Hisztamin receptorok térszerkezetének vizsgálata és alkalmazása a gyógyszerkutatásban

Hisztamin receptorok térszerkezetének vizsgálata és alkalmazása a gyógyszerkutatásban Doktori értekezés

Kiss Róbert Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Józan Miklós, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Ferenczy György, Ph.D. Dr. Tapolcsányi Pál, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Török Tamás, D.Sc. Dr. Kéri György, D.Sc. Dr. Kolossváry István, D.Sc.

Budapest 2008

Tartalom

1 Bevezetés…………………………………………………………………………… 3 1.1 Célkitűzések…………………………………………………………………… 4 2 Irodalmi előzmények……………………………………………………………… 5 2.1 A G-protein-kapcsolt receptorok……………………………………………… 6 2.1.1 GPCR kristályszerkezetek……………………………………………… 9 2.1.2 GPCR homológiamodellek……………………………………………. 10 2.1.2.1 Szekvenciaillesztés…………………………………………… 10 2.1.2.2 Modellépítés………………………………………………….. 13 2.1.2.3 Modellvalidálás………………………………………………. 15 2.1.2.4 GPCR modellek alkalmazásai……………………………….. 17 2.2 Szerkezet-alapú virtuális szűrések…………………………………………… 18 2.2.1 Dokkoló algoritmusok………………………………………………… 18 2.2.2 Értékelőfüggvények…………………………………………………… 21 2.2.3 Dúsulási tesztek……………………………………………………….. 23 2.3 A hisztamin és a hisztamin receptorok felfedezése………………………….. 25 2.4 A hisztamin receptorok farmakológiája……………………………………… 26 2.5 A hisztamin receptorok szerkezete…………………………………………… 37 2.6 A hisztamin receptorok kötőhelye…………………………………………… 38 2.7 A hisztamin receptorok publikált szerkezeti modelljei………………………. 41 3 Módszerek és anyagok…………………………………………………………… 44 3.1 A számításokhoz felhasznált módszerek…………………………………….. 44 3.2 A kísérletekben használt módszerek és anyagok…………………………….. 49 4 Eredmények és értékelésük……………………………………………………… 51 4.1 A humán hisztamin H1 receptor (hH1R) modell…………………………….. 51 4.1.1 Homológiamodellezés és validálás……………………………………. 51 4.1.2 Az agonista kötőhely feltérképezése………………………………….. 55

1

4.1.3 Az antagonista kötőhely feltérképezése……………………………….. 58 4.1.4 H1 antagonisták kötődési módjának vizsgálata……………………….. 59 4.2 A humán hisztamin H4 receptor (hH4R) modell…………………………….. 65 4.2.1 Homológiamodellezés és validálás……………………………………. 65 4.2.2 A hH4R kötőhelyének vizsgálata, referenciavegyületek dokkolása…... 69 4.2.3 Dúsulási tesztek……………………………………………………….. 78 4.2.4 Virtuális szűrés………………………………………………………… 85 4.2.5 Radioligandum kötődési tesztek………………………………………. 89 5 Következtetések, új tudományos eredmények………………………………… 100 6 Összefoglalás……………………………………………………………………. 102 7 Summary………………………………………………………………………… 103 8 Irodalomjegyzék………………………………………………………………… 104 8.1 Az értekezés alapját képező közlemények………………………………….. 104 8.2 Az értekezés témaköréhez kapcsolódó saját közlemények…………………. 104 8.3 Más témához kapcsolódó saját közlemények……………………………….. 104 8.4 Hivatkozott irodalmak jegyzéke…………………………………………….. 105 9 Köszönetnyilvánítás…………………………………………………………….. 116

2

1 Bevezetés Az

immunrendszer

az

emberi

szervezet

szempontjából

létfontosságú

és

elengedhetetlen a homeosztázis fenntartásához. A kialakuló immunválasz azonban gyakran nagyobb károkat okoz a szervezet számára, mint amekkorát a vélt vagy valós kórokozó kifejteni képes. Az allergiás megbetegedésekben az immunrendszer kórokozóként ismer fel olyan antigéneket, amelyek nem jelentenek veszélyt a szervezetre. Az allergiás szénanátha (rhinitis) okozta tünetek enyhítésére a szteroid jellegű gyulladáscsökkentők mellett, a leggyakrabban alkalmazott gyógyszerek a hisztamin H1 receptor antagonistái, ismertebb nevükön, antihisztaminok. A hisztamin receptor család legújabb tagja a H4 receptor, amelyről farmakológiai adatok bizonyítják, hogy szintén jelentős szerepe lehet az allergiás folyamatokban. Napjainkban az allergiás megbetegedések száma folyamatosan növekszik, ezért egyre nagyobb szükség van hatékony és szelektív allergia ellenes gyógyszerekre. A H1 és a H4 receptor egyaránt jelentős terápiás célpont, amelyek gátlása külön-külön, vagy akár kombinálva eredményes

lehet

az

allergia

és

egyéb

patológiás

immunfolyamatok

farmakoterápiájában. A hisztamin receptorokról jelenleg nem áll rendelkezésre kísérleti úton meghatározott térszerkezet. Ugyanakkor lehetőség van homológiamodell elkészítésére, amelyhez legalább egy rokon szerkezetű fehérje térszerkezetére és a fehérjék aminosav szekvenciájának illesztésére van szükség. A gyógyszerkutatásban a fehérjeszerkezet-alapú megközelítések számos helyen alkalmazhatók. Egy célfehérje térszerkezete információkat szolgáltathat a ligandumok kötőhelyéről. Ezáltal kiaknázhatóvá válnak a kötőhely azon sajátságai, amelyek egyszerre biztosítanak nagyobb affinitást és szelektivitást. Megfelelő minőségű térszerkezetek pedig akár teljesen új ligandumok azonosítására is alkalmasak lehetnek. Az utóbbi esetben virtuális szűréssel nagy adatbázisokból választhatunk ki ígéretes molekulákat, amelyek tényleges hatékonyságát biológiai tesztekkel igazolhatjuk. A biológiai méréssel is megerősített ún. in vitro találatok új, nagy affinitású és szelektivitású vegyületek fejlesztésének kiindulópontjai lehetnek.

3

1.1 Célkitűzések Munkánk során célul tűztük ki a humán hisztamin H1 receptor releváns homológiamodelljének

elkészítését.

A

receptor

kötőhelyének

azonosításához

irodalomban leírt irányított mutációs vizsgálatok eredményeit kívántuk felhasználni. További célul tűztük ki ismert H1 antagonisták dokkolását a receptor kötőhelyére, és az így kialakult ligandum-receptor komplexek vizsgálatával új kölcsönhatási lehetőségek azonosítását. Kutatásunk folytatásaként célul tűztük ki a humán hisztamin H4 receptor releváns homológiamodelljének elkészítését is. Az elkészült modell kötőhelyének azonosítása után irodalmi adatok alapján H4 affinitással rendelkező molekulákat kívántunk dokkolni a kötőhelyre. Ezt követően azt terveztük megvizsgálni, hogy a különböző módszerekkel kifejlesztett hH4R homológiamodellek alkalmasak-e virtuális szűrésre. Majd további célkitűzésünk volt egy virtuális szűrés megvalósítása a hH4R homológiamodelljén. Ehhez több mint 8.7 millió kereskedelmi forgalomban kapható, ill. egyetemek számára hozzáférhető

molekulát

gyűjtöttünk

össze

egy

molekulakönyvtárba.

