III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tongkol jagung hasil limbah pertanian. Bahan yang digunakan untuk sintesis nanoselulosa adalah natrium hidroksida (NaOH), asam asetat (CH3COOH), sodium hipoklorit, asam klorida (HCl) dan air destilata. Bahan yang digunakan untuk analisis proksimat dan analisis kimia lainnya adalah asam sulfat (H2SO4), asam borat (H2BO3), asam klorida (HCl), K2SO4, heksana, alkohol dan aseton. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, timbangan analitik, autoclave, kertas saring, pH meter, pompa vakum, Scanning Electron Microscope (SEM) type JSM-5000 Japan, ultraturrax, mikroskop cahaya, ChromatometerMinolta 300 dan alat-alat laboratorium lainnya (gelas piala, gelas ukur, erlenmeyer, pipet,labu lemak dan sebagainya).
B. Metode Penelitian 1. Persiapan Bahan Baku Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tongkol jagung. Pada tahap persiapan bahan, tongkol jagung dikeringkan terlebih dahulu dengan oven bersuhu 720C selama 48 jam. Setelah mengalami proses pengeringan, tongkol jagung tersebut digiling dan diayak dengan saringan 100 mesh. Tepung tongkol jagung inilah yang nantinya akan digunakan sebagai bahan baku untuk sintesis nanoselulosa dari tongkol jagung dengan perlakuan hidrolisis kimia dan homogenisasi.
2. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi proses sintesis nanoselulosa. Pada penelitian pendahuluan ini dilakukan dua kali trial and error.Pada trial and error I dilakukan uji coba proses sintesis nanoselulosa dengan metode kimia dan mekanik seperti pada Gambar 6, sedangkan pada trial and error II juga dilakukan uji coba sintesis nanoselulosa dengan metode hidrolisis kimia dan homogenisasi seperti pada Gambar 7. Proses yang membedakan antara trial and error I dan trial and error II adalah perlakuan steam explosion dan proses homogenisasi dengan menggunakan ultra-turrax. Pada trialand error I tidak dilakukan proses steam explosion dan proses homogenisasinya hanya 1 jam dengan menggunakan ultra-turrax kecepatan 11.000 rpm, sedangkan pada trial and error II dilakukan proses steam explosion dan proses homogenisasinya selama 3 jam dengan menggunakan ultra-turaax kecepatan 16.000 rpm.
11
Tepung tongkol jagung
Tambahkan 2% NaOH (perbandingan serat larutan 1:10)
Masukkan ke dalam autoclave selama 1 jam (T = 121oC, P=1,2 atm)
Cuci dengan air sampai tidak basa
Isolasi selulosa
Bleaching dengan campuran (NaOH 2,7 %+as.asetat 7,9%) kemudian NaOCl (1:3) (masing-masing selama 1 jam)
Cuci dengan air destilata
Tiriskan dengan pompa vakum
Tambahkan HCl 1 N
Masukkan ke dalam autoclave selama 2 jam (T = 1210C, P=1,2 atm)
Cuci sampai pH netral Sintesis nanoselulosa Larutkan dengan air destilata
Homogenisasi dengan ultra-turrax kecepatan 11.000 rpm selama 1 jam
Nanoselulosa
Gambar 6. Diagram alir metode trial-error I
12
Tepung tongkol jagung
Tambahkan 2% NaOH (perbandingan bahan dan larutan 1:10)
Masukkan ke dalam autoclave selama 1 jam (T = 121o C, P=1,2 atm) Cuci dengan air sampai tidak basa
Isolasi selulosa
Bleaching dengan campuran (NaOH 2,7 %+as.asetat 7,9%) kemudian NaOCl (1:3) (masing-masing selama 1 jam)
Cuci dengan air destilata
Tiriskan dengan pompa vakum
Tambahkan HCl 1 N
Masukkan ke dalamautoclave selama 15 menit, lepaskan tekanannya tiba-tiba (T = 1210C, P=1,2 atm), ulangi 8 kali Cuci sampai pH netral
Sintesis nanoselulosa
Larutkan dengan air destilata
Homogenisasi dengan ultra-turrax kecepatan 16.000 rpm selama 3 jam
Nanoselulosa
Gambar 7. Diagram alir metode trial-error II
13
