Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria
I-MET-FLVVT-087
I-MET-FLVVT-087
BEPALING VAN VITAMINE E (DL-α α-TOCOFEROL) IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND
®
-HPLC)
Versie
05
Datum van toepassing
2014-09-10
Opgesteld door :
Jean-Pierre De Lannoy, Laborant
Nazicht door :
Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke; 2014-09-09
Goedkeuring vrijgave door :
Mandy Lekens, Laboratoriummanager; 2014-09-10
Beheer & locatie geldende versie :
FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem
Bestemmelingen :
Medewerkers FLVVT
Trefwoorden :
Toevoegingsmiddelen, Vitaminen
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) Overzicht wijzigingen Herziening * door/datum J. Versnick, 09/2007 QAM, 12/2008 M. Vanbrabant, 04/ 2009 M. Vanbrabant, 09/ 2010 M. Vanbrabant, 06/2013 JP De Lannoy, 09/2014
*
Reden van de herziening
Tekstdeel/draagwijdte van de herziening
Opsteller initiële versie Nummering FoodLIMS geen wijziging versie
Blz 1 + 2
Nazicht en aanpassing numerieke verwijzingen
Volledige tekst
Aanpassing methode naar aanleiding van klacht TC-10/105 Invoering Verordening 152/2009 Update documentbeheer
Volledige tekst
Aanpassing houdbaarheid standaard stockoplossing n.a.v. interne audit 2014-04
Paragraaf 8
Volledige tekst
Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar
bedragen.
Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood.
Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document.
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 2/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) INHOUDSTABEL
1
DOEL .................................................................................................................................. 4
2
TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4
3
WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN........................................................... 4
4
DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 4
5
PRINCIPE........................................................................................................................... 4
6
PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 5
7
VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 5
8
REAGENTIA EN HULPSTOFFEN..................................................................................... 5 8.1
REAGENTIA..................................................................................................................... 5
8.2
HULPSTOFFEN ................................................................................................................ 6
8.2.1 9
Standaarden ........................................................................................................ 6
TOESTELLEN .................................................................................................................... 7 9.1
ALGEMEEN ..................................................................................................................... 7
9.2
SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE .............................................................................. 7
9.3
HPLC-CONDITIES ........................................................................................................... 7
10 WERKWIJZE...................................................................................................................... 7 10.1
INWEEG...................................................................................................................... 8
10.2
HYDROLYSE ............................................................................................................... 8
10.3
EXTRACTIE (SPE) ...................................................................................................... 9
10.4
HPLC-BEPALING ........................................................................................................ 9
11 KWALITEITSCONTROLE ............................................................................................... 10 12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................. 10 13 OPMERKINGEN .............................................................................................................. 10 14 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN ................................................................................................ 11
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 3/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) 1
Doel
Kwantitatieve bepaling van dl-alfa-tocoferol (vitamine E). Het gehalte aan vitamine E wordt uitgedrukt in milligram dl-alfa-tocoferol per kg (mg/kg).
2
Toepassingsgebied
De methode is geschikt voor de kwantitatieve bepaling van vitamine E in diervoeder en 1
voormengsels. De rapporteringsgrens bedraagt 3 mg/kg . Al naargelang het veronderstelde gehalte aan dl-alfa-tocoferol worden de producten verdeeld in twee groepen: -
Groep A: gehalten van minder dan 100 mg/kg
-
Groep B: gehalten gelijk aan of hoger dan 100 mg/kg
Indien in hetzelfde monster eveneens vitamine D3 dient bepaald te worden, gebruikt men methode I-MET-FLVVT-016.
3
Wettelijke en normatieve documenten
Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT.
4
Definities en afkortingen
Term HPLC RP
5
Definitie High Performance Liquid Chromatography Reversed phase
Principe
Een hoeveelheid fijngemalen monster wordt warm gehydrolyseerd onder stikstofatmosfeer met een ethanolische kaliumhydroxide-oplossing in aanwezigheid van een antioxidant. Vitamine E wordt vervolgens geëxtraheerd over een Chromabond® XTR-kolom met nhexaan. Een bepaald volume van het extract, afhankelijk van de gewenste concentratie,
1
1 IE vit E = 1 mg dl-alfa-tocoferolacetaat = 0,9090 mg dl-alfa-tocoferol
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 4/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) wordt ingedampt tot droog en opgelost in methanol. Het gehalte aan vitamine E wordt bepaald met behulp van RP-HPLC met UV-detectie.
