11
III. BAHAN DAN METODE
3.1 Ikan Uji Larva ikan gurame diperoleh dari pembenihan di Desa Ciherang Kec. Darmaga, Kab. Bogor. Larva dipelihara dalam akuarium berukuran 1,0x0,5x0,5 m3 dengan kepadatan sekitar 20 ekor/liter. Setelah ikan mencapai ukuran 0,75 1,00 cm dilakukan pengurangan kepadatan menjadi 2-3 ekor/liter. Pakan awal yang diberikan berupa naupli Artemia sp. selama 10 hari, dilanjutkan dengan cacing sutera hingga ikan mencapai ukuran 4 - 5 cm dengan bobot 2,5 – 3,0 gram. Adaptasi
terhadap
pakan
buatan
dilakukan
sebelum
pemberian
pakan
mengandung rElGH. 3.2 Produksi rGH Produksi rElGH dilakukan menggunakan bakteri Escherichia coli BL21 yang mengandung konstruksi pCold-1/rElGH (Alimuddin et al. 2010). Klon bakteri E. coli dikultur dalam 4 mL media 2xYT cair yang mengandung ampisilin, dan diinkubasi menggunakan shaker pada suhu 37°C selama 16-18 jam. Setelah itu, dilakukan subkultur dengan mengambil sebanyak 1 mL dari kultur awal, dan dimasukkan ke dalam 100 mL media 2xYT cair baru, dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam. Kemudian kultur diberi kejutan suhu 15°C selama 30 menit, ditambahkan IPTG 1 mM sebanyak 1 mL, dan diinkubasi menggunakan shaker pada suhu 15°C selama 24 jam. Bakteri hasil kultur dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2-10 menit. Lisis dinding sel bakteri dilakukan secara kimiawi menggunakan lisozim. Pelet bakteri hasil sentrifugasi dicuci menggunakan 1 mL bufer tris-EDTA (TE) per 200 mg bakteri, diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit, dan selanjutnya disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Supernatan dalam tabung microtube dibuang, diganti dengan larutan lisozim (10 mg dalam 1 mL buffer TE) sebanyak 500 µL, diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang, dan pelet yang terbentuk merupakan protein rHP dalam bentuk badan inklusi (inclusion body). Pelet rGH dicuci dengan bufer fosfat salin (PBS) sebanyak 1 kali, dan rGH disimpan pada
12
suhu -80°C hingga akan digunakan. Keberadaan rGH dalam badan inklusi dianalisis menggunakan metode SDS-PAGE (Blackshear (1984) dalam Bollag et al. (1996)). 3.3 Pembuatan Pakan Mengandung rGH Pembuatan
pakan
mengandung
rGH
dilakukan
dengan
cara
mencampurkan rElGH yang sudah dilakukan penyalutan (coating) ke dalam pakan komersial (protein sekitar 30%). Penyalutan pakan dilakukan berdasarkan metode Promdonkoy et al. (2004) menggunakan HP55 (Shin-Etsu, Japan) sehingga terbentuk matriks rElGH-HP55. Pelet rElGH dilarutkan dalam amonium asetat yang mengandung HP55 dalam etanol 72,8%. Setelah penyalutan, rElGHHP55 dikering-bekukan menggunakan freeze drier. Selanjutnya matriks rElGHHP55 diresuspensi dalam asam asetat
yang mengandung 10 mM NaCl, dan
0,013% (w/v) deoxyholic acid hingga proteinnya mencapai konsentrasi 0,5 mg/mL. Pencampuran rElGH-HP55 dengan pakan uji dilakukan dengan cara disemprotkan, kemudian dikering-anginkan. Selanjutnya pada masing-masing pakan (kontrol, harian, dan perlakuan) diambil sebagian untuk analisis proksimat sebagai data awal tentang komposisi nutriasi pakan yang diberikan (Tabel 1). Tabel 1. Komposisi proksimat pakan yang digunakan (% bobot kering) Pakan perlakuan dosis (mg/kg pakan) Pakan harian Kontrol 0,3 3,0 30,0 Abu 9,37 9,37 9,20 9,15 9,21 Protein 35,52 38,56 38,88 39,85 41,18 Lemak 6,90 7,07 6,90 6,73 6,67 Serat kasar 5,02 5,07 4,84 3,86 3,35 BETN 43,19 39,93 40,17 40,42 39,58 DE (kkal/kg pakan) 2.881,71 2.920,56 2.924,19 2.949,96 2.971,45 C/P(kkal/g protein) 8,11 7,57 7,52 7,40 7,21 Keterangan: Pakan harian; Pakan tanpa dicampur HP-55, Pakan kontrol; Pakan dicampur HP-55. Pakan perlakuan diberikan 2 kali per minggu, BETN; bahan ekstrak tanpa nitrogen, DE: digestible energy yang diperhitungkan dari: 1 g protein= 3,5 kkal; 1 g lemak= 8,1 kkal; 1 g karbohidrat= 2,5 kkal. Parameter uji