A

molekulakönyvtár virtuális szűrése után, a legígéretesebb vegyületek H4 aktivitását biológiai vizsgálatokkal terveztük igazolni.

4

2 Irodalmi előzmények A hisztamin (2.1. ábra) a szervezet egyik legfontosabb multifunkcionális hírvivő molekulája, amely számos élettani és patobiokémiai folyamatban vesz részt.

2.1. ábra. A hisztamin szerkezete.

Mediátorként szerepet játszik az allergiás túlérzékenységi reakciókban, a gyomor sósavszekréciójában, immunrendszer

a

központi

szabályozásában,

idegrendszer a

jelátviteli

sejtdifferenciálódásban

folyamataiban, és

az

az

embrionális

fejlődésben. [1]. A hisztamint az élő szervezetben a hisztidin-dekarboxiláz enzim állítja elő hisztidinből. A szintézis és a tárolás helye elsősorban a hízósejtek és a bazofil granulociták. A bázikus jellegű hisztamin intracelluláris granulumokban tárolódik savas jellegű fehérjékhez kötődve [2]. Miután a hisztamin a megfelelő stimulus hatására felszabadult a granulumokból, az imidazol-N-metil-transzferáz enzim metabolizálja. A keletkező N-metil-hisztamin a monoamino-oxidáz hatására N-metil-imidazol-ecetsavvá alakul, majd a metabolit a vizelettel ürül a szervezetből. A hisztamin etilamin oldallánca fiziológiás pH-n szinte kizárólag protonált formában van jelen [3]. Az imidazol gyűrű protonáltsági állapota ugyanakkor már nem ennyire egyértelmű. Az imidazol gyűrű protonálódása valószínűleg szükséges a hisztamin vezikulákban történő raktározásához [4,5], ugyanakkor korábbi munkák a receptoriális kötődésben mindegyik hisztamin receptor esetében a deprotonált forma jelenlétét valószínűsítették [6-9]. Újabb szilárd-fázisú NMR vizsgálatok eredményei a humán H1 receptor esetében megmutatták, hogy a receptorhoz kapcsolódva a hisztamin monokationos és dikationos formában egyaránt megtalálható, a receptorhoz nem kapcsolódó forma pedig döntően dikationos [10]. Korábbi elméleti számolások [11,12] és kísérleti adatok [3,13] alapján valószínűsíthető, hogy a monokationos hisztamin a

5

kétféle lehetséges tautomer állapot közül döntően az N(τ)-formában fordul elő (protonált N(3) és deprotonált N(1), 2.1. ábra). A hisztamin hatásait elsősorban hisztamin receptorokon keresztül fejti ki, amelyek közül a mai napig négy különböző altípust sikerült azonosítani. Ezek mindegyike a Gprotein-kapcsolt receptorok (GPCR) családjába tartozik.

2.1 A G-protein-kapcsolt receptorok A GPCR-ok olyan hét membránon átívelő és egy a sejtmembránnal párhuzamosan futó rövid α-hélixből álló transzmembrán (TM) fehérjék, amelyek kiemelt szerepet játszanak a jelátviteli folyamatokban (2.1.1. ábra).

2.1.1. ábra. A G-protein-kapcsolt receptorok (GPCR) szerkezetének sematikus ábrája.

Míg a membrán felé általában lipofil oldalláncok néznek, addig a fehérje belseje és az extracelluláris (EC) ill. intracelluláris (IC) hurkok ennél lényegesen polárosabb elemeket tartalmaznak. A TM régió jóval konzerváltabb struktúrát mutat, mint az EC ill. IC hurkok. Számos jellegzetes elemről tudunk, amely a GPCR-ok jelentős részében előfordul. Ezek vagy a szerkezet vagy a működés szempontjából kiemelten fontosak, és ezért a GPCR-ok differenciálódása során csak kis mértékben változtak. Ezen konzervált elemek alapján alkották meg a GPCR szekvenciák számozásának egyik leggyakrabban alkalmazott módszerét, a Ballesteros-Weinstein-féle számozást [14]. Ennek lényege, hogy az aminosavakat egyrészt aszerint azonosítjuk, hogy melyik TM részben helyezkednek el, másrészt hogy mekkora távolságra vannak a szóban forgó TM rész legkonzerváltabb aminosavától. Ennek alapján a hét TM hélix legkonzerváltabb

6

aminosavainak jelölése rendre a következő: Asn (1.50), Asp (2.50), Arg (3.50), Trp (4.50), Pro (5.50), Pro (6.50), Pro (7.50). Ha például egy aminosav az első TM hélixben a legkonzerváltabb elemhez képest két aminosavval az N-terminális felé helyezkedik el, akkor a jelölése (1.48) lesz. Az egyik leggyakrabban előforduló konzerválódott GPCR motívum egy diszulfidhíd, amely a TM2 EC oldalán és az EC2 hurokban elhelyezkedő cisztein aminosavak oldalláncát köti össze. Néhány kivételtől eltekintve (pl. kannabinoid CB1 és CB2 receptorok) ez a diszulfid-híd minden GPCR-ban megtalálható. Egy másik rendkívül gyakran előforduló, konzervált szekvencia a TM3 IC végén a D(E)RY motívum. Ebben a szekvenciában az arginin aminosav (3.50) feltételezések szerint számos GPCR-ban ionos kölcsönhatást alakít ki a TM6 IC végén lévő glutamát (6.30) aminosavval, így rögzítve a TM3 és a TM6 IC végeinek távolságát. Mai ismereteink szerint, a GPCR-ok aktivációja során ez az ionos kölcsönhatás felszakad, és a TM3 és a TM6 IC végei eltávolodnak egymástól [15]. Ugyancsak konzervált szekvencia a TM7 IC végén lévő NPXXY motívum. A szekvencia elején lévő aszparagin és a végén elhelyezkedő tirozin aminosavak fontos szerepet töltenek be a GPCR-ok aktiválódásában [16-20]. A GPCR-okat aminosavszekvencia homológia és funkcionális hasonlóság alapján hat családba sorolhatjuk. Ezek közül a legnépesebb a „rodopszin-szerű” (A) család, amelybe a biogén aminok receptorai is sorolhatók. A GPCR-ok rendkívül változatos ligandumok (aminok, peptidek, adhéziós molekulák, fotonok, szagok, ízek, hormonok) jeleit közvetítik a sejt belseje felé. Ennek megfelelően a ligandumok kötőhelye is változatos. Egyes ligandumok (pl. a P-anyag: a neurokinin NK1 receptor liganduma) kizárólag a receptor EC részéhez kapcsolódnak. Egyes peptid ligandumok (pl. opioidok, bradikinin) az EC és a TM régiókban is alakítanak ki kölcsönhatásokat. Ugyanakkor a biogén

aminok

kötőhelye

döntően

a

TM

részben

található.