6
Prestatiekenmerken
De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De
waarden
voor
de
reproduceerbaarheid
(RSDR%)
zijn
terug
te
vinden
in
M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx.
7
Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen
De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de nodige maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffuus daglicht, eventueel in bruin glaswerk of glaswerk dat is beschermd met aluminiumfolie. In het laboratorium wordt gebruik gemaakt van het dimmen van de verlichting. Deze wordt op minimale lichtsterkte gebracht van zodra een vitamineoplossing of –suspensie in de werkruimte aanwezig is. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht zonder de invloed van zuurstof, vervang zuurstof waar mogelijk door stikstof. Het malen van monsters gebeurt vlak voor het wegen en hydrolyseren om het verlies aan vitamine E zo klein mogelijk te houden. Het monster wordt voorbereid volgens instructie LAB 25-I 23 BEREIDING MONSTERS. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT.
8 8.1
Reagentia en hulpstoffen Reagentia
Alle reagentia dienen van ‘pro analyse ‘-kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld.
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 5/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) Reagentia
Labonr.
8.1.1 Ethanol 96% (v/v) (eventueel gedenatureerd met methylethylketon) R0338 8.1.2 n-hexaan, HPLC-kwaliteit R0134 8.1.3 Methanol, HPLC-kwaliteit (CH3OH) R0183 8.1.4 Water, HPLC-kwaliteit 8.1.5 Stikstof, zuiver
R1003
8.1.6 L-ascorbinezuur 8.1.7 Kaliumhydroxide, zuiver
R0778
8.1.8 Natriumsulfide, zuiver 8.1.9 Glycerine, zuiver
R0930
8.1.10 8.1.11 8.1.12 8.1.13
Natriumsulfide-oplossing 0,5 M in glycerine 70% (v/v) in water (R1003) Kaliumhydroxide-oplossing 50% (g/v) p.a. Chromabond® XTR kolom, polypropyleen, volume 70 ml, 14,5 g kieselguhr voor vloeistof-vloeistof-extractie, capaciteit 20 ml Mobiele fase: 1% water (R1003) in methanol (R0183) (v/v)
8.1.14 Butylhydroxytolueen zuiver 8.1.15 Butylhydroxytolueen-oplossing in methanol (R0183): 1 mg/ml
8.2
R0921
R0020 W0005 W0002 R1067 W0014 R1064 W0039
Hulpstoffen
8.2.1 •
G0001
Standaarden
Vitamine E (dl-alfa-tocoferol) standaardstof van gegarandeerde zuiverheid (S0130, olie)
8.2.1.1
Vitamine E (dl-alfa-tocoferol) standaard stockoplossing, 1 mg/ml (W0020)
Weeg een druppel alfa-tocoferol (olie) (≥ 97,0%, S0130) in een getarreerde erlenmeyer (= x mg). Voeg vervolgens een gelijk aantal ml butylhydroxytoleen-oplossing (W0039) toe zodat de concentratie 1 mg/ml bedraagt. Zo bekomt men uiteindelijk ongeveer 50 ml standaard stockoplossing. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 °C is deze oplossing 1 jaar 4 maanden bruikbaar. 8.2.1.2
Vitamine E (dl-alfa-tocoferol) standaard werkoplossing, 0,02 mg/ml (W0055)
Pipetteer 1 ml standaard stockoplossing (W0020) in een maatkolfje van 50 ml en vul aan tot 50 ml met methanol (R0183). De concentratie bedraagt dan 0,02 mg/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 °C is deze oplossing 4 weken houdbaar.
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 6/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) De concentratie van de nieuwe standaard werkoplossing uit de (nieuwe) stockoplossing wordt met behulp van HPLC vergeleken met die van de vorige standaard werkoplossing uit de (oude) stockoplossing. Zie LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN en ‘Beheer standaarden.xls’. De stabiliteit moet tussen 95% en 105% liggen. De standaard werkoplossing wordt bij gebruik telkens gecontroleerd ten opzichte van de vorige run. Deze controle wordt geregistreerd in de file ‘Controlekaart Vitamine E.xlsx’. Algemene richtlijnen met betrekking tot het beheer van standaarden worden weergegeven in LAB 25-I 19 BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN.
