KANDUNGAN FITOKIMIA, AKTIVITAS ANTIOKSIDAN, DAN SITOTOKSISITAS EKSTRAK BUAH HARENDONG (Melastoma affine D. Don)
NOVILIA EKA SYAFITRI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Kandungan Fitokimia, Aktivitas Antioksidan, dan Sitotoksisitas Ekstrak Buah Harendong (Melastoma affine D. Don) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh saya sendiri. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2013 Novilia Eka Syafitri NIM G84090004
ABSTRAK NOVILIA EKA SYAFITRI. Kandungan Fitokimia, Aktivitas Antioksidan, dan Sitotoksisitas Ekstrak Buah Harendong (Melastoma affine D. Don). Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan SYAMSUL FALAH. Buah harendong diduga mengandung senyawa aktif termasuk fenolik dan flavonoid yang berperan sebagai antioksidan. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis senyawa kimia, mencari ekstrak yang berpotensi sebagai antioksidan, serta menguji sitotoksisitas ekstrak buah harendong (Melastoma affine D. Don). Komponen fitokimia baik ekstrak buah harendong mentah maupun ekstrak buah masak meliputi alkaloid, triterpenoid, flavonoid, fenolik, dan tanin. Pengukuran secara kuantitatif terhadap total fenolik dan flavonoid pada 6 jenis ekstrak dengan hasil total fenolik tertinggi adalah ekstrak etanol 96% buah mentah sebesar 189,56 mg/g, sedangkan kandungan total flavonoid tertinggi adalah ekstrak etanol 70% buah mentah sebesar 225.50 mg/g. Ekstrak terbaik yang mampu menghambat 50% radikal bebas DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazil) adalah ekstrak etanol 70% buah mentah dengan IC50 sebesar 0.01 ppm. Semua ekstrak bersifat tidak toksik terhadap Artemia salina Leach atau tidak aktif untuk uji antikanker dengan nilai LC50 lebih dari 1000 ppm. Kata kunci: antioksidan, Melastoma affine, sitotoksisitas.
ABSTRACT NOVILIA EKA SYAFITRI. Phytochemical Compound, Antioxidant Activity, and Cytotoxicity by Melastoma affine D. Don Fruit Extract. Supervised by MARIA BINTANG and SYAMSUL FALAH. Melastoma affine D. Don fruit is predicted to contain active compounds such as phenolic and flavonoid that act as antioxidant. The aim of the study were to analyze chemical compound, to explore the extract that has potential function as antioxidant, and cytotoxicity test of Melastoma affine D. Don fruit extract. Component of Phytochemical both crude extracts unripe and ripe Melastoma affine D. Don fruit included alkaloid, triterpenoid, flavonoid, phenol, and tannin. Quantitative measurement of total phenols and flavonoids in 6 types extract which highest total phenol was 96% ethanol extract of the unripe fruit was 189.56 mg/g, while the highest content of total flavonoid was 70% ethanol extract of the unripe fruit was 225.50 mg/g. the best extract to inhibit the free radical DPPH by 50% was 70% ethanol extract of the unripe fruit by IC50 was 0.01 ppm. All extracts were not toxic against Artemia salina Leach or inactive for testing anticancer because the LC50 values were more than 1000 ppm. Keywords: antioxidant, cytotoxicity, Melastoma affine.
KANDUNGAN FITOKIMIA, AKTIVITAS ANTIOKSIDAN, DAN SITOTOKSISITAS EKSTRAK BUAH HARENDONG (Melastoma affine D. Don)
NOVILIA EKA SYAFITRI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi:Kandungan Fitokimia, Aktivitas Antioksidan, dan Sitotoksisitas Ekstrak Buah Harendong (lvfelastoma affine D. Don). :Novili& ~ka Syafitri Nama :G8409Q004 NlM
Disetujui oleh
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Pembimbing I
Tanggal Lulus:
'02 AUG 2013
~!
Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si Pembim bi ng II
Judul Skripsi: Kandungan Fitokimia, Aktivitas Antioksidan, dan Sitotoksisitas Ekstrak Buah Harendong (Melastoma affine D. Don). Nama : Novilia Eka Syafitri NIM : G84090004
Disetujui oleh
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Pembimbing I
Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA Segala puji bagi Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya tulis ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan judul Kandungan Fitokimia, Aktivitas Antioksidan, dan Sitotoksisitas Ekstrak Buah Harendong (Melastoma affine D. Don) dilaksanakan sejak bulan Februari sampai Mei 2013 di Laboratorium Penelitian, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS selaku pembimbing 1 dan Dr. Syamsul Falah, S.Hut., M.Si. selaku pembimbing 2 yang telah memberikan bimbingan, motivasi, dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Adhi, Aila, Ika, Dina, Narita, Lusi, Yayuk, Mina, Dhian, Erika, Oki, Azra, dan pihak-pihak lain yang terlibat dalam memberikan bantuan ide maupun materi selama penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada mama, papa, dan Dina atas segala doa, nasihat, dan dukungannya. Akhir kata penulis berharap tulisan ini dapat berguna bagi penulis sendiri maupun semua pihak demi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Agustus 2013 Novilia Eka Syafitri
DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
PENDAHULUAN
1
METODE
3
Bahan
3
Alat
3
Prosedur Percobaan
3
HASIL
6
PEMBAHASAN
9
SIMPULAN DAN SARAN
12
Simpulan
12
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
28
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 3 4 5
Buah harendong Struktur radikal DPPH yang stabil Kadar air buah harendong Rendemen buah harendong Kandungan total fenolik dalam ekstrak buah harendong mentah dan masak Kandungan total flavonoid dalam buah harendong
2 2 6 7 8 8
DAFTAR TABEL 1 Uji fitokimia ekstrak buah harendong 2 Aktivitas antioksidan ekstrak buah harendong berdasarkan dalam IC50 3 Nilai LC50 ekstrak buah harendong
7 9 9
DAFTAR LAMPIRAN 1 Diagram alir penelitian 2 Kadar air buah harendong 3 Rendemen hasil ekstraksi 4 Hasil uji fitokimia 5 Kurva standar asam galat 6 Kandungan total fenolik ekstrak buah harendong 7 Kurva standar katekin 8 Kandungan total flavonoid ekstrak buah harendong 9 Contoh perhitungan IC50 ekstrak buah harendong 10 Pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap % inhibisi 11 Contoh perhitungan LC50 ekstrak buah harendong 12 Analisis statistika dengan SPSS 18
16 17 17 18 19 20 20 21 21 22 26 26
1
PENDAHULUAN Gaya hidup yang tidak sehat seperti merokok, mengkonsumsi makanan yang tidak seimbang, dan terpapar polusi setiap hari menyebabkan peningkatan radikal bebas di dalam tubuh. Peningkatan radikal bebas yang disertai dengan jumlah antioksidan sedikit di dalam tubuh dapat membahayakan tubuh seperti risiko kanker, stroke, aterosklerosis, arthritis, iskemia, penyakit neurodegeneratif, dan AIDS (Kumpulainen dan Salonen 1999; Cook dan Samman 1996). Senyawa radikal bebas dapat terbentuk setiap saat melalui berbagai cara. Radikal bebas atau oksigen reaktif secara umum terbentuk melalui 2 cara, yaitu secara endogen dan eksogen. Pembentukan secara endogen merupakan respon normal proses biokimia di dalam tubuh baik intraseluler maupun ekstraseluler, sedangkan pembentukan secara eksogen misalnya dari polusi, makanan, serta injeksi ataupun absorpsi melalui kulit (Supari 1996). Radikal bebas sifatnya sangat labil dan reaktif sehingga dapat menimbulkan kerusakan pada komponen sel seperti DNA, lipid, protein dan karbohidrat. Kerusakan tersebut dapat menimbulkan berbagai kelainan biologis seperti aterosklerosis, kanker, dan diabetes (Chen 1996). Antioksidan adalah senyawa yang dapat menunda, menghambat, atau mencegah oksidasi lipid atau molekul dengan menghambat inisiasi dan penyebaran reaksi berantai oksidatif (Javanmardi 2003). Radikal bebas dapat direduksi oleh antioksidan, karena antioksidan memiliki elektron bebas yang dapat berpasangan dengan radikal bebas. Secara umum, antioksidan dikelompokkan menjadi 2, yaitu antioksidan enzimatis dan non enzimatis. Antioksidan enzimatis meliputi enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase. Antioksidan non-enzimatis masih dibagi dalam 2 kelompok lagi yaitu antioksidan larut lemak seperti tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, serta antioksidan larut air seperti asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme. Kedua jenis antioksidan tersebut bekerja sama dalam mencegah kerusakan di dalam tubuh akibat senyawa radikal (Miyazaki 2000). Antioksidan non-enzimatis dapat diperoleh secara alami, yaitu dari tanaman. Senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan dapat diprediksi dari golongan fenolik, flavonoid, dan alkaloid, yang merupakan senyawa polar. Flavonoid memberikan efek penghambatan pada radikal bebas yang berlebihan. Hal ini berfungsi dalam mencegah efek merusak dari spesies oksigen reaktif yang mencakup peroksidasi lipid, oksidasi sulfidril dan kelompok rentan lainnya dalam protein (Sies 1985, 1991).