3. Penelitian Utama a. Sintesis Nanoselulosa Metode yang digunakan untuk sintesis nanoselulosa adalah metode campuran perlakuan kimia dan mekanik (hidrolisis kimia dan homogenisasi). Metode ini merupakan modifikasi dari metode sebelumnya yang dilakukan pada proses trial and error I. Modifikasi yang dilakukan adalah menambah proses perendaman selama 1 jam dengan larutan penghidrolisis sebelum dimasukkan ke autoclave dan meningkatkan suhu proses bleaching (dari suhu ruang menjadi 60o C). Kedua hal tersebut dilakukan untuk mengoptimalkan proses hidrolisis hemiselulosa dan lignin dari bahan baku. Secara garis besar terdapat empat tahapan perlakuan dalam sintesis nanoselulosa. Tahap pertama adalah perlakuan basa dengan menggunakan NaOH disertai pemanasan. Tahapan tersebut bertujuan untuk menghidrolisis hemiselulosa dan depolimerisasi lignin pada tepung tongkol jagung menjadi komponen gula dan fenolik yang larut air (Cherian et al. 2010). Pada penelitian ini digunakan 3 taraf konsentrasi NaOH, yaitu NaOH 2%, NaOH 4% dan NaOH 8%. Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui konsentrasi larutan NaOH yang terbaik untuk mengisolasi selulosa tanpa mendegradasinya. Tahap kedua adalah perlakuan bleachingdengan menggunakan campuran NaOH 2,7% dan asam asetat 7,9% kemudian dilanjutkan dengan NaOCl (1:3). Tahapan tersebut bertujuan untuk menghilangkan lignin yang masih tersisa. Lignin perlu dihilangkan dalam proses sintesis nanoselulosa karena lignin jika teroksidasi struktur aromatiknya akan menghasilkan senyawa kuinon berwarna coklat yang tidak diinginkan (Hattaka 2001). Selain itu, lignin juga perlu dihilangkan agar selulosa pada bahan baku lebih mudah diisolasi karena menghilangkan lignin yang menyelubungi selulosa. Tahap ketiga adalah perlakuan asam dengan menggunakan HCl 1 N disertai pemanasan. Tahapan tersebut bertujuan untuk membantu menguraikan fibril-fibril selulosa yang masih saling berikatan dalam bentuk mikrofibril selulosa. Sampel yang telah mengalami 3 tahapan tersebut akan diuji kadar selulosa dan lignin Tahap keempat adalah homogenisasi, tahapan ini bertujuan untuk mereduksi ukuran lebih lanjut karena dengan adanya gaya gesek dan tekanan diharapkan mampu memutuskan ikatan hidrogen intramolekular antar fibril selulosa. Pada penelitian ini proses homogenisasi dilakukan dengan menggunakan alat ultraturrax pada kecepatan 11.000 rpm . Proses homogenisasi dilakukan dengan 3 taraf waktu homogenisasi, yaitu 2 jam, 3 jam dan 4 jam. Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui waktu homogenisasi yang paling optimal untuk mereduksi ukuran fibril selulosa. Metode yang digunakan pada penelitian ini merupakan metode yang telah diadaptasi dari penelitian yang telah dilakukan Cherian et al. (2010) . Sampel yang telah dilarutkan 4 tahapan diatas merupakan produk akhir dari penelitian ini. Produk akhir tersebut akan dikarakterisasi sifat fisik (pengukuran waarna dengan Chromatometer Minolta 300 dan dilihat suspensi yang terbentuk) dan mikrostrukturalnya (diamati strukturnya dengan mikroskop cahaya dan Scanning Electron Microscope type JSM-5000 Japan. Adapun
14
diagram alir metode sintesis nanoselulosa dari tepung tongkol jagung dapat dilihat di Gambar 8. Tepung tongkol jagung
Tambahkan NaOH (konsentrasi 2%,4%,8% dengan perbandingan bahan dan larutan 1:10)
Rendam selama 1 jam
Masukkan autoclave selama 1 jam (T = 121o, P=1,2 atm)
Isolasi selulosa
Cuci dengan air sampai tidak basa
Bleaching dengan campuran NaOH (2,7%) + asam asetat (7,9%) selama 1 jam (T=600 C)
Bleaching dengan larutan NaOCl (1:3) selama 1 jam (T=600 C )
Cuci dengan air destilata Tiriskan dengan pompa vakum Tambahkan HCl 1 N Masukkan autoclave selama 2 jam (T = 1210, P=1,2 atm) Cuci sampai pH netral
Sintesis nanoselulosa
Larutkan dengan air sampai konsentrasi 1% Homogenisasi dengan ultra-turraxkecepatan 11.000 rpm (selama 2, 3, dan 4 jam)
Nanoselulosa
Gambar 8. Diagram alir metode sintesis nanoselulosa dari tepung tongkol jagung
15
b. Analisis Kimia 1.
