III. METODOLOGI PENELITIAN
A.
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di laboratorium Teknik Pengolahan Pangan dan Hasil Pertanian Departemen Teknik Mesin dan Biosistem, Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian. Waktu penelitian dilaksanakan mulai Maret 2011 sampai April 2011.
B.
Bahan dan Alat Penelitian 1.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah biji sorgum varietas lokal yang diperoleh dari Yogyakarta. Sampel biji sorgum yang digunakan dalam pendugaan kadar air, protein dan karbohidrat dengan metode NIR dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Sampel biji sorgum yang akan digunakan dalam pendugaan kadar air, protein dan karbohidrat dengan NIRFlex Petri Solids N-500 Bahan kimia yang digunakan untuk menganalisis kadar karbohidrat, protein dan kadar air dengan analisis kimiawi antara lain aquades, asam perklorat, HCl 0.02 N, 1.9 mg K2SO4, 40 mg HgO, 2 ml H2SO4, H3BO3, NaOH-Na2S203. 2.
Alat Penelitian
a.
Instrumen NIRFLex Tipe N-500 merk Buchi
NIRFlex Tipe N-500 memiliki berbagai macam sistem atau bentuk, yaitu NIRFlex Solids dengan cawan petri dan XL Add-on, NIRFlex Fiber Optic Solids, dan NIRFlex Liquids. Pada penelitian ini digunakan NIRFlex Solids dengan cawan petri yang dapat dilihat pada Gambar 3 dan prinsip fungsional dari instrumen yang digunakan untuk penelitan ini dapat dlihat pada gambar 4.
10
Gambar 3. NIRFlex N-500 Petri Solids
9
8
7
10
5
11
6
4
3 α 2
14
12
1 15 16 13
17
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Detektor Sensor magnet LED Tombol start Tombol stop Referensi Internal Koding magnetik Sampel Cawan Petri
10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.
Penyangga Cawan Petri Piringan berputar Motor Optik 1 Penghalang Sinar Cermin 1 Cermin 2 Optik 2
Gambar 4. Prinsip fungsional dari alat NIRFlex Solids
b. Komputer Komputer (PC) digunakan mengolah data dan mengukur pendugaan komposisi kimia sorgum menggunakan NIRFlex N-500 petri solids sehingga diperoleh data reflektan dan absorban baik dalam bentuk tabel maupun grafik. Software bawaan yang akan digunakan untuk penelitian ini adalah NIRWare Operator, NIRWare Management Console, dan NIRCal 5. c.
Peralatan Lainnya
Peralatan lain yang digunakan selama penelitian antara lain oven untuk pengukuran kadar air dengan cara pengeringan. Selain itu digunakan pula timbangan digital, cawan, gelas Erlenmeyer, dan desikator.
C.
Metode Penelitian
Diagram alir pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada Gambar 7. Metode yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut: 1.
Persiapan Sampel Penelitian
Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah biji sorgum varietas lokal yang diperoleh dari Yogyakarta. Sampel yang akan diukur dimasukkan ke dalam cawan petri. Masingmasing sampel memiliki berat 100 gram. Gambar 5 menunjukkan sampel yang telah dimasukkan ke dalam cawan petri.
Gambar 5. Sampel yang akan diukur menggunakan NIR 2.
Persiapan Instrumen NIR
Sebelum dilakukan pengukuran instrument NIRFlex N-500 Petri Solids dinyalakan dan dibiarkan terlebih dahulu beberapa saat. Kemudian sebelum dilakukan pengukuran ke sampel biji nyamplung, terlebih dahulu dilakukan proses kalibrasi dengan software bawaan yang akan digunakan untuk proses kalibrasi adalah NIRWare Operator (Anonimousb,2008). 3.
Pengukuran Pantulan Spektrum NIR
Pendugaan sampel biji sorgum dengan cara pengukuran dengan instrument NIRFlex N-500 Petri Solids dan software bawaan yaitu NIRWare Operator, lama pengukuran setiap sampel adalah 8-9 detik. Jumlah sampel yang akan diukur sebanyak 70 sampel, dimana setiap sampel dilakukan 3 pengulangan dengan 3 titik pengukuran yang berbeda. Selanjutnya biji sorgum akan disinari inframerah dekat (NIR) dengan panjang gelombang 1000-2500 nm dan daerah yang disinari akan memberikan pantulan atau gambaran berupa spektrum. Hasil pantulan spektrum akan ditangkap oleh lensa optik yang kemudian direkam oleh detektor. Informasi yang diperoleh merupakan hasil interaksi gelombang elektronika dengan komponen penyusun bahan komposisi kimia tersebut. Spektrum yang terukur dari detektor akan diteruskan ke komputer untuk disimpan secara langsung. Data yang disimpan sudah dalam bentuk digital sehingga lebih mudah untuk diolah lebih
lanjut dengan software bawaan NIR. Setelah dilakukan pengambilan pantulan spektrum NIR biji sorgum, dilakukan analisis kimiawi biji sorgum dengan metode konvensional. Proses pengukuran dengan NIRFLex petri solids ditunjukkan pada Gambar 6. Spektrum dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:
Dimana: V contoh = Tegangan pantulan contoh/sampel (Volt) V standar = Tegangan pantulan standar putih (Volt)
Gambar 6. Proses pengukuran kadar air, protein dan karbohidrat biji sorgum dengan NIRFlex petri solids. 4.