Gambar 1
Gambar 1 Buah harendong mentah (kiri) dan masak (kanan) Salah satu spesies dari marga Melastoma adalah Melastoma affine D. Don atau disebut dengan nama harendong di daerah sunda yang telah banyak diteliti
2 khasiatnya sebagai obat tradisional terutama pada bagian akar dan daun, sedangkan penelitian pada bagian buah tanaman ini masih jarang dilakukan. Di Pananjung Pangandaran, Jawa Barat, daun harendong dapat digunakan sebagai obat luka dengan cara dikunyah dan ditempelkan pada bagian yang luka (Zuhud 1995). Di Kampar, Riau, rebusan daun keduduk digunakan sebagai obat antimalaria (Uji 1995). Di kecamatan Pamarican, Kabupaten Ciamis, daun M. malabathricum yang masih muda diseduh, kemudian digunakan untuk kumur pada saat sakit gigi (Purwantoro 1995). Menurut Munawaroh (1995), di Singkawang, rebusan daun cengkodok diminum sebagai obat penurun panas dan obat mual. Seduhan atau kunyahan daun harendong laki digunakan sebagai obat mencret/diare oleh suku Baduy di Banten. Rebusan daun harendong atau disebut risak oleh suku Dayak di kecamatan Beduai, Kalimantan Barat digunakan sebagai obat muntaber dan berak darah (Wardah dan Setyowati). Semua tanaman mengandung senyawa metabolit baik metabolit primer (asam amino, karbohidrat, asam lemak, sitokrom, klorofil, dan metabolit intermediet dari jalur anabolik dan katabolik) maupun metabolit sekunder termasuk fenolik dan flavonoid yang memiliki berbagai fungsi dan dapat dimanfaatkan dalam bidang kesehatan (Heldt 2005). Senyawa-senyawa metabolit sekunder pada buah harendong belum pernah diteliti sebelumnya, sehingga pada penelitian ini dilakukan penapisan fitokimia. Buah harendong memiliki warna ungu pekat yang diduga mengandung flavonoid serta memiliki rasa manis pada buah masak dan pahit pada buah mentah yang dikendalikan oleh senyawa fenolik berupa asam fenolat atau tanin. Flavonoid memiliki banyak fungsi termasuk sebagai antioksidan (Heldt 2005). Kandungan flavonoid dan fenolik pada setiap buah berbeda-beda dan fungsi kedua senyawa ini juga bervariasi. Oleh karena itu dilakukan uji aktivitas antioksidan terhadap ekstrak buah yang diduga mengandung kedua senyawa tersebut serta dianalisis hubungan antara kedua senyawa bioaktif dengan aktivitas antioksidan. Selain itu dicari ekstrak terbaik yang memiliki kandungan fenolik dan flavonoid tinggi dengan aktivitas antioksidan yang tinggi. Metode yang digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan adalah metode DPPH, yaitu menggunakan DPPH sebagai radikal bebas yang akan ditangkap oleh senyawa aktif yang berada dalam ekstrak. DPPH merupakan senyawa yang stabil pada suhu ruang. DPPH akan tereduksi dan kehilangan warna violetnya menjadi warna kuning pucat (Molyneux 2004). Proses penangkapan radikal ini melalui mekanisme pengambilan atom hidrogen dari senyawa antioksidan oleh radikal bebas, sehingga radikal bebas menangkap satu elektron dari antioksidan. Selanjutnya DPPH akan diubah menjadi DPPH-H (bentuk tereduksi DPPH) oleh senyawa antioksidan (Pine 1988).
Gambar 2 Struktur radikal DPPH yang stabil (Park 2008) Sifat antioksidasi tanaman pada akhirnya akan dimanfaatkan, sehingga perlu dilakukan pengujian sitotoksisitas untuk mengetahui sifat toksik. Senyawa
3 yang bersifat toksik dikaitkan dengan kemampuan senyawa tersebut dalam membunuh sel kanker. Uji ini merupakan uji hayati yang dapat digunakan untuk menduga suatu ekstrak dapat berfungsi sebagai pembunuh sel kanker (Meyer et al. 1982). Penelitian ini bertujuan menganalisis kandungan fitokimia, mencari ekstrak yang berpotensi sebagai antioksidan yang mengandung total fenolik dan flavonoid terbaik, serta menguji sitotoksisitas ekstrak buah harendong (Melastoma affine D. Don). Manfaat dari penelitian ini adalah mengetahui komponen senyawa aktif buah harendong dan fungsi senyawa tersebut sebagai antioksidan, serta mendapatkan ekstrak yang potensial sebagai antioksidan. Pengujian sitotoksisitas diharapkan dapat memberikan informasi lebih lanjut tentang penggunaan buah harendong sebagai antikanker jika sitotoksisitasnya tinggi.
METODE Bahan Bahan yang diteliti adalah buah harendong yang mentah dan masak yang berasal dari daerah Lebak-Banten. Bahan-bahan yang digunakan adalah pereaksi Meyers, Dragendorf, Wagner, Folin ciocalteu 10%, 7.5%, metanol proanalis, NaOH 1 M, 5%, 10%, asam galat, katekin hidrat, larutan DPPH 0.1 mM, asam askorbat, Artemia salina Leach, air laut, dan air (aquabidest). Alat Alat-alat yang digunakan adalah cawan porselin, neraca analitik, eksikator/desikator, vortex, oven, blender, pipet mikro, rotary evaporator, penangas air, spektrofotometer UV/Vis, dan plate BSLT. Prosedur Percobaan Preparasi Sampel Sampel segar diambil sebanyak 2 kg buah harendong mentah dan 2 kg buah harendong masak. Semua bahan dipisahkan dari kotoran atau bahan-bahan asing lainnya dan dicuci hingga bersih. Sampel dikeringkan dengan oven pada suhu 40-50oC selama 4-5 hari hingga kadar air kurang dari 10% agar bahan yang diperoleh tidak mudah rusak. Sampel kering lalu dihaluskan dengan blender dan diayak dengan ukuran 100 mesh. Simplisia yang didapat dibungkus dengan plastik dan disimpan untuk pengujian selanjutnya. Penentuan Kadar Air Penentuan kadar air ini menggunakan metode menurut Association of Official Analytical Chemist (AOAC 2006). Cawan porselin dikeringkan di dalam oven pada suhu 105ºC selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang bobot kosongnya. Sampel berupa buah harendong segar ditimbang sekitar 3 gram dan dimasukkan ke cawan porselin. Sampel beserta cawannya dikeringkan pada suhu 105°C selama 3 jam di dalam oven.
