ICSI BEHANDELINGEN: PREVALENTIE, AARD EN RESULTAAT VAN ANTICOAGULATIETHERAPIE

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2008 - 2009

TROMBOFILIE BIJ FERTILITEITSPATIENTEN MET DRIE GEFAALDE IVF/ICSI BEHANDELINGEN: PREVALENTIE, AARD EN RESULTAAT VAN ANTICOAGULATIETHERAPIE.

Hanneke VANDEWALLE Laurent WILLEMOT

Promotor: Prof. Dr. P. De Sutter

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot

ARTS

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2008 - 2009

TROMBOFILIE BIJ FERTILITEITSPATIENTEN MET DRIE GEFAALDE IVF/ICSI BEHANDELINGEN: PREVALENTIE, AARD EN RESULTAAT VAN ANTICOAGULATIETHERAPIE.

Hanneke VANDEWALLE Laurent WILLEMOT

Promotor: Prof. Dr. P. De Sutter

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot

ARTS

Dankwoord Deze scriptie is het resultaat van een gezamelijke inspanning. Graag hadden wij dan ook een woord van dank opgedragen aan de volgende mensen: Ten eerste gaat onze welgemeende dank uit naar het volledige team van de dienst Infertiliteit 2P3 van het Universitair Ziekenhuis Gent. Dankzij wederzijds respect was het mogelijk om het dossieronderzoek op een efficiënte manier te laten verlopen. In het bijzonder danken wij Dhr. Stijn Bal voor zijn vriendelijke hulp op vlak van statistiek en informatica. Verder danken wij ook de Dienst Medische Genetica voor de nodige patiëntenlijsten en de informatie omtrent de procedure van genetische trombofiliescreening. Vervolgens wensen wij Prof. Dr. Saskia Middeldorp te bedanken voor de vriendelijke en snelle reacties op onze epidemiologische vragen. Prof. Dr. G. Vanmaele verdient een bijzondere vermelding vanwege zijn aanbevelingen op het vlak van statistische verwerking. Tenslotte danken wij van harte onze promotor Prof. Dr. Petra De Sutter voor haar begeleiding tijdens dit onderzoek en voor het steeds nauwgezet nalezen en verbeteren van onze teksten. Het enthousiasme en het vertrouwen dat zij toonde omtrent dit onderzoek stimuleerde ons om altijd het onderste uit de kan te halen.

| Trombofilie bij fertiliteitspatiënten met drie gefaalde IVF/ICSI behandelingen |

INHOUDSOPGAVE ABSTRACT .................................................................................................................................................. 1 INLEIDING .................................................................................................................................................. 3 1. WAT IS INFERTILITEIT? ........................................................................................................................... 3 2. PREVALENTIE VAN INFERTILITEIT ........................................................................................................... 3 3. OORZAKEN VAN INFERTILITEIT ............................................................................................................... 4 4. EVALUATIE VAN HET INFERTIELE KOPPEL............................................................................................... 4 5. WAT ZIJN DE MOGELIJKE BEHANDELINGEN? ........................................................................................... 5 6. WAT NA DRIE KEER FALEN VAN IVF/ICSI? ............................................................................................ 6 7. WAT IS TROMBOFILIE?............................................................................................................................ 7 8. WELKE TROMBOFILIEËN? ..................................................................................................................... 10 9. WETENSCHAPPELIJKE ONDERBOUWING ................................................................................................ 12 10. RATIONALE ........................................................................................................................................ 13 MATERIALEN EN METHODEN ........................................................................................................... 15 1. ONDERZOEKSVRAAG ............................................................................................................................ 15 2. STUDIEDESIGN ...................................................................................................................................... 15 3. VERZAMELEN VAN GEGEVENS .............................................................................................................. 15 4. STUDIEPOPULATIE ................................................................................................................................ 17 5. CONTROLEPOPULATIE........................................................................................................................... 17 6. VARIABELEN ........................................................................................................................................ 18 7. STATISTIEK ........................................................................................................................................... 19 8. TROMBOFILIESCREENINGSONDERZOEKEN ............................................................................................ 19 RESULTATEN ........................................................................................................................................... 21 1. BESCHRIJVING VAN DE STUDIEPOPULATIE ............................................................................................ 21 1.1. Leeftijd ......................................................................................................................................... 21 1.2. Ethniciteit..................................................................................................................................... 21 1.3. Duur van de infertiliteit................................................................................................................ 21 1.4. Totaal aantal verse IVF/ICSI-cycli en totaal aantal mislukte IVF/ICSI-cycli ............................. 21 1.5. Oorzaak van infertiliteit en type infertiliteit................................................................................ 21 1.6. Aangewende reproductiemethodes............................................................................................... 22 2. ONDERZOEKSVRAGEN .......................................................................................................................... 22 2.1. Prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen (MTHFR, Factor V Leiden, Factor II mutatie) – bestaat er een significant verschil in prevalentie ten opzichte van de controlepopulaties?22 2.2. Bestaat er een verschil in prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen in bepaalde subgroepen van de studiepopulatie?................................................................................................... 25

I


2.2.1. Subgroepen volgens leeftijd .........................................................................................................................25 2.2.2. Subgroepen volgens indicatie voor infertiliteitsbehandeling.....................................................................25 2.2.3. Subgroepen volgens BMI .............................................................................................................................26 2.2.4. Subgroepen volgens tabakusus ....................................................................................................................26 2.2.5. Subgroepen volgens duur van de infertiliteit ..............................................................................................27 2.2.6. Subgroepen volgens morfologie van de embryo’s .....................................................................................27 2.2.7. Subgroepen volgens graviditeit en pariteit..................................................................................................28 2.2.8. Hoeveel vrouwen uit de studiepopulatie met een genetische trombofilie-afwijking werden behandeld met aspirine – welk percentage van de studiepopulatie werd zwanger na toediening van aspirine?.................28 2.2.9. Komen miskramen significant meer voor bij patiëntes met een afwijking in de trombofiliegenen? ......30

DISCUSSIE................................................................................................................................................. 31 1. OP WELKE MANIER ZOU GENETISCHE TROMBOFILIE DE IMPLANTATIE KUNNEN BEÏNVLOEDEN? ........... 31 2. BESTAAN ER VERSCHILLEN IN PREVALENTIE VAN GENETISCHE TROMBOFILIE-AFWIJKINGEN TUSSEN DE STUDIE- EN CONTROLEPOPULATIE?...........................................................................................................

33

3. ANALYSE VAN DE SUBGROEPPREVALENTIES......................................................................................... 35 3.1. Leeftijd ......................................................................................................................................... 35 3.2. Oorzaak van infertiliteit ............................................................................................................... 36 3.3. Body Mass Index .......................................................................................................................... 37 3.4. Tabakusus .................................................................................................................................... 37 3.5. Duur van de infertiliteit................................................................................................................ 38 3.6. Morfologie van de getransfereerde embryo’s .............................................................................. 38 3.7. Graviditeit en pariteit................................................................................................................... 38 4. WAT IS DE BETEKENIS VAN DE GECOMBINEERDE GENETISCHE TROMBOFILIE-AFWIJKINGEN DIE VOORKOMEN IN ONZE STUDIEPOPULATIE? ................................................................................................

39

5. LITERATUURONDERZOEK ..................................................................................................................... 39 6. SITUERING VAN TROMBOFILIESCREENING IN DE CONTEXT VAN BEHANDELING VAN INFERTILITEIT ...... 43 6.1. Trombofiliescreening en multipel IVF/ICSI-falen........................................................................ 43 6.2. Trombofiliescreening en herhaald miskraam .............................................................................. 44 7. WAT IS DE MEEST GESCHIKTE BEHANDELING VAN GENETISCHE TROMBOFILIE IN DE CONTEXT VAN INFERTILITEITSBEHANDELING?.................................................................................................................

45

7.1. Aspirine en heparine .................................................................................................................... 45 7.2. Behandeling van hyperhomocysteïnemie ..................................................................................... 47 8. WAT ZIJN DE BEPERKINGEN VAN DIT ONDERZOEK? .............................................................................. 47 8.1. Tekortkomingen in de dossiers..................................................................................................... 47 8.2. Ontbreken van een controlepopulatie .......................................................................................... 48 8.3. Moeilijkheden in verband met ethiniciteit van controle- en studiepopulatie ............................... 48 8.4. Conclusie ..................................................................................................................................... 48

II


REFERENTIELIJST ................................................................................................................................. 49 BIJLAGEN.................................................................................................................................................. 55 BIJLAGE 1 : ETIOLOGIEËN VAN HERHAALD IMPLANTATIEFALEN (RIF)..................................................... 55 BIJLAGE 2 : CLASSIFICATIE VAN AANGEBOREN TROMBOFILIEËN.............................................................. 56 BIJLAGE 3 : E-MAIL PROF. DR. S. MIDDELDORP (UNIVERSITEIT LEIDEN) ................................................. 57

III


Abstract Inleiding: De zwangerschapskans bij een in vitro fertilisatie cyclus bedraagt tussen de 30 en 40%. Gemiddeld zal één op drie koppels niet zwanger worden na 3 opeenvolgende cycli. Wat de oorzaken van multipel implantatiefalen zijn, is al jaren het onderwerp van onderzoek. Een van de hypothesen is dat afwijkingen in de trombofiliegenen hiervoor (mede)verantwoordelijk zijn. Er is op tot op heden, o.a. door het gebrek aan uniformiteit tussen de verschillende studies, over dit onderwerp nog geen consensus bereikt. Het is de bedoeling van deze retrospectieve studie om na te gaan of genetische trombofilieën een verschillende prevalentie kennen in een studiepopulatie van vrouwen met minstens drie opeenvolgende gefaalde IVF/ICSI-pogingen. We vergelijken de gevonden prevalenties in onze studiepopulatie met de prevalenties in de algemene bevolking. Het is uiteindelijk de bedoeling om dankzij deze vergelijking de waarde van de trombofiliescreening in retrospectie te analyseren. Daarnaast hoopten we ook het effect van anticoagulantia na te gaan in de groep van vrouwen met een aangeboren trombofilie-afwijking. Om hierover een wetenschappelijk onderbouwde uitspraak te doen, was het databestand te beperkt. Materialen & methoden : We verzamelden de gegevens van alle patiëntes die in het Universitair Ziekenhuis Gent een trombofiliescreening ondergingen na ten minste drie opeenvolgende gefaalde IVF/ICSI-cycli. De data van deze 266 vrouwen werd vergeleken met de controlepopulaties uit de literatuur voor wat betreft de prevalentie van de aangeboren trombofilie-afwijkingen (factor V Leiden, prothrombine 20210G>A mutatie en MTHFR 677C>T mutatie). Resultaten : De prevalentie van de heterozygote mutaties van MTHFR en

factor II is

significant hoger in onze studiepopulatie. De heterozygote factor V Leiden mutatie is daarentegen significant minder prevalent in de studiepopulatie. Bij het vergelijken van de prevalenties van de bovengenoemde genetische trombofilie-afwijkingen in verschillende subgroepen van de populatie (volgens tabakusus, duur infertiliteit, leeftijd, body mass index, type infertiliteit, oorzaak van infertiliteit en embryokwaliteit) konden geen klinisch significante verschillen worden opgemerkt. 1


Discussie & conclusie : De heterozygote MTHFR 677C>T mutatie heeft geen verdere klinische betekenis. De factor II 20210G>A mutatie zou wel een rol kunnen spelen in de etiologie van multipel IVF/ICSI-falen. Al is het precieze biologisch mechanisme nog niet gekend. Bovendien lijken onze resultaten aan te sluiten bij de idee dat factor V Leiden een protectieve rol zou spelen in het verhaal van herhaald implantatiefalen. Verder fundamenteel en klinisch onderzoek in dit domein is noodzakelijk om het belang van trombofilie in de problematiek van herhaald implantatiefalen onweerlegbaar te kunnen duiden.

2


Inleiding

1. Wat is infertiliteit? Infertiliteit valt niet eenvoudig te definiëren. In medische woordenboeken maakt men vaak het onderscheid tussen infertiliteit en steriliteit. Met het eerste bedoelt men een verminderde kans op het produceren van nageslacht en met het tweede een volkomen onmogelijkheid tot reproductie. In de klinische praktijk voldoet men pas aan de diagnose “infertiliteit” na minstens 1 jaar ongewenst uitblijven van zwangerschap terwijl er regelmatige onbeschermde geslachtgemeenschap plaats heeft gehad tijdens de vruchtbare periode van de cyclus. Zowel patiënten als clinici hebben soms de neiging om de lekenbetekenis van infertiliteit hieraan te koppelen. Dit wil zeggen dat men er, na een jaar zonder zwangerschap, van uitgaat dat de kans in komende jaren per definitie heel laag of zelfs onbestaand is (Habbema et al., 2004). Fertiliteit is daarentegen een statistisch begrip. Elke afkapping in de tijd is dan ook kunstmatig. Om het fertiliteitscontinuüm te benadrukken, werd de term “subfertiliteit” in het leven geroepen. De term wordt tegenwoordig meer en meer gebruikt voor al wie te kampen heeft met een vorm van verlaagde fertiliteit. Voor de vlotheid van de tekst zullen wij hier echter de meer gangbare term “infertiliteit” verder gebruiken. Voorts wordt een onderscheid gemaakt tussen primaire en secundaire infertiliteit. Indien er in de voorgeschiedenis ooit al een zwangerschap beschreven werd, spreekt men van secundaire infertiliteit, ook al resulteerde die zwangerschap niet in de geboorte van een levend kind.

2. Prevalentie van infertiliteit Ondanks een stabiele prevalentie van infertiliteit in de populatie is de vraag naar fertiliteitsbehandelingen (of Assisted Reproductive Technology; ART) de laatste 20 jaar enorm toegenomen. Ongeveer 10 tot 15 % van de koppels in de Westerse wereld blijft kinderloos na 1 jaar onbeschermde coïtus (Forti and Krausz, 1998).

3


De gestegen vraag heeft veel te maken met het toegenomen aanbod. De laatste 25 jaar zijn zowel de technische mogelijkheden als de publieke bekendheid van ART exponentieel toegenomen. Infertiliteit werd langzamerhand uit de taboesfeer gehaald en dit heeft de drempel om medische hulp te zoeken aanzienlijk verlaagd.

3. Oorzaken van infertiliteit De kans op een spontane zwangerschap bij infertiele vrouwen correleert sterk met de leeftijd, de duur van infertiliteit en het type infertiliteit (primair of secundair). Het spreekt voor zich dat deze factoren uitermate belangrijk zijn in de evaluatie van koppels en therapiekeuze. De voornaamste oorzaken van infertiliteit zijn de mannelijke factor infertiliteit, anovulatie, tubaire factoren en onverklaarde infertiliteit. In de laatste categorie vinden we ten eerste de koppels die tot dan toe pech hebben gehad maar waar fysiologisch niets mis mee is. Ten tweede de koppels met heel subtiele afwijkingen die niet werden opgemerkt in de voorafgaande evaluatie.