9
Toestellen
9.1
Algemeen
Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT.
9.2
Specificaties voor deze methode
•
Allihn-condensor met slijpstuk, geschikt voor terugvloeikoeling onder stikstofstroom
•
Spectrofotometer met kwartscuvetten
9.3
HPLC-condities
De volgende condities worden als leidraad gegeven; andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen.
•
HPLC-kolom
: Analytische kolom: LiChrospher 100 RP-18e, 5 µm, 125 x 4 mm of gelijkwaardig eventueel met overeenkomstige voorkolom
•
Detector
: UV op 290 nm
•
Eluens
: Methanol/H2O (99/1)
•
Loopsnelheid
: 1,2 ml/min
•
Injectievolume
: 20 µl
•
Dataverwerkingsysteem: HPLC System Manager (Lachrom)
10 Werkwijze
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 7/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) 10.1 Inweeg
Voor de af te wegen hoeveelheid en de verdunningen wordt instructie LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN geraadpleegd. Dit document dient enkel als leidraad. Weeg, afhankelijk van het te verwachten gehalte aan dl-alfa-tocoferol, van het monster een hoeveelheid (g) af als volgt:
-
Voor producten van groep A
-
Voor producten van groep B:
30 (± 0,1) g
100 < 1000 mg/kg
10 (± 0,05) g
1000 < 4000 mg/kg
5 (± 0,03) g
4000 < 50.000 mg/kg
3 (± 0,01) g
50.000 mg/kg en meer
1 (± 0,005) g
Voor concentraten (olie of adsorbaat 50%) wordt methode I-MET-FLVVT-088 toegepast.
-
Breng de afgewogen hoeveelheid direct over in een kolf met ingeslepen stop. Indien men niet weet tot welke groep het monster behoort, weegt men 10 g af. 10.2 Hydrolyse
-
Voor producten van groep A: Voeg achtereenvolgens toe:
-
•
1 g ascorbinezuur
(R0778)
•
100 ml ethanol
(R0338)
•
20 ml kaliumhydroxide-oplossing 50%
(W0002)
•
4 ml natriumsulfide-oplossing
(W0005)
Voor producten van groep B: Voeg achtereenvolgens toe: • 1 g ascorbinezuur
(R0778)
• 50 ml ethanol
(R0338)
• 10 ml kaliumhydroxide-oplossing 50%
(W0002)
• 4 ml natriumsulfide-oplossing
(W0005)
Weeg de erlenmeyer met inhoud plus roerstaaf en noteer het gewicht. Sluit een condensor aan op de erlenmeyer en verwarm gedurende 30 minuten in een warmwaterbad met magneetroerder bij 70 à 80°C, dit onder terugvloeikoeling en al roerend
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 8/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) met toevoer van een trage stikstofstroom boven de vloeistof. Spoel de condensor vervolgens met 20 ml water en koel de inhoud van de erlenmeyer af in een waterbad. Weeg de erlenmeyer opnieuw en breng deze op het begingewicht + 20 g met ethanol.. 10.3 Extractie (SPE)
Breng ± 1 g ascorbinezuur en 10 ml water in een maatkolf van 50 ml. Los het ascorbinezuur volledig op. Laat ondertussen de matrix van het extract (10.2Fout! Verwijzingsbron niet gevonden.) bezinken. Pipetteer na bezinken voorzichtig 40 ml extract en voeg dit bij de ascorbinezuuroplossing. Breng op volume (50 ml) met water. Pipetteer vervolgens 10 ml van dit mengsel op de Chromabond® XTR-kolom. Laat de oplossing gedurende 12 tot 15 minuten op de kolom absorberen. Elueer met 100 ml n-hexaan, in twee delen van 30 ml en één deel van 40 ml. Pas vervolgens procedure a) of procedure b) toe, met LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN als leidraad: a) Vang het eluaat op in een rondbodemkolf van 100 ml. Damp de verkregen oplossing droog
d.m.v.