4 Setelah didinginkan dalam desikator selama 30 menit, cawan beserta isinya ditimbang. Prosedur dilakukan berulang kali sampai didapatkan bobot tetap. Penentuan kadar air dilakukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo). Penentuan kadar air dapat dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut : = Dimana a = bobot sebelum dikeringkan (g) b = bobot setelah dikeringkan (g) Ekstraksi Sampel Ekstraksi buah harendong menggunakan metode maserasi menurut Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia (BPOM RI 2004). Maserasi adalah metode ekstraksi dengan perendaman sampel dengan pelarut tertentu. Proses ekstraksi pada penelitian ini menggunakan pelarut etanol 70%, etanol 96%, dan air. Sebanyak 30 gram buah harendong yang telah menjadi bentuk simplisia ditambahkan pelarut dengan perbandingan 1:10, dimasukkan ke dalam maserator, direndam selama 6 jam sambil sekali-kali diaduk, dan didiamkan sampai 24 jam. Maserat dipisahkan dan proses diulang 2 kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 50°C-80°C sampai diperoleh sampel yang menyerupai pasta atau serbuk. Uji Fitokimia (Harborne 1987) a. Alkaloid Ekstrak senbanyak 0.1 gram ditambahkan 10 mL kloroform dan ditambahkan beberapa tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan beberapa tetes H2SO4 pekat. Fraksi asam diambil dan dibagi menjadi 3 tabung, kemudian ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Terdapatnya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada endapan pereaksi Wagner. b. Steroid/ triterpenoid Sebanyak 1 g contoh dilarutkan dengan 25 mL etanol panas 50ᵒC, kemudian disaring ke dalam pinggan porselin dan diuapkan sampai kering. Residu dilarutkan dengan eter dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat (Uji Lieberman Burchard). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau atau biru menunjukkan adanya steroid. c. Flavonoid Sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37 % dan etanol 95 % dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. d. Saponin (uji busa) Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 10 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
5 e. Tanin Ekstrak sebanyak 1 gram ditambahkan 10 mL akuades kemudian dididihkan. Setelah dingin filtrat ditambahkan 5 mL FeCl3 1 % (b/v). Apabila terjadi perubahan warna menjadi biru tua, berarti sampel mengandung tanin. f. Uji Fenolik hidrokuinon (pereaksi FeCl3) Sebanyak 1 gram sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Ekstrak sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Pengukuran Total Fenolik dalam Ekstrak Buah Harendong Konsentrasi fenolik yang terkandung dalam ekstrak buah harendong diukur menggunakan metode spektrofotometri (Singleton 1999). Ekstrak dengan konsentrasi 1 mg/ml atau setara dengan 10 mg dalam 10 ml metanol digunakan dalam analisis. Sebanyak 0.5 ekstrak yang telah dilarutkan dengan metanol diambil, ditambah dengan 2.5 ml reagen Folin Ciocalteu 10% yang dilarutkan dalam air, dan ditambah dengan 2.5 ml NaHCO3 7.5%. Blanko yang digunakan berupa campuran 0.5 ml metanol, 2.5 ml reagen Folin Ciocalteu yang dilarutkan dalam air, dan 2.5 ml NaHCO3 7.5%. Sampel-sampel tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 450C selama 45 menit. Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali dan pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 765 nm. Prosedur yang sama dilakukan untuk membuat kurva standar asam galat. Berdasarkan pengukuran absorbansi, total fenolik dapat dibaca dari kurva standar, lalu total fenolik ekstrak ditunjukan dalam asam galat ekuivalen (mg GAE/g ekstrak). Pengukuran Total Flavonoid Pengukuran total flavonoid dilakukan dengan metode Kim et al. (2003) yang dimodifikasi. Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 10 ml akuades, lalu sebanyak 5 ml larutan ekstrak diambil dan ditambah dengan 0.3 ml NaNO2 5%. Tahap selanjutnya, ditambahkan 0.3 ml AlCl3 10% yang dilarutkan dengan metanol dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Setelah inkubasi, tambahkan 2 ml NaOH 1 M dan volume dicukupkan hingga 10 ml dengan akuades. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 510 nm. Pengukuran dilakukan 3 kali ulangan dan penentuan total flavonoid dinyatakan dalam katekin ekuivalen (mg CE/g ekstrak). Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Harendong dengan Metode DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazil) Pengukuran aktivitas antioksidan ini merupakan metode Aqil et al. (2006) dengan menggunakan DPPH dengan konsentrasi 0.1 mM dalam metanol. Ekstrak buah harendong sebanyak 1 ml dengan konsentrasi berbeda, yaitu 12.5, 25, 50, 100, dan 200 ppm ditambah dengan 1 ml DPPH 0.1 mM. campuran larutan diinkubasi selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm. Kontrol positif menggunakan asam askorbat dengan konsentrasi yang lebih kecil dibandingkan sampel, yaitu 1.25, 2.5, 5, 10, dan 20 ppm dalam metanol. Daya hambat ditentukan sebagai % inhibisi yang dihitung dengan rumus sebagai berikut: % inhibisi= x 100%
6 Keterangan: A0= absorbansi kontrol negatif/absorbansi larutan DPPH tanpa sampel A =absorbansi sampel Uji Sitotoksisitas Uji sitotoksisitas dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) ini menggunakan metode Modifikasi Meyer et al. (1982). Sebanyak ± 1 ml air laut yang berisi Artemia salina Leach sebanyak 10 ekor dipipet, dimasukkan ke dalam wadah uji, dan ditambahkan larutan sampel yang akan diuji masing-masing sebanyak 5 ml, dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500 dan 1000 ppm yang dilarutkan dalam air laut. Kontrol negatif (blanko) disiapkan dengan perlakuan yang sama, tetapi tanpa mengandung ekstrak. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup dari tiap lubang wadah uji. Uji potensi hayati ini dilakukan secara duplo untuk setiap kombinasi. Analisis Data Nilai LC50 ditentukan melalui metode analisis probit dengan software SPSS 18 dengan selang kepercayaan 95%. Penentuan beda nyata dilakukan analisis dengan One-Way ANOVA, sedangkan korelasi data ditentukan secara bivarian dengan software SPSS 18.
HASIL Kadar Air Buah Harendong Penentuan kadar air meliputi pengukuran kadar air sampel segar dan kadar air simplisia. Buah mentah mengandung kadar air lebih rendah dibandingkan buah masak pada kondisi segar dan simplisia buah mentah juga memiliki kadar air yang lebih rendah dibandingkan dengan simplisia buah masak. Kadar air (%)
80 57.37
60 40
24.42
18.66±0.12
20
6.38±0.52
0 Kadar air sampel segar Buah mentah
kadar air simplisia
Buah masak
Gambar 3 Kadar air buah harendong Ekstrak Buah Harendong Ekstraksi sampel buah harendong menggunakan metode maserasi. Rendemen ekstrak dihitung dengan membagi bobot ekstrak dengan bobot sampel kering. Rendemen ekstrak buah harendong mentah paling tinggi adalah ekstrak air, sedangkan rendemen buah masak paling tinggi adalah ekstrak etanol 96% (Gambar 4).