3.4 Pemberian rElGH-HP55 dengan Dosis Berbeda Melalui Pakan Benih ikan gurame dipelihara dalam akuarium yang berukuran 1,0x0,5x0,5 m3 dengan kepadatan 45 ikan/akuarium selama 4 minggu, dilanjutkan dalam hapa berukuran 2x1x1 m3 selama 4 minggu. Pakan yang diberikan adalah
13
pakan yang telah diberi protein rElGH-HP55 dengan dosis berbeda (0; 0,3; 3,0; dan 30 mg/kg pakan). Setiap perlakuan diberi 3 kali ulangan. Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari. Pakan mengandung rElGH-HP55 diberikan 2 kali dalam seminggu dengan tingkat pemberian pakan 5% dari bobot tubuh. Pemberian pakan mengandung rElGH diberikan satu kali pada pagi hari. Bobot ikan diukur setiap 2 minggu. Penghitungan kelangsungan hidup (KH) dilakukan pada akhir pemeliharaan. Panjang baku dan tinggi badan diukur pada semua ikan tiap perlakuan pada akhir pemeliharaan. Proksimat daging ikan awal, ikan dari perlakuan dosis terbaik, dan kontrol dianalisis pada akhir penelitian. Organ hati diambil masing-masing secara acak dari satu ekor ikan untuk perlakuan terbaik dan kontrol pada akhir penelitian untuk analisis histologis. Begitu juga untuk sampel analisis ekspresi gen IGF-1, dan GHR-1. Selanjutnya, pengukuran hepatosomatic index juga dilakukan dengan mengukur bobot tubuh dan hati masing-masing 15 ekor ikan tiap perlakuan terbaik dan kontrol. Selain itu, sebagai data penunjang dilakukan pengukuran kualitas air kolam (suhu, pH, amoniak, nitrit dan oksigen terlarut) selama pemeliharaan. 3.5 Analisis Hepatosomatic Index (HSI) HSI diukur dengan menimbang bobot hati dibandingkan dengan bobot tubuh ikan gurame hasil perlakuan terbaik dan kontrol. Pada akhir pemeliharaan sampel ikan perlakuan terbaik dan kontrol diambil masing-masing sebanyak 15 ekor, kemudian dimatikan, dan ditimbang bobot tubuh dan hati dari masingmasing ikan. Selanjutnya dilakukan perhitungan HSI pada kedua perlakuan tersebut. Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis secara deskriptif. 3.6 Analisis Proksimat Pakan dan Komposisi Tubuh (AOAC 1984) Analisis proksimat terhadap pakan yang digunakan dan ikan perlakuan terbaik dan kontrol dilakukan pada Laboratorium Nutrisi Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Analisis tersebut berupa kadar protein kasar yang dilakukan dengan menggunakan metode Kjeldahl, kadar lemak dengan metode sochlet, kadar abu dengan pemanasan sampel dalam
tanur bersuhu 600 °C, karbohidrat menggunakan metode pelarutan sampel dengan asam dan basa kuat serta pemanasan, dan kadar air dengan metode pemanasan
14
dalam oven bersuhu 105-110°C, sedangkan untuk proksimat dari daging ikan mengikuti metode Folch (Takeuchi 1988). 3.7 Analisis Ekspresi Gen IGF-I dan GHR-1 Analisis ekspresi gen IGF-I dan GHR-1 dilakukan untuk mendapatkan informasi tentang ekspresi gen IGF-I dan GHR-1 akibat introduksi dari rGH eksogen dengan cara mengambil sampel otak dan hati ikan gurame dari masingmasing perlakuan dosis rGH terbaik dan kontrol. Pengambilan sampel dilakukan pada akhir perlakuan, yakni setelah pemberian pakan rElGH diberhentikan selama 4 minggu, selanjutnya ikan dipindahkan ke dalam akuarium. Pemberian pakan yang mengandung rElGH, dan pakan kontrol dilakukan setelah ikan dipuasakan selama sehari (untuk mengosongkan isi lambung). Jaringan hati dan otak diambil pada jam ke-24 setelah perlakuan. RNA total diekstraksi menggunakan isogen (Nippon Gen, Japan) sesuai prosedur dalam manual. Jaringan tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing microtube yang berisi larutan isogen 200 µL, kemudian dihancurkan dengan menggunakan penggerus yang telah disterilkan dengan dietylpyrocarbonate (DEPC) 0,1%. Ke dalam microtube ditambahkan larutan isogen hingga mencapai volume akhir 800 µL dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang sampai semua jaringan terlisis sempurna. Setelah itu, kloroform ditambahkan sebanyak 200 µL, kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam microtube baru yang telah berisi 400 µL larutan isopropanol, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4°C. Supernatan pada microtube dibuang, dan pelet RNA pada dasar microtube dilarutkan dengan cara menambahkan 1 mL etanol 70% dingin, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. RNA dikeringkan dengan cara membuang larutan yang terdapat pada microtube. Setelah kering sempurna, RNA dilarutkan dengan 30 µL DEPC 0,1%. Konsentrasi hasil isolasi RNA total diukur menggunakan alat pengukur konsentrasi RNA/DNA (GeneQuant). Absorbansi diukur dengan panjang gelombang 260, dan 280 nm. Sintesis cDNA IGF-1 dan GHR-1 dilakukan menggunakan kit Ready-toGo You-Prime First Strand Beads, FSRMB (GE Healthcare). Konsentrasi RNA
15
dibuat 3 µg dalam 30 µL DEPC, kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit dan diletakkan dalam kondisi on ice. Sampel RNA dipindahkan ke dalam microtube FSRMB dan ditambahkan 3 µL primer „dT3‟RACE-VECT‟ (5‟-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT -3‟) dengan konsentrasi 1 µg/3 µL. Larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. cDNA yang terbentuk ditambahkan 30 µL SDW steril dan disimpan dalam refrigerator hingga digunakan. Ekspresi gen IGF-1 dan GHR-1 dideteksi menggunakan metode semikuantitatif PCR dengan primer IGF1-F: 5‟-TTCAAGAGTGTCATGTGCTGTA3‟ dan IGF1-R 5‟-CATAGCCTGTTGGTTTACTGAA-3‟ untuk amplifikasi gen IGF-1, GHR1-F: 5‟-ACCGGCCACAACATGAATATAAGG-3‟ dan GHR1-R: 5‟-GTCTTGATCAGGCAGGTCTGG-3‟
untuk
amplifikasi
gen
GHR-1
(Irmawati, belum dipublikasikan). Kondisi PCR untuk IGF-1 adalah predenaturasi pada 94°C selama 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 57°C selama 30 detik, ekstensi 72°C selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72°C selama 3 menit. Kondisi PCR untuk GHR-1 adalah predenaturasi pada 94°C selama 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 60°C selama 30 detik, ekstensi 72°C selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72°C selama 3 menit. Ekspresi gen β-aktin dianalisis sebagai kontrol internal loading RNA saat sintesis cDNA. Primer yang digunakan untuk gen β-aktin adalah primer F (5‟AAC CAT GGA TGA TGA AAT CGC CGCA-3‟) dan R (5‟-TGA TGC CTG GGG CGA CCG ACG ATGG -3‟) (Irmawati, belum dipublikasikan) dengan kondisi PCR adalah predenaturasi pada 94°C selama 3 menit, 28 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 59°C selama 30 detik, ekstensi 72°C selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72°C selama 3 menit. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5%. Pengukuran level IGF-1 dan GHR-1 dilakukan dengan mengukur ketebalan pita DNA hasil elektroforesis menggunakan software UN-SCAN-IT gel 6.1, kemudian hasilnya dibandingkan dengan gen β-aktin yang digunakan sebagai kontrol.
16
3.8 Analisis Statistik Pertumbuhan bobot,
laju
pertumbuhan spesifik,
konversi
pakan,
kelangsungan hidup, tinggi badan dan panjang baku ikan gurame dianalisis dengan metode sidik ragam (ANOVA), dan uji lanjut Fisher‟s menggunakan program Minitab 16. Proksimat, ekspresi gen IGF-1 dan GHR-1, serta histologis hati dianalisis secara deskriptif.