A

kötőhely

meghatározásában támpontot adhatnak az irányított pontmutációs vizsgálatok, amelyek azt vizsgálják, hogy ha egy aminosavat egy másikra cserélünk, akkor ez hogyan befolyásolja az adott ligandum affinitását. Amennyiben az affinitás jelentős csökkenését tapasztaljuk, akkor valószínű, hogy az adott aminosav része a ligandum kötőhelyének. Ugyanakkor előfordulhat, hogy a mutáció olyan konformációs változást okoz a fehérjében, amely tőle távolabbi pontokon is érezteti hatását. Így például a GPCR-ok esetében egyes aminosavak mutációja jelentősen befolyásolja a membránba ágyazódás

7

folyamatát. Másrészről előfordulhat, hogy egy mutáció a GPCR-okra jellemző kiterjedt interhelikális hidrogén-hidas (H-hidas) rendszer megzavarásához vezet. Ilyenkor a bekövetkező affinitáscsökkenés nem feltétlenül az adott aminosav kötőhelyhez közeli elhelyezkedésére utal. A GPCR-okban agonista jellegű ligandum kötése után globális konformációs változások játszódnak le (2.1.2. ábra B és C).

2.1.2. ábra. A G-protein-kapcsolt receptorok (GPCR) aktivációjának sematikus ábrája.

A konformációs változások oda vezetnek, hogy a C-terminálishoz és az IC3 hurokhoz kapcsolódó G-protein α-alegységén a GDP GTP-ra cserélődik (2.1.2. ábra D). Ezután a GTP-kötő α-alegység hidrolizál a βγ-alegységről valamint magáról a receptorról (2.1.2. ábra E), és ezt követően főként az α-alegység, de egyes esetekben a βγ-alegység is képes jeltovábbító kaszkádok beindítására. Később az α-alegység újból GDP-t köt (2.1.2. ábra F), és megint kialakul a GPCR-Gαβγ komplex (2.1.2. ábra A). Az α-alegység effektor funkciója alapján a GPCR-ok három legfontosabb csoportja: a Gαs, Gαi/o és Gαq/11 kapcsolt receptorok. A Gαs típusú G-protein az adenilát-cikláz enzim

8

serkentésével növeli a cAMP koncentrációt, amely aktiválja a protein kináz A enzimet (PKA), a PKA pedig számos jeltovábbító enzimet foszforilál. A Gαi/o családba tartozó G-proteinek a – Gαs családdal szemben – csökkentik a cAMP koncentrációt. A Gαq/11 típusú G-proteinek a foszfolipáz C enzimet serkentik, amely a foszfatidilinozitol-4,5biszfoszfátot (PIP2) hasítja inozitol-1,4,5-trifoszfátra (IP3) és 1,2-diacilglicerolra (DAG), amelyek másodlagos hírvivőként számos folyamatot indukálhatnak. A GPCR-ok terápiás jelentőségét jól mutatja, hogy a mai gyógyszerek több mint 45 %-a, míg a 100 leggyakrabban alkalmazott gyógyszer 25 %-a GPCR-okon keresztül fejti ki hatását [21]. A Human Genome (HUGO) projekt befejeztével pontosabb információkkal rendelkezünk az emberi szervezet GPCR-okat kódoló génállományának nagyságáról. A mai elképzelések szerint 948 emberi gén kódol GPCR-t [22], amely az emberi génállomány kb. 5 %-ának felel meg [23]. Számos olyan GPCR-t is sikerült már klónozni, amelyek endogén liganduma és funkciója egyelőre ismeretlen [21]. Ezek alapján kijelenthető, hogy a GPCR-ok területe a közeljövőben is intenzív kutatómunka tárgya lesz a világ vezető egyetemein és gyógyszercégeinél egyaránt.

2.1.1 GPCR kristályszerkezetek Kiemelkedő terápiás jelentőségük ellenére a GPCR-ok térszerkezetéről nagyon kevés információval rendelkezünk. Mivel a GPCR-ok TM fehérjék, ezért natív szerkezetüket a sejtmembránban nyerik el. Ebben a formában röntgen-krisztallográfiás vagy NMRspektroszkópiás vizsgálatuk igen körülményes. Ugyanakkor a membrán stabilizáló hatása nélkül a natív szerkezet nem, vagy csak korlátozottan vizsgálható. A kristályosítást különösen az IC3 hurok rendezetlensége nehezíti. Hosszú ideig csak a bakteriorodopszin esetében rendelkeztünk elektronkriomikroszkópiából származó szerkezeti információval [24]. A bakteriorodopszin azonban nem valódi GPCR, jóllehet mutat szerkezeti hasonlóságokat a GPCR-okkal (hét α-hélix építi fel). Ezt követően 2000-ben Palczewski és munkatársai 2.8 Å felbontással meghatározták a marha rodopszin (MR) térszerkezetét (PDB ID: 1F88) [25]. Később, a felbontást sikerült 2 Åig javítani (PDB ID: 1U19) [26]. Ez a szerkezet egészen napjainkig meghatározó jelentősséggel bír a GPCR-ok szerkezetkutatásában. 2007 októberében Kobilka és kutatócsoportja publikálta az első humán GPCR, a humán β2 adrenerg receptor két

9

különböző módszerrel az inverz agonista karazolol jelenlétében meghatározott kristályszerkezeteit. Az első esetben az IC3 hurokhoz egy antitestet kapcsoltak, amely stabilizálta annak konformációját, így lehetővé téve a kristályosítást [27]. A másik eljárás során az IC3 régiót a T4 lizozim enzimmel helyettesítették, amelynek stabil térszerkezete ugyancsak jelentősen javította a receptor kristályosíthatóságát [28]. 2008 júniusában Warne és munkatársai közölték a pulyka β1 adrenerg receptor az antagonista cianopindolol jelenlétében meghatározott kristályszerkezetét [29]. A szerzők itt mutációkkal és deléciókkal érték el a kristályosításhoz szükséges stabilitást. A GPCR-ok kristályosításának területén elért legújabb eredmények alapján valószínűsíthető,

hogy

a

közeljövőben

újabb

GPCR-ok

kristályszerkezetének

meghatározására kerülhet sor.