Ten

derde

de

koppels

met

belangrijke,

maar

ongediagnosticeerde/

ondiagnosticeerbare afwijkingen. Tenslotte treft men in deze categorie ook de koppels aan waar enkel de vrouwelijke leeftijd als etiologische factor wordt gevonden. Het is duidelijk dat deze zeer heterogene groep moeilijk etiologisch te behandelen valt (De Sutter, 2006). Idealiter zouden diagnostische technieken zover moeten evolueren dat deze restcategorie “onverklaarde infertiliteit” kleiner en kleiner wordt, tot ze uiteindelijk helemaal verdwijnt.

4. Evaluatie van het infertiele koppel In de evaluatie van het infertiele koppel is het belangrijk te beseffen dat infertiliteit geen ziekte is. Het is een term die gebruikt wordt om een statistisch verlaagde kans op conceptie uit te drukken. Een diagnostische aanpak, zoals vroeger de gewoonte was, is dan ook stilaan uit de mode geraakt. De klassieke diagnostische indeling in vrouwelijke, mannelijke, gecombineerde en onverklaarde infertiliteit heeft veel van haar waarde verloren. Tegenwoordig werkt men

4


vanuit een prognose georiënteerde aanpak. Zoals in de meeste takken van de geneeskunde dient men te beginnen met een gerichte medische en een voor deze context specifieke seksuele anamnese. Vervolgens is voor de vrouwelijke partner een volledig lichamelijk en gynaecologisch onderzoek noodzakelijk, inclusief transvaginale echografie. In afwezigheid van coïtale problemen en indien het klinisch onderzoek normaal was, gaat men verder met het onderzoeken van de ovulatie en doorgankelijkheid van de tubae. Bij de mannelijke partner wordt altijd een (of meerdere) semenanalyse(s) verricht. Klinisch onderzoek van de man is enkel aangewezen in het geval van afwijkende semenwaarden (De Sutter, 2006).

5. Wat zijn de mogelijke behandelingen? Meestal probeert men in eerste instantie een oorzakelijke behandeling te vinden. Voorbeelden van oorzakelijke behandelingen zijn tubaire of vasale reanastomosen bij gesteriliseerde patiënten, ovulatie-inductie bij anovulatoire vrouwen en mogelijks ook de behandeling van mannelijke infertiliteit. Is dit niet mogelijk, gaat men over naar technieken om de fertiliteit te “verbeteren”. Zoals verder wordt uitgelegd zijn dit alle behandelingen die inspelen op een aantal stappen van de “natuurlijke” bevruchting, op zo’n manier dat er minder aan het toeval wordt overgelaten en de kans op succesvolle conceptie stijgt. Soms is het daarentegen aangewezen om onmiddellijk over te gaan tot de tweede vorm van therapie. Afwachten of de oorzakelijke behandeling aanslaat kan in sommige gevallen in het nadeel werken van de patiënte aangezien leeftijd, zoals hoger vermeld, een belangrijke risicofactor voor infertiliteit is. Kansverhogende ingrepen zijn de intrauteriene inseminatie of IUI, de in-vitrofertilisatie of IVF en de intracytoplasmatische spermainjectie of ICSI (De Sutter, 2006). Deze drie technieken gaan in toenemende mate ingrijpen in het natuurlijk conceptieproces. Bij de IUI wordt sperma op het juiste moment in de uterus van de vrouwelijke partner gedeponeerd. De cyclus wordt hiervoor nauwlettend gevolgd en kan eventueel hormonaal gestimuleerd worden. Bij IVF gaat men eerst hormonen (FSH) toedienen om eicellen te doen rijpen. Eens de cellen de gewenste rijpheid hebben verkregen dient men hCG toe te dienen om 34-35 uur later (juist voor de ovulatie) de eicellen te oogsten. Dit wordt een eicel pick-up genoemd. Zowel eicellen als sperma worden geprepareerd om vervolgens samen geïncubeerd te worden tot fertilisatie 5


optreedt. Men laat de gefertiliseerde eicellen of zygoten verder delen gedurende 48uur. Daarna wordt het vier- tot achtcellig embryo van de beste kwaliteit geselecteerd om teruggeplaatst te worden in de uterus. Bij ICSI gaat men op ongeveer dezelfde manier te werk. Het enige verschil is dat men hier de fertilisatie niet meer aan het toeval overlaat, maar manueel één spermacel in de eicel gaat injecteren. Dit is vooral aangewezen bij koppels met een zeer lage spermakwaliteit of -kwantiteit. De drie technieken hebben elk hun eigen strikte indicaties. Indien etiologische behandeling niet succesvol is maar tubaire doorgankelijkheid en spermakwaliteit goed zijn, is het aangewezen om te starten met IUI. Pas na 4-6 gefaalde IUI’s raadt men aan om met IVF/ICSI te beginnen (De Sutter, 2006).

6. Wat na drie keer falen van IVF/ICSI? Voor koppels die beschikken over embryo’s van goede kwaliteit en waarbij de vrouw niet ouder is dan 35 jaar kan de kans op zwangerschap bij een verse IVF/ICSI-poging tot 40% bedragen. Deze cijfers gelden enkel voor koppels bij wie een etiologische factor aangetroffen en behandeld werd en anderzijds voor koppels die behoren tot de categorie onverklaarde infertiliteit. Statistisch is de cumulatieve kans op een zwangerschap bij deze patiënten na 3 pogingen bijna 100%. Is er daarentegen na 3 pogingen nog steeds geen zwangerschap vastgesteld, spreekt men van “multipel implantatiefalen”. Algemeen wordt deze artificiële grens gebruikt om het onderscheid te maken tussen toevallig falen (m.a.w “pech”) en pathologisch falen. In het laatste geval vermoedt men een onderliggend mechanisme dat de kans op zwangerschap verlaagt. Over de verschillende oorzaken van multipel implantatiefalen heerst nog heel wat onduidelijkheid. Meestal worden ze onderverdeeld in de volgende brede categorieën; onvoldoende embryokwaliteit, implantatiefalen en/of een multifactoriële oorzaak. Voor een gedetailleerde indeling van de etiologieën van herhaald implantatiefalen verwijzen wij naar Bijlage 1. Om de etiologie aan het licht te brengen, verricht men een batterij aan testen. De zogenaamde Repeated Implatation Failure-batterij of RIF-batterij. In het Universitair Ziekenhuis Gent bestaat de de batterij uit 5 specifieke testen. Ten eerste wordt een hysteroscopie uitgevoerd ten einde uterusafwijkingen zoals myomen, poliepen, een septum of vergroeiingen te detecteren. Aangezien de patiëntes die in deze setting een hysteroscopie 6


ondergaan echter reeds talrijke echo’s hebben gehad, zullen slechts kleine afwijkingen aan het licht komen. Bovendien bestaat er tot op vandaag geen evidentie dat het verwijderen van kleine letsels de kans op zwangerschap zou verhogen. Ten tweede worden aan de hand van een karyotypering structurele en/of numerieke chromosoomafwijkingen bij beide ouders opgezocht.

In

tegenstelling

tot

de

uterusafwijkingen

is

het

wel

zeker

dat

chromosoomanomalieën de zwangerschapskans negatief beïnvloeden. Jammer genoeg bestaat voor deze afwijkingen geen behandeling en dient te worden overgegaan tot preïmplantatie genetische diagnostiek of zelfs donatie. Een derde onderdeel van de testbatterij omvat de schildklierfunctietesten. Vanwege hun lage kost en snelle resultaten worden de schildklierfunctietesten echter meer en meer vanaf de start van de infertiliteitsbehandeling uitgevoerd. Daarenboven zijn schildklierdysfuncties over het algemeen pathologieën waarvoor eenvoudige en efficiënte therapieën bestaan. Schildklierlijden zou zowel een invloed hebben op implantatiefalen als op herhaald miskraam, wat opnieuw een situering van de test aan het begin van de infertiliteitsbehandeling kan rechtvaardigen. Als vierde test binnen de RIFbatterij wordt een antistoffenbepaling uitgevoerd. Hierbij worden factoren als Lupus Anticoagulans, anticardiolipine antilichamen, reumafactoren en antinucleaire factoren opgezocht vanwege de associatie tussen antifosfolipidensyndroom en reumatologische aandoeningen en het voorkomen van herhaalde miskramen. Men volgt hierbij de redenering dat implantatiefalen als een zeer vroegtijdig miskraam kan gezien worden. Tenslotte behoort ook een genetische trombofiliescreening tot de RIF-batterij. Deze laatste test zal meteen ook het onderwerp van deze studie zijn.

7. Wat is trombofilie? Alvorens in te gaan op het verband tussen multipel implantatiefalen en trombofilie, is een korte verklaring van de term “trombofilie” wel op zijn plaats. Trombofilie wordt gedefinieerd als een verhoogde neiging tot het ontwikkelen van tromboses en/of embolieën door de aanwezigheid van aangeboren en/of verworven afwijkingen in het systeem van bloedstolling en fibrinolyse. Volledigheidshalve geven wij een kort overzicht van de klassieke trombofilie classificatie in Bijlage 2. De verworven afwijkingen zijn in het algemeen milde risicofactoren 7


die op hun beurt worden opgedeeld in persistente of eerder transiënte factoren. Daarnaast onderkennen we ook de aangeboren of vaak verkeerdelijk genoemde “erfelijke” trombofilieën. Om de pathogenese van trombofilie te verduidelijken dienen we eerst even in te gaan op de werking van het normale stollingsmechanisme (Figuur 1). Dit verdedigingssysteem treedt in actie bij vaatbeschadiging. Op dat moment wordt een cascade van reacties in gang gezet die tot uiteindelijk doel heeft om verdere bloeding uit het betreffende bloedvat te voorkomen en herstelling van de bloedvatwandschade te bekomen. Het primum movens is een plaatsjesactivatie waarbij de voorbijstromende trombocyten zich op de beschadigde site vasthechten (adhesie) en tevens aan elkaar gaan klitten (aggregatie). Een tweede systeem dat in gang wordt gezet om samen met het voorgaande tot een efficiëntere klontervorming te leiden, is de plasma-eiwit dependente stolling. De verschillende stollingseiwitten worden één na één geactiveerd tot wanneer fibrinogeen omgezet wordt in fibrine (factor I). Dit kan dankzij de enzymatische activiteit van trombine (factor II), dat op zijn beurt uit de precursor protrombine moet gevormd worden. Deze omzetting wordt gerealiseerd door het geactiveerde factor X en V complex ter hoogte van een bloedplaatje. Het enzymatisch complex krijgt de naam “tenase” en kan op twee manieren ontstaan. In tegenstelling tot wat vroeger de heersende gedachte was, zijn dit geen twee evenwaardige pathways (extrinsiek en intrinsiek), maar één initiërende (de Tissue Factor of extrinsieke) en één amplificerende (intrinsieke). In de eerste cascade ziet men een activatie van factor VII door de weefselfactor (Tissue Factor) die vrijkomt bij weefselschade. Geactiveerde factor VII heeft twee belangrijke functies. Het activeert ten eerste factor X dat onderdeel wordt van het tenase, en activeert ook factor IX dat deel uitmaakt van de intrinsieke pathway. Deze pathway begint typisch in vitro door contact met de negatief geladen oppervlakte van de reageerbuis. In vivo is initiatie mogelijk door stoffen die vrijkomen bij weefselschade, maar het is waarschijnlijker dat deze arm van de cascade voornamelijk als amplificatie van de extrinsieke pathway tot zijn recht komt. Factor IX activeert factor XI, die op zijn beurt factor X en zo het tenase activeert. Gelijktijdig met de activatie van de stollingscascade wordt een feedbackmechanisme in gang gezet dat overdreven stolling voorkomt: de anticoagulatie. Voorts treedt ook bijna onmiddellijk het fibrinolytisch systeem in actie. Dit systeem zorgt voor de resorptie van de fibrineklonter. Tenslotte vindt in

8


aansluiting op dit alles een recanalisatie van het bloedvat en een reendothelialisatie van de wand plaats. Het procoagulante, anticoagulante en fibrinolytisch systeem vormen samen het zogenaamd hemostatisch mechanisme. De verhouding tussen deze drie systemen kan het best gezien worden als een zeer gevoelige balans die door kwantitatieve of kwalitatieve afwijkingen in één of meer factoren kan leiden tot zowel trombose als bloeding (Gomez Garcia et al., 2003). In deze studie wordt de focus gelegd op de conditie waarbij de balans overhelt naar de kant van overdreven klontervorming of trombose. Theoretisch kan men de oorzaak van trombose het best samenvatten met de trias van Virchow; vaatwandafwijkingen, stase en een gestegen coagulabiliteit. Patiënten met trombofilie hebben een intrinsieke aanleg tot het vormen van bloedklonters. Dit omschrijft men als een protrombotische status. De status op zich blijkt echter onvoldoende te zijn om trombose te veroorzaken, maar kan in de aanwezigheid van bijkomende risicofactoren tot trombotische events leiden. (Offner, 2007-2008)

▲Figuur 1. Schematische voorstelling van de stollingscascade. De plaats van de verschillende stollingsfactoren (waaronder prothrombine of factor II en factor V) en de synergie tussen intrinsieke en extrensieke pathway worden hier duidelijk weergegeven. (met dank aan Prof. Dr. F. Offner)

9


8. Welke trombofilieën? Tot de voorgenoemde RIF-batterij behoort een screening voor genetische trombofilieën. In concreto betekent dit dat men de aanwezigheid van de factor V Leiden en protrombine 20210G>A mutaties evenals de MTHFR 677C>T mutatie gaat nagaat. Alvorens in te gaan op het wetenschappelijk onderzoek dat deze mutaties aan multipel implantatiefalen associeert, lijkt het ons zinnig eerst even verder in te gaan op elk van deze factoren. Factor V Leiden (FVL) en geactiveerde proteïne C (APC) resistentie. Zoals hoger vermeld is factor V is een essentiële cofactor in de factor Xa gekatalyseerde activatie van factor II (protrombine) naar trombine. Als onderdeel van de anticoagulatie splitst het door trombomoduline geactiveerde Proteïne C (aPC) factor V tot zijn inactieve variant. Een puntmutatie in het gen coderend voor factor V veroorzaakt een verandering in de aminozuursequentie ter hoogte van de cleavage site (Coppens et al., 2006). FVL wordt ongeveer 10x trager geïnactiveerd dan zijn normale variant en blijft langer in de circulatie. Dit leidt tot een gestegen trombinevorming en milde hypercoagulabele status (Kujovich, 2007). Het gaat hier in 95 procent (Franchini et al., 2006) van de gevallen over één enkele aminozuur verwisseling: Arginine506 wordt Glutamine ten gevolge van een 1691guanine naar adenosine puntmutatie in het F5 gen van chromosoom 1 (Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), #188055, 2008). In 1995 verscheen in The Lancet een studie van Rees et al. (1995) welke een allelfrequentie van 4,4 procent vond in Europa. Het moet wel vermeld worden dat een groot verschil in frequentie bestaat tussen de Europese landen, waarbij Griekenland het hoogste scoort (7%). De prevalentie van homozygoot dragerschap ligt veel lager, tussen de 0 en 1%. Belangrijk is ook dat de mutatie bij individuen van Afrikaanse, Zuid-Aziatische, Australische (Aborignal) en Amerikaanse (Native-American) origine heel zeldzaam is. De toevoeging “Leiden” verwijst naar de universiteit waar de mutatie in 1994 door Bertina et al. werd ontdekt. Andere varianten van mutaties binnen het factor V gen die leiden tot aPC resistentie, zoals factor V Hong Kong en Cambridge, komen sporadisch voor. Protrombine 20210G>A. Bij patiënten met een Guanine naar Adenosine omzetting op positie 20210 van het protrombine gen op chromosoom 11 vind men verhoogde protrombine (factor