Penentuan Absorban Spektrum NIR
Data absorban diperoleh dengan cara mentransformasikan nilai reflektan kedalam bentuk log (1/R). nilai absorban dari NIRFlex N-500 petri solids diperoleh dari hasil penyerapan (absorban) oleh objek dengan persamaan:
Dimana: A = nilai absorban S = intensitas panjang gelombang pada sampel D = intensitas panjang gelombang pada dark R = intensitas panjang gelombang pada reference 5.
Penentuan Kadar Air, Protein dan Karbohidrat Secara Destruktif a.
Penentuan Kadar Air (Metode Thermogravitimetri)
Penentuan kadar air dilakukan dengan metode thermogravitimetri atau pengeringan. Cawan aluminium kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven pada suhu 1300 C selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Cawan ditimbang menggunakan neraca analitik (A). Sampel sebanyak 2 gram (W) yang sudah dihomogenisasi dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian cawan beserta sampel ditimbang dengan neraca analitik, tutup cawan diangkat, dan cawan beserta isi dan tutupnya ditempatkan dalam oven pada suhu 1300C selama 1 jam. Kemudian cawan berisi sampel didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang (Y). setelah itu, cawan berisi sampel dikeringkan kembali dalam ven selama 15-30 menit, lalu ditimbang kembali. Pengeringan diulangi hingga diperoleh bobot konstan (selisih bobot ≤0.005 gram). Penentuan kadar air dilakukan sebanyak 2 kali. Hasil penentuan tersebut kemudian diratakan. Kadar air diukur dengan cara sebagai berikut:
Dimana: W = Bobot sampel awal (g) X = Bobot sampel dan cawan setelah dikeringkan (g) A = Bobot cawan kosong (g) b. Penentuan Kadar Protein Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Kjeldahl. Metode Kjeldahl merupakan metode yang paling mudah digunakan untuk mengukur kandungan protein bahan yaitu dengan mengukur besarnya kandungan nitrogen dalam bahan. Metode ini juga lebih baik digunakan untuk mengukur bahan-bahan dengan kandungan protein lebih besar dari 10% (Winarno 1980). Sampel ditimbang seberat 5-10 mg, kemudian dimasukkan ke dalam labu kjehdahl 30 ml. Ditambahkan 1.9 mg K2SO4, 40 mg HgO, 2 ml H2SO4, dan beberapa butir batu didih. Kemudian dididihkan 1-1.5 jam sampai cairan menjadi jernih. Kemudian didinginkan dan ditambah sedikit air secara perlahan. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi Erlenmeyer 125 ml berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 4 tetes indikator (campuran 2 bagian metal merah 0.2 % dalam alkohol) diletakkan di bawah kondensor. Tambahkan 8-10 ml larutan NaOH-Na2S2O3 dan didestilasi sampai tertampung 15 ml destilat dalam Erlenmeyer. Tabung kondensor dibilas dengan air dan air bilasan dimasukkan Erlenmeyer yang sama. Isi Erlenmeyer diencerkan sampai kira-kira 50 ml, kemudian dititrasi dengan HCL 0.02 N sampai terbentuk warna abu-abu. Kadar protein dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
c.
Penentuan Kadar Karbohidrat by difference
Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan secara by different yaitu dengan cara mengurangkan 100% dengan komponen gizi lainnya (kadar air, abu, lemak, dan protein) dalam basis basah. Rumus yang digunakan adalah: Kadar karbohidrat (basis basah) = 100% - (A+B+C+D)
6.