2.1.2 GPCR homológiamodellek Mivel a GPCR-ok topológiája azonos és az egyes képviselők szerkezeti homológiát is

mutatnak,

a

MR

kristályszerkezet

megteremtette

a

lehetőséget

GPCR

homológiamodellek készítésére. Ehhez a MR kristályszerkezet mellett a modellezni kívánt fehérje és a MR aminosav szekvenciáinak illesztésére van szükség. 2.1.2.1 Szekvenciaillesztés A szekvenciaillesztés során két vagy több szekvenciát tipikusan sorokként ábrázolunk, és rések megfelelő pozíciókba helyezésével azonos oszlopokba azonos vagy hasonló aminosavakat próbálunk illeszteni. Filogenetikai szemszögből nézve a szekvenciaillesztéssel a fehérjék evolúciós változását vizsgáljuk. Két fehérje aminosav szekvenciájának vizuális módszerrel történő illesztésére használhatjuk a pont-ábrázolást, ahol az egyes szekvenciák egy kétdimenziós mátrix első sorába, illetve oszlopába kerülnek. A mátrix azon celláiba, amelyekhez mindkét szekvenciában megegyező aminosav tartozik, egy pont kerül. Ezzel az eljárással könnyen felismerhetővé válnak a deléciók, az inzerciók és az ismétlődések. A pontábrázolás egyszerűen alkalmazható kvalitatív módszer, azonban hosszú szekvenciáknál nem elég hatékony.

10

A fehérjék aminosav szekvenciáinak algoritmusok által történő automatikus illesztése során a cél az optimális (legnagyobb homológiához tartozó) illesztés megtalálása. Egy adott pozícióban előforduló aminosavak változékonysága mutatja, hogy a fehérje adott részlete mennyire konzervált. A rések hiánya és az előforduló aminosavak nagyfokú konzerváltsága az adott pozícióban szerkezeti és/vagy funkcionális szerepre utal. Mivel a GPCR-ok TM régiója erősen konzervált, ezért a hélixek TM szakaszaiban ritkán fordulhat elő rés az illesztésben, és számos konzervált szekvencia segíti az optimális szekvenciaillesztés megtalálását. A szekvenciaillesztő algoritmusok az egyes illesztéseket aminosavak helyettesítési mátrixával és a rések büntetőpontozásával értékelik. A szekvenciaillesztő algoritmusokat működési elvük alapján lehetnek általános vagy lokális illesztő programok. Az általános illesztésnél a teljes szekvenciák összes lehetséges illesztését vizsgáljuk, a lokális illesztések viszont a szekvenciákban rövid, lokálisan előforduló homológiát keresnek. Az általános illesztések hasonló méretű és nagyfokú hasonlóságot mutató szekvenciák illesztésekor hatékonyak. Az általános illesztések egyik gyakran alkalmazott algoritmusa a Needleman-Wunsch algoritmus [30]. Ez a módszer az ún. dinamikus programozás alapelve szerint működik, vagyis egy adott problémát (jelen esetben az optimális szekvenciaillesztést) alproblémákra oszt fel, és ezeket egyenként megoldva jut el az alapprobléma megoldásához. Egy hasonlósági mátrixban rögzíti az egyes aminosavak hasonlóságát egymáshoz képest, az illesztésben a réseket büntetőpontokkal veszi figyelembe, és ez alapján pontozza minden egyes pozícióban az összes lehetséges illesztést. A lokális illesztések hatékonyabbak lehetnek hosszabb és kis hasonlóságot mutató szekvenciák illesztésében. Az egyik tipikus lokális illesztő algoritmus a Smith-Waterman algoritmus [31], amely a Needleman-Wunsch algoritmus módosított változata. A legfontosabb eltérés a két algoritmus között, hogy a Needleman-Wunsch algoritmus által alkalmazott hasonlósági mátrix negatív elemei a Smith-Waterman algoritmusban nullára vannak cserélve, és így a pozitív pontszámot kapó lokális illesztések előtérbe kerülnek. Két szekvencia illesztésére ugyancsak alkalmazhatók ún. heurisztikus módszerek, amelyek lényege, hogy egyértelmű logikus lépések helyett főként próbálkozással, korábbi tapasztalatok felhasználásával jutunk el a probléma megoldásáig. Ezek a módszerek ugyan nem garantálják a legjobb illesztés megtalálását, de sokkal

11

gyorsabbak, mint a dinamikus programozási eljárások. Ide tartozik a FASTA [32] és a BLAST [33] eljárás is. Ezek az algoritmusok egymással nem átfedő, rövid szekvenciák alapján végzik az illesztést. Ezek az eljárások különösen hatékonyak, amikor sok aminosav szekvencia párt kell illesztenünk. Ilyen feladat lehet például egy adott szekvencia homológjainak felkutatása egy nagy fehérje adatbázisban. A többszörös szekvenciaillesztés két szekvencia illesztésének a kiterjesztése. Így elvben alkalmazhatók a dinamikus programozás módszerei, azonban a szekvenciák számának növelésével ezek a módszerek túlságosan sok számítógépes kapacitást igényelnek. Ennek oka, hogy két azonos N-hosszúságú szekvencia esetében a lehetséges esetek száma N2, 10 szekvencia esetében pedig már N10. Ezért a dinamikus programozási eljárásokat csak néhány szekvencia illesztésénél tudjuk alkalmazni. A másik lehetőség a többszörös szekvenciaillesztésre a progresszív módszerek alkalmazása. Ezek a módszerek az összes szekvenciát először páronként illesztik, majd meghatározzák a szekvenciák távolságmátrixát. Ez alapján felépítenek egy filogenetikus vezérfát, amely alapján a leghasonlóbb szekvenciákat illesztik először, és fokozatosan haladnak a kevésbé hasonlók felé. A módszer hátránya, hogy a kezdeti illesztéstől nagymértékben függ a többszörös illesztés, ugyanis az elején bekerülő rések vagy illesztési hibák a későbbiekben már nem változnak. A progresszív módszeren alapuló egyik leggyakrabban alkalmazott illesztőprogram a Clustal [34]. Ennek módosított formája a ClustalW [35], amelyben a közeli szekvenciák illesztését kisebb súllyal veszi figyelembe az algoritmus. A progresszív módszer azon hibáját, hogy nagymértékben függ a kezdeti szekvenciapárok illesztésétől, iteratív módszerekkel próbálhatjuk meg kiküszöbölni. Ilyenkor a többszörös szekvenciaillesztés eredményét felhasználva a program újraszámolja a szekvenciák távolságmátrixát, amely alapján új filogenetikus fát készít, és ez alapján újra elvégzi a többszörös illesztést. Az iteráció addig folytatható, amíg az új többszörös illesztés már nem tartalmaz lényegi eltérést a korábbihoz képest. A GPCR-ok homológiamodellezésénél elegendő lehet egy páros szekvenciaillesztés is, azonban érdemes többszörös szekvenciaillesztéseket is végezni a konzerválódott régiók illesztésének pontosítására. A szekvenciaillesztést általában a korábban leírt módszereken alapuló automata szekvenciaillesztő programok segítségével végezzük.