7
Rendemen (%)
60
50.89±13.65
50
46.89±2.47
42.08±6.96
40 30 20 10
10.44±1.09
6.76±0.62
11.27±3.42
0 Etanol 96%
Etanol 70% Ekstrak Buah mentah Buah masak
Air
Gambar 4 Rendemen buah harendong Uji Fitokimia Uji fitokimia meliputi uji alkaloid, triterpenoid/sterol, flavonoid, saponin, tannin, dan fenolik. Hasil uji fitokimia ekstrak buah harendong mentah dan masak positif untuk uji alkaloid, triterpenoid, flavonoid, tanin, dan fenolik, sedangkan bereaksi negatif untuk uji saponin (Tabel 1). Tabel 1 Uji fitokimia ekstrak buah harendong Buah mentah Uji EtOH EtOH Air 70% 96% Dragendorf + + + Alkaloid Wagner + + + Meyer + + + Triterpenoid + ++ ++ Flavonoid + +++ +++ Saponin Tanin + +++ +++ Fenolik + + +
Air + + + + ++ +++ +
Buah masak EtOH 70% + + + +++ +++ +++ +
EtOH 96% + + + ++ +++ +++ +
EtOH70%: ekstrak etanol 70%, ETOH96%: ekstrak etanol 96%
Total Fenolik Hasil pengukuran total fenolik menunjukan bahwa ekstrak buah mentah mengandung lebih banyak fenolik dibandingkan dengan ekstrak buah masak. Ekstrak etanol 70% buah mentah merupakan ekstrak yang memiliki kandungan fenolik tertinggi dibandingkan ekstrak lain, yaitu sebesar 189.66 mg/g (Gambar 5).
Total fenolik GAE (mg/g)
8 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
189.56c±10.47 168.06c±4.04 123.03b±19.78 108.37b±9.70 47.38a±5.09 41.25a±1.30
Etanol 96%
Etanol 70% ekstrak
Buah mentah
Air
Buah masak
Gambar 5 Total fenolik ekstrak buah harendong Total Flavonoid
Total flavonoid CE (mg/g)
Hasil pengukuran total flavonoid pada ekstrak buah harendong mentah dan masak diperoleh bahwa buah harendong mentah mengandung total flavonoid lebih tinggi dibandingkan dengan buah harendong masak. Ekstrak yang memiliki total flavonoid tertinggi adalah ekstrak etanol 96% buah mentah (Gambar 6). 250 225.50e±12.63 192.33d±4.95
200 150
105.93c±7.18
100
62.89b±2.27 43.58a±3.03 32.55a±1.25
50 0 Etanol 96%
Etanol 70% ekstrak Buah mentah Buah masak
Air
Gambar 6 Total flavonoid ekstrak buah harendong Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Harendong Aktivitas antioksidan dinyatakan dalan konsentrasi yang dapat menghambat 50% radikal bebas. Gambar 5 menunjukan hubungan antara jenis ekstrak dan nilai IC50. Ekstrak dengan nilai IC50 terendah adalah adalah ekstrak etanol 70% buah mentah, yaitu 0.01a±0.009 ppm. ekstrak dengan nilai IC50 tertinggi adalah ekstrak air buah mentah, yaitu 83.20d±2.85 ppm.
9 Tabel 2 Aktivitas antioksidan ekstrak buah harendong berdasarkan nilai IC50 Ekstrak Etanol 96% buah mentah Etanol 70% buah mentah Air buah mentah Etanol 96% buah masak Etanol 70% buah masak Air buah masak Asam askorbat a,b,c,d
IC50 (ppm) 1.45a±0.17 0.01a±0.009 83.20d±2.85 19.65b±2.85 2.97a±1.39 56.62c±0.10 4.78a±0.10
Keterangan untuk menunjukkan berbeda atau tidak berbeda nyata antar data
Sitotoksisitas Ekstrak Buah Harendong Nilai konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% populasi didapat dengan menghubungkan log konsentrasi ekstrak dengan % kematian larva udang. Ekstrak dengan nilai LC50 terendah adalah ekstrak etanol 70% buah mentah, sedangkan ekstrak dengan nilai tertinggi adalah ekstrak air buah masak (Tabel 3). Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak buah harendong LC50.(ppm x 104) 0.2147a±0.1342 0.1761a±0.0116 2.2268ab±0.0409 4.9415ab±1.6118 0. 4238a±0.2038 6.9009b±4.3827
Ekstrak Etanol 96% buah mentah Etanol 70% buah mentah Air buah mentah Etanol 96% buah masak Etanol 70% buah masak Air buah masak a,b
Keterangan untuk menunjukkan berbeda atau tidak berbeda nyata antar data
PEMBAHASAN Tanaman harendong memiliki buah yang berwarna ungu kemerahan dan diduga memiliki senyawa bioaktif seperti flavonoid dan fenolik yang berperan dalam menangkal radikal bebas, sehingga berpotensi sebagai antioksidan. Buah harendong masak memiliki kadar air sampel segar dan kadar air simplisia yang lebih besar dibandingkan dengan buah mentah. Buah mentah mengandung sedikit air karena air yang ada pada tanaman sebagian besar tidak disimpan di buah mentah, namun digunakan untuk proses fotosintesis. Air, karbon dioksida, nitrat, dan sulfat berperan dalam proses fotosintesis untuk membentuk karbohidrat dan asam amino. Masa perkecambahan biasanya diinduksi oleh pengangkutan air yang menyebabkan bagian-bagian protein membentuk sebuah vakuola (Heldt 2006). Oleh karena, kemungkinan penyebab buah masak lebih banyak mengandung air berkaitan dengan pengangkutan air pada masa perkecambahan. Hasil ekstraksi buah harendong mentah berupa serbuk, sedangkan buah harendong masak berupa pasta. Rendemen hasil ekstraksi untuk buah harendong mentah lebih sedikit dibandingkan dengan rendemen buah masak. Hal ini disebabkan oleh simplisia buah masak mengandung kadar air yang lebih tinggi dibandingkan simplisia buah mentah. Jumlah ekstrak buah mentah tertinggi adalah ekstrak air, sedangkan pada ekstrak buah masak yang memiliki jumlah ekstrak
10 tertinggi adalah ekstrak etanol 96%. Hal ini mungkin dipengaruhi oleh kepolaran dari pelarut yang mempengaruhi banyaknya senyawa yang terlarut termasuk senyawa lain yang tidak diharapkan seperti gula pada ekstrak buah masak dan senyawa-senyawa lainnya pada ekstrak air. Berdasarkan fenomena yang terjadi ketika proses ekstraksi, simplisia buah mentah menyatu dengan pelarut air. Ini mungkin menjadi salah satu penyebab jumlah ekstrak air buah mentah lebih tinggi. Analisis senyawa kimia buah harendong menggunakan dua metode pengujian, yaitu penapisan fitokimia sebagai uji kualitatif dan pengukuran total fenolik dan flavonoid sebagai uji kuantitatif. Penapisan fitokimia adalah uji kualitatif untuk mengetahui kandungan kimia suatu sampel. Hasil uji fitokimia menunjukan bahwa kedua sampel baik sampel buah mentah maupun buah masak memiliki kandungan senyawa kimia yang sama, yaitu alkaloid, triterpenoid, flavonoid, tanin, dan fenolik, namun tidak mengandung saponin. Ekstrak air buah mentah