kapilláris elektroforézissel [FLT3 D835]: az FLT3 gén 835. pozíciójában (tirozin kináz domén, TKD) található aszparaginsav (D835) pontmutációinak kimutatása DNS-mintából PCR-t követő restrikciós fragmens hossz analízissel (RFLP) A mutációk jelenléte fontos az AML-es beteg prognózisának megítélésekor és esetlegesen a kezelést is befolyásolhatja.
Akut myeloid leukémia kezelési elvek __________________________________
Egyed M: Heveny leukémiák in: Dank, Demeter (szerk): Fókuszban az onkológia, onkohematol,, 2006
33
2008.09.26.
A felnőttkori akut lymphoid leukémia • ALL előfordulása: 1,4 beteg / 100 000 lakos férfiakban kissé gyakoribb WHO besorolás - prekurzor B-sejtes lymphoblastoslymphoma/leukemia - „ T-sejtes „ - Burkitt lymphoma/leukémia
„
Rizikóbecslás akut lymphoid leukémiában
34
2008.09.26.
Idült myeloproliferatív betegségek
Idült myeloproliferatív betegségek Krónikus lefolyású, őssejt eredetű klonális megbetegedések
A csontvelőben egy- vagy több sejtvonal proliferációja
Jellemző:
leukocytosis
thrombocytosis
+ hepatosplenomegalia
35
2008.09.26.
Idült myeloproliferatív betegségek Miért idült ?
Akut és krónikus myeloproliferatív betegség megkülönböztetése ___________________________________________________ akut myeloid leukémiát definiáló sajátság alapján: 20 %-os vagy afeletti blast-arány a csontvelőben és/vagy a perif. és ennek következményei
A krónikus myeloproliferatív betegségek WHO felosztása Krónikus myeloid leukémia [Ph kromoszóma, t(9;22)(q34;q11), BCR/ABL CR/ABLpozitív] pozitív]
Polycythemia vera Krónikus idiopathiás myelofibrosis (extramedullaris hematopoiesissel)
Essentialis thrombocythaemia Krónikus neutrofil leukémia Krónikus eosinofil leukémia(és a hypereosinofilia syndroma)
36
2008.09.26.
Krónikus myeloid leukémia (CML):
Az összes leukémia esetek 15-20%-a
Incidencia: 1,7-2,2 /100 000 lakos/év, az életkorral nő
Kórlefolyás:: a CML fázisai Kórlefolyás Előrehaladott fázisok Krónikus fázis
átlagosan 5-6 év
Akcelerált fázis
Blasztos krízis
Átlagos tartam
Átlagos túlélés
6–9 hónap
3–6 hónap
–A dg. az esetek 50%50%-ban rutin labor vizsgálatok során derül ki –Az esetek 85%85%-ra a krónikus fázisban derül fény
Fehérvérsejt érési sor 1.
2.
myeloblast;
promyelocyta
3.
myelocyta;
4.
5.
metamyelocyta pálca
6.
szegment
GAP (granulocyta alk. phosph.). aktivitás
GAP negatív granulocyta
GAP ++++ granulocyta
37
2008.09.26.
A CML diagnózisának sine qua nonnon-ja: a Ph kromoszómapozitivitás: kromoszómapozitivitás:
9
9 (q+)
Ph
22
(22q-)
bcr bcr-abl abl
citogenetika: t(9;22)transzlokáció t(9;22)transzlokáció
Fúziós protein tirozinkináze aktivitással
Molekulárisan: BCR/ABL pozitivitás
CML: klonális megbetegedés
genetikai oka a 9. és 22. Kromoszóma hosszú karjai közti reciprok transzlokáció következtében a 22. Kromoszómán ( ún. Philadelphia kromoszóma) létrejövõ bcr/abl fúziós gén, melynek fehérje terméke kóros tirozinkináz aktivitással rendelkezik és felelős a leukémiás folyamatért.
A fokozott TK aktivitás miatt - növekedési faktor független proliferáció, - csökkent apoptózis - csökkent adhézió áll fenn.
38
2008.09.26.
Az integrált megközelítés lehetősége malignus hematológiai megbetegedésekben: CML Klinikai adatok: leukocytosis, basophilia, thrombocytosis. splenomegalia Morfológia: perifériás vér
és
csontvelőkenet
Diagnosztikai komplexitás CML-ben Szövettani szubtípus meghatározás Kariotípus t (9;22) FISH BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
39
2008.09.26.