12

Tanácsos azonban az automatikus illesztést átvizsgálni és szükség szerint módosítani, ugyanis nem feltétlenül a legnagyobb homológiához tartozó illesztés a helyes. 2.1.2.2 Modellépítés Korábban

a

modellezni

kívánt

fehérje

aminosavainak

oldalláncait

a

szekvenciaillesztés felhasználásával, geometriai szabályok alapján építették rá a templát gerincére. Ma már a szekvenciaillesztés és a templátok térszerkezetének birtokában automata programok segítségével (pl. MODELLER [36], Swiss-Model [37], Composer [38], Prime [39]) gyorsan elkészíthetjük a modellezni kívánt fehérje térszerkezetének modelljét. A MODELLER program a templát térszerkezete, valamint a templát és a modellezni kívánt fehérje aminosav szekvenciájának illesztése alapján távolsági kényszerek alkalmazásával próbál a templát térszerkezetéhez minél hasonlóbb homológiamodellt generálni. A szekvenciaillesztés alapján a templát térszerkezetéből kiindulva a MODELLER első lépésben előállítja azokat a térbeli kényszerfeltételeket, amelyeknek a végső modell(ek) minél nagyobb mértékben meg kell, hogy feleljen(ek). Ezeknek a kényszerfeltételeknek a definiálása 105 különböző családba tartozó, összesen 416 fehérjeszerkezet kísérleti úton meghatározott térszerkezetén alapszik. Amennyiben rendelkezünk valamilyen kísérleti adattal a modellezendő fehérje térszerkezetéről, akkor ezt saját kényszerfeltételként is definiálhatjuk és felhasználhatjuk a modellépítés során. Ilyen adat lehet például NMR mérésből származó távolsági kényszer, információ a másodlagos szerkezetről, mutációs adatok, fluoreszcencia spektroszkópiás vizsgálatok adatai, elektron mikroszkópos felvételből nyert információk, valamint keresztkapcsolási kísérletek adatai, amelyek specifikus atomok egymástól mért távolságára utalnak. Ezeket az adatokat távolságok, szögek, diéderes szögek, diéderes szögpárok, és néhány egyéb, atomok vagy pszeudo atomok közötti távolsághoz köthető tulajdonságok formájában lehet definiálni. Ezután a MODELLER konjugált gradiens optimálás és szimulált hőkezeléses molekuladinamika (MD) módszerek alapján próbálja megtalálni a legalacsonyabb energiájú modelleket. A megfelelő sztereokémia számításához a CHARMM erőtér [40] energiatagjait használja, miközben a kényszerfeltételeket büntető energiatagokként veszi figyelembe. Érdemes külön kiemelni, hogy a MODELLER

13

programban a MD szimuláció távolsági kényszerek mellett történik, amely GPCR-ok esetében kiemelten fontos, mert egy vákuumban történő MD szimuláció során a modell könnyen elveszítheti általános szerkezetét, viszont a távolsági kényszerek alkalmazása ezt megakadályozza. Általánosan elfogadott, hogy a GPCR-ok főlánc konformációja – főként a TM régióban – nagy hasonlóságot mutat, és ezért jól modellezhető a MR kristályszerkezet alapján. Sokkal nehezebb feladat ugyanakkor az aminosavak oldalláncainak modellezése. A mutációs adatok gyakran nyújtanak segítséget a kötőhelyet alkotó aminosavak oldalláncainak modellezésében. Az oldalláncok orientációja indokolt esetben módosítható, illetve a ligandumok illeszkedéséből nyert információ explicit módon is felhasználható [41]. Utóbbi módszer kidolgozója Andreas Evers és Gerhard Klebe, akik módszerüket „MOBILE”-nak nevezték el (Modeling Binding Sites Including Ligand Information Explicitly, vagyis kötőhelyek modellezése ligandum információ explicit felhasználásával) [42]. Számos olyan fehérjét ismerünk, amelyet különböző ligandumokkal együtt is sikerült már kikristályosítani, ezért ismert tény, hogy a ligandumnak jelentős hatása lehet a fehérje oldalláncainak konformációjára. A ligandum-információt hordozó homológiamodellek építésében ezért a megfelelő ligandum kiválasztása nagyban befolyásolhatja a modell hatékonyságát virtuális szűrésekben, ugyanis előfordulhat, hogy a fehérje kötőhelye túlságosan specifikussá válik egy ligandumra nézve, és így ez a modell nem alkalmazható eredményesen virtuális szűrésre [43]. Tekintve, hogy kevés információval rendelkezünk a ligandumok kötőkonformációjáról, ezért az esetek többségében azt a ligandumot választjuk a modell oldalláncainak finomításához, amelyről a legtöbb mutációs adat áll rendelkezésre. Fontos megjegyezni, hogy a ligandum kötőkonformációját a kristályosítás körülményei is befolyásolhatják. Ez a GPCR-ok esetében azért is lényeges, mert a MR kristályosításának körülményei jelentősen különböznek a sejt membránjában lévő fiziológiás állapotoktól. Ezek az adatok azt mutatják, hogy megfelelő minőségű GPCR homológiamodellek előállításához az oldalláncok és a főlánc konformációjának finomítására is szükség lehet.

14

2.1.2.3 Modellvalidálás Az elkészült homológiamodelleket elsőként a rendelkezésre álló mutációs adatok alapján validálhatjuk. Azok az aminosavak, amelyek bizonyítottan szerepet játszanak ligandumok kötésében a végső modellben a kötőhely belseje felé kell nézzenek. Amennyiben ez nem teljesül, valószínűleg hibát vétettünk a szekvenciaillesztés vagy a modellépítés során. Az elkészült homológiamodellek minőségét ún. validáló programokkal is ellenőrizzük. Mivel az irodalomban számos ilyen program alkalmazását írták már le, jelen munkában csupán az általunk alkalmazott módszereket ismertetjük, amelyek véleményünk

szerint

legkritikusabb

paraméterek

alapján

elemzik

a

GPCR

homológiamodelleket. Első lépésként a fehérje főláncának geometriai paramétereit jellemezzük a Ramachandran eloszlással, amelynek felvételére többek között a PROCHECK programmal van lehetőség [44]. Ez az eloszlás kísérletesen meghatározott kristályszerkezetek főlánckonformációiból származó adatokon alapszik, és segítségével megvizsgálhatjuk, hogy mely aminosavaknak van szokatlan Φ/Ψ szögpárja. A glicin aminosavakban β-helyzetben metil csoport helyett hidrogén atom található, ezért a Φ/Ψ szögpár tekintetében sokkal nagyobb a konformációs szabadságuk, mint a többi aminosavnak, ezért a Ramachandran eloszlásban nem szerepelnek. A prolin aminosavak ugyanakkor a ciklikus felépítésük miatt csak pontosan meghatározott Φ/Ψ szögeket vehetnek fel, így a Ramachandran eloszlásban szintén nem szerepelnek. Amennyiben a Ramachandran eloszlás csak elvétve, és akkor is a modell vizsgálni kívánt részétől távol jelez szokatlan Φ/Ψ szögpárokat, úgy a modell alkalmazható lehet. Mivel a GPCR-ok ligandum-kötő része gyakran a TM régióban van, ezért ilyenkor az IC és EC hurkok aminosavai távol esnek a kötőhelytől. Ezek az oldalláncok kevésbé konzerváltak, ezért itt gyakrabban fordulnak elő szokatlan konformációk. Másrészről, a GPCR-ok ezen részei a valóságban vízmolekulákkal és a membrán fejcsoportjaival alakítanak ki kölcsönhatásokat, amelyek vákuumban készült modellekben nincsenek jelen. Hasonló okból a TM rész azon aminosavai, amelyek kifelé (a valóságban a membrán felé) fordulnak, ugyancsak nehezebben modellezhetők vákuumban. A PROCHECK program segítségével vizsgáljuk a fehérje főláncának egyéb fontos paramétereit is, így például a