memiliki rendemen yang paling tinggi tetapi untuk semua uji fitokimia hanya memiliki tanda positif 1 atau memiliki warna yang tidak pekat. Hal ini diprediksi karena pada proses ekstraksi, simplisia buah mentah menjadi satu dengan pelarut air, sehingga pemisahan beberapa senyawa tertentu yang diharapkan menjadi tidak efektif karena banyak kontaminan yang ikut terlarut. Ekstrak lain selain ekstrak air memiliki rendemen yang rendah namun kandungan triterpenoid, flavonoid, dan taninnya banyak, karena senyawa-senyawa yang diharapkan terlarut dengan efektif dan mungkin mengandung sedikit kontaminan. Analisis senyawa kimia dilanjutkan dengan analisis secara kuantitatif meliputi pengukuran total fenolik dan total flavonoid. Total fenolik dalam penelitian ini diduga sebagai asam fenolat atau biasa disebut dengan asam galat yang merupakan senyawa tanin. Senyawa tanin berperan dalam mengatur rasa buah. Buah mentah biasanya mengandung tanin lebih banyak dibandingkan buah masak, sehingga buah mentah cenderung memiliki rasa pahit. (Crozier et al. 2006). Hal ini dibuktikan dengan data hasil pengukuran total fenolik pada ekstrak buah harendong mentah lebih tinggi dibandingkan ekstrak buah harendong masak. Kandungan total flavonoid ekstrak buah mentah lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak buah masak. Senyawa flavonoid yang diduga lebih banyak terkandung dalam buah harendong mentah adalah antosianidin yang diproduksi untuk melindungi buah dari sinar matahari dan serangga, sedangkan pada buah masak lebih banyak mengandung antosianin (turunan antosianidin) yang mengandung lebih banyak gula dan diproduksi untuk menarik serangga penyerbuk (Crozier et al. 2006). Rendemen ekstrak buah mentah memang lebih kecil dibandingkan dengan ekstrak buah masak, namun memiliki total fenolik dan total flavonoid yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak buah masak. Hal ini membuktikan bahwa kandungan gula mempengaruhi kandungan total fenolik dan total flavonoid yang terdapat dalam buah masak. Kandungan total fenolik dan flavonoid yang tinggi pada ekstrak buah mentah tidak dipengaruhi oleh kadar air. Hal ini karena proses pemekatan ekstrak dengan rotary evaporator dilakukan pada suhu 50-70oC, sehingga dapat menguapkan pelarut termasuk air. Ekstrak yang memiliki total flavonoid tertinggi adalah ekstrak etanol 96% buah mentah, sedangkan ekstrak dengan total fenolik tertinggi adalah ekstrak
11 etanol 70% buah mentah. Hal ini diduga dipengaruhi oleh kepolaran pelarut yang dapat dikaitkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Stankovic et al. (2011) yang menyatakan bahwa kandungan fenolik tertinggi ada pada pelarut dengan kepolaran tinggi, sedangkan kandungan flavonoid tertinggi ada pada pelarut dengan kepolaran sedang. Etanol 70% adalah pelarut yang lebih polar dibandingkan dengan etanol 96%, sehingga senyawa fenolik akan cenderung untuk terlarut lebih banyak dalam etanol 70%, sedangkan senyawa flavonoid akan terlarut lebih banyak dalam etanol 96%. Total fenolik untuk ekstrak etanol 96% dengan etanol 70% baik buah mentah maupun buah masak menunjukan data yang tidak berbeda nyata, sedangkan untuk ekstrak air kedua buah berbeda nyata. Jika dibandingkan antar jenis buah, maka ekstrak etanol 96% dan ekstrak etanol 70% buah mentah berbeda nyata dengan kedua ekstrak pada buah masak, namun tidak berbeda nyata untuk ekstrak air. Berdasarkan data total fenolik, ekstrak terbaik adalah ekstrak buah harendong mentah dengan pelarut etanol 70%. Berdasarkan data total flavonoid, semua ekstrak menunjukan data yang berbeda nyata. Ekstrak etanol 96% buah mentah mengandung total flavonoid yang tertinggi dibandingkan dengan semua ekstrak, sedangkan ekstrak etanol 96% buah masak adalah ekstrak dengan total flavonoid tertinggi dibandingkan dengan buah masak dengan pelarut yang berbeda. Oleh karena itu, dapat dinyatakan bahwa total flavonoid lebih banyak terlarut dalam pelarut etanol 96% dan lebih banyak terkandung dalam buah mentah dibandingkan dengan buah masak. Total fenolik dan total flavonoid dalam penelitian ini dikaitkan dengan aktivitas antioksidan. Senyawa radikal yang digunakan adalah DPPH sebagai senyawa radikal yang paling stabil. Prinsip dari pengukuran ini adalah kemampuan sampel dalam penangkap DPPH yang ditandai dengan perubahan warna dari ungu menjadi cokelat sampai kuning. Hasil uji aktivitas antioksidan berupa nilai IC50 yaitu konsentrasi penghabatan 50% senyawa radikal. Berdasarkan data IC50 yang didapat, ekstrak buah harendong memiliki kemampuan yang tinggi dalam menangkap radikal bebas dengan konsentrasi ekstrak yang rendah. Nilai IC50 terendah dimiliki oleh ekstrak etanol 70% buah mentah, yaitu 0.01 ppm. Nilai IC50 ekstrak etanol 96% buah mentah sebesar 1.45 ppm. dan ekstrak etanol 70% buah masak sebesar 2.97 ppm yang tidak berbeda nyata dengan ekstrak etanol 70% buah mentah. Ekstrak lain memiliki nilai IC50 lebih besar dibandingkan ketiga ekstrak di atas, namun masih masuk ke dalam rentang nilai yang dianggap memiliki potensi sebagai antioksidan. Nilai kurang dari 200 ppm memiliki potensi sebagai antioksidan, sedangkan nilai IC50 antara 200-1000 ppm kurang aktif namun masih berpotensi sebagai zat antioksidan (Molyneux 2004). Berdasarkan nilai IC50 pada Tabel 4, aktivitas antioksidan asam askorbat lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak etanol 70% buah mentah. Berdasarkan analisis data secara bivarian dengan software SPSS 18, maka korelasi total fenolik dan aktivitas antioksidan dalam IC50 serta korelasi total flavonoid dan IC50 adalah berbanding terbalik. Hal ini karena koefisien korelasi total fenolik dan IC50 maupun total flavonoid dan IC50 bernilai negatif, yaitu berturut-turut -0.691 dan -0.863. Korelasi bersifat signifikan secara statistika dengan p-value berturut-turut sebesar 0.01 dan 0.00 karena berada di bawah 0.05.