10


II) plasmawaarden. Experimenteel onderzoek heeft uitgewezen dat het hier waarschijnlijk gaat om een meer efficiënte en accurate verwerking van het 3` uiteinde van het eiwit mRNA ten gevolge van de transitie. Een dergelijke snellere processing zou een opstapeling van mRNA veroorzaken en bijgevolg een overproductie aan factor II. De studie van Rosendaal et al. (1998) vermeldt een prevalentie van 1,7% in Noord-Europa voor het heterozygoot dragerschap van deze factor II mutatie. Homozygoten werden binnen dit onderzoek dat 5527 deelnemers telde niet gevonden. Dit lijkt een normale bevinding gezien de prevalentie van homozygoot dragerschap slechts op 0,01% wordt geschat. Kyrle et al. toonde in 1998 aan dat een hoog factor II gehalte een verhoging in trombine waarden teweegbrengt en bijgevolg een hypercoagulabele toestand. Verhoogde factor II waarden in het bloed zouden ook indirect trombotisch werken via een inhiberende werking op de aPC splitsing van factor V. (Kujovich, 2006). Andere gekende allelische varianten van de klonteringsfactor veroorzaken dysprotrombinemie (type 3, Barcelona, Himi, Quick I en II) of hypoprotrombinemie. MTHFR 677C>T. Het MTHFR gen op chromosoom 1 bevat de genetische informatie voor de vorming van het methyleentetrahydrofolaatreductase enzyme. Het enzyme katalyseert de omzetting van 5,10-methyleentetrahydrofolaat naar 5-methyltetrahydrofolaat. Samen met vitamine B12 is 5-methyltetrahydrofolaat een cofactor voor het methionine synthase, het enzyme verantwoordelijk voor de homocysteïne omzetting tot methionine. Frosst et al. ontdekten in 1995 een cytosine mutatie naar thymidine ter hoogte van nucleotide 677. Dit mutant allel veroorzaakt ter hoogte van het enzyme een vervanging van alanine door valine, wat op zijn beurt resulteert in een verminderde werking van het enzym op 37 graden Celcius. Vandaar de alternatieve benaming “thermolabiel” MTHFR (OMIM, *607093, 2007). Homozygote dragers hebben significant hogere homocysteïne waarden in het plasma. Heterozygoot dragerschap van de 667C-T mutatie komt volgens een studie van de Lau et al. (2005) bij 5920 individuen in 44,8 procent van de Nederlandse bevolking voor. In tegenstelling tot factor V Leiden is de mutatie niet zo sterk etnisch bepaald. We zien wel de laagste prevalentie in Afrika (6,6 procent). Voor homozygoten bedraagt de prevalentie binnen de Nederlandse bevolking 10,2 procent. Er bestaan naast het TT-genotype nog polymorfismen (zoals de 1289A-C mutatie) die aanleiding geven tot thermolabiele MTHFR. Ook kunnen er MTHFR enzymtekorten ontstaan als gevolg van weer andere puntmutaties, welke opnieuw

11


kunnen leiden tot hyperhomocysteïnemie (OMIM, *607093, 2007, huGENet, 2007). Over die varianten is weinig geweten, maar van de 677C>T mutatie weet men dat ze verhoogde homocysteïne plasmawaarden geeft in homozygote dragers met foliumzuurtekort. (HuGENet, 2007) De MTHFR gen mutatie wordt door een aantal studies als een mogelijke causale factor beschouwd voor cardiovasculaire ziekten, maar is uiteindelijk vooral bekend als oorzaak van neurale buis defecten (Neural Tube Defects, NTD). Spina Bifida patiënten hebben een verhoogd risico op homozygoot dragerschap. Over de rol van MTHFR in het ontstaan van gespleten lip/verhemelte is nog geen consensus bereikt. Hetzelfde geldt voor hypertensie, schizofrenie, kanker, depressie, Down syndroom en glaucoom. (OMIM, *607093, 2007). Het is belangrijk op te merken dat factor V Leiden, factor II 20210G>A en MTHFR mutaties autosomaal dominant overerven en niet geslachtsdependent zijn.

9. Wetenschappelijke onderbouwing In de wetenschappelijke literatuur werd al meermaals het verband gelegd tussen hypercoagulabiliteit ten

gevolge van

trombofilie en

een

stijging in

het aantal

zwangerschapscomplicaties. Het voorkomen van miskramen, foetaal verlies, abruptio placentae, pre-eclampsie en intrauteriene groeiretardatie blijkt verhoogd in aanwezigheid van trombofilie. Men vermoedt een etiologische rol van placentaire tromboses. Om uit te wijzen of hetzelfde pathofysiologisch mechanisme verantwoordelijk zou kunnen zijn voor multipel implantatiefalen, werden al enkele onderzoeken uitgevoerd. Martinelli et al. vonden in 2003 geen verband tussen gefaalde IVF/ICSI pogingen en een verhoogde kans op FVL, protrombine 20210G>A of MTHFR mutaties. Zij voerden een case-control studie uit op 234 vrouwen die verwezen werden voor IVF/ICSI behandeling. Een groep van 234 vrouwen die spontaan zwanger werden, diende als controlepopulatie. Men moet wel opmerken dat er uiteindelijke maar zeven van de 234 vrouwen in de studie een totaal van drie gefaalde pogingen kende. Dit onderzoek kan volgens ons dan ook maar weinig bijbrengen over de rol van trombofilie in het kader van multipel implantatiefalen. Azem et al. voerden in 2004 een andere case-control studie uit. Ze vergeleken 45 vrouwen met een voorgeschiedenis van vier of meer gefaalde IVF cycli met 44 “gezonde” gematchte vrouwen en 15 vrouwen die zwanger werden na de eerste 12


IVF cyclus. In de laatste groep werd het laagste percentage aan trombofilie gevonden. Azem et al. (2004) weerhielden zich er weliswaar van om de statische significante hiervan te toetsen, dit vanwege de kleine steekproefgrootte. De onderzoeksgroep rapporteert een significant hoger totaal aantal trombofilie afwijkingen. De meest voorkomende mutaties waren MTHFR en protrombine 20210G>A. Deze afwijkingen kwamen tweemaal zo frequent voor als in de controlegroep. De FVL mutatie bleef stabiel in beide groepen. In 2006 voerden ook Qublan et al. een case-control onderzoek uit. Zij vergeleken 90 vrouwen met drie of meer gefaalde IVF/ICSI pogingen met twee controlegroepen die vergelijkbaar waren aan die van Azem et al. Hun aantallen bedroegen respectievelijk 100 en 90. Ook zij vonden een significante verhoging van het totaal aantal trombofilie mutaties. In tegenstelling tot Azem et al. (2004) vonden Qublan et al. (2006) wel een hogere prevalentie aan FVL mutaties maar een vergelijkbare protrombine 20210G>A prevalentie. De MTHFR incidentie was net als bij Azem et al. (2004) significant hoger. In oktober 2008 werd een turkse studie van Simur et al. gepubliceerd. Deze onderzoeksgroep vergeleek 51 vrouwen met drie of meer gefaalde IVF pogingen met 50 controles. De controles waren vrouwen die spontaan zwanger waren geworden, ten minste één ongecompliceerde zwangerschap en geen miskramen in de voorgeschiedenis hadden. Simur et al. (2008) konden geen significante verschillen weerhouden voor de prevalentie van FVL, factor II 20210G>A noch MTHFR mutaties. Uit deze gegevens mag blijken dat, omwille van tegenstrijdige resultaten, verder onderzoek noodzakelijk is. Een uitgebreide bespreking van onze interpretatie van de gevonden resultaten komt in het onderdeel “discussie” aan bod.

10. Rationale Het is de bedoeling om met deze masterproef na te gaan of trombofilie en meer specifiek FVL, FII 2021G>A en MTHFR 677C>T mutaties meer of minder frequent voorkomen in een populatie van koppels met drie of meer gefaalde IVF/ICSI pogingen dan in de algemene bevolking. Dit betrachten wij aan de hand van een retrospectief onderzoek. Omtrent een eventueel causaal verband kunnen we enkel maar speculeren. Het zijn deze drie factoren die 13


we onderzoeken omwille van de heersende controverse over hun belang en rol. Anderzijds zijn het de enige vormen van genetische trombofilie die opgenomen zijn in het UZ RIF batterij protocol. Ons doel is dan ook om, afhankelijk van de resultaten, een wetenschappelijke ondersteuning dan wel kritiek te geven omtrent de situering van de genetische trombofilie testen binnen de RIF-batterij. Aanvankelijk was het ook de bedoeling om binnen onze populatie aan trombofilie patiënten na te gaan welke het effect was van anticoagulantia behandeling. Dit bleek echter al gauw onmogelijk. De studiepopulatie bood ons niet de mogelijkheid om een dergelijke vergelijking te maken. Dit omwille van een tekort aan patiënten, een niet gerandomiseerde verdeling en een gebrek aan onbehandelde patiënten.

14


Materialen en methoden

1. Onderzoeksvraag Komen in een populatie van vrouwen die drie (of meer) opeenvolgende mislukte IVF/ICSIcycli ondergingen, de genetische trombofilie-afwijkingen factor V Leiden, factor II 20210G>A en MTHFR 677C>T mutatie frequenter voor dan in de algemene bevolking?

2. Studiedesign De opzet van deze studie is een retrospectief dossieronderzoek. Hiervoor werd de goedkeuring verkregen van het Ethisch Comité UZ Gent. Informatie over de studiepopulatie werd gehaald uit de papieren dossiers van de archieven van de dienst Fertiliteit van het UZ Gent in de P3. Om praktische en financiële redenen werden geen reële controlepatiënten gebruikt maar werd er enkel gewerkt met controlewaarden uit de literatuur.

3. Verzamelen van gegevens De patiënten die voor deze masterproef in aanmerking kwamen werden geselecteerd uit de databank van de dienst Medische Genetica. Gezien een omschakeling van het databasesysteem in maart 2006 kregen we van het CMG (Centrum Medische Genetica Gent) twee lijsten. De eerste lijst bevatte alle aanvragen voor genetisch onderzoek vanuit de afdeling Gynaecologie van het UZ Gent door Dr. K. Dirckx, Prof. Dr. P. De Sutter, Prof. Dr. J. Gerris, Dr. P. Cabri en Prof. Dr. M. Dhont van de periode januari 2000 t.e.m. maart 2006. Dit bracht met zich mee dat deze lijst onder andere ook alle vruchtwaterpunctie-onderzoeken, borstkankergeneticaonderzoeken,

genetica

aanvragen

in

het

kader

van

herhaalde

miskramen,

miskraamweefselonderzoek, karyotyperingen, screeningen in kader van mucoviscidose,

15


dragerschap fragiele X-syndroom en deleties van het Y-chromosoom bevatte. De tweede lijst bevatte alle patiënten voor wie in de periode 21 maart 2006 – 1 oktober 2007 een trombofiliescreening was aangevraagd. De eerste lijst telde 1013 patiënten waarvan: •

503 mannen;

•

41 met het label prenatale diagnostiek;

•

64 miskraamweefselonderzoek, vruchtwaterpuncties, postnatale chromosomenafwijkingen en pre-implantatiediagnostiek;

•

8 borstkankergenetica;

•

48 (enkel) karyotyperingen;

•

233 niet voldaan aan inclusiecriteria;

•

108 opgenomen in de studie;

•

8 niet gevonden.

De tweede lijst telde 542 patiënten waarvan: •

439 patiëntes niet voldaan aan inclusiecriteria;

•

93 opgenomen in de studie;

•

9 niet gevonden.

Dit bracht het totaal aantal op 210 patiëntes. Hierbij voegden we nog een extra 24 patiëntes toe komende uit een voorlopige lijst verkregen van de dienst Fertiliteit aan de start van het onderzoek, in afwachting van de lijst van Genetica. Aangezien deze niet voorkwamen op de lijsten van de Dienst Genetica nemen we aan dat al deze patiëntes elders getest zijn. Om de power te maximaliseren besloten we ook alle patiëntes die tussen de start van dit onderzoek en het einde van de eerste steekproefselectie aan drie (of meer) gefaalde pogingen waren geraakt, op te nemen in de studie. Hiervoor wendden we ons tot de statistische dienst van de dienst Fertiliteit. Daar werd een nieuwe lijst getrokken van alle patiëntes met drie of meer opeenvolgende gefaalde pogingen tussen oktober 2007 en 26 juni 2008. Hieruit werden een extra 41 patiëntes gehaald. Dit bracht het totaal op 266 patiëntes in onze studiepopulatie. Bovendien konden we terzelfdertijd de rest van database updaten.

16


4. Studiepopulatie De patiëntes die werden opgenomen in onze studiepopulatie voldoen aan de volgende inclusiecriteria. Het zijn

koppels met minstens drie opeenvolgende mislukte IVF/ICSI

pogingen. Met “opeenvolgend” bedoelt men dat de drie pogingen niet onderbroken werden door een zwangerschap. Onafhankelijk van het feit of deze eindigde in miskraam, extrauteriene zwangerschap of partus. Onder de term ‘mislukt’ vallen die pogingen die niet leiden tot een zwangerschap die op echo waarneembaar is. Alle pogingen dienden ‘vers’ te zijn, m.a.w geen cryocycli. Cycli die werden onderbroken omwille van psychologische, medische of technische reden werden niet meegerekend als zijnde mislukt. Vervolgens dienen volgende exclusiecriteria gerespecteerd te worden : •

lesbische koppels;

•

eicel- en sperma-acceptoren;

•

systeemziekten en chronische medicatiegebruik.

Dit om een eventuele bias te reduceren. Verder dient opgemerkt te worden dat patiëntes altijd gelinkt zijn aan een welbepaalde partner. Wanneer een patiënte meerdere opeenvolgende partners heeft dan vormt zij met hen steeds een afzonderlijke entiteit.

5. Controlepopulatie De gegevens over de controlepopulatie werden in de literatuur gevonden. Hierbij werd intensief gezocht naar cijfermateriaal dat toepasselijk was voor onze populatie. Genetische variatie is vaak geografisch/ethnisch gebonden en dit geldt, zoals reeds vermeld in de inleiding, zeker voor genetische trombofilie. Dankzij de PubMed-databank konden we een aantal artikels selecteren waarvan de data bij benadering vergelijkbaar zijn met de eigen populatie. Daarbij werden volgende zoektermen gehanteerd: prevalence, heriditary thrombophilia, MTHFR, dutch population, geographic distribution. Uiteindelijk kozen we voor het volgende artikel: DE LAU L.M.L. et al.: Methylenetetrahydrofolate reductase C677T genotype and

PD.

American

Neurological

Association,

2005, 57,

927-930.