15

peptid-kötések planaritását, a főlánc kötéshosszakat és kötésszögeket valamint a kedvezőtlen nem-kötő kölcsönhatásokat. Lehetőség van a fehérjére átlagosan jellemző paraméterek elemzésére, valamint azok aminosav-szintű lebontásának vizsgálatára. A PROCHECK a számított paramétereket összeveti a Protein Adatbázis (PDB) nagyfelbontású kristályszerkezeteiben tapasztalt értékekkel. A fehérjemodell oldalláncainak állásáról kevés információval rendelkezünk a GPCR homológiamodellek

esetén.

Az

oldalláncok

konformációjának

vizsgálatára

a

PROCHECK által számított χ1/χ2 és χ3/χ4 torziós szögpáreloszlások vizsgálatával nyerhetünk információkat. Fontos jellemzője a modellnek a G-faktor (jósági faktor), amely a torziós szögekre (Φ/Ψ, χ1/χ2 (χ2-vel nem rendelkező aminosavaknál csak χ1), χ3/χ4 és Ω) és a kovalens geometriára (főlánc kötésszögek és főlánc kötéshosszak) számolt pontokból képzett átlagos sztereokémiai paraméter. A modell energetikai jellemzőit a PROSA programmal vizsgálhatjuk [45]. A PROSA által felvett z-pontszám eloszlás segítségével azonosíthatjuk a modell azon aminosavait, amelyeknek a környezetükkel számított kölcsönhatási energiája magas. Az egyes aminosavakra számított z-pontszám egy olyan tudásalapú leíró, amely több ezer experimentálisan meghatározott fehérjeszerkezet tapasztalataira épül. A kiugró pozitív z-pontszámok feszült, rosszul prediktált szerkezetre utalnak. A fehérjemodell térszerkezetét vizsgálhatjuk a HARMONY program segítségével abból a szempontból, hogy az egyes aminosavak milyen valószínűséggel találhatók meg a fehérjeszekvencia adott pozíciójában [46]. Ehhez a HARMONY program az aminosavak

környezetét

három

szempont

(főlánc

konformáció,

oldószer

hozzáférhetőség és H-kötések) szerint jellemzi, majd a vizsgált fehérjeszekvenciát alapul véve egy homológ keresést hajt végre a SWISS-PROT adatbázisban. A találatok számának arányában a HARMONY elveti a legközelebbi rokon fehérjéket, majd megvizsgálja, hogy a fennmaradó rokon fehérjékben az adott pozícióban található aminosav milyen lokális környezettel rendelkezik, és ezt veti össze az általunk vizsgált fehérje adott aminosavának lokális környezetével. A HARMONY, ugyancsak a homológ fehérjék szekvenciáinak illesztésével, azt is vizsgálja, hogy az adott pozícióban mekkora a valószínűsége, hogy az adott aminosavat egy másikkal lehessen helyettesíteni. Lehetőség van globális és lokális térszerkezeti problémák feltárására is a

16

fehérje teljes szekvenciájára ill. az egyes aminosavakra vonatkozó pontszámok vizsgálatával. A fehérjemodell egyes aminosavainak a környezetükkel kialakított nem-kötő kölcsönhatásait a WHATIF program „packing quality” tesztjével vizsgálhatjuk [47]. Ebben a tesztben a WHATIF program a fehérjék aminosavait a legnagyobb lehetséges fragmensekre osztja, amelyekben még nincs torziós szög. Ezeknek a fragmenseknek a környezetét vizsgálja, és veti össze a PDB nagyfelbontású kristályszerkezeteivel. Amennyiben a WHATIF program által számolt pontszám bizonyos aminosavak esetében alacsony, akkor ennek a hátterében állhat kofaktorral alkotott kölcsönhatás, vagy elképzelhető, hogy az aminosav a kötőhely része, és olyan szabad kölcsönhatási felületek veszik körül, amelyeket a kötődő ligandum képes lefedni. Amennyiben egy hosszabb szekvencia pontszáma alacsony, az rosszul feltekert térszerkezetre utal. Mivel a fent leírt módszerek mindegyike alapvetően experimentálisan meghatározott kristályszerkezetekből nyert információkra épül, fontos megjegyezni, hogy jelenleg mindössze három GPCR-ról áll rendelkezésre kristályszerkezet, vagyis a GPCR-ok a validáló

programok

tanító

halmazában

alul

vannak

reprezentálva.

Ez

azt

eredményezheti, hogy egyes GPCR-okban a validáló programok tévesen értékelnek problémásnak egy adott aminosavat vagy szekvenciát. 2.1.2.4 GPCR modellek alkalmazásai A MR kristályszerkezet a receptor inaktív formáját tartalmazza, ezért elsősorban antagonista jellegű GPCR modellek készítésére nyújt lehetőséget. Mivel a GPCR-ok közötti homológia a TM részen a legkifejezettebb, ezért ezen modellek főként azokban az esetekben bizonyulnak hasznosnak, amikor a ligandum kötőhelye a TM részen van. GPCR homológiamodelleket sikerrel alkalmaztak többek között mutációs adatok értelmezésére [48-62], ligandumok kötőhelyének felderítésére, ill. ligandumok dokkolására [6,48-57,62-64]. Az utóbbi években néhány szerző sikeres virtuális szűréseket is publikált GPCR homológiamodelleken [42,65,66]. Ezzel a módszerrel számos új, aktív vegyületet sikerült felfedezni [53,65-67], ami jól mutatja a homológiamodellek alkalmazhatóságát a fehérjeszerkezet-alapú gyógyszertervezésben. Fontos megemlíteni azt is, hogy míg a ligandum-alapú módszerek nagymértékben

17

függnek a tanító halmaztól amelyre a modell épül, addig a fehérjeszerkezet-alapú szűrés nagyobb eséllyel találhat teljesen új ligandum szerkezeteket. A farmakofór megközelítéssel könnyen elveszíthetjük azokat a molekulákat, amelyek a kötőhely eddig fel nem derített részeihez kötődnének. Másrészről a farmakofór alapú megközelítés alkalmazhatóságának feltétele, hogy jelentős számú molekuláról álljon rendelkezésre megbízható biológiai adat. A fehérjeszerkezet-alapú dokkolás nagy hátránya ugyanakkor, hogy jelentős számítógépes kapacitást igényel. Előnye viszont, hogy a nagy adatbázisok szűrése párhuzamosítható, és így számítógép klaszterek is alkalmazhatók a megvalósítására. Erre jó példa az ún. „Screensaver” (képernyővédő) projekt, amely nagyszámú felhasználó bevonásával zajlott, és rákellenes célpontokat gátló ligandumok keresésén alapult [68].