12 Senyawa fenolik merupakan bagian dari buah yang penting karena dapat menunjukkan aktivitas antioksidan dengan menonaktifkan radikal bebas lipid atau mencegah dekomposisi hidroperoksida menjadi radikal bebas (Maisuthisakul et al. 2007). Senyawa ini termasuk senyawa antioksidan karena dapat menyumbangkan atom hidrogen atau elektron untuk radikal bebas (Bandoniene dan Murkovic 2002). Oleh karena itu, semakin tinggi total fenolik, maka semakin kecil nilai IC50 atau semakin besar aktivitas antioksidannya. Begitu pula dengan total flavonoid. Flavonoid memiliki banyak fungsi, salah satunya adalah sebagai antioksidan (Crozier et al. 2006). Oleh karena itu, korelasi flavonoid dan IC50 berbanding terbalik atau dengan kata lain kandungan flavonoid yang tinggi memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Kemampuan ekstrak buah harendong sebagai antioksidan telah terbukti mampu menangkal radikal bebas sebesar 50% dengan konsentrasi < 200 ppm. Hasil dari uji ini biasanya akan diarahkan pada aplikasi. Oleh karena itu dibutuhkan uji lain untuk menduga efek farmakologi ekstrak yang diperoleh yang dinyatakan dengan nilai LC50. Pengujian ini telah banyak dihubungkan dengan sel kanker pada manusia, tumor, dan leukemia sebagai pengujian awal aktivitas antikanker maupun antitumor. Larva udang Artemia salina Leach adalah organisme zoologi yang sederhana (berupa artropoda). Pemilihan larva udang sebagai objek percobaan ini karena larva udang tumbuh cepat, sederhana, dan tidak mahal. BSLT digunakan sebagai pengujian awal sitotoksisitas dari suatu ekstrak tanaman dan pengujian aktivitas pestisida dengan larva udang Artemia salina Leach. Sitotoksisitas dinyatakan dalam lethal concentration 50% (LC50). Berdasarkan analisis statistika, data LC50 untuk ekstrak atanol 96% buah mentah, ekstrak etanol 70% buah mentah, dan ekstrak etanol 70% buah masak berbeda nyata dengan ekstrak etanol 96% buah masak, ekstrak air buah mentah, dan ekstrak air buah masak. Namun, nilai LC50 semua ekstrak lebih dari 1000 ppm, sehingga dapat dinyatakan bahwa ekstrak buah harendong tidak bersifat toksik atau tidak aktif dalam membunuh sel kanker. Sampel dengan nilai LC50 < 200 ppm dalam bentuk ekstrak dan LC50 < 2 ppm dalam bentuk senyawa murni dapat dinyatakan sebagai sifat toksik dengan keaktifan tinggi (Anderson et al. 1988).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak buah harendong mentah maupun masak mengandung alkaloid, triterpenoid, tanin, fenolik, dan flavonoid. Senyawa fenolik lebih larut dalam etanol 70% dan lebih banyak terkandung dalam buah mentah, sedangkan flavonoid lebih larut dalam etanol 96% dan lebih banyak terkandung dalam buah mentah. Buah harendong memiliki sifat antioksidan yang kuat dengan nilai IC50 kurang dari 200 ppm pada semua ekstrak. Ekstrak buah harendong tidak memiliki sifat toksik terhadap Artemia salina Leach atau tidak aktif untuk uji antikanker dengan nilai LC50 lebih dari 1000 ppm.
13 Saran Buah harendong mengandung senyawa bioaktif yang beragam, namun perlu diteliti lebih lanjut fungsi senyawa-senyawa tersebut juga mekanisme antioksidasi buah harendong secara in vivo.
DAFTAR PUSTAKA Anderson JE, Chang CJ, McLaughlin JL. 1988. Bioactive component of Allamanda schottii. J Nat Prod. 51:307-308. [AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Official Methods of Analysis. Washington DC (US): Association of Official Analytical Chemist. Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z. 2006. Antioxidant and free radical scavenging properties of twelve traditionally used Indian medicinal plants. Turk J Biol. 30:177-183. Bandoniene D, Murkovic M, 2002. The detection of radical scavenging compounds in crude ekstract of Borage (Borago offivialis L.) by using en online HPLC-DPPH method. J Biochem Biophys Methods. 53:1-3. [BPOM RI] Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2004. Ekstrak Tumbuhan Indonesia Vol. 2. Jakarta (ID): BPOM. Chen HM, Koji M, Fumio Y, Kiyoshi N. 1996. Antioxidant activity of designed dalam teh. Majalah Kedokteran Indonesia. 52:361-364. Cook NC, Samman S. 1996. Flavonoids- chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary sources. Nutritional Biochemistry. 7:66-76. Crozier A, Clifford MN, Ashihara H. 2006. Plant Secondary Metabolites: Occurrence, Structure, and Role in the Human Diet. Lowa (US): Blackwell Publishing Ltd. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Bandung (ID): Penerbit ITB. Heldt HW. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Burlington (US): Elsevier Academic Press. Javanmardi J, Stushnoff C, Locke E, Vivanco JM. 2003. Antioxidant activity and total phenolic content of Iranian ocimum accessions. J Food Chem. 83:547550. Kim DO, Jeong SW, Lee CY. 2003. Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums. Food Chemistry. 81:321-326. Kumpulainen JT, Salonen JT. 1999. Natural antioxidants and anticarcinogens in nutrition, health and disease. The Royal Society of Chemistry. 1:178-187. List PH, Schmidt PC. 1989. Phytopharmauceutical Technology. Boston (US): CRC Press. Maisuthisakul P, Suttajit M, Pongsawatmanit R. 2007. Assessment of phenolic content and free radical-scavenging capacity of some Thai indigenous plants. Food Chemistry. 100:1409-1418. Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung (ID): ITB. Padmawinata K, penerjemah. Terjemahan dari: Phytochemical Method. Meloan CE. 1999. Chemical Separation. New York (US): J. Willey.
14 Meyer BN, Ferrigni NR, Putman JE, Jacobson LB, Nichol DE, Mc Laughin JL. 1982. Brine Shrimps: A convenient general bioassay for active plant constituent. Planta Medica. 45:31-34. Miyazaki H. 2000. Strenuous endurance training in humans reduces oxidative stress following exhausting exercise. European Journal of Applied Physiology. 84:1-6. Molyneux P. 2004. The use of the stable free radicals diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol. 26:211-219. Munawaroh E. 1995. Pemanfaatan tumbuhan sebagai tanaman obat tradisional di Singkawang, Sambas, Kalimantan Barat. Di dalam: Prosiding Seminar dan Likakarya Etnobotani II. Yogyakarta, 24-25 Jan 1995. Yogyakarta: Ikatan Pustakawan Indonesia. Hlm: 145-151. Park YS. 2008. Antioxidant and proteins in ethylene-treated kiwifruits. Food Chemistry. 107: 640-648. Pine SH. 1988. Kimia Organik 2, diterjemahkan oleh Roehyati Joedodibroto dan Sasanti. Bandung (ID): ITB. Purwanto Y, Walujo EB. 1992. Etnobotani suku Dani di lembah Baliem-Irian Jaya: suatu telaah tentang pengetahuan dan pemanfaatan sumber daya alam tumbuhan. Di dalam: Prosiding Seminar dan Lokakarya Nasional Etnobotani; Cisarua-Bogor, 19-20 Feb 1992. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. hlm 132-148. Sies H. 1985. Oxidative Stress. London (GB): Academic Press. Sies H. 1991. Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants. London (GB): Academic Press. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. 1999. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin Ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 299:152-178. Stankovic MS, Niciforovic N, Topuzovic M, Solujic S. Total phenolic content, flavonoid noncentrations and antioxidant activity, of the whole plant and plant parts extracts from Teuchium montanum L. var. Montanum, F. supinum (L.) Reichenb [catatan penelitian]. 2011. Biotechnol. dan Biotechnol. Eq. 25:22222227. Supari F. 1996. Radikal Bebas dan patofisiologi beberapa penyakit. Di dalam: Prosiding Seminar Senyawa Radikal dan Sistem Pangan: Reaksi Biomolekuler, Dampak terhadap Kesehatan dan Penangkalan Jakarta, Des 1996. Bogor: Kerjasama Pusat Studi Pangan dan Gizi dengan Kedutaan Besar Perancis. Uji T. 1995. Pemanfaatan tumbuhan obat antimalaria pada beberapa suku di Indonesia. Di dalam: Prosiding Seminar dan Lokakarya II; Yogyakarta, 24-25 Jan 1995. Yogyakarta: Ikatan Pustakawan Indonesia. hlm 89-95. Wardah, Setyowati FM. 1995. Penelitian tumbuhan dalam pengobatan tradisional suku Dayak di kecamatan Beduai, Kalimantan Barat. Di dalam: Prosiding Seminar dan Lokakarya Etnobotani II; Yogyakarta, 24-25 Jan 1995. Yogyakarta: Ikatan Pustakawan Indonesia. hlm 152-160. Zuhud EAM. 1995. Keanekaragaman tumbuhan obat di Cagar Alam Pananjung Pangandaran. Di dalam: Prosiding Seminar Etnobotani II; Yogyakarta, 24-25 Jan 1995. Yogyakarta: Ikatan Pustakawan Indonesia. hlm 39-51.