Analisis Kadar Air Metode Oven (SNI 01-2891-1992) Kadar air ditentukan secara langsung dengan menggunakan metode oven pada suhu 105oC. Sampel sejumlah 1-2 gram ditimbang dan dimasukkan dalam cawan yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Kemudian contoh dan cawan dikeringkan dalam oven bersuhu 105oC selama 3 jam, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar air sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : %
100
Keterangan : a = bobot sampel sebelum dikeringkan (g) b = kehilangan bobot setelah dikeringkan (g)
2.
Analisis Kadar Abu Metode Pengabuan Kering (SNI 01-2891-1992) Cawan porselin kosong dikeringkan dalam oven bersuhu 105oC selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sampel sebanyak 2-3 gram dimasukkan dalam cawan dan ditimbang. Cawan berisi sampel dibakar sampai asapnya habis, kemudian dimasukkan ke dalam tanur listrik dengan suhu 550o C sampai pengabuan sempurna. Cawan berisi sampel dikeluarkan dari tanur, kemudian didingankan dalam desikator dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : %
100
Keterangan : a = bobot sampel sebelum diabukan (g) b = bobot sampel + cawan sesudah diabukan (g) c = bobot cawan (g)
3.
Analisis Kadar Protein Metode Kjeldahl (SNI 01-2891-1992) Sampel sebanyak 0,51 gram dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 100ml, kemudian tambahkan 2 gram campuran Selenium dan 25 ml H2SO4 pekat. Labu kjeldahl yang telah berisi sampel dan pereaksi dipanaskan di atas pembakar listrik sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan ( sekitar 2 jam). Biarkan dingin, kemudian encerkan dan masukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Setelah itu, pipet 5 mL larutan dan masukkan ke dalam alat penyuling, lalu tambahkan 5 mL NaOH 30% dan beberapa tetes indikator PP. Lanjutkan dengan proses penyulingan selama kurang lebih 10 menit dan sebagai penampung gunakan 10 mL larutan asam borat 2% yang telah dicampur dengan indikator. Setelah itu, titrasi dengan larutan HCl 0,01 N. Kadar protein sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
16
1
2
0,0014
100
Keterangan: w = bobot sampel V1 = volume HCl 0,001 N yang digunakan untuk penitaran sampel V2 = volume HCl yang digunakan untuk penitaran blanko N = normalitas HCl fk = faktor konversi untuk protein dan makanan secara umum (6,25) fp = faktor pengenceran 4.
Analisis Kadar Lemak Metode Soxhlet (SNI 01-2891-1992) Labu lemak yang akan digunakan dikeringkan dalam oven kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 1-2 gram sampel dimasukkan ke dalam selongsong kertas saring yang dialasi dengan kapas. Sumbat selongsong kertas yang berisi sampel dikeringkan dalam oven pada suhu tidak lebih dari 80oC selama kurang lebih 1 jam, kemudian dimasukkan pada labu ekstraksi Soxhlet. Alat kondensor diletakkan di atasnya dan labu lemak diletakkan di bawahnya. Pelarut heksana dimasukkan dalam labu lemak secukupnya, selanjutnya dilakukan ekstraksi selama 6 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu berwarna jernih. Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi dan pelarut ditampung kembali. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven suhu 105oC hingga mencapai berat tetap, kemudian didinginkan dalam desikator dan timbang. Kadar lemak sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut; %
100
Keterangan: a = bobot sampel (g) b = bobot labu lemak + lemak hasil ekstraksi (g) c = bobot labu lemak kosong (g) 5.
Analisis Kadar Karbohidrat By Difference Kadar karbohidrat sampel dianalisis dengan menggunakan metode by difference. Kadar karbohidrat dihitung sebagai sisa dari kadar air, abu, protein dan lemak sampel. Kadar karbohidrat sampel dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Kadar Karbohidrat = 100-(kadar air + kadar abu +kadar protein +kadar lemak)
6.