De

17


prevalentiecijfers van factor II en factor V Leiden komen uit twee artikels die ons werden aangeraden door Prof. Dr. S. Middeldorp van de Universiteit van Leiden, respectievelijk: ROSENDAAL F.R. et al.: Geographic Distribution of the 20210G to A Prothrombin Variant. Thromb Haemost, 1998, 79, 706-708. Rees D.C et al. en REES D.C. et al.: World distribution of factor V Leiden. The Lancet, 1995, 346, 1133-1134.

6. Variabelen Volgende variabelen werden in de studiedatabase opgenomen : •

Geboortedatum;

•

Datum van de eerste en laatste ART poging;

•

Datum trombofiliescreening;

•

Jaartal sinds wanneer kinderwens;

•

Leeftijd op het moment van trombofiliescreening (berekend uit datum trombofiliscreening en geboortedatum moeder);

•

Duur van infertiliteit (berekend uit het jaar van de kinderwens en datum trombofiliescreening);

•

Aard van de trombofilie-afwijking;

•

Karyotype;

•

Anticoagulantiagebruik;

•

Onstaan van zwangerschap na RIF-batterij;

•

Indicatie of oorzaak infertiliteit;

•

Graviditeit, Pariteit, Extra-Uterine Graviditeit en Abortus;

•

Tabakusus;

•

Ethniciteit;

•

Lengte en gewicht, waaruit ook de Body Mass Index of BMI werd berekend.

18


Ter beschrijving van de cycli werden volgende variabelen ingevoerd: •

Methode van ART;

•

Totaal aantal cycli en totaal aantal mislukte cycli;

•

Totaal aantal getransfereerde embryo’s;

•

Morfologische karkateristieken van de getransfereerde embryo’s (gebaseerd op de richtlijnen van Laverge et al., 2001).

7. Statistiek De statische analyse werd gedaan aan de hand van Fisher Exact testen. Alle testen waren tweezijdig. Een P-waarde kleiner dan 0.05 werd als significant weerhouden. Alle berekeningen werden uitgevoerd dankzij het statistisch verwerkingspakket SPSS. Voor deze masterproef maakten we gebruik van de 17de versie.

8. Trombofiliescreeningsonderzoeken Volledigheidshalve vermelden wij kort op welke manier het onderzoek naar genetische trombofilieën verloopt. Factor V Leiden en APC resistentie. Hiervoor gebruikt men een polymerasekettingreactie beter gekend als PCR. De PCR is een moleculair biologische techniek waarbij een stukje genetisch materiaal exponentieel wordt geamplifieerd. De techniek steunt op het toevoegen van een polymerase-enzym aan enkelstrengig DNA of mRNA. Dit enzym is in staat om de complementaire streng te vormen uit losse trinucleotiden. Dankzij het gebruik van ‘primers’ werkt het polymerase enkel op sterk afgebakende stukken DNA in. Om het proces meermaals te kunnen laten verlopen wordt de oplossing cyclisch verhit waardoor de dubbelstrengige helices weer uit elkaar vallen, en het proces opnieuw kan beginnen. Het onderscheid tussen normale en gemuteerde genen kan gemaakt worden door het toevoegen van digestieve 19


enzymes. Dit soort enzymes is in staat om genetisch materiaal te klieven, op voorwaarde dat hiervoor het juiste signaal gevonden wordt. Het signaal is niets anders dan een bepaalde opeenvolging van baseparen. Om de Factor V Leiden mutatie aan te tonen voegt men het MnlI enzym toe aan de PCR reactie. Daarna worden de fragmenten gescheiden op een 3% agarosegel. Het Factor V gen bestaat normaal uit 267 baseparen. Na toevoeging van MnlI worden drie fragmenten gevormd (van 163, 67 en 37 bp). In aanwezigheid van de Factor V Leiden muatatie worden slechts twee delen gevormd (van 67 en 200 bp). Protrombine gen mutatie. De opsporing van deze puntmutatie (20210G>A) in het gen voor Factor II gebeurt op volledig analoge wijze. Enkel het digestief enzyme verschilt. Voor deze mutatie gebruikt men het HindIII enzym. Een normaal Factor II gen bestaat uit 345 baseparen en wordt na toevoeging van HindIII niet gesplitst. Indien toch een splitsing plaatsvindt (in twee fragmenten van 322 en 23bp), wijst dit op de aanwezigheid van de mutatie. MTHFR gen mutatie. De moleculair genetische test gebruikt om deze puntmutatie (677C>T) op te sporen is op zijn beurt ook weer volledig gelijkaardig aan deze voor FVL en FII. Het gebruikte enzyme is in dit geval HinfI. Het normaal MTHFR-gen bestaat uit 198 baseparen en wordt niet gesplitst na toediening van HinfI. Het gemuteerde MTHFR-gen daarentegen wordt door HinfI gesplitst in twee fragmenten (van 175 en 23bp) (UZ Gent, Centrum Medische Genetica, laboratorium voor moleculaire biologie, 2006).

20


Resultaten

1. Beschrijving van de studiepopulatie

1.1. Leeftijd Op het moment van het trombofilie-onderzoek (RIF-batterij) is de gemiddelde leeftijd van onze patiëntes 33,2 jaar, met een spreiding van 26 tot 43 jaar (Standaard Deviatie of SD=3.860).

1.2. Ethniciteit Wat betreft de ethniciteit tellen we 247 (92,9%) patiëntes van Caucasisch origine, 14 (5,3%) van Turkse/Arabische oorsprong en 4 (1,5%) van Aziatisch origine.

1.3. Duur van de infertiliteit De gemiddelde duur van infertiliteit, in dit onderzoek uitgedrukt als de tijd tussen het jaar waarin voor het eerst een kinderwens aanwezig is en het uitvoeren van de RIF-batterij, bedraagt 5 jaar. De spreiding ligt tussen 1 en 17 jaar (SD=2.329).

1.4. Totaal aantal verse IVF/ICSI-cycli en totaal aantal mislukte IVF/ICSI-cycli Het totaal aantal verse (m.a.w geen cryo) IVF/ICSI-cycli is gemiddeld 5,3 (min. 3, max. 16, SD=3.674). Het totaal aantal mislukte verse IVF/ICSI-cycli bedraagt gemiddeld 4,82 (min. 3, max. 14, SD=3.048).

1.5. Oorzaak van infertiliteit en type infertiliteit In 44,4% van gevallen gaat het om een infertiliteit op basis van een mannelijke factor, in 22,2% gaat het om een vrouwelijke factor, in 18,8% om een mannelijke en vrouwelijke

21


gecombineerde factor en in 13,9% van de gevallen kan geen duidelijke oorzaak weerhouden worden. Deze categorie wordt “onverklaarbaar” of “onverklaarde infertiliteit” genoemd. Voor het bepalen van het type infertiliteit werd een nieuwe variabele aangemaakt bestaande uit de categorieën primaire en secundaire infertiliteit. Primaire infertiliteit houdt in dat de patiëntes in hun voorgeschiedenis geen zwangerschap meegemaakt hebben. Bijna de helft (46,4%) van de studiepopulatie valt in deze categorie.

1.6. Aangewende reproductiemethodes De aangewende reproductiemethodes zijn uitsluitend IVF in 11,7% van de patiënten, uitsluitend ICSI in 59,4% en beide technieken in 28,9% van de gevallen.

2. Onderzoeksvragen

2.1. Prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen (MTHFR, Factor V Leiden, Factor II mutatie) – bestaat er een significant verschil in prevalentie ten opzichte van de controlepopulaties? Bij 124 patiëntes (46,6%) kan geen genetische trombofilie worden vastgesteld. Rekening houdend met het gecombineerd voorkomen van trombofilieën, wordt bij 98 patiëntes (36,8%) de heterozygote MTHFR mutatie teruggevonden. Slechts 31 patiëntes dragen de mutatie in de homozygote vorm (11,7%). Heterozygote factor II mutaties worden in totaal bij 13 patiëntes (4,8%) vastgesteld,

de homozygote factor II

mutatie wordt maar eenmalig (0,4%)

gediagnosticeerd. Negen patiëntes (3,4%) dragen de factor V Leiden mutatie in de heterozygote vorm. De homozygote vorm bleek niet aanwezig in onze populatie (Tabel 1).

22


▼Tabel 1. Prevalentie van de genetische trombofilie-afwijkingen binnen de studiepopulatie Prevalentie Trombofilie

Frequentie

Percent

Geen Mutatie

124

46,6

MTHFR hetero

91

34,2

MTHFR homo

28

10,5

II hetero

9

3,4

V hetero

4

1,5

MTHFR hetero / II hetero

3

1,1

MTHFR hetero / V hetero

3

1,1

MTHFR homo / II hetero

1

,4

MTHFR homo / V hetero

2

,8

MTHFR hetero / II homo

1

,4

Subtotaal trombofilie

51

19,2

Totaal

266

100

Van de 266 patiëntes hebben er in totaal 51 (19,2%) een afwijking in de trombofiliegenen (waarbij de heterozygote MTHFR mutatie als “klinisch normaal” wordt beschouwd). De factor V Leiden mutatie komt in 3,4% van de studiepopulatie voor. In de controlepopulatie is de prevalentie 9,7%. Het verschil is significant (P=0.013). Het percentage heterozygote factor II mutaties is 4,8% in vergelijking met de controlewaarde van 1,6%. Dit verschil blijkt statistisch significant te zijn (P=0.01). De aanwezigheid van één geval van homozygositeit voor factor II ofwel 0,4% van de patiëntes blijkt niet significant hoger te zijn dan de afwezigheid van deze mutatie in de controlepopulatie (P=0.088). Het relatieve aantal MTHFR heterozygote mutaties is lager dan in de controleprevalentie, respectievelijk 36,8% en 44,8%. Ook hier vinden we significantie (P=0.012). Met een prevalentie van 11,7% was het aantal MTHFR homozygoten nauwelijks hoger dan in de controlepopulatie waar we een prevalentie zien van 10,2%. Ook hier bekomt men geen significantie (P=0.469). Alle hypothesetesten werden uitgevoerd door middel van Fisher Exact testen (Figuur 3).

Bijvraag: Prevalentie van gecombineerde genetische trombofilie-afwijkingen en vergelijking met de controlepopulaties. Om deze vraag te beantwoorden werd telkens de prevalentie van de gecombineerde genetische trombofilie-afwijking in de studiepopulatie vergeleken met de geschatte prevalentie binnen 23


onze studiepopulatie. Deze geschatte prevalentie werd berekend vanuit de afzonderlijke prevalenties van de genetische afwijkingen.

•

MTHFR hetero/Factor II hetero: een geschatte prevalentie van 1,7% ten opzichte van een werkelijke prevalentie van 1,1%.

•

MTHFR hetero/FV hetero: een geschatte prevalentie van 1,2% ten opzichte van een werkelijke prevalentie van 1,1%.

•

MTHFR homo/FII hetero: een geschatte prevalentie van 0,5% ten opzichte van een werkelijke prevalentie van 0,4%.

•

MTHFR homo/FV hetero: een geschatte prevalentie van 0,3% ten opzichte van een werkelijke prevalentie van 0,8%.

•

MTHFR hetero/FII homo: een geschatte prevalentie van 0,1% ten opzichte van een werkelijke prevalentie van 0,4%.

Vervolgens vergeleken we de werkelijke prevalenties binnen onze studiepopulatie met de geschatte prevalenties gebaseerd op de afzonderlijke prevalenties van de genetische afwijkingen in de controlepopulatie.

•

MTHFRhetero/FactorIIhetero: de geschatte prevalentie volgens de controlepopulaties bedraagt 0,7% ten opzichte van een werkelijke prevalentie binnen onze studiegroep van 1,1%.

•

MTHFRhetero/FVhetero: de geschatte prevalentie volgens de controlepopulaties bedraagt 4,3% ten opzichte van een werkelijke prevalentie binnen onze studiegroep van 1,1%.

•

MTHFRhomo/FIIhetero: de geschatte prevalentie volgens de controlepopulaties bedraagt 1,6% ten opzichte van een werkelijke prevalentie binnen onze studiegroep van 0,4%.

•

MTHFRhomo/FVhetero: de geschatte prevalentie volgens de controlepopulaties bedraagt 0,9% ten opzichte van een werkelijke prevalentie binnen onze studiegroep van 0,8%.

•

MTHFRhetero/FIIhomo: de geschatte prevalentie volgens de controlepopulaties bedraagt 0,4% (hierbij werd voor Factor II homozygoot gerekend met een prevalentie van 1/10000) en is daarmee gelijk aan de werkelijke prevalentie binnen onze studiepopulatie.

24


2.2. Bestaat er een verschil in prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen in bepaalde subgroepen van de studiepopulatie? Teneinde een overzichtelijke vergelijking te kunnen maken tussen de verschillende subgroepen hanteren we indeling “normaal” en “trombofilie”. De heterozygote vorm van de MTHFR mutatie behoort tot de eerste groep aangezien deze geen etiologische rol zou spelen in trombotische aandoeningen (Kupferminc et al., 1999). Vanwege de significant hogere prevalentie van de heterozygote factor II mutatie onderzoeken we diens verdeling over de subgroepen telkens ook afzonderlijk.

2.2.1. Subgroepen volgens leeftijd Van de 264 vrouwen waarvan de leeftijd gekend is, waren er 70 van 30 jaar of jonger op het moment van de trombofilietest. Van die 70 vrouwen hadden er 13 (18,6%) trombofilie. Er waren 117 vrouwen ouder dan 30 jaar maar jonger dan 36 jaar. Van hen waren er 17 (14,5%) met trombofilie. Tot slot bevatte onze dataset 77 vrouwen met een leeftijd van 36 jaar of hoger. Twintig (26%) van hen hadden trombofilie. Het verschil was niet significant (P=0.146). Dezelfde berekeningen werden afzonderlijk gemaakt voor factor II 20210G>A. In de eerste categorie vinden we 8,6% trombofilie, in de tweede categorie 0,9% trombofilie en in de derde categorie 7,8% trombofilie. Hoewel het in absolute getallen maar om 13 patiënten gaat, bleek het verschil significant te zijn (P=0.011).

2.2.2. Subgroepen volgens indicatie voor infertiliteitsbehandeling Hierbij werden volgende twee deelgroepen met elkaar vergeleken: •

Vrouwelijke en/of mannelijke factor aantoonbaar;

•

Onverklaarbare infertiliteit.

Van de 37 patiëntes met een onverklaarbare infertiliteit waren er 7 met trombofilie (18,9%), tegenover 42 van de 227 patiëntes met mannelijke en/of vrouwelijke oorzakelijke factor (18,5%). Dit maakt dat er geen (significant) verschil bestaat voor het verschil in prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen tussen deze twee deelgroepen (P=1.000).

25


Dezelfde berekeningen werden afzonderlijk voor de heterozygote factor II 20210G>A mutatie uitgevoerd. In de categorie van onverklaarbare infertiliteit werden geen factor II mutaties terugvonden. In de categorie van mannelijke en/of vrouwelijke infertiliteit vinden we 5,5% factor II mutaties. Het is verschil is niet significant (P=0.220).