de
rotatievacuümverdamper
bij
gereduceerde
druk
en
een
badtemperatuur van 40°C. Koel af door kortstondig dompelen in een waterbad op kampertemperatuur en neem het residu meteen op in een aantal ml methanol zodat de concentratie dl-alfa-tocoferol ongeveer 20 µg per ml bedraagt.
b) Vang het eluaat op in een maatkolf van 100 ml. Breng op volume met n-hexaan en meng. Pipetteer een aantal ml in een rondbodemkolf, damp droog d.m.v. de rotatievacuümverdamper bij gereduceerde druk en een badtemperatuur van 40°C. Koel af door kortstondig dompelen in een waterbad op kampertemperatuur en neem het residu meteen op in een aantal ml methanol zodat de concentratie dl-alfa-tocoferol ongeveer 20 µg per ml bedraagt. Voor de recovery van vitamine E wordt LAB 25-I 59 RECOVERY VITAMINEN gevolgd. 10.4 HPLC-bepaling
Algemene richtlijnen m.b.t. het gebruik van het HPLC-systeem (opstart, injectieschema,…) en toegestane afwijkingen worden weergegeven in LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN.
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 9/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) 11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN.
12 Berekening en rapportering Het gehalte aan dl-alfa-tocoferol van het monster wordt berekend op basis van de hoeveelheid afgewogen materiaal en van de verdunningen die in de loop van de analyse zijn uitgevoerd. Document LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN dient hier weer als leidraad. De concentratie aan dl-alfa-tocoferol wordt berekend door de HPLC System Manager software. Het resultaat wordt gerapporteerd in mg dl-alfa-tocoferol per kg. De berekening van de hoeveelheid vitamine E wordt uitgevoerd door de software aan de hand van een standaardcurve (zie ook LAB 25-P 04).
Het gehalte aan vitamine E in mg/kg in het monster kan ook bepaald worden met behulp van formule:
× × = ⋯ /
× waarbij :
A = piekoppervlakte of -hoogte van de monsteroplossing B = piekoppervlakte of -hoogte van de standaardoplossing V = volume van het monsterextract in ml (rekening houdend met eventueel uitgevoerde verdunningen) m = massa van het monster in g C = concentratie van de standaardoplossing in µg/ml
De rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN. Enkel resultaten ≥ 3 mg/kg worden gerapporteerd.
13 Opmerkingen •
Van monsters met de benaming kunstmelkpoeder, aanvullend kunstmelkpoeder en vetkern, wordt vooraf het vetgehalte bepaald. Indien het vetgehalte van het monster groter is dan 12%, wordt de hoeveelheid KOH verhoogd zodat bij de verzeping minstens 2,5 g KOH per gram vet aanwezig is. Deze verhoging gebeurt door toevoeging van vast KOH.
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 10/11
BEPALING VAN VITAMINE E IN DIERENVOEDERS (CHROMABOND®-HPLC) Bijvoorbeeld: Het monster bevat 20% vet (6 g in 30 g monster). Dan is er 6 x 2,5 = 15 g KOH nodig Volgens Fout! Verwijzingsbron niet gevonden. wordt er 10 g toegevoegd (20 ml 50% KOH). Er moet dan nog 15 -10 = 5 g KOH (vast) worden toegevoegd. •
Voor monsters met een waarborg hoger dan 200.000 mg/kg alfa-tocoferol (vitamine E), wordt standaard 10 g vast KOH toegevoegd aan de verzepingsoplossing.
14 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-F 25
AANVRAAG ONTLENING MONSTERS VITAMINEN
LAB 25-F 62
REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART
LAB 25-I 19
BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN
LAB 25-I 23
BEREIDING MONSTERS
LAB 25-I 27
VERDUNNINGEN VITAMINEN
LAB 25-I 59
RECOVERY VITAMINEN
LAB 25-L 18
OVERZICHT WETGEVING FLVVT
LAB 25-L 21
APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT
LAB 25-L 22
OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT
LAB 25-P 04
RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN
LAB 25-P 07
VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT
LAB 25 I-MET-FLVVT-087 - Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 11/11