15
LAMPIRAN
16
17 Lampiran 1 Diagram alir penelitian Buah Harendong (Melastoma affine D. Don)
Preparasi sampel Pengujian kadar air flavonoid
Simplisia Ekstraksi
Pengukuran total fenolik
Uji Fitokimia
Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
Pengukuran total flavonoid
Uji Sitotoksisitas dengan BSLT
Lampiran 2 Kadar air buah harendong Kadar air sampel segar Bobot Bobot %kadar air awal akhir
Sampel Buah mentah
2000.5000
1511.9800
24.42
Rata-rata
Bobot awal 2.9925 3.0010 3.0007
24.42
Buah masak
2001.7200
1148.4100
57.37
Rata-rata
57.37
Contoh perhitungan: % kadar air =
(
(
= = 5.82%
3.3333 3.4196 3.3151
Kadar air simplisia Bobot % kadar air akhir 2.8182 5.82 2.7955 6.85 2.8066 6.47 6.38 2.7078 18.77 2.7856 18.54 2.6959 18.68 18.66
SD 0.52
0.12
) )
Lampiran 3 Rendemen buah harendong Sampel
Bobot simplisia
EtOH96% mth
30.0190 30.0010 30.0003
Bobot simplisia terkoreksi 28.1038 28.0869 28.0863
Bobot ekstrak
Rendemen ekstrak
Rendemen rata-rata
SD
3.0000 3.2000 2.6000
10.6747 11.3932 9.2572
10.44
1.09
18 Lampiran 3 lanjutan Bobot Bobot Rendemen Rendemen simplisia SD ekstrak ekstrak rata-rata terkoreksi 30.0141 28.0992 1.7000 6.0500 EtOH70% mth 30.0011 28.0870 2.0000 7.1207 6.76 0.62 30.0100 28.0954 2.0000 7.1186 30.0012 28.0871 2.3000 8.1888 Air mth 30.0373 28.1209 3.0000 10.6682 11.27 3.42 30.0004 28.0864 4.2000 14.9538 30.0110 24.4109 9.1000 37.2784 EtOH96% msk 30.0020 24.4036 12.4000 50.8122 50.89 13.65 30.0005 24.4024 15.7570 64.5715 30.0111 24.4110 12.0000 49.1582 EtOH70% msk 30.0011 24.4029 10.8000 44.2570 46.89 2.47 30.0000 24.4020 11.5303 47.2514 30.0010 24.4028 8.6047 35.2611 Air msk 30.0023 24.4039 10.2000 41.7966 42.08 6.96 30.0008 24.4026 12.0000 49.1751 EtOH96% mth: ekstrak etanol 96% buah mentah, EtOH70% mth: ekstrak etanol 70% buah mentah, Air mth: ekstrak air buah mentah, EtOH96% msk: ekstrak etanol 96% buah masak, EtOH70% msk: ekstrak etanol 70% buah masak, Air msk: ekstrak air buah masak. Bobot simplisia
Sampel
Contoh perhitungan: % Rendemen = = = 49.1751% Lampiran 4 Hasil uji fitokimia Ekstrak Uji
Air mth
Dragendorf
Alkaloid
Meyer
Wagner
Steroid/Triterpenoid
EtOH 70% mth
EtOH 96% mth
Air msk
EtOH 70% msk
EtOH 96% msk
19 Lampiran 4 lanjutan Ekstrak Uji
EtOH 70% mth
Air mth
EtOH 96% mth
Air msk
EtOH 70% msk
EtOH 96% msk
Saponin
Tanin
Fenolik
Air mth: ekstrak air buah mentah, EtOH70% mth: ekstrak etanol 70% buah mentah, EtOH96% mth: ekstrak etanol 96% buah mentah, Air msk: ekstrak air buah masak, EtOH70% msk: ekstrak etanol 70% buah masak, EtOH96% msk: ekstrak etanol 96% buah masak.
Lampiran 5 Kurva standar asam galat Konsentrasi (ppm) 30 40 50 60 70 80 100
A 0.231 0.328 0.41 0.545 0.63 0.738 0.876
Kurva standar 1
Absorban
0.8 0.6 R2=0,9924 y=-0,0472+(9,5078.