Diagnosztika krónikus myeloid leukémiában Szövettani szubtípus meghatározás
9
9 (q+)
Kariotípus Ph
22
(22q-)
t (9;22) FISH bcr bcr-abl
BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
abl Fuziós PROTEIN TYROSINKINASE aktivitással
Diagnosztika CML-ben Szövettani szubtípus meghatározás
normális
Kariotípus t (9;22) FISH (Fluoreszcens in situ hibridizáció)
t (9;22)
BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
40
2008.09.26.
Diagnosztika krónikus myeloid leukémiában Szövettani szubtípus meghatározás Kariotípus t (9;22) FISH
BCR-ABL fúziós gén képződése
BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok Hematológiai válasz
Citogenetikai válasz t (9;22) FISH Molekuláris válasz: BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
•Normalis vérsejtszámok Fvs <10 x 109/L Thrc <450 x 109/L éretlen sejtek hiánya • splenomegalia • norm. fizikális status • a kezelést a beteg tolerálja
41
2008.09.26.
A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok (G sávozással vizsgált mintában, legalább 20 metafázis alapján)
Szövettani szubtípus meghatározás •
Minimális (MCgR)
Citogenetikai válasz
Ph+ sejtosztódás: 35 - 95 %, a kiindulási értékhez képest kevesebb
t (9;22) FISH
•
Parciális (PCgR) Ph+ sejtosztódás:
BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
•
de
1 - 34 %
Komplett (CCgR) Ph+ sejtosztódás:
0%
A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok Szövettani szubtípus meghatározás
Klonális evolúció
Citogenetika t (9;22) FISH BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
42
2008.09.26.
A CML kezelése során végzett utánkövetéses vizsgálatok Molekuláris monitorozás mint a klinikai döntéshozatal alapja Szövettani szubtípus meghatározás Kariotípus t (9;22) FISH
BCR-ABL fúziós gén képződése
Molekuláris válasz: BCR/ABL transzkript mennyiségi meghatározás
Időpont
2002.12
Fvs X G/l
Thr X G/l 79,0
Hb g/l
Citogenetika
3268
84 46, X,Y (1) 46, XY t(9,22)( 29)
Blast: 25%
FISH
Kvant. RT-PCR (TaqMan)
-
1309 CML score: 4277 (nagy rizikó)
2003.03
4,1
500
134 46, X,Y (24) 46, XY t(9,22)( 6)
12% bcr/abl+
32
2003.05
4,9
179
146 Neg.
negatív
Csv.hypoplasia
2003.o6
4,9
211
141 Neg.
negatív
Csv: extrém hypoplasia 92
2003.o8
4,1
163
147 Neg.
-
negativ
2003.11
4,9
150
141 Neg..
-
0,75
2008. 09.
4,6
186 146
t (9;22) negativ
negativ
Neg.
43
2008.09.26.
A CML kezelésének és a terápiás válasz monitorozásának lehetőségei Évek
Gyógyszer
Monitorozás
Várható túlélés
1950-59 19501960--69 1960
busulphan hydroxyurea (Litalir)
fvs, lépméret „
3-4 év 4-5 év
1970--79 1970
allogén csontvelőátültetés
citogenetika
55--60% hosszú távú túlélés 55
1980--89 1980
interferon interferon--a (Intron--A, (Intron Roferon--A) Roferon
citogenetika
6-7 év
1999 óta
(imatinib, Glivec) citogenetika kvantitativ RTRT-PCR
2005 óta
(dasatinib, Sprycel)
még nem ismert
Prof. Dr Kelemen Endre
44
2008.09.26.
Európai Őssejttranszplatációs Csoport tevékenységének alakulása CML-ben
www.ebmt.org
Az új szerekkel (tirozinkinázgátlókkal) végzett kezelés során a CML fázisai közti határok eltolódhatnak
Előrehaladott fázisok Krónikus fázis
átlagosan 5-6 év stabilizáció
Akcelerált fázis
Blasztos krízis
Átlagos tartam
Átlagos túlélés
6–9 hónap
3–6 hónap
A klasszikus 3 fázisú kórelfolyás megváltozhat Baccarani, 2006
45
2008.09.26.
POLYCYTHAEMIA RUBRA VERA (PRV) Pancytosissal járó krónikus myeloproliferativ megbetegedés. Mindhárom csontvelői sejtrendszer autonom proliferációja, a vörösvérsejtrendszer hyperplasiája dominál.