Analisis Kadar Acid Detergent Fiber (ADF)(AOAC 973.18 1990) Prinsip dasar dari analisa ini mengukur bagian dinding sel tanaman yang tidak dapat larut dalam larutan detergen asam dengan komposit utama CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) pada pemanasan satu jam. Timbang sampel sebanyak 1 gram (a) masukan kedalam gelas piala 600 ml, tambahkan 100 ml larutan ADS. Ekstrak selama 60 menit dari mulai mendidih. Saring menggunakan cawan kaca masir yang telah ditimbang sebelumnya (b). Bilas
17
residu menggunakan air panas dan aceton. Keringkan pada oven 105° C selama ± 4 jam sampai beratnya stabil, angkat dan dinginkan dalam desikator. Setelah dingin, keluarkan cawan dari desikator dan timbang (c). Kadar ADF sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: % ADF =
x 100%
% Hemiselullosa = % NDF - % ADF
Keterangan : a = bobot sampel(g) b = bobot cawan kaca masir (g) c = bobot cawan+residu setelah dikeringkan (g) 7.
Analisis Kadar Selulosa(AOAC 973.18 1990) Analisa selulosa merupakan lanjutan dari analisa ADF. Sampel analisa ADF yang sudah ditimbang (c) ditambah larutan asam sulfat (H2SO4) 72% sampai terendam selama 3 jam. Setelah 3 jam, residu dibilas menggunakan air panas dan aceton. Keringkan pada oven 105° C selama ± 4 jam sampai beratnya stabil, angkat dan dinginkan dalam desikator. Setelah dingin, keluarkan cawan dari desikator dan timbang (d). Kadar selulosa sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: % Selulosa =
x 100%
Keterangan: a = bobot sampel (g) c = bobot cawan+sampel hasil analisis ADF (g) d = bobot cawan+residu akhir setelah dikeringkan (g) 8.
Analisis Kadar Lignin((AOAC 973.18 1990) Analisa lignin merupakan kelanjutan dari analisa ADF dan selulosa. Sampel yang sudah dikeringkan (d), selanjutnya dibakar dalam tanur dengan tempratur ± 600°C. Angkat dan dinginkan cawan dalam eksikator dan timbang (e). Besarnya kandungan lignin dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut : % Lignin =
x 100%
Keterangan : a = bobot sampel (g) c = bobot cawan+sampel hasil analisis ADF (g) e = bobot cawan+residu akhir setelah diabukan (g)
18
c.
Karakterisasi Produk Akhir Sintesis Nanoselulosa 1.
Karakterisasi Kimia Produk Akhir Karakterisasi kimia dilakukan pada sampel yang telah mengalami proses hidrolisis basa, bleaching dan hidrolisis asam namun belum dilarutkan dalam air dan mengalami proses homogenisasi. Karakterisasi kimia yang dilakukan mencakup analisis kadar Acid Detergent Fiber (ADF), selulosa, dan lignin dengan metode Van Soest (untuk metode lengkapnya dapat dilihat pada sub bab analisis kimia).
2. Karakterisasi Fisik Produk Akhir 2.1 Parameter Warna Karakteristik warna produk akhir akan diukur dengan Chromatometer Minolta 300. Chromatometer adalah suatu alat analisis warna secara trimulus untuk mengukur warna yang dipantulkan oleh suatu permukaan. Sistem notasi warna yang digunakan pada penelitian ini adalah sistem notasi warna Hunter (L a b). Ilustrasi sistem notasi warna Hunter (L a b). Notasi L pada sistem hunter menyatakan cahaya pantul yang menghasilkan warna akromatik putih, abu-abu dan hitam Notasi L* : 0 menyatakan warna hitam dan L* : 100 menyatakan warna putih. Notasi a pada sistem hunter menyatakan warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai +a* (positif) dari 0 sampai +80 untuk warna merah, dan nilai –a* (negatif) dari 0 sampai -80 untuk warna hijau. Notasi b pada sistem Hunter menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +b* (positif) dari 0 sampai +70 untuk warna kuning, dan nilai –b*(negatif) dari 0 sampai -70 untuk warna biru (Hunter Lab 2008). Sementara itu nilai oHue menunjukkan warna dari sampel. Nilai oHue diperoleh dari perhitungan arc tan (b/a). Warna sampel berdasarkan nilai oHueditunjukkan pada Tabel 4. Tabel 4. Warna sampel berdasarkan nilai oHue Warna Red purple Red yellow Yellow red Yellow Yellow green Green Blue green Blue Blue purple Purple
Nilai oHue 342 – 18 18 – 54 54 – 90 90 – 126 126 – 162 162 – 198 198 – 234 234 – 270 270 – 306 306 – 342
Sumber : Hutching 2009
19
2.2Parameter Pembentukan Suspensi Produk akhir yang telah mengalami keseluran proses kemudian akan diamati penampakan suspensinya secara kasat mata, apakah terdispersi sempurna atau terdapat fase lain yang mengendap. Penampakan suspensi produk akhir sintesis nanoselulosa merupakan sebuah sifat fisik yang cukup penting karena produk nanoselulosa dengan kualitas baik memiliki suspensi yang terdispersi sempurna.