2.2.3. Subgroepen volgens BMI We verdelen de waarden voor de Body Mass Index van onze patiëntes in vier categorieën. De eerste categorie bevat de patiëntes met een BMI-waarde kleiner dan 20. Van de 42 patiëntes uit de categorie hebben er 7 (16,7%) trombofilie. De volgende categorie bevat de patiëntes met een BMI-waarde tussen 20 en 25, deze bevat 101 vrouwen. Hiervan hebben er 22 (21,8%) trombofilie. In de categorie van patiëntes met een BMI tussen de 25 en 30 tellen we 32 vrouwen. Hiervan hebben er 6 (18,8%) trombofilie. Tenslotte zien we in de laatste categorie de patiëntes met een BMI hoger dan 30. Deze bevat 18 patiëntes waarvan er 5 (27,8%) positief testen voor trombofilie. Het verschil in prevalentie tussen de verschillende subgroepen blijkt niet significant (P=0.774). We maken dezelfde berekeningen voor de heterozygote factor II mutatie. Van lage naar hoge BMI categoriën vinden we respectievelijk 4,8%, 4,0%, 6,3% en 5,6% factor II mutaties. Er is geen significantie (P=0.873).

2.2.4. Subgroepen volgens tabakusus De tabakusus werd voor de volledigheid in drie categorieën ingedeeld: •

Patiëntes die nooit gerookt hebben;

•

Patiëntes die nog steeds roken;

•

Patiëntes

die

ooit

gerookt

hebben

maar

onbepaalde

tijd

voor

de

vruchtbaarheidsbehandelingen gestopt zijn. Van de 266 vrouwen in onze studiepopulatie is bij 251 de tabakusus gekend. Hondertweeënzeventig van hen heeft nooit gerookt en daarvan hebben er 36 (20,9%) trombofilie. Drieënveertig patiëntes rookten op het moment van de behandeling nog. Van hen hebben er

6 (14,0%) trombofilie. Tenslotte zijn er 36 patiëntes voor de start van de

26


vruchtbaarheidsbehandelingen gestopt waren met roken. Deze laatste categorie telt 31 vrouwen waarvan 5 (13,9%) met trombofilie. Bij het uitvoeren van de hypothesetest bleek er geen significant verschil te bestaan voor de trombofiliestatus tussen vrouwen die gerookt hebben, nog roken of nooit gerookt hebben (P=0.513). We maakten dezelfde berekening voor het verschil tussen de vrouwen die nooit gerookt hadden en zij die rookten of gerookt hadden. Het verschil was hier duidelijk groter, maar nog steeds niet significant (P=0.207). We deden hetzelfde voor de heterozygote factor II mutatie. We vonden hierbij dat 4,7% van de niet-rooksters, 7,0% van de rooksters en 2,8% van de patiëntes die gestopt waren met roken positief testten voor de factor II mutatie. De verschillen waren niet significant (P=0.659).

2.2.5. Subgroepen volgens duur van de infertiliteit De duur van de infertiliteit werd ingedeeld in drie categorieën. Alle infertiliteitsperiodes van minder dan twee jaar vormen de eerste categorie. Van die 26 patiëntes hadden er 4 (15,4%) trombofilie. De tweede categorie omvat de periodes van infertiliteit die tussen de twee en de vijf jaar duren. Van de 150 patiëntes in deze groep hadden er 27 (18,0%) trombofilie. Tenslotte worden alle periodes van infertiliteit die langer duren dan vijf jaar samen genomen in de laatste categorie. Deze telt 83 patiëntes waarvan er 18 (21,7%) trombofilie hebben. De Fisher Exact test toont hierbij aan dat het verschil niet significant is (P=0.728). Indien we de verdeling herbekijken voor de heterozygote factor II mutatie vinden in dezelfde categoriën als hierboven respectievelijk 7,7%, 3,3% en 7,2% trombofilie. Er is geen significantie (P=0.284).

2.2.6. Subgroepen volgens morfologie van de embryo’s Drie patiëntes van de 266 kennen een slechte embryokwaliteit, zij hebben alle 3 een normaal genotype voor trombofilie. Van de 92 patiëntes met een matige embryokwaliteit hebben er 18 (19,6%) trombofilie, tegenover 29 van de 156 patiëntes met een goede embryokwaliteit (18,6%). Het verschil is niet significant (P=0.868).

27


Wanneer we de prevalentie van factor II bekijken, zien we van slechte naar goede kwaliteit: 0%, 4,3% en 5,1% trombofilie. De aantallen zijn te klein om een significante correlatie aan te tonen.

2.2.7. Subgroepen volgens graviditeit en pariteit Zoals reeds hoger vernoemd lijden 122 (46,4%) van de patiëntes in onze studiepopulatie aan de primaire vorm van infertiliteit. Van hen zijn er 20 (16,4%) met trombofilie. Van de 141 vrouwen met een secundaire vorm van infertiliteit daarentegen zijn er 31 (22%) met trombofilie. Dit verschil wordt echter niet significant bevonden (P=0.277). Voor wat betreft factor II geldt dat 4,9% van diegene met primaire en 5% van diegene met secundaire infertiliteit een heterozygote mutatie hebben (P=1.000). Van de 141 vrouwen met secundaire infertiliteit zijn er precies 50% die minstens een partus in de voorgeschiedenis hebben. Achttien (26,1%) van hen hebben trombofilie tegenover 17,2% van de vrouwen die geen partus in de voorgeschiedenis hebben. Dit verschil is niet significant (P=0.115). Voor factor II geldt dat 2,9% van de vrouwen met een voorgeschiedenis van partus een heterozygote mutatie heeft tegenover 5,7% van de vrouwen zonder voorgeschiedenis van partus. Dit maakt opnieuw een niet-significant verschil (P=0.524).

2.2.8. Hoeveel vrouwen uit de studiepopulatie met een genetische trombofilie-afwijking werden behandeld met aspirine – welk percentage van de studiepopulatie werd zwanger na toediening van aspirine? Van de 51 vrouwen binnen onze studiepopulatie waarbij een genetische trombofilie-afwijking werd ontdekt, kregen er uiteindelijk 33 (64,7%) anticoagulantia toegediend. Daarnaast namen 3 vrouwen sinds onbepaalde tijd anticoagulantia. Zeven van de 51 ondernamen na de trombofiliescreening geen volgende IVF/ICSI-poging meer, dus kunnen wij daar bijgevolg geen uitspraak doen over het anticoagulantiagebruik. Tenslotte waren er 4 (7,8%) trombofiliepositieve vrouwen binnen onze studiepopulatie die ondanks verdere IVF/ICSIpogingen volgend op de trombofiliescreening geen anticoagulantiabehandeling kregen. De reden voor deze laatste vaststelling konden wij niet terugvinden in de desbetreffende dossiers.

28


Van 4 van de 51 vrouwen met genetische trombofilie-afwijkingen was geen informatie terug te vinden over het anticoagulantiagebruik. Van de 33 vrouwen die uiteindelijk anticoagulantia toegediend kregen bij IVF/ICSI-pogingen volgend op een positieve trombofiliescreening, werden er 20 (60,6%) niet meer zwanger binnen het tijdsbestek van dit onderzoek. Van de overige 13 werden er 8 (24,3%) zwanger reeds bij de eerste IVF/ICSI-poging na trombofiliescreening, 3 (9,1%) bij de tweede en 2 (6,1%) bij de derde poging na trombofiliescreening. Van de 3 vrouwen met een abnormale genetische trombofilie-status die volgens het dossier sinds onbepaalde tijd anticoagulantia gebruikten, werd er uiteindelijk één zwanger bij de zesde IVF/ICSI-poging volgend op de trombofiliescreening. Een van de drie ondernam geen verdere IVF/ICSI-pogingen meer na het uitvoeren van de trombofilietest en de derde werd tot op heden niet zwanger. Van de 4 patiëntes die volgens het dossier geen anticoagulantie toegediend kregen naar aanleiding van een genetische trombofilie-afwijking werd één spontaan zwanger na de trombofiliescreening en bleven de verdere IVF/ICSI-pogingen van de andere drie tot op heden vruchteloos. Gezien de heterozygote factor II mutatie de enige is die een significant verschillende prevalentie kent ten opzichte van de controlepopulatie, doen wij bovenstaande berekeningen opnieuw voor deze mutatie afzonderlijk. Daaruit blijkt dat van de 9 (11,1%) patiëntes met een heterozygote factor II mutatie er 5 (55,6%) een behandeling met anticoagulantia krijgen en één volgens het dossier geen anticoagulatia toegediend krijgt na de positieve trombofiliescreening. Daarnaast zijn er 2 (22,2%) van de 9 patiëntes die geen verdere IVF/ICSI-pogingen meer ondernamen na de trombofilietest en is er een patiënte (11,1%) die volgens het dossier reeds sinds onbepaalde tijd anticoagulantia gebruikt. Van de 5 patiëntes die factor II heterozygoot positief zijn en naar aanleiding daarvan anticoagulantia gebruiken, werd er een zwanger in de tweede poging volgend op de RIF-batterij, terwijl de andere 4 tot op heden niet zwanger werden. De patiënte die factor II heterozygoot is en volgens het dossier sinds onbepaalde tijd anticoagulantia gebruikt, ondernam na de trombofiliescreening geen verdere IVF/ICSIpogingen meer. De patiënte die volgens het dossier geen anticoagulantie-behandeling kreeg na bekendmaking van de factor II heterozygote status werd tot op heden niet zwanger bij verdere IVF/ICSI-pogingen.

29


2.2.9. Komen miskramen significant meer voor bij patiëntes met een afwijking in de trombofiliegenen? Van de 51 vrouwen met trombofilie hebben er 18 (35,2%) een miskraam in de voorgeschiedenis. Van de 212 vrouwen zonder trombofilie hebben er 64 (30,1%) een miskraam in de voorgeschiedenis. Er is geen significantie (P=0.630).

30


Discussie

1. Op welke manier zou genetische trombofilie de implantatie kunnen beïnvloeden? Er heerst nog steeds controverse over het oorzakelijk verband tussen genetische trombofilieafwijkingen en het onverklaard herhaald falen van IVF/ICSI-behandelingen. In theorie maakt men hierbij het onderscheid tussen implantatiefalen en een biochemische zwangerschappen. In het geval van implantatiefalen kan men na de embryotransfer geen hCG verhoging waarnemen. In het geval van een biochemische zwangerschap ziet men aanvankelijk wel een hCG stijging maar kan twee weken later op echo geen vrucht gevonden worden. Er is met andere woorden sprake van een zeer vroegtijdig miskraam. In de praktijk gaat men er van uit dat een grote overlap bestaat in de etiologie van beide gevallen. In de literatuur vindt men uiteenlopende theoriën over de wijze waarop genetische trombofilieën een effect kunnen hebben op implantatie en op vroege miskramen. De bevindingen van Rey et al. (2003) ondersteunen de hypothese van Kupferminc et al. (1999) dat tromboses in de intervilleuze ruimtes ter hoogte van de implantatieplaats een mogelijk verklarend mechanisme zijn voor herhaald implantatiefalen in het eerste semester van de zwangerschap (Figuur 2). Een andere theorie is dat dergelijke tromboses de invasie van maternele vaten door syncythiotrophoblasten verstoren (Azem et al. 2004 en Simur et al. 2009). Een bedenking bij deze theoriën is dat de intervilleuze ruimtes pas op 11 à 12 weken zwangerschap ontstaan. Trombose kan dan ook moeilijk als unieke oorzaak aanzien worden. De rol van MTHFR wordt door sommige auteurs gesitueerd in het kader van gestegen maternele homocysteïne plasmaspiegels die op hun beurt geassocieerd worden aan toegenomen DNA-methylatie en een gewijzigde genexpressie. Deze cascade zou dan uiteindelijk leiden tot inefficiënte vascularisatie van de intervilleuze ruimtes (Qublan et al., 2006). Experimenten op muizen tonen aan dat foetaal overlijden kan veroorzaakt worden door activatie van de bloedstolling ter hoogte van de foeto-maternele interface. Geactiveerde coagulatiefactoren zouden er apoptosis induceren en de groei van de trofoblastcellen inhiberen (Middeldorp, 2005). Margalioth et al. (2006) argumenteren dat een combinatie van genetische trombofilie met een andere, al dan

31


niet gekende, oorzaak van verminderde endometriale receptiviteit (zoals een dun endometrium,

een

afwijkende

uteriene

caviteit,

een

veranderde

expressie

van

adhesiemolecules en immunologische factoren ) het effect van de mutatie versterken. Een laatste bedenking is dat het gaat om genetische (en dus overerfbare) aandoeningen. Dit wil zeggen dat mogelijks ook voor foetale trombofilie een rol is weggelegd. Hierover is nog weinig geweten. Bovendien hebben trombogene genen mogelijks ook andere functies, die al dan niet rechtstreeks belang hebben voor de implantatie.

▲Figuur 2. Illustratie van de placentaire bloedvaten zoals ze zich voordoen na de 12de zwangerschapsweek. (Bron: http://www.med.umich.edu, 30 april 2009) Anderzijds suggereren verschillende auteurs (o.a. Gopel et al., 2002) in onafhankelijke onderzoeken zelfs een verbeterde implantatie ten gevolge van de Leiden mutatie. In 1994 werd deze hypothese reeds voorgesteld door Majerus (1994). De mutatie biedt hiermee naast het verlaagde risico op postpartum bloedingen (Lindqvist and Dahlbäck, 2008) een bijkomend 32


evolutionair voordeel. Beide argumenten vormen een plausibele verklaring voor de globale verspreiding en prevalentie van genetische trombofilieën. Het is duidelijk dat de concrete mechanismen buiten het bereik van deze masterproef vallen. Fundamenteel onderzoek zal aan het licht brengen op welke wijze genetische trombofilieën een effect hebben op implantatie(falen) en vroegtijdig miskraam. Dit uiteraard, op voorwaarde dat genoeg bewijsmateriaal voor handen is om een dergelijk oorzakelijk verband te doen vermoeden.

2. Bestaan er verschillen in prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen tussen de studieen controlepopulatie? Bij een α van 0.05 vinden we een significant hogere prevalentie voor de heterozygote factor II 20210G>A mutatie in de studiepopulatie. De factor V Leiden en de heterozygote MTHFR 677C>T mutaties komen in onze studiepopulatie significant minder voor. Voor de overige mutaties kon geen significant verschil opgemerkt worden (Figuur 3). Men is geneigd hieruit af te leiden dat de factor II 20210G>A mutatie mogelijks een oorzakelijke rol speelt in het herhaald falen van IVF/ICSI pogingen. Grandone and Cappuccini (2001) zijn, voor zover wij in de literatuur konden terugvinden, de enigen die dit reeds eerder suggereerden. Al zijn zij er, net als Qublan et al. (2006), van overtuigd dat de factor V Leiden mutatie de hoofdrolspeler is binnen dit mechanisme. Onze bevindingen in verband met factor V Leiden liggen niet in deze lijn. De betekenis van de lagere prevalentie van factor V Leiden die wij terugvonden in de studiepopulatie is mogelijks wel te verklaren aan de hand van de reeds aangehaalde theorie van Majerus (1994). Het is waarschijnlijk dat de zeer zeldzame homozygote factor II 20210G>A mutatie ook significant hoger voorkomt in een populatie van vrouwen met drie of meer gefaalde IVF/ICSI pogingen. Door de relatief kleine sample size konden we dit jammer genoeg niet beschrijven. De oorzaak van de hogere prevalentie van heterozygote MTHFR mutaties in de studiepopulatie blijft een raadsel. Het is algemeen aanvaard dat deze mutatie in heterozygote 33


vorm geen fenotypische uiting kent. Waarom we dan toch een significant hogere prevalentie terugvinden in onze studiepopulatie is onduidelijk. Een eerste hypothese is dat door gebrek aan een eigen controlepopulatie een artificieel significant verschil werd gecreeërd. Met twee argumenten menen we deze veronderstelling te kunnen verwerpen. Ten eerste is het geweten dat de MTHFR mutatie minder ethnische variatie kent dan andere genetische trombofilieën. Ten tweede gebruikten we ter vergelijking een controlegroep van 5920 Rotterdamse inwoners. En kunnen we er, dankzij de geografische nabijheid, van uitgaan dat de ethnische variatie minimaal is. De tweede hypothese is dat een sampling error is opgetreden. Dit zou evenwel betekenen dat alle andere resultaten met grote voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd.