Előfordulása:
általában 55 éves kor felett Férfi:nő arány: 1: 1
A polycythaemia vera diagnózis kritériumai: A kategória: 1. megnövekedett vörösvértest volumen (Cr 51 izotóp) 2. Artériás vér oxigén telítettsége >92% 3. splenomegalia B kategória: 1. thrombocytosis 2. leukocytosis (láz és fertőzés nélkül) 3. a granulocyta alkalikus foszfatáze aktivitás növekedett 4. serum B12 növekedett Dg kimondható: ha 3 A kategóriás kritérium, vagy az 1 és 2 A kritérium + 2 B kategóriás kritérium teljesül.
46
2008.09.26.
Polycythaemia verában javasolt (kiegészitő) vizsgálatok: Csontvelőbiopszia Polimorf megakaryocytaszaporulat, nagy megakaryocyták, fokozott csontvelői cellularitás: panmyelosis lehet rácsrostszaporulat szérum erythropoetin (Epo) szint meghatározás
Csontvelőhisztológia: normal cellularitás
47
2008.09.26.
PV
Csontvelőbiopszia: fokozott cellularitás trilineáris hyperplasiával
Szerzett JAK2 mutáció Pontmutáció a JAK2 gén JH2 pseudokináz doménjében (V617F)
A tirozinkináze fehérje 617-es poziciójában a Valin helyett Phenylalanin van
48
2008.09.26.
JAK V 617 F mutációanalizis a JAK-2 pozitivitás gyakorisága PV (65-97%)
ET (23-57%)
78
MF (35-90%)
35
50 %
Erősebb poiztiv, mint negativ prediktiv érték a DNS vizsgálat nem helyettesiti ugyan a csontvelőbiopsziát, de nagyon hasznos
Áramlás citometriai panelek I. IgG izotípus kontrollok AL I. blasztok esetén
CD14 – HLA-DR – CD45
AL, MDS, CMPD, CML blasztos kr.
CD13 – CD7 – CD19
Myeloid vonal
T-sejtes vonal
B-sejtes vonal
CD15 – CD33 – CD45
CD7 – CD8 – CD4
CD20 – CD10 – CD19
CD36 – CD64 – CD45
CD5 – CD7 – CD3
CD9 – CD34 – CD19
Co – CD34 – CD45
icCD3 – CD1a – CD2
CD10 – CD38 – CD19
MPO – CD34 – CD45
(ploiditás gyerek leukémiában)
IgM – CD19 – CD45 Co – CD19 – CD45 icIgM – CD19 – CD45 (ploiditás gyerek leukémiában)
SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
49
2008.09.26.
Áramlás citometriai panelek II. IgG izotípus kontrollok Κ – λ – CD19
Ly I.
CD3 - CD8 – CD4 CD10 – CD19 – CD45 T-sejtes vonal
B-sejtes vonal
TCRα/β – TCRγ/δ – CD2
CD5 – CD23 – CD19
CD3 – CD26 – CD4
CD38 – CD56 – CD19
(Sezary szindr., Mycosis Fung. esetén)
Szűk CLL
Szűk Myeloma multiplex.
CD10 – CD19 – CD45
CD10 – CD19 – CD45
CD5 – CD23 – CD19
CD38 – CD56 – CD19
CD103 – CD22 – CD20 ha CLL Zap70 kontrollal
co– CD38 – CD19 Zap70 – CD38 – CD19 SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
Real-time PCR assay-k 1. BCR-ABL minor génfúzió, t(9;22)(q34;q11) felnőtt ALL-ben 25-30%, gyerek 2-5%, AML-ben ritkábban, CML nagy részében 2. BCR-ABL major génfúzió, t(9;22)(q34;q11) CML nagy részében, ALL ~35%-ban 3. BCL2-IgH génfúzió, t(14;18) FL
4. PML-RARA génfúzió, t(15;17)(q22;q21) M3 AML-ben, 5. CBFB-MYH11 génfúzió Inv(16)(p13q22) 8-9% of newly diagnosed AML, 6. TEL-AML1 génfúzió t(12;21)(p13;q22) gyerek precursor-B-ALL ~25%-ban 7. MLL-AF4 génfúzió t(4;11)(q21;q23) leggyakoribb 11q23 transzlokáció precursor B-ALL-ben, a terápia indukált ALL mintegy 4060%-ában. 8. AML1-ETO génfúzió t(8;21)(q22;q22) AML ~8% 9. SIL-TAL1 génfúzió, 1p32 intrakromoszómális mikrodelécio a leggyakoribb kromoszómaaberráció gyerek T-ALL-ben. Az esetek 5-25%-ban,CD3- és TCR ab+ esetekben. SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
50
2008.09.26.