3.
Karakterisasi Mikrostruktural
3.1 Karakterisasi Mikrostruktural dengan Mikroskop Cahaya Nanoselulosa yang dihasilkan diukur diameternya dengan menggunakan skala garis yang terdapat pada mikroskop cahaya. Skala pengukuran pada mikroskop terdapat 2 skala yaitu skala okuler dan skala objektif. Pada perbesaran 1000 kali, jarak antara dua garis terkecil memiliki nilai 0,1 μm dan pada perbesaran 400 kali, jarak antara dua garis terkecil memiliki nilai 0,25 μm. 3.2 Karakterisasi Mikrostruktural dengan Scanning Electron Microscope (SEM) Nanoselulosa yang dihasilkan diamati dengan SEM untuk dianalisis karakteristik mikrostrukturalnya dan untuk mengukur diameter nanoselulosa yang dihasilkan. Pada penelitian ini instrumen SEM yang digunakan adalah SEM tipe JSM-5000. 3.3 Preparasi Sampel Preparasi sampel perlu dilakukan agar sampel dapat diamati dengan baik. Sampel yang akan diamati merupakan sampel cair, dan untuk mengamatinya diperlukan preparasi khusus. Preparasi sampel yang digunakan untuk sampel produk akhir sintesis nanoselulosa yaitu, teteskan saru droplet suspensi nanoselulosa ke atas stub yang telah dilapisi dengan cover glass, kemudian keringkan dalam oven vakum bersuhu 75o C selama kurang lebih 15 menit (Zhou 2012) 3.4 Pelapisan Sampel Pelapisan (coating) sampel perlu dilakukan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Pelapisan sampel dapat menggunakan logam mulia seperti emas. Proses coating dilakukan oleh alat yang bernama ion coater. Proses coating in dilakukan dalam keadaan vakum selama 20 menit. 3.5 Pengamatan Sampel Produk yang telah dipreparasi dan dilapis emas kemudian diamati dengan SEM pada perbesaran 100 kali dan 10000 kali dengan voltase 20 kV. Adapun prinsip kerja SEM adalah sebuah pistol elektron memproduksi sinar elektron yang akan ditembakkan ke sampel dengan bantuan lensa magnetik untuk memfokuskan elektron menuju sampel dan ketika elektron mengenai sampel,
20
maka sampel akan mengeluarkan elektron baru yang akan diterima oleh detektor dan dikirim ke monitor (CRT). Diamater gambar pada sampel diukur dengan menggunakan software image type J version 3.7 d. Analisis Statistik Rancangan percobaan yang digunakan untuk analisis data formula sintesis nanoselulosa adalah rancangan acak lengkap dan dua kali ulangan. Faktor-faktor yang mempengaruhi kadar selulosa dan ukuran nanoselulosa adalah konsentrasi bahan penghidrolisis (NaOH) pada 3 taraf konsentrasi (2%, 4%, dan 8%) dan waktu homogenisasi dengan ultraturrax pada 3 taraf waktu (2 jam, 3 jam, dan 4 jam) . Analisis statistik ini akan dilakukan pada data pengukuran warna, kadar selulosa, dan lignin produk akhir. Uji yang dilakukan adalah uji F dan uji lanjut Duncan (jika faktor yang diuji berpengaruh). Adapun software yang digunakan untuk analisis statistik ini adalah The SAS System for Windows 9.0.
21