▲Figuur 3. Vergelijking van de prevalenties van de genetische trombofilie-afwijkingen tussen studieen controlepopulatie.

34


3. Analyse van de subgroepprevalenties Voor de subgroepanalyse werd zowel gewerkt met het cumulatieve totaal aantal trombofilieën als met de afzonderlijke heterozygote factor II 20210G>A prevalentie. Enkel wanneer een verschillend resultaat werd bekomen voor deze laatste factor, zal dit besproken worden.

3.1. Leeftijd Het is wetenschappelijk bewezen dat de vruchtbaarheid omgekeerd evenredig is met de leeftijd. De redenen waarom leeftijd infertiliteit ongunstig beïnvloedt zijn volgens Fitzgerald et al. (1998): •

Leeftijd gerelateerde veranderingen in het ovarium : -

De oöcyten, die reeds van bij de geboorte in het ovarium aanwezig zijn, boeken verlies op kwantitatief en kwalitatief vlak.

-

Het ovarium krijgt het met de oplopende leeftijd moeilijker om zijn normale functie binnen de neuroendocriene as te handhaven.

•

De functie van de baarmoeder wordt aangetast door de leeftijd. Het endometrium verliest zijn mogelijkheden om de implantatie en de groei van het embryo te ondersteunen. Dit is het gevolg van veranderingen in de uteriene doorbloeding en veranderingen in de hormoonafhankelijke ontwikkeling van het endometrium.

•

Met stijgende leeftijd wordt het risico op ontwikkelen van medische, gynaecologische of obstetrische complicaties groter.

Volgens Fitzgerald et al. (1998) daalt de spontane cumulatieve zwangerschapsratio bij vrouwen tussen de 31 en 35 jaar. Een derde van de vrouwen tussen de 35 en 39 jaar zou moeilijkheden ondervinden om zwanger te worden ten opzichte van de helft van de vrouwen tussen de 40 en 44 jaar. Minder dan 55% van de vrouwen boven de 40 jaar worden zwanger na een jaar versus 75% van de vrouwen onder de 30 jaar. Dit laatste gegeven is van belang wanneer men de definitie van infertiliteit in acht neemt.

35


Het valt daarom te beargumenteren dat we eerder bij de jongere dan bij de oudere vrouwen een hoger percentage trombofilie zouden vinden. We redeneren hierbij dat in de oudere populatie vooral de gekende factor leeftijd een rol speelt in de etiologie van subfertiliteit en niet zozeer de minder gekende trombofilie. Dit vermoeden konden we echter niet staven aan de hand van de cijfers uit onze studiepopulatie. Opvallend is wel dat zowel voor het cumulatief percentage aan trombofilieën als voor de prevalentie van de heterozygote factor II de laagste prevalentie werd gevonden in de middenste leeftijdscategorie (tussen 30 en 36 jaar). Voor factor II was dit verschil zelfs significant (P=0.011). Een verklarende hypothese voor dit verschijnsel ontbreekt. Idealiter zou men kunnen nagaan of het U-vormig verloop van de curve, zoals ze zich nu voordoet, behouden blijft wanneer er nauwere leeftijdscategorieën gehanteerd worden. Daartoe bevat onze studiepopulatie echter te weinig patiënten (Figuur 4).

Leeftijd en trombofilie

30 25 20 Prevalentie 15

Totaal Trombofilie Factor II hetero

10 5 0 <30j

>30j<36j

>36j

Leeftijd

▲Figuur 4. Illustratie van de prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen in de verschillende leeftijdscategorieën.

3.2. Oorzaak van infertiliteit Indien we aannemen dat de oorzaken van infertiliteit in de groep van de “verklaarde infertiliteit” de infertiliteit volledig verklaren, zou men verwachten dat in deze groep de prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen lager zou zijn. Anderzijds zien we dat in

36


de meerderheid van de gevallen een behandeling werd ingesteld om de gekende factoren op te heffen of te omzeilen. De cijfers uit onze studiepopulatie wijzen op een niet-significant verschil tussen de subpopulaties met mannelijke en/of vrouwelijke infertiliteit en onverklaarbare infertiliteit.

3.3. Body Mass Index Een recente studie van Bellver et al. (2009) bekeek de embryokwaliteit en reproductieve outcome (implantatie, zwangerschap, miskraam en de ratio der levendgeborenen) in functie van de body mass index van vrouwen die een IVF/ICSI-procedure ondergingen. De conclusie van deze studie was dat vrouwelijke obestitas de outcome van de IVF-behandeling negatief beïnvloedt maar dat de embryokwaliteit geen veranderingen ondervindt bij een hogere BMI. Deze bevindingen suggereren dat een gestegen BMI dus vooral een negatieve invloed zou hebben op de uteriene omgeving. Men zou verwachten dat de vrouwen met een hogere BMI-waarde relatief minder genetische trombofilie-afwijkingen vertonen. Opnieuw gaan we hierbij uit van de redenering dat de obesiteit al voldoende is om de gedaalde fertiliteit te verklaren. Dit vermoeden kon niet bevestigd worden aan de hand van de gegevens uit onze studiepopulatie. De verdeling van de trombofilieën over de verschillende categorieën lijkt volledig toevallig.

3.4. Tabakusus Reeds in 1977 werd door Jick et al. bewezen dat roken een negatief effect heeft op de ovaria. De auteurs vonden een significant verschil in menopauzeleeftijd tussen rooksters en nietrooksters. De leeftijd lag bij de zware rooksters duidelijk lager. Soares et al. gingen in 2006 op zoek naar het bewijs voor het feit dat roken ook de uteriene receptiviteit zou aantasten. Dit bewijs werd geleverd aan de hand van een retrospectieve studie waarbij de outcome van eiceldonatie IVF-cycli werd nagegaan in functie van de rookstatus van de acceptorpatiëntes. Met deze theorieën in gedachten, onderzochten we of de veronderstelling dat genetische trombofilie-afwijkingen meer zouden voorkomen bij patiënten met een negatieve rookstatus klopte voor onze studiepopulatie. De cijfers uit onze studiepopulatie konden deze

37


veronderstelling niet bevestigen. Er werd geen significant verschil gevonden in prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen tussen de verschillende categorieën voor tabakusus. Het verschil werd iets groter, doch nog steeds niet significant wanneer we prevalentie vergelijken tussen zij die nooit gerookt hebben en zij die roken of ooit gerookt hebben. Dezelfde conclusies kunnen getrokken worden uit de berekeningen die wij maakten voor de afzonderlijke heterozygote factor II mutatie.

3.5. Duur van de infertiliteit Men verwacht dat een afwijkende genetische trombofilie-status een factor is die kan leiden tot een langere periode van infertiliteit. Deze hypothese wordt niet bevestigd door de gegevens uit onze studiepopulatie. Er is geen significant verschil in prevalentie waarneembaar tussen de verschillende categorieën voor duur van de infertiliteit.

3.6. Morfologie van de getransfereerde embryo’s We voerden een hypothesetest uit om na te gaan of de prevalentie van genetische trombofilieën correleert met de embryomorfologiescore. De aantallen waren echter te klein om een significante correlatie te kunnen aantonen. Bovendien moet met rekening houden met het feit dat hier enkel werd gewerkt met de kwaliteit van de getransfereerde embryo’s en niet met een gemiddelde score voor alle embryo’s die bekomen werden na een in vitro behandeling.

3.7. Graviditeit en pariteit Een andere hypothese was dat vrouwen die ten minste één succesvolle zwangerschap en partus in de voorgeschiedenis hadden, een lagere prevalentie van genetische trombofilie zouden vertonen. De cijfers van onze studiepopulatie konden deze veronderstelling niet bevestigen. Ook voor de indeling naargelang type infertiliteit kan geen significant verschil in trombofilieprevalentie aangetoond worden.

38


4. Wat is de betekenis van de gecombineerde genetische trombofilieafwijkingen die voorkomen in onze studiepopulatie? Prevalentiegegevens over de gecombineerde mutaties die voorkomen in onze studiepopulatie ontbreken in de literatuur. Door middel van kansrekenen konden we de verwachte prevalentie van een gecombineerde mutatie schatten aan de hand van de prevalenties van de afzonderlijke mutaties in de literatuur. Hierbij werden geen noemenswaardige verschillen opgemerkt. Dit doet ons vermoeden dat er voor de gevonden gecombineerde mutaties geen andere verklaring moet gezocht worden dan een puur stochastische. We vergeleken ook de prevalentie van de gecombineerde mutaties in de studiepopulatie met een andere geschatte prevalentie. Hiervoor gebruikten we de prevalenties van de afzonderlijke mutaties binnen onze studiepopulatie. Ook hier werden geen belangrijke verschillen weerhouden. De literatuur suggereert nochtans dat gecombineerde trombofilie-afwijkingen eerder dan geïsoleerde mutaties in trombofiliegenen, een rol zouden spelen in de etiologie van herhaald falen van IVF/ICSI-cycli (Grandone and Cappuccini, 2001; Coulam et al., 2006; Simur et al., 2008). Er bestaat evenwel weinig consensus over wat men in de literatuur verstaat onder ‘gecombineerde trombofilie-afwijkingen’. Reznikoff-Etiévant et al. (2001) suggereren in een onderzoek naar oorzaken van spontane miskramen in de eerste tien weken van de zwangerschap dat een combinatie van dragerschap van een heterozygote factor V Leiden mutatie en factor II 20210G>A een verhoogd risico met zich meebrengt. Of deze redenering kan worden doorgetrokken naar het herhaald falen van IVF/ICSI-pogingen blijft voorlopig een open vraag.

5. Literatuuronderzoek In 2001 publiceren Grandone et al. in Fertility and Sterility een onderzoek naar het verband tussen genetische trombofilie en het falen van IVF. Ze vergeleken 18 vrouwen met drie of meer gefaalde pogingen (groep A) met 24 vrouwen die bij de eerste of tweede IVF poging zwanger werden (groep B) en met 216 vrouwen die spontaan zwanger werden en bevallen

39


zonder complicaties (groep C). De bevinding van de Zuid-Italiaanse onderzoeksgroep was dat FVL en factor II 20210G>A meer voorkwamen in de studiepopulatie dan in beide controles. De prevalenties voor FVL waren in groep A 11,1%, in groep B 0% en in groep C 1,9%. De prevalenties voor de factor II mutatie waren in groep A 16,6%, in groep B 0% en in groep C 4,1%. Door de kleine sample size waren de verschillen evenwel niet significant. De auteurs suggeren toch een rol voor trombofilie in het herhaald falen van implantatie. In 2003 publiceren Martinelli et al. een onderzoekspaper over het verband tussen maternele trombofilie en embryo implantatie. Zij vergeleken 162 patiëntes bij wie na verschillende IVF/ICSI-cycli geen zwangerschap was ontstaan met 234 spontane zwangeren. In hun studiepopulatie vonden ze 5% FVL, 3% heterozygote factor II en 19% homozygote MTHFR mutaties. Bij de controles was de prevalentie van FVL lager (2%), van factor II hoger (6%) en van MTHFR gelijk (20%). De Noord-Italiaanse auteurs concludeerden hieruit dat trombofilie geen rol speelt in het herhaald falen van fertiliteitsbehandelingen. De resultaten van Grandone and Cappuccini (2001) wijzen volgens hen op een bias ten gevolge van te kleine populaties. In 2004 publiceren Azem et al. een artikel in Human Reproduction over trombofilie en herhaald IVF falen. Zij vergeleken 45 vrouwen met een voorgeschiedenis van 4 of meer gefaalde IVF-cycli met twee controlegroepen. De eerste bestaande uit 44 gezonde vrouwen die na een ongecompliceerde zwangerschap bevielen in hun ziekenhuis in Tel Aviv, de tweede bestaande uit 15 die zwanger werden na de eerste IVF-cyclus. Zij vonden voor FVL een prevalentie van 6,7% in groep A, 6,8% in groep B en 0% in groep C. Voor factor II vonden ze 8,9% t.o.v 2,3% en 6,7% respectievelijk. De homozygote vorm van MTHFR was aanwezig in 17,8% in de controlegroep t.o.v 9,1% en 13,3% in de controlegroepen. De auteurs besluiten dat trombofilie wel een rol speelt bij herhaal falen en meer bepaald in de subgroep van de onverklaarde infertiliteit. In 2006 publiceerde de Jordaanse onderzoeksgroep van Qublan op zijn beurt een studie over dit onderwerp. Ook hun studieopzet is sterk gelijkaardig aan de voorgaande. Zij vergeleken 90 vrouwen met een voorgeschiedenis van drie of meer gefaalde pogingen met twee controlepopulaties. Deze bestonden uit vrouwen die succesvol zwanger werden na een eerste IVF poging (B) en uit vrouwen die spontaan zwanger waren geworden (C). De groepen telden respectievelijk 90 en 100 patiëntes. Qublan et al. (2006) vonden een significant hogere prevalentie van homozygote FVL mutaties (4,4%) in de studiegroep tegenover 0% in de controlepopulaties. Verder vonden ze een heterozygote FVL mutatie prevalentie van 11% in

40


de studiegroep t.o.v 1,1% en 2% in groepen B en C. Er was geen significantie. Heterozygote factor II kende een verdeling van 5,6% in de studiegroep en 3,3% en 3% in beide controlegroepen. Voor de homozygote vorm van deze mutatie was dit 1,1% tegenover 1,1% en 0%. Opvallend was ook dat 65% van groep A homozygoot was voor MTHFR in tegenstelling tot 27,3% en 18,2% in de controlegroepen. De auteurs besluiten dat trombofilie een risicofactor is voor herhaald falen van IVF. Ten slotte is er nog het onderzoek van Simur et al. dat in 2008 het licht zag. Deze Turkse studie onderzocht 51 vrouwen met drie of meer gefaalde cycli en vergeleek ze met een gematchte controlegroep van 50 vrouwen met een ongecompliceerde zwangerschap in de voorgeschiedenis. Ze vonden één geval van FVL homozygositeit (1,9%) in de studiegroep. Verder vonden ze in deze groep 19,6% FVL heterozygositeit, nul gevallen van factor II mutaties en 7,8% MTHFR homozygoten. In de controlegroep was dit nul gevallen van FVL homozygositeit, 12% FVL heterozygote mutaties, geen enkele factor II mutatie en 12% homozygote MTHFR mutaties. Voor geen enkel verschil tussen studieen controle werd er significantie bereikt.