2.2 Szerkezet-alapú virtuális szűrések Napjainkban a gyógyszerkutatás általában egy jól definiált hatásmechanizmus alapján történő célfehérje kiválasztás után, a célfehérjéhez kötődő kismolekulák, ún. találatok azonosításával kezdődik. Ezt követően a feladat a találatok számos szempont szerinti (affinitás, szelektivitás, ADMET paraméterek) optimálása, amely ideális esetben kedvező in vivo terápiás hatással rendelkező gyógyszerjelölt molekulákhoz vezet. A virtuális szűrések célja olyan kismolekulák (találatok) azonosítása, amelyek az adott célfehérjéhez jelentős affinitással kötődnek. A szerkezet-alapú virtuális szűrési eljárás alapja egy kismolekulákból álló adatbázis dokkolása a fehérjemodell kötőhelyére, a kötőkonformációk értékelése pontozással, majd a pontozás alapján egy rangsor felállítása. Az így kapott rangsor elején lévő molekulák hatékonyságát biológiai tesztekkel vizsgálhatjuk.

2.2.1 Dokkoló algoritmusok Kismolekulák dokkolása egy fehérje aktív helyére valójában a konformációs analízis egy

speciális

esete,

energiaszintjeihez

ahol

tartozó

a

kismolekula-receptor

elrendeződéseket

keressük.

komplex Ennek

legalacsonyabb a

feladatnak

a

megoldásában kulcsfontosságú a ligandum és a receptor flexibilitásának kezelése.

18

Korábban a ligandum-receptor kötődés jellemzésére a klasszikus „kulcs-zár” modellt alkalmazták, így a ligandum és a fehérje szerkezetét alapvetően rigidnek tekintették a dokkolás során. Ma a „kéz a kesztyűben” analógia inkább elfogadott, vagyis hogy a kötődés során a ligandum, sőt a fehérje szerkezete is változik. A legelső algoritmusok mind a fehérjét, mind a ligandumot merev testként kezelték. Erre példa az első dokkoló program (DOCK), amelyet Kuntz és kutatócsoportja fejlesztett ki 1982-ben [69]. A DOCK program először a fehérje kötőhelyét felületek formájában képezi le, majd olyan gömböket definiál, amelyek kitöltik az aktív helyet. Ezek után a gömbök középpontjait a ligandum egyes atomjainak próbálja megfeleltetni, majd végül az így kialakított ligandum-receptor komplexeket értékeli pontozással. Az eljárás lényegében geometriai és kémiai kompatibilitást vizsgál a ligandum és a fehérje kötőhelye között. A DOCK programban a ligandumok flexibilitását úgy vehetjük figyelembe, hogy a fenti dokkolási eljárást a ligandum megfelelően nagyszámú konformerére elvégezzük. Ez a módszer azonban sok forgatható kötést tartalmazó ligandumok esetében nagyon számításigényes. A DOCK algoritmusához hasonló szisztematikus módszerek célja, hogy a dokkolási feladat összes szabadsági fokát feltérképezve találja meg a legjobb megoldást. A fragmens alapú dokkolási eljárások a DOCK eljárás azon korlátját igyekeznek kiküszöbölni, hogy a ligandumok összes konformációját dokkolni és értékelni kelljen. Egy tipikus fragmens alapú algoritmus alapján dokkol a FlexX dokkoló program [70], amely inkrementálisan építi fel a ligandumot a fehérje kötőhelyén. Az eljárás során a ligandumot az egyszeres forgatható kötések mentén feldaraboljuk, és néhány alapfragmentum kerül kiválasztásra. Az alapfragmentumok állhatnak több fragmensből is. A FlexX azzal a feltevéssel él, hogy az alapfragmentumok az oldalláncok nélkül is abban az orientációban és konformációban dokkolódnak, mint a teljes ligandumban. Az alapfragmentumok dokkolása a kötőhelyre a kedvező kölcsönhatások számának maximalizálásával történik. Az algoritmus először azonosítja a kötőhely betölthető kölcsönhatási pontjait, ezeket háromszögekként ábrázolja, és arra törekszik, hogy az alapfragmentum ezek közül minél többet elfoglaljon. Az alapfragmentumok lehetséges kötőkonformációinak előállítása után a FlexX egyenként kapcsolja a megfelelő oldalláncokat az alapfragmensekhez. A FlexX minden lépésben pontozza a kötőkonformációkat és csak a legkedvezőbb esetekben folytatja a molekula felépítését.

19

A megoldások klaszterezésével az algoritmus elveti azokat a megoldásokat, amelyek túl hasonlóak egymáshoz. A dokkoló algoritmusok másik nagy csoportja sztochasztikus módszerrel keresi a ligandum legalacsonyabb kötőkonformációit. Ide tartoznak a Monte Carlo módszerek, a genetikus algoritmusok és a „tabu” keresés. A Monte Carlo módszerek a ligandum véletlenszerűen kiválasztott konformációiból indulnak ki. Ezután a kötőhellyel kialakított kölcsönhatások alapján döntenek az adott konformáció megtartásáról vagy elvetéséről. Monte Carlo módszeren alapszik az ICM dokkoló algoritmus [71]. A

genetikus

algoritmusok

a

dokkolási

probléma

megoldásait

jelentő

kötőkonformációkat kromoszómákként kezelik, amelyek génjei egy-egy szabadsági foknak felelnek meg. A genetikus algoritmusok egy véletlenszerű populációt hoznak létre, amelyeknek tagjait egy értékelőfüggvénnyel pontozzák. Az egyes kromoszómák további sorsát ez az értékelés határozza meg. A legjobb kromoszómák változatlanul kerülnek tovább a következő generációba. A legrosszabb kromoszómákat az algoritmus elveti. Az algoritmus ezek után az összes olyan kromoszómából, amely nem került kidobásra, új kromoszómákat generál a genetika szabályai szerint mutációk és kereszteződések által. A sztochasztikus jelleget a „szülő” kromoszómák véletlenszerű kiválasztása adja. Az iteráció addig folytatódik, amíg egy előre

rögzített

generációszámot el nem érünk. A SYBYL [38] programban található FlexiDock modul a genetikus algoritmusok közé tartozik. A FlexiDock programban az oldalláncok megfelelő szabadsági fokainak génekként való leírásával lehetőség van a fehérje oldalláncainak flexibilis kezelésére. A FlexiDock értékelőfüggvénye a Tripos erőtérre épül [38]. A FlexiDock minden populációgenerálás után ellenőrzi, hogy keletkeztek-e azonos kromoszómák (minden gén helyén megegyező allél), és ha igen, akkor eltávolítja a duplikátumokat. A „szigetek” számának növelésével lehetőség van részben elszigetelt,

egymással

csak

megfelelő

időközönként

„keveredő”

populációk

létrehozására is. A mutációk mértéke és a bekövetkezés valószínűsége is állítható. A „tabu” keresés ugyancsak a sztochasztikus eljárások közé tartozik. Lényege, hogy a ligandum egy kezdőkonformációjából véletlenszerűen generál új konformációkat, amelyeket értékel, és a legjobbat kiválasztva újrakezdi a konformáció generálást. Annak elkerülése érdekében, hogy már korábban kiválasztott konformáció legyen az új

20

generálás kiindulópontja, ún. „tabu” listát hoz létre, amelyben tárolja a korábban felhasznált konformációkat, ezért az eljárás hatékonyan alkalmazható a helyi minimumokból való kitörésre. A „tabu” keresés módszerét használja a PRO_LEADS program algoritmusa [72].