FISH PRÓBÁK I Akut myeloid leukaemia
B-sejtes akut leukaemia
t(9;22) ES
BCR//ABL BCR
t(12;21) ES
TEL//AML1 TEL
t(8;21) DF
AML1//ETO AML1
t(9;22) ES
BCR//ABL BCR
t(15;17) DF
PML//RARA PML
11q23 split
MLL MLL
11q23 split
MLL MLL
inv16 split
CBFB CBFB
Chronicus lymphoid leukaemia
ES - extra signal
CEP12
12
17p13
p53
13q14
13q14
11q22.2
ATM
DC - dual color SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
FISH PRÓBÁK II Chronicus myeloid leukaemia
Myelodysplasias syndroma
t(9;22) ES
BCR//ABL BCR
CEP7/7q31
7/7q31
22q11 split
BCR BCR
5p15/5q33
5p15//5q33 5p15
CEP8
8 Follicularis lymphoma Burkitt lymphoma
t(14;18) DC
Igh/ Igh/BCL2
CEP8/t(8;14) TC c-myc myc//IgH
14q32 split
Ig IgH H
8q24 split
18q21 split
BCL2 BCL2
c-myc
ES - extra signal DC - dual color SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
51
2008.09.26.
FISH PRÓBÁK III Köpenysejtes lymphoma
Myeloma multiplex
t(11;14) DC
CCND1//IgH CCND1
t(11;14) DC
11q13 split
CCND1 CCND1
13q14
CCND1//IgH CCND1
t(4;14) Myeloma multiplex, új beteg 17p
p53 11q
t(11;14) Myeloma multiplex, relapszus
t(4;14)
1q ES - extra signal
17p
DC - dual color SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
FISH PRÓBÁK IV Egyéb próbák 3q27 split
BCL6 BCL6
CEPXY
XY
CEP17
17
CEP3/3p
3/3p
Anaplasias nagysejtes lymphoma 2p23--24 split 2p23
ALK1 ALK1
ES - extra signal DC - dual color SOTE I Pathológia Dr Csomor Judit, Prof. Matolcsy András
52
2008.09.26.
A morfológia szerepe a congenitalis thrombocytopeniák osztályozásában
A MayMay-Hegglin anomália: egy autosomalis dominánsan öröklődő, a fehérvérsejtekben látható un. DöhleDöhle-szerű testekkel járó macrothrombocytopenia. Egy család két tagján, anyán és fián diagnosztizáltuk a betegséget és észleltük a társuló veseérintettséget
(Demeter J, Lelkes G, emes L, Kenéz A, Turbucz P, de Chatel R: Familial occurrence of MayMay-Hegglin anomaly: anomaly: is the accompanying renal failure part of a new subentity? Ann Haematol 80 80,, 368368-371 371,, 2001 2001)).
53
2008.09.26.
1996-ban egy 41 éves nőbeteget vettünk fel klinikánkra magas láz miatt. Anamnézisében 1984-ben ITP dg-al (vélelmében) végzett splenektomia. Thrombocytaszám: 40 G/. A perifériás vérkenetben óriásthrombocyták és fehérvérsejtek többségében Döhle-szerű kék zárványteseket láttunk.
Elektronmikroszkóposan a zárványtestek párhuzamos filamentumokból állnak
54
2008.09.26.
May-Hegglin anomáliában szenvedő betegeink klinikai adatai Anya Klinikai tünetek Vérzési idő (Ivy) Thrombocyta Automatával FKFK-Mikroszkóppal MPV Thrombocyta morfológia Fvs morfológia Vesefunkció Proteinuria Audiológia
Beteg fiúgyermek Easy bruising Simplate II: 15 perc felett
16-39x109 /l 1620--27x109 /l 20 9 39--60x10 /l 39 40--43x109 /l 40 11,5 11,5--12,2 11--11,5 11 Óriás thrombocyták Orsó alakú kék zárványtestek Krónikus uraemia Normális 2,7--3,5 g/die 2,7 1,92 g/die Súlyos retrocochleáris Normális halláscsökkenés
Kék zárványtestek, un. DöhleDöhle-szerű testek a betegek neutrophil granulocitáiban (May--Grünwald (May Grünwald--Giemsa)
55