0.4 0.2 0 30
40
50
60
70
Konsentrasi (ppm)
80
100
)x
20 Lampiran 6 Kandungan total fenolik ekstrak buah harendong Ulangan 1 2 3 Rata-rata Bobot ekstrak (g) Faktor pengenceran Total Fenolik (mg/L) Total fenolik GAE (mg/g)
AB mth 0.477 0.396 0.499 0.457 0.0112 1 53.0301
Absorbansi sampel Buah mentah Buah masak E70 mth E96 mth AB mtg E70 mtg E96 mtg 0.648 0.564 0.455 0.381 0.382 0.578 0.538 0.457 0.536 0.339 0.633 0.562 0.429 0.427 0.415 0.620 0.555 0.447 0.448 0.379 0.0111 0.0113 0.0126 0.0127 0.0124 3 3 1 3 3 210.5219 190.0124 51.9784 156.2506 134.4791
47.35
189.66
160.15
41.25
Contoh perhitungan : 1. Total fenolik ekstrak Persamaan kurva standar asam galat : y=-0,0472+(9,5078. Absorbansi rata-rata= 0,0472+(9,5078. ) (total fenolik) 0.457 = -0,0472+(9,5078. ) (total fenolik) Total fenolik =
123.03
)x
= 53.0301 mg/L x faktor pengenceran = 53.0301 mg/L x 1 = 53.0301 mg/L 2. Total fenolik GAE Total fenolik GAE (C) = c (V/m) Keterangan: c = konsentrasi total fenolik dari kurva standar V = volume ekstrak m = berat ekstrak Diketahui:c = 53.0301 mg/L, V = 10 ml = 0.01 L, m = 0.0129 g Total fenolik GAE (C) = 53.0301 mg/L (0.01 L/0.0112 g) = 47.35 mg/g
Lampiran 7 Kurva standar katekin Konsentrasi (ppm) 10 20 30 40 50 60
Kurva standar
1 Absorbansi
A 0.164 0.308 0.459 0.582 0.670 0.841
0.8 0.6 0.4
R2=0,9942 y=0,0446+0,0131x
0.2 0 10
20
30 40 50 Konsentrasi (ppm)
60
108.45
21 Lampiran 8 Kandungan total flavonoid ekstrak buah harendong Absorbansi sampel Ulangan 1 2 3 Rata-rata Bobot ekstrak (g) Faktor pengenceran Total Fenolik (mg/L) Total fenolik CE (mg/g)
AB mth 0.762 0.674 0.693 0.710 0.0233
Buah mentah E70 mth 0.752 0.752 0.784 0.763 0.0114
E96 mth 0.763 0.837 0.838 o.813 0.0104
AB mtg 0.557 0.598 0.578 0.578 0.0250
Buah masak E70 mtg 0.268 0.271 0.256 0.265 0.0107
E96 mtg 0.460 0.486 0.520 0.489 0.0128
1
2
2
1
2
2
50.79
109.68
117.31
40.72
33.65
67.85
43.58
192.33
225.50
32.55
62.89
105.93
Contoh perhitungan : 1. Total flavonoid Persamaan kurva standar katekin : y=0,0446+0,0131x Absorbansi rata-rata= 0,0446+0,0131(total flavonoid) 0.710 = 0.0446+0.0131(total flavonoid) Total flavonoid = = 50.7939 mg/L x faktor pengenceran = 50.7939 mg/L x 1 = 50.7939 mg/L 2. Total flavonoid CE Total flavonoid CE (C) = c (V/m) Keterangan: c = konsentrasi total flavonoid dari kurva standar V = volume ekstrak m = berat ekstrak Diketahui: c = 50.7939 mg/L, V = 20 ml = 0.02 L, m = 0.0233 g Total flavonoid CE (C) = 50.7939 mg/L (0.02 L/0.0233 g) = 43.58 mg/g
Lampiran 9 Contoh perhitungan IC50 ekstrak buah harendong 1. % Inhibisi % inhibisi = x 100% = x 100% = 88.49% Keterangan: = absorbansi DPPH setelah diinkubasi 20 menit A = absorbansi sampel + DPPH setelah diinkubasi 20 menit 2. IC50 Y=0.24225+0.04245x (% inhibisi) = 0.24225+0.04245(IC50) ( ) IC50 = = = 1172.15 ppm
22 22
Lampiran 10 Pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap % inhibisi Ekstrak Etanol 96% Buah Mentah Ulangan 1
Ulangan 2
% inhibisi
% inhibisi
80 60 y = 9.0129ln(x) + 46.173 R² = 0.5248
40 20
120
120
100
100
80
80
60
% inhibisi
100
Ulangan 3
y = 9.3351ln(x) + 47.903 R² = 0.5509
40 20
0 100
200
y = 9.915ln(x) + 45.575 R² = 0.5541
40 20
0 0
60
0
300
0
Konsentrasi (ppm)
100
200
300
0
Konsentrasi (ppm)
100
200
300
Konsentrasi (ppm)
Ekstrak Etanol 70% Buah Mentah Ulangan 1
Ulangan 2
60
% inhibisi
% inhibisi
80 y = 4.6942ln(x) + 66.408 R² = 0.7988
40 20 0 0
100
200
Konsentrasi (ppm)
300
92 90 88 86 84 82 80
% inhibisi
100
Ulangan 3
y = 2.8678ln(x) + 75.718 R² = 0.7381
0
100
200
Konsentrasi (ppm)
300
92 90 88 86 84 82 80 78
y = 3.8713ln(x) + 69.875 R² = 0.7451 0
100
200
Konsentrasi (ppm)
300
23 Ekstrak Air Buah Mentah Ulangan 2
Ulangan 3
100
80
80
80
60
60
60
40
y = 22.063ln(x) - 52.471 R² = 0.828
20 0
40
% inhibisi
100
% inhibisi
% inhibisi
Ulangan 1
y = 29ln(x) - 75.356 R² = 0.8477
20
40
0
0 0
100
200
300
-20 0
Konsentrasi (ppm)
y = 20.359ln(x) - 36.557 R² = 0.9463
20
100 200 Konsentrasi (ppm)
0
300
100
200
300
Konsentrasi (ppm)
Ekstrak Etanol 96% Buah Masak Ulangan 2
Ulangan 3
120
120
100
100
100
80
80
80
60
y = 24.054ln(x) - 24.246 R² = 0.8156
40
60 20
0
0 0
100
200
Konsentrasi (ppm)
300
y = 19.528ln(x) - 4.682 R² = 0.8742
40
20
% inhibisi
120
% inhibisi
% inhibisi
Ulangan 1
60 y = 23.565ln(x) - 21.274 R² = 0.8803
40 20 0
0
100
200
Konsentrasi (ppm)
300
0
100
200
Konsentrasi (ppm)
300
24 Ekstrak Etanol 70% Buah Masak Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Ekstrak Air Buah Masak Ulangan 1
Ulangan 2
PLENO 1
Ulangan 3
25
Kontrol Positif (Asam Askorbat) Ulangan 1
Ulangan 2
% inhibisi
% inhibisi
80 60 40
y = 28.485ln(x) + 4.9576 R² = 0.9569
20
100
100
80
80
60
y = 30.071ln(x) + 2.8153 R² = 0.9672
40 20
0
% inhibisi
100
Ulangan 3
10
20
Konsentrasi (ppm)
30
40
y = 29.288ln(x) + 4.8982 R² = 0.9344
20
0 0
60
0 0
10
20
Konsentrasi (ppm)
30
0
10
20
Konsentrasi (ppm)
30
26
Lampiran 11 Contoh perhitungan LC50 ekstrak buah harendong Y=-21.4286+14.2857x % kematian=-21.4286+14.2857(log IC50) 50==-21.4286+14.2857(log IC50) Log LC50 Log LC50= 5.0000 LC50= = 105 LC50= = 3.1446. Lampiran 12 Analisis statistika dengan SPSS 18 1. Analisis total fenolik
2. Analisis total flavonoid
26
27 3. Analisis IC50
4. Korelasi IC50, total flavonoid, dan total fenolik
5.
Analisis LC50
28
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Metro, 18 Januari 1992 dari ayah Supandi dan Ibu Siti Ponisah. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Riwayat pendidikan penulis dimulai dari SDN 2 Cilangkahan, Provinsi Banten tahun 19972003, melanjutkan pendidikan ke SMPN 2 Panggarangan, Provinsi Banten tahun 2003-2006, dan menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 1 Malingping, Provinsi Banten tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Pada saat semester 7, penulis melakukan praktik lapang di Laboratorium Research and Development (RnD) PT. Saraswanti Indo Genetech dengan judul laporan “Homogenitas Kadar Pewarna Allura Red dengan Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC)”. Selama masa perkuliahan, penulis mengikuti organisasi kampus sebagai bendahara divisi dan sekretaris divisi Bioanalisis CREBs (Community of Reasearch and Education in Biochemistry) tahun 2011-2012 dan 2012-2013. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum pengantar penelitian biokimia tahun ajaran 2013. Penulis juga pernah mengikuti berbagai kepanitiaan seperti Lomba Karya Ilmiah Populer (LKIP) tahun 2010 dan 2011, Seminar Kesehatan dan Keselamatan Kerja tahun 2011, Seminar Akademik Dosen dan Mahasiswa tahun 2011-2012, Masa Pengenalan Departemen tahun 2011, Seminar Nasional Kesehatan tahun 2012, Biochemistry Champion League tahun 2011, Seminar dan Kajian Latin Kehalalan tahun 2012, dan Stadium General Kimia Analitik 20112012. Penulis dalam bidang karya tulis pernah mengikuti Pekan Ilmiah Mahasiswa Nasional (PIMNAS) tahun 2012.