2.2.2 Értékelőfüggvények A dokkoló algoritmusok által előállított ligandum-receptor komplexekre vonatkozó kötődési szabadentalpiát különböző értékelőfüggvények alapján becsülhetjük. Ezt a becslést az értékelőfüggvények különböző

típusú energiatagok összegzésével

számolják. Minden függvény kísérleti adatokra épül, ezért magában hordozza a hiba lehetőségét. Fontos megemlíteni, hogy a kristályszerkezetek csak a kedvező kölcsönhatásokról hordoznak információkat, ezért az ezekre épülő értékelőfüggvények használhatósága megkérdőjelezhető. Az értékelőfüggvényeket alapvetően három csoportba soroljuk: erőtér-alapú, empirikus és tudás-alapú függvények. Az erőtér-alapú függvények egy ismert molekulamechanikai erőtér energiatagjait felhasználva becslik a kötődési szabadentalpiát. Az erőterekből főként a nemkötő kölcsönhatásokhoz tartozó energiatagokat használják fel, néha szolvatációs és entrópia energiatagokkal kombinálva. Előnyük, hogy az erőterek széles körben tesztelt, pontosan paraméterezett

egyenleteire

épülnek,

ugyanakkor

gyakran

túlértékelik

az

elektrosztatikus tagokat. Ilyen függvény például a DOCK programban használt AMBER erőtéren alapuló értékelőfüggvény (D-score) [69], amely elektrosztatikus és lipofil energiatagokat tartalmaz:

D − score =

 A qi q j  B   − 6 + 332 12  D rij  rij fehérje rij 

∑ ∑ ligandum

ahol qi és qj az i és j atomok töltései, D a dielektromos állandó, A és B a megfelelő van der Waals paraméterek, rij az i és j atomok távolsága. Az erőtér-alapú értékelőfüggvények közé tartozik a GOLD [73] és a FLOG [74] programok értékelőfüggvénye

is.

Fontos

21

megemlíteni,

hogy az

erőtér-alapú

értékelőfüggvényeknél a van der Waals kölcsönhatásokat figyelembe vevő LennardJones 6-12 potenciál kis távolságoknál gyakran túlértékeli a taszító erőt, ezért ezeket sok esetben finomítani szokták (GOLD: 4-8, FLOG: 6-9). Az

empirikus

értékelőfüggvények

kristályszerkezetekben

található

a

explicit

kötődési

H-hidas

és

szabadentalpiát

hidrofób

a

kölcsönhatások

pontozásával becslik, a kísérletileg meghatározott kötődési energia értékének felhasználásával. Ezek a függvények a klasszikus nemkötő kölcsönhatásokra vonatkozó energiatagokon kívül egyéb járulékos tagokat is felhasználhatnak. Erre példa a ChemScore-ban [75] található hidrogén-kötő energiatag, amely a távolságok mellett a megfelelő orientációt is figyelembe veszi. Ugyancsak a ChemScore-ban található egy rotációs energiatag, amely az entrópia-effektus becslésére szolgál. Szintén empirikus függvény a FlexX saját értékelőfüggvénye a FlexX-Score [70]. A FlexX-Score az ideális

H-hidas,

ionos,

aromás

és

lipofil

kölcsönhatásoktól

való

eltérést

büntetőfüggvények formájában írja le:

∑ f (∆R, ∆α ) + ∆G

∆G = ∆G0 + ∆G rot × N rot + ∆G H − hidas

H − hidas

+ ∆G aromás

∑ f (∆R, ∆α ) + ∆G aromás

lipofil

ionos

∑ f (∆R, ∆α ) ionos

∑ f (∆R ) lipofil

ahol ∆G a kötődési szabadentalpia, ∆G0 a zérusponti szabadentalpia, ∆Grot a rotációs szabadsági fokok befagyasztásából származó energiatag, Nrot a ligandum forgatható kötéseinek száma, ∆GH-hidas a H-hidakból származó energiatag, ∆Gionos az ionos kölcsönhatásokból származó energiatag, ∆Garomás az aromás kölcsönhatásokból származó energiatag, ∆Glipofil a lipofil kölcsönhatásokból származó energiatag és f(∆R,∆α), illetve f(∆R) a távolság és szögfüggő, valamint a távolságfüggő büntetőfüggvények. Ezeknek a módszereknek a hátránya, hogy általában szűk tanítóhalmazra épülnek, ugyanis kevés olyan ligandum-receptor komplex van, ahol a kristályszerkezet és a kötődési energia értéke is rendelkezésre áll. Azokat az értékelőfüggvényeket, amelyek szögfüggő energiatagokat tartalmaznak „erős” értékelőfüggvényeknek nevezzük, ugyanis ezek a kötőkonformáció kis változtatására is érzékenyen reagálnak. Az

22

empirikus értékelőfüggvények tipikusan az „erős” értékelőfüggvények közé tartoznak. Ezzel szemben azokat a függvényeket, amelyekben nincsenek ilyen energiatagok a „lágy” értékelőfüggvények csoportjába soroljuk. A tudás-alapú értékelőfüggvények ugyancsak a kristályszerkezetekben található kölcsönhatásokra épülnek, ezeket azonban implicit módon veszik figyelembe, ugyanis a kristályszerkezetekben az egyes kölcsönhatások előfordulási valószínűsége alapján értékelik a ligandum-receptor komplexeket. Széles körben alkalmazott tudás-alapú értékelőfüggvények a PMF-Score [76] és a DrugScore [77].

PMF − Score =

∑ ∑ A (d ) ij

ij

ligandum fehérje

ij  j (r ) ρ seg Aij (d ij ) = − k B T ln  f térf _ korr (r ) ij  ρ tömb  

ahol Aij(dij) az egyes ligandum-fehérje atompárokhoz tartozó kölcsönhatás szabadentalpiája, kB a Boltzmann-állandó, T a hőmérséklet, f térfogatkorrekciós faktora, ij

atomtávolságnál, ρ

tömb

ρijseg(r)

j térf_korr(r)

a ligandum

az ij típusú atompárok sűrűsége