▲Figuur 5. Overzicht van de prevalenties van genetische trombofilie-afwijkingen bij studieen controlepopulaties in de meest relevante studies.

41


Zoals ook uit de bovenstaande grafiek is af te leiden, is het moeilijk om uit al deze gegevens een eenduidige lijn te trekken. De resultaten zijn wisselend en divergent.We kunnen hiervoor een aantal redenen opsommen:

•

De meeste studies hebben heel beperkte studiepopulaties. Door kleine samples te kiezen, vergroot de kans op bias sterk.

•

De studies zijn onderling moeilijk of niet te vergelijken vanwege de sterke geografische en ethnische variaties op de mutatieprevalentie.

•

De verschillende studies onderzoeken meestal naast de meest voorkomende genetische trombofilieën (FVL, factor II 20210G>A en MTHFR) ook uiteenlopende mutaties (o.a. protein C, protein S en Antitrombine III) wat het vergelijken van het cumulatief aantal trombogene mutaties bemoeilijkt.

•

In alle bovenstaande studies wordt de heterozygote MTHFR 677C>T mutatie aanzien als een relevante genetische trombofilie-afwijking, terwijl wij er in onze studie van uitgaan dat deze mutatie in heterozygote vorm weinig of geen klinische betekenis heeft. Alle cijfers die in de voorgenoemde studies handelen over het totaal aan genetische trombofiliegen mutaties geven dus een wat vertekend beeld, zeker wanneer men weet dat MTHFR 677C>T veruit de meest voorkomende mutatie is. Wanneer we het echter hebben over significante verschillen zou dit geen probleem mogen opleveren, gezien we er in onze redenering van uit gaan dat de heterozygote MTHFR 677C>T mutatie gelijk verdeeld is over studieen controlegroep.

•

De inclusiecriteria kennen weinig uniformiteit.

42


6. Situering van trombofiliescreening in de context van behandeling van infertiliteit

6.1. Trombofiliescreening en multipel IVF/ICSI-falen Grandone et al. stelden in 2007 voor om een trombofiliescreening uit te voeren na drie gefaalde IVF/ICSI-cycli. Dit protocol vond ook op de Dienst Infertiliteit UZ Gent ingang en dit reeds ongeveer tien jaar geleden. Nochtans kan men in de literatuur geen eenduidige resultaten terugvinden. Aan de hand van de cijfers van ons onderzoek zou men geneigd zijn te stellen dat de screening naar factor V Leiden en de MTHFR 677C>T mutaties niet voordelig is. De factor II 20210G>A mutatie lijkt daarentegen wel interessant. Men mag hierbij niet vergeten dat het om een vrij zeldzame mutatie gaat (1,6% van de bevolking). Daarom dienen we ook rekening te houden met het gezondheidseconomisch aspect. De redenering van associatie van genetische trombofilie met herhaald implantatiefalen kan immers doorgetrokken worden naar een eventuele relatie tussen genetische trombofilie en onverklaarde infertiliteit (Coulam et al., 2009). Indien een trombofiliescreening standaard zou worden toegepast bij alle patiëntes met onverklaarde infertiliteit zorgt dit echter voor een stijging van de basiskost. Omdat niet gekend is welk effect een behandeling op dat moment in de therapie op de outcome zou hebben (zie verder) is het jammer genoeg onmogelijk een number needed to treat (NNT) te berekenen. Het berekenen van een kost per Quality Adjusted Life Year (QALY) is dermate complex dat het buiten de beschouwing van deze masterproef valt. Om zinvol te screenen heeft de World Health Organisation (WHO) in 1968 een aantal criteria opgesteld. Het eerste stelt dat de screening een belangrijk gezondheidsprobleem betreft. Het tweede dat er voor de aandoening een adequate therapie moet bestaan. We merken op dat er nog geen wetenschappelijk bewijs geleverd werd voor een beschermende werking van anticoagulantia bij vrouwen met een genetische trombofiliefactor in de infertiliteitssetting (Dirkx et al., 2009). Men moet zich de vraag stellen of het wel relevant is om naar een aandoening te screenen wanneer nog geen evidentie bestaat voor de behandeling.

43


6.2. Trombofiliescreening en herhaald miskraam Er zijn stemmen die opgaan om de screening vanaf het begin te universaliseren naar alle infertiliteitspatiënten. De redenering is dat het onderzoek niet enkel belangrijk is voor de implantatie maar ook voor het risico op miskraam in de verdere zwangerschap. Daarom lichten we dit onderwerp kort toe. We maken het onderscheid tussen vroege miskramen (voor 10de-12de zwangerschapsweek) en latere miskramen.

Vroege miskramen : Volgens de studie van Reznikoff-Etiévant et al. (2001) komen factor V en prothrombine 20210G>A mutaties meer voor bij vrouwen die een spontaan miskraam hadden voor de tiende zwangerschapsweek.

Latere miskramen : Volgens de studie van Rodger en Middeldorp et al. (2008) bestaat er een associatie tussen erfelijke trombofilieën en placentagemedieerde zwangerschapscomplicaties. Tot op heden kon geen oorzakelijke relatie worden aangetoond. Aan de hand van de Hill criteria voor causaliteit trachtten zij volgende besluiten te trekken : •

Hoewel er vaak vasculaire trombosen gevonden worden bij histologisch onderzoek op de placenta bij late foetale verliezen , is het niet zeker dat placentagemedieerde zwangerschapscomplicaties uitsluitend hieraan te wijten zijn. Zo kunnen inflammatoire mechanismen onafhankelijk van trombose eveneens een mogelijke oorzaak vormen.

•

Er zijn tot nu toe nog geen cohort of case-control studies voorhanden die groot genoeg zijn om een bewijs te leveren voor de biologische gradiënt.

•

Er zijn tot op vandaag geen gerandomiseerde gecontroleerde studies gepubliceerd die bewijzen dat anticoagulantia een voordeel opleveren. Daarom is er volgens deze onderzoekers geen evidentie om routinematig aan alle vrouwen, met of zonder erfelijke trombofilie, laag moleculair gewicht heparine toe te dienen.

Trombofilie wordt dus gezien als slechts een van de mogelijke oorzaken van placentagemedieerde zwangerschapscomplicaties. Het lijkt bovendien onwaarschijnlijk dat een geïsoleerde trombofilie in staat is deze complicaties te veroorzaken.

44


De redenering die de Dienst Medische Genetica van het UZ Gent hanteert kan ingepast worden in bovenstaande bevindingen. De aanbevelingen zijn gebaseerd op de guidelines die Walker et al. in 2001 publiceerden. Er wordt bijgevolg gescreend in de volgende situaties: •

Persoonlijke of familiale voorgeschiedenis van veneuze tromboembolie;

•

Vroege aanvang van en herhaalde pre-eclampsie;

•

Herhaalde foetale groeiretardatie;

•

Herhaald verlies van de zwangerschap of doodgeboorte;

•

Placentale abruptie.

Het verband tussen herhaald miskraam en trombofilie kan bijgevolg niet meteen een argument vormen om een trombofiliescreening standaard aan te bieden bij het begin van de infertiliteitsbehandeling.

7. Wat is de meest geschikte behandeling van genetische trombofilie in de context van infertiliteitsbehandeling?

7.1. Aspirine en heparine Men heeft altijd gedacht dat een lage dosis aspirine interessant was in de context van IVF vanwege

de

anti-inflammatoire,

vasodilaterende

en

plaatjesaggregatie-inhiberende

eigenschappen (Ruopp et al., 2009). Aspirine of acetylsalicylzuur is een inhibitor van het cyclooxygenase-1 enzym. Inhibitie van dit enzym resulteert in een geremde biosynthese van prostaglandines en tromboxane uit arachidonzuur. In de bloedvatwand voorkomt deze enzyminhibitie de synthese van prostacycline. Prostacycline is een vasodilatator met antiaggregantie eigenschappen terwijl tromboxane een vasoconstrictor is die plaatjesaggregatie veroorzaakt (Dirckx et al., 2009). Het inhibitorisch inwerken van aspirine op deze protrombotische en vasoconstrictieve mechanismen zou overwegen en de implantatie van het embryo mogelijks ten goede komen. Deze stelling is gebaseerd op de hypothese die Kuo et al.,

45


in 1997 naar voor bracht, waarin gesteld werd dat aspirine resulteerde in een verbeterde uteriene bloedflow. In het Universitair Ziekenhuis Gent wordt aan de RIF-patiënten met genetische trombofilie gedurende de stimulatie-fase heparine toegediend. Heparine is hier eerste keuze omdat het sneller geklaard wordt dan aspirine. Het bloedingsrisico tijdens de pick-up wordt hierdoor verlaagd. Na de pick-up wordt vervolgens een lage dosis aspirine voorgeschreven eventueel in combinatie met heparine. Bij de MTHFR-genmutaties wordt een combinatie van aspirine en hooggedoseerd foliumzuur toegediend. Gezien de kleine aantallen patiënten in onze studiepopulatie was het niet mogelijk relevante besluiten te vormen met betrekking tot het al dan niet effect hebben van de anticoagulatietherapie. Idealiter zou men een randomised clinical trial (RCT) uitvoeren waarbij men na drie gefaalde IVF/ICSI-pogingen anticoagulantia toedient aan de helft van de vrouwen met genetische trombofilie en placebo aan de andere. Een verschil in cyclus-outcome zou dan indicatief zijn voor een therapeutisch effect van de anticoagulantie en nadelig effect van de mutatie. Het probleem dat zich stelt is dat het aantal vrouwen met een genetische trombofilie laag is, gezien de relatief lage prevalentie van genetische trombofilieën (factor V Leiden, factor II 20210G>A en homozygoot MTHFR 677C>T). Men voorziet al snel een tekort aan patiënten wil men voldoende power bekomen. Bovendien rijst hier ook een ethisch probleem. Weinig of geen vrouwen zullen bereid gevonden worden om in deze studie te stappen, gezien allen liever een behandeling zullen krijgen met mogelijks werkzame anticoagulantia dan met placebo. Het relatief kleine risico op ernstige bijwerkingen van anticoagulantia weegt voor een vrouw met kinderwens in de merendeel van de gevallen niet op tegen het eventuele voordeel dat zij hiervan zou kunnen ondervinden. De vraag stelt zich of men niet beter onmiddellijk op grote schaal aspirine zou voorschrijven aan alle fertiliteitspatiënten. Op die manier zou men ook de trombofiliescreening kunnen omzeilen. Aan de andere kant is het voorschrijven van aspirine niet zonder risico’s. De destructieve effecten op maagmucosa en het verhoogde bloedingsrisico zijn hier de meest voor de hand liggende voorbeelden van. Recent onderzoek aan de Universiteit Gent door Dirckx et

46


al. (2009) besloot dat het toedienen van aspirine aan alle patiënten vanaf het begin van de fertiliteitsbehandelingen geen invloed had op de zwangerschapsratio’s in de eerste noch in de tweede cyclus. De conclusie van deze gerandomiseerde placebo gecontroleerde studie was dat: “gezien het ontbreken van evidentie voor een positief effect van lage dosis aspirine en de bestaande zorgen omtrent de potentiële bijwerkingen ervan, het niet aan te raden is aspirine routinematig voor te schrijven bij IVF/ICSI-behandelingen”.

7.2. Behandeling van hyperhomocysteïnemie Hyperhomocysteïnemie ten gevolge van de MTHFR mutatie kan gemedieerd worden door toediening van vit B6, B12 en foliumzuur (De Stefano et al., 2002).

8. Wat zijn de beperkingen van dit onderzoek?

8.1. Tekortkomingen in de dossiers De data voor dit onderzoek werden gehaald uit de papieren dossiers in de archieven van de Vrouwenkliniek UZ Gent. Gezien dit een tertiair centrum betreft, gaat het vaak om patiëntes die na een falende behandeling in de periferie naar hier zijn doorgestuurd. Dit verklaart waarom er soms gegevens ontbreken uit de obstetrische voorgeschiedenis van de vrouwen. We denken echter dat er geen redenen zijn om aan te nemen dat deze onduidelijke of ontbrekende gegevens de resultaten van deze studie hebben gebiased. Gezien er tot op heden geen evidence based richtlijnen beschikbaar zijn omtrent de screening naar genetische trombofilie bij infertiliteitspatiënten, worden er ook door de verschillende artsen van het UZ Gent soms anders genuanceerde protocollen gehanteerd. Dit maakt dat niet alle vrouwen die het UZ Gent bezochten en drie openeenvolgende mislukte IVF/ICSIpogingen hadden een trombofiliescreening ondergingen. Opnieuw is er geen reden om aan te nemen dat daardoor onze studiepopulatie zou gebiased zijn.

47


8.2. Ontbreken van een controlepopulatie In ideale omstandigheden hadden we voor deze studie een controlepopulatie laten testen op genetische trombofilie. Dit had een gerandomiseerde selectie van de Gentse bevolking kunnen zijn of een gerandomiseerde selectie van patiëntes op de materniteit. Een controlepopulatie bestaande uit vrouwen die zich aanmelden op de Dienst Fertiliteit en nog geen IVF/ICSI pogingen ondergaan hebben, had ook interessant kunnen zijn. Een eigen controlepopulatie laten testen zou het voordeel meegebracht hebben dat zoveel mogelijk bias zou worden vermeden. We denken hier vooral aan ethniciteit en geografische spreiding van de studieen controlepopulatie. Deze werkwijze zou ook toegelaten hebben studieen controlepopulatie te laten testen door hetzelfde laboratorium. Het spreekt voor zich dat een dergelijk studieprotocol heel wat praktische en financiële beslommeringen met zich meebrengt. Voor deze masterproef werd dan ook besloten gebruik te maken van benaderende waarden uit de literatuur.

8.3. Moeilijkheden in verband met ethiniciteit van controle- en studiepopulatie Wat betreft de bepaling van de ethniciteit van de vrouwen uit onze studiepopulatie hadden wij geen andere mogelijkheid dan ons te baseren op de naam. Dit is soms een weinig betrouwbare methode. Het geschatte aantal niet-Caucasische vrouwen in de studiepopulatie bedraagt 6,8%. We menen dat dit geen verstoring van onze resultaten heeft teweeggebracht. Na uitsluiten van de niet-Caucasische en missings blijft de prevalentie van genetische trombofilie-afwijkingen immers 19% (versus 19,2% voor de totale studiepopulatie). We willen graag opmerken dat de studiepopulatie bestaat uit Belgische en Nederlandse patiëntes. Dit is belangrijk gezien de nauwe samenhang tussen mutatieprevalentie en geografische spreiding. Het was niet eenvoudig een geschikte controlepopulatie te selecteren aangezien we geen cijfers konden vinden in de literatuur voor een specifieke Belgisch-Nederlandse populatie. Bijgevolg maakten wij volgende keuzes : •

Factor V Leiden : Verenigd Koninkrijk, blanke populatie;

•

Factor II 20210G>A : boven 50° noorderbreedte (Malmö, Manchester, Sheffield, Amsterdam, Leiden);

•

MTHFR 677C>T : Rotterdamse populatie.