Analisis Data Penelitian
Data-data yang diperole akan dianalisis dengan menggunakan bantuan perangkat lunak (software) komputer, seperti : Microsoft excel 2007 dan software bawaan dari NIRflex N-500 merk BUCHI yaitu NIRWare Management Console dan NIRCal 5. Microsoft Excel 2007 digunakan untuk pembuatan kurva reflektan (R) dan absorban (log(1/R)) NIR. Penggunaan NIRWare Management Console untuk memasukkan data hasil analisis kimiawi laboratorium (data referensi). Sedangkan NIRCal 5 digunakan untuk membuat bentuk dan model kalibrasi antara data reflektan dan absorban NIR terhadap hasil analisis kimiawi laboratorium dengan metode kalibrasi multivariatif yaitu principal component regression (PCR) dan partial least square (PLS). Keluaran hasil analisis data penelitian dari metode kalibrasi multivariatif tersebut dengan menggunakan software NIRCal 5 adalah data dugaan, grafik, dan persamaan regresi kalibrasi antara data reflektan atau absorban NIR dengan nilai hasil analisis kimiawi laboratorium yang memiliki koefisien korelasi (R) dan koefisien determinasi (R2) yang tinggi serta standar deviasi dan bias yang rendah. Analisis data penelitian meliputi data reflektan (R) dan absorban (log(1/R)). Dari seluruh jumlah sampel (70 sampel sorgum) yang diukur akan dibagi dua tahap yaitu tahap kalibrasi dan validasi. Jumlah sampel untuk tahap kalibrasi harus lebih banyak daripada tahap validasi diman jumlah sampel untuk tahap kalibrasi sebanyak 45 sampel (2/3 total sampel) sedangkan jumlah sampel
untuk validasi sebanyak 25 sampel (1/3 total sampel). Selain itu, range data yang digunakan untuk tahap kalibrasi harus lebih besar daripada tahap validasi. a.
Kalibrasi 1.
Metode partial least square (PLS)
Tahap kalibrasi ini dilakukan untuk menentukan hubungan antara komposisi kimia sorgum dengan data reflektan maupun absorban NIR. Untuk pendugaan komposisi kimia sorgum dapat dilakukan dengan metode kalibrasi multivariatif yaitu partial least square (PLS). Metode kalibrasi ini memiliki struktur sistematik linier dan non-linier (Herve, 2003 dalam Saragih, 2007). Metode PLS digunakan memperoleh pendugaan bagi Y sebagai fungsi peubah-peubah Xn yang terpilih. Persamaan regresi kalibrasi antara peubah Y dengan a dan b sebagai konstanta kuadrat terkecil parsial X terpilih (Naes, 1985 dalam Rumahorbo), dinyatakan sebagai berikut: Y = a + b1X1 + b2X2 + … + bnXn Dimana: Y = Kadar air/karbohidrat/protein sorgum A dan b = Konstanta kuadrat terkecil parsial X = Fungsi peubah kuadrat terkecil parsial pada kisaran panjang gelombang antara 1000-2500 nm. 2.
Metode principal component regression (PCR)
PCR merupakan metode kalibrasi multivariatif untuk menganalisis statistika peubah ganda yang dapat digunakan untuk keperluan mereduksi sejumlah peubah asal menjadi beberapa peubah baru yang bersifat orthogonal dan tidak mengurangi serta tetap mempertahankan total keragaman yang jumlahnya lebih besar dari peubah asalnya (Matjik et al., 2006). Hasil analisis berupa akar cirri, vector cirri, proporsi dan proporso kumulatif total keragaman yang diterangkan oleh masing-masing komponen serta skor komponen. Persamaan regresi kalibrasi dapat dibangun dengan menggunakan metode principal component regression (Matjik et al., 2006), dinyatakan sebagai berikut: Y = a +b1P1 + b2P2 + b3P3 + … + bnPn Dimana: Y = Kadar air/karbohidrat/protein sorgum A dan b = Konstanta komponen utama P = komponen utama pada kisaran panjang gelombang antara 1000-2500 nm.