8.4. Conclusie 48


Afgaande op de resultaten van deze studie vermoeden we dat genetische trombofilie, en in het bijzonder factor II 20210G>A, wel degelijk een rol speelt in het herhaald falen van IVF/ICSIcycli. De tegenstrijdige resultaten in de literatuur herinneren er ons echter aan dat niet zomaar conclusies mogen getrokken worden uit één enkel onderzoek. Er is nood aan verder wetenschappelijk onderzoek op epidemiologisch en klinisch vlak.

Referentielijst

49


•

AZEM F., MANY A., YOVEL I., AMIT A., LESSING J.B., KUPFERMINC M.J. : Increased rates of thrombophilia in women with repeated IVF failures. Human Reproduction, 2004, 19, 368-370.

•

BELLVER J., AYLLON Y., FERRANDO M., MELO M., GOYRI E., PELLICER A., REMOHI J., MESEGUER M. : Female obesity impairs in vitro fertilization outcome without affecting embryo quality. Fertility and Sterility, Online, 2009, 1-9. Opgehaald op

24

april

2009,

van

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T6K-4VG35RFB&_user=794998&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C0000 43466&_version=1&_urlVersion=0&_userid=794998&md5=874a4e36c88f71770 1e45ace4a1baf23. •

COPPENS M. KAANDORP S.P., MIDDELDORP S. : Inherited Thrombophilias. Obstetrics and Gynaecology Clinics of North America, 2006, 33, 357-374.

•

COULAM C.B., JEYENDRAN R.S. : Thrombophilic gene polymorphisms are risk factors for unexplained infertility. Fertility and Sterility, 2009, 91, 1516-1517.

•

DE LAU L.M.L., KOUDSTRAAL P.J., VAN MEURS J.B.J., UITTERLINDEN A.G., HOFMAN A., BRETELER M.B. : Methylenetetrahydrofolate reductase C677T genotype and PD. American Neurological Association, 2005, 57, 927-930.

•

DE SUTTER P. : Rational Diagnosis and treatment in infertility. Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology, 2006, 20, 647-664.

•

DE STEFANO V., ROSSI E., PACIARONI K., LEONE G. : Screening for inherited thrombophilia: indications and therapeutic complications. Haematology, 2002, 87, 1095-1108.

•

DIRCKX K., CABRI P., MERIEN A., GALAIDOVA L., GERRIS J., DHONT M., DE SUTTER P. : Does low-dose aspirin improve pregnancy rate in IVF/ICSI? A randomized double blind placebo controlled trial. Human reproduction, 2009, 24, 856860.

•

FITZGERALD C., ZIMON A.E., JONES E.E. : Aging and reproductive potential in women. Yale Journal of Biology and Medicine, 1998, 71, 367-381.

•

FORTI G., KRAUSZ C. : Evaluation and Treatment of the Infertile Couple. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1998, 88, 4177-4188. 50


•

FRANCHINI M., VENERI D., MANZATO F., LIPPI G. : Inherited Thrombophilia. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 2006, 43, 249-290.

•

FROSST P., BLOM H.J., MILOS R., GOYETTE P., SHEPPARD C.A., MATTHEWS R.G., BOERS G.J., DEN HEYER M., KLUIJTMANS L.A., VAN DEN HEUVEL L.P., ROZEN R. : A candidate genetic risk factor for vascular disease : a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nature Genetics, 1995, 10, 111-113.

•

GELBAYA T.A., KYRGIOU M., STERN C., NARDO I.G. : Low-dose aspirin for in vitro fertilization: a systematic review and meta-analysis. Human Reproduction Update, 2007, 13, 357-364.

•

GOMEZ GARCIA E.B., SCHRANDER-STRUMPEL C.T.R.M., DE NIJS H. : Klinische genetica (40): erfelijke trombofilie. Patient Care, 2003, 30, 89-94.

•

GOPEL W., LUDWIG M., JUNGE AK., KOHLMANN T., DIEDRICH K., MOLLER J. Selection pressure for the factor-V-Leiden mutation and embryo implantation. The Lancet, 2002, 359, 894.

•

GRANDONE E., CAPPUCCINI V. : Inherited thrombophilia and in vitro fertilization implantation failure. Fertility and Sterility, 2001, 76, 201-202.

•

GRANDONE E., COLAIZZO D., LO BLUE A., CAPPUCCI F., CITTADINI E., MARGAGLIONE M. : Clinical relevance of inherited thrombophilia in implantation failure: who needs to be screened? Haematologica, 2007, 88, 171.

•

HABBEMA JD., COLLINS J., LERIDON H., EVERS JL., LUNENFELD B., TE VELDE ER. : Towards less confusing terminology in reproductive medicine: a proposal. Human Reproduction, 2004, 19(7), 1497-501.

•

HuGENet. http://www.cdc.gov/genomics/hugenet/default.htm, zoals opgehaald op 15 september 2007.

•

JICK H., PORTER J. Relation between smoking and age of natural menopause. The Lancet, 1977, 1, 1354-1355.

•

KUJOVICH J.L. : Factor V Leiden Thrombophilia. Gene Reviews, 2007.

•

KUJOVICH J.L. : Prothrombin Thrombophilia. Gene Reviews, 2006.

•

KUO H.C., HSU C.C., WANG S.T., HUANG K.E. : Aspirin improves uterine blood flow in peri-implantation. Journal of the Medical Association, 1997, 96, 253-257.

51


•

KUPFERMINC M.J., ELDOR A., STEINMAN N., MANY A., BAR-AM A., JAFFA A., FAIT G., LESSING J.B. : Increased frequency of genetic thrombophilia in women with complications of pregnancy. New England Journal of Medicine, 1999, 340, 9-13.

•

LAVERGE H., DE SUTTER P., VAN DER ELST P., DHONT M. : A prospective randomized study comparing day 2 and day 3 embryo transfer in human IVF. Human Reproduction, 2001, 16, 476-480.

•

LINDQVIST PG, DAHLBACK B. : Carriership of Factor V Leiden and evolutionary selection advantage. Current Medical Chemistry, 2008, 15, 1541-1544.

•

MAJERUS PW. : Human genetics. Bad blood by mutation. Nature, 1994, 369, 14-15.

•

MARGALIOTH E.J., BEN-CHETRIT A., GAL M., ELDAR-GEVA T. : Mini review – Developments in reproductive medicine. Human Reproduction, 2006, 21, 3036-3043.

•

MARTINELLI I., TAIOLO E., RAGNI G., LEVI-SETTI P., PASSAMONTI S.M., BATTAGLIOLI T., LODIGIANI C., MANNUCCI P.M. : Embryo impantation after assisted reproductive procedures and maternal thrombophilia. Journal of Hematology, 2003, 88, 789-793.

•

MIDDELDORP S. : Oral contrceptives and the risk of venous thromboembolism. Gender Medicine, 2005, 3-9.

•

MIDDELDORP S. : Thrombophilia and pregnancy complications: cause or association? Journal of thrombosis and Haemostasis, 2007, 5, 276-282.

•

OFFNER F. : Cursus Hematologie 1ste master Geneeskunde, Universiteit Gent, academiejaar 2007-2008.

•

Online Mendelian inheritance in man. #188055, *607093, zoals opgehaald op 15 september 2007.

•

QUBLAN H.S., EID S.S., ABABNEH H.A.,AMARIN Z.O., SMADI A.Z., ALKHAFAJI F.F., Khader Y.S. : Acquired and inherited thrombophilia: implication in recurrent IVF and embryo transfer failure. Human Reproduction, 2006, 21, 2694-2698.

•

REES D.C., COX M., CLEGG J.B. : World distribution of factor V Leiden. The Lancet, 1995, 346, 1133-1134.

•

REY E., KAHN S.R., DAVID M., SHRIER I. : Thrombophilic disorders and fetal loss: a meta-analysis. The Lancet, 2003, 361, 901-908.

52


•

REZNIKOFF-ETIEVANT M.F., CAYOL V., CARBONNE B., ROBERT A., COULET F., MILLIEZ J. : Factor V Leiden and 20210G>A prothrombin mutations are risk factors for very early recurrent miscarriage. Britisch Journal of Obstetrics and Gynaecology, 2001, 108, 1251-1254.

•

RODGER M.A., PAIDAS M., CLAIRE McL., MIDDELDORP S., KAHN S., MARTINELLI I., HAGUE W., MONTELLA K.R., GREER I. : Inherited Thrombophilia and Pregnancy Complications Revisited. Obstetrics and Gynaecology, 2008, 112, 320-324.

•

ROSENDAAL F.R., DOGGEN C.J.M., ZIYELIN A., ARRUDA V.R., AJACH M., SISCOVICK D.S., HILLARP A., WATZKE H.H., BERNARDI F., CUMMING A.M., PRESTON F.E., REITSMA P.H. : Geographic Distribution of the 20210G to A Prothrombin Variant. Thromb Haemost, 1998, 79, 706-708.

•

RUOPP M.D., COLLINS T.C., WHITCOMB B.W., SCHISTERMAN E.F. : Evidence of absence or absence of evidence? A reanalysis of the effects of low-dose aspirin in in vitro fertilization. Fertility and Sterility, 2009, 1, 71-76.

•

SIMUR A., ÖZDEMIR S., ACAR H., COLAKOGLU M.C., GÖRKEMLI H., BALCI O., NERGIS S. : Repeated in vitro fertilization failure and its relation with thrombophilia. Gynaecologic and Obstetric Investigation, 2009, 67, 109-112.

•

SOARES S.R., SIMON C., REMOHI J., PELLICER A. : Cigarette smoking affects uterine receptiveness. Human Reproduction, 2007, 22, 543-547.

•

UZ,

CENTRUM

MEDISCHE

GENETICA,

LABORATORIUM

VOOR

MOLECULAIRE GENETICA : Achtergrondtekst betekenis van de factor V Leiden mutatie, de factor II 20210G>A mutatie en de MTHFR 677C>T mutatie als risicofactor voor trombofilie. Versie 22 februari 2006. •

UZ,

CENTRUM

MEDISCHE

GENETICA,

LABORATORIUM

VOOR

MOLECULAIRE GENETICA : APC-resistentie. Opsporen mutatie 1691G>A / R506Q in het factor V (F V) gen op chromosoom 1. Versie 2 april 2003. •

UZ,

CENTRUM

MEDISCHE

GENETICA,

LABORATORIUM

VOOR

MOLECULAIRE GENETICA : Factor II (prothrombine) – muatie. Opsporen mutatie 20210G>A in het 3’ onvertaald gebied (utr) van het II (F II, prothrombine) gen op chromosoom 11. Versie 2 april 2003.

53


•

WALKER I.D., GREAVES M., PRESTON F.E. : Guideline. Investigation and management of heritable thrombophilia. British Journal of Haematology, 2001, 114, 521-528.

•

http://www.med.umich.edu/lrc/coursepages/M1/embryology/embryo/images/placenta. gif, zoals opgehaald op 30 april 2009.

54


Bijlagen

Bijlage 1 : Etiologieën van herhaald implantatiefalen (RIF) ▼Tabel aangepast vanuit Margalioth et al., 2006. Bijlage 1. Etiologieën van herhaald implantatiefalen (RIF) Verminderde endometriale receptiviteit abnormaliteiten van de uteriene caviteit dun endometrium veranderde expressie van adhesieve molecules immunologische factoren trombofilie Gebrekkige embryonale ontwikkeling genetische abnormaliteiten (man/vrouw/gameten/embryo) zona verharding suboptimale cultuur condities Multifactoriële effectoren endometriose hydrosalpinx suboptimale ovarium stimulatie

55


Bijlage 2 : Classificatie van aangeboren trombofilieën. ▼Tabel aangepast vanuit Franchini et al., 2006. Bijlage 2. Classificatie van aangeboren trombofilieën Kwalitatieve / kwantitatieve defecten van de bloedstolling of fibrinolyse Antitrombine deficiëntie Proteïne C deficiëntie Proteïne S deficiëntie Heparine cofactor II deficiëntie Weefselfactor pathway inhibitor deficiëntie trombomoduline deficiëntie Gestegen bloedspiegels van coagulatiefactoren Geactiveerde proteïne C resistentie en factor V Leiden Protrombine gen mutatie (20210G>A) Dysfibrinogenemie and hyperfribrinogenemie Gestegen bloedspiegels van stollingsfactoren VII, VIII, IX, XI en XII Hyperhomocysteïnemie Afwijkingen in het fibrinolytisch systeem Plasminogeen Weefsel plasminogeen activator Trombine-activeerbare fibrinolysis inhibitor Factor XIII Lipoproteïne Veranderde plaatjesfunctie Platelet glycoproteïne GPIb-IX GPIa-Iia GPIIb-IIIa 56


Bijlage 3 : e-mail Prof. Dr. S. Middeldorp (Universiteit Leiden)

(Zoals ontvangen op 18 september 2008)

Dag Hanneke, Leuk project hoor. Nu zoeken jullie een controle groep om de prevalentie van trombofilie in jullie populatie te vergelijken met die van de Belgische bevolking, klopt dat? Een klein lesje epidemiologie: als je een patiënt controle onderzoek doet, dient de controlegroep eigenlijk maar 1 doel: het moet een goede afspiegeling zijn van de zogenaamde bronpopulatie. Dat impliceert dat je niet perse vrouwen hoeft te nemen die al een keer succesvol zwanger zijn geraakt. Feitelijk zou je de prevalentie van netgeboren jongetjes in Belgie kunnen nemen! Dit is erg contra-intuitief, maar wel de harde epidemiologische waarheid. Het is mijn ervaring dat de meeste clinici (ben ik ook, dus ik mag het zeggen, haha) dit niet begrijpen en heel moeilijk doen om controlegroepen te vinden maar dat is dus niet nodig. Als ik jullie geconstateerde prevalenties vluchtig beschouw, is dat precies wat je verwacht in de bevolking van onze landen; daar is geen controle groep voor nodig. Er zijn goede studies naar de prevalentie FVL en protrombine mutatie: 1) DC REES, Lancet 1995 (World prevalence of FVLeiden) 2) FR ROSENDAAL, Thromb Haemost 1997 (Geographic distribution of prothrombin mutation) Vast ook als je goed zoekt naar MTHFR maar die heb ik even niet paraat. Tenslotte, als jullie de literatuur goed hebben nagevlooid, zullen jullie wel zien dat er bijzonder veel onenigheid is om iets te doen met anticoagulantia, als er een associatie tussen zwangerschapsellende en trombofilie wordt gevonden. Ik ben een van de fanatieke voorstanders van het afwachten van trials, cq het opzetten ervan. Ik attach een stukje van mijn hand over recidiverende 57


miskramen. Succes en vriendelijke groeten, Saskia Middeldorp Dr S. Middeldorp, internist Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC) Afdelingen Klinische Epidemiologie en Algemene Interne Geneeskunde Departments of Clinical Epidemiology and General Internal Medicine Postal address: Leiden University Medical Center (LUMC) Department of Clinical Epidemiology, C9-P P.O. Box 9600 2300 RC Leiden The Netherlands Phone: +31 (0)71 5264037 Fax: +31 (0)71 5266994

58

ICSI BEHANDELINGEN: PREVALENTIE, AARD EN RESULTAAT VAN ANTICOAGULATIETHERAPIE

Recommend Documents