b. Validasi Setelah didapatkan model persamaan regresi kalibrasi, dilakukan tahap validasi dengan menggunakan sisa data yang lain. Data sampel yang berbeda tersebut dimasukkan ke dalam persamaan regresi kalibrasi, sehingga diperoleh data kadar air, protein, dan karbohidrat sorgum dugaan NIR. Validasi bertujuan menguji ketepatan pendugaan komposisi kimia dengan persamaan regresi kalibrasi yang telah dibangun. Parameter untuk menentukan kecocokan model kalibrasi adalah koefisien determinasi (R 2), standard error (SE), coefficient of variation (CV). Koefisien determinasi atau R 2 menunjukkan kemampuan model menerangkan keragaman nilai peubah tak bebas. Semakin besar nilai R 2 berarti model semakin mampu menerangkan perilaku peubah tak bebas. Kisaran nilai R2 mulai dari 0% sampai 100 % (Matjik et al., 2006)
R2 = (R)2 Data komposisi kimia dugaan NIR akan divalidasi dengan data hasil pengujian secara kimiawi di laboratorium kimia dan dibuat hubungan antara keduanya, setelah itu akan dihitung standar error. Standar error merupakan selisih antara nilai hasil dugaan dengan nilai sebenarnya. SE yang semakin kecil menunjukkan model yang semakin baik. Nilai kecil yang baik adalah nilai yang semakin mendekati nol sehingga dipastikan model dapat memprediksi dengan baik kadar dugaan. Standar error diperoleh dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:
Dimana: SE = Standar error validasi YNIR = Kadar air, protein, karbohidrat dugaan NIR Y = Kadar air, protein, karbohidrat dengan uji kimia n = Jumlah sampel Setelah dihitung standar error (SE), dihitung pula koefisien keragaman (Coefficent of Variability). Walpole (1995) menyatakan bahwa dengan simpangan baku (standar deviasi) saja tidak dapat mengatakan banyak mengenai keragaman satu kumpulan data. Ukuran lain yang mungkin lebih layak adalah koefisien keragaman (CV). CV menunjukkan besarnya error sebanding dengan rata-rata hasil analisis kimiawi laboratorium (data referensi). CV dapat digunakan untuk membandingkan dua keragaman kelompok data yang selang nilainya jauh berbeda satu sama lain bahkan dapat digunakan untuk membandingkan keragaman dua atau lebih kelompok data meskipun satuan pengukurannya tidak sama. Menurut Matjik et al. (2006) besaran ideal nilai CV sangat tergantung pada bidang studi yang digeluti, misalnya untuk bidang pertanian nilai CV yang dianggap wajar adalah 20-25 %, namun percobaan dilakukan di laboratorium nilai CV diharapkan jauh lebih kecil mengingat sebagian kondisi lingkungan dalam keadaan terkontrol. Fontaine et al. (2002) mendefinisikan CV sebagai relatif standar deviasi (RSD) untuk membandingkan keragaman crude protein dengan asam amino hasil kalibrasi NIRS. SE dan CV terkecil menunjukkan hasil yang paling baik. Coefficient of variability dirumuskan dengan:
Dimana: CV = Koefisien keragaman SE = Standar error validasi = Rataan kadar air, protein, karbohidrat aktual sampel penelitian
c.
Data Treatment
Pada penelitian ini perlakuan data yang diberikan adalah normalisasi, penghalusan rataan setip 3 titik, derivatif kedua Savitzky-Golay setiap 9 titik, kombinasi antara rataan setip 3 titik, derivatif kedua Savitzky-Golay setiap 9 titik, dan kombinasi antara ketiga perlakuan data. Normalisasi dilakukan untuk meminimalkan atau menghilangkan pengaruh tegangan terhadap hasil yang diberikan dan mengurangi pengaruh perbedaan ukuran sampel yang diuji. Smoothing berfungsi untuk memilih penghalusan fungsi dengan teliti tanpa menghilangkan informasi spektrum yang ada dan mengurangi guncangan dan memperkecil galat yang terjadi selama pengukuran NIR dan analisis kimiawi laboratorium. Derivatif kedua Savitzky-Golay berfungsi untuk mereduksi efek basis dari adanya pertambahan dari proses absorban serta menghilangkan masalah basis kemiringan persamaan regresi (Tiaprasit dan Sangpithukwong dalam Purba, 2010).
Mulai
Biji Sorgum sebanyak 70 sampel
Pengukuran spektrum biji sorgum dengan NIRFlex Solids Spectrometer N-500 dengan NIRWare
Analisis kimiawi kadar air, karbohidrat dan protein biji sorgum secara destruktif
Metode kalibrasi dan seleksi spektrum kalibrasi/validasi 1. Kalibrasi (2/3 total sampel) 2. Validasi (1/3 total sampel)
Data pantulan (Reflektan,R) Data absorban (Log 1/R)
Data analisis kimia bii sorgum dalam software yaitu NIRWare Management Console Proses kalibrasi dan validasi menggunakan software NIRCal 5
Data Treatment
Perancangan model kalibrasi dengan metode multivariatif, yaitu: 1. Principal Component Regression (PCR) 2. Partial Least Square (PLS)
Penentuan persamaan regresi kalibrasi R2, koefisien keragaman (CV), dan standar error kalibrasi (SEC)
Penentuan validasi
R2, koefisien keragaman (CV), dan standar error validasi (SEP)
Selesai Gambar 7. Diagram alir pelaksanaan penelitian pendugaan kadar air, karbohidrat, dan protein biji sorgum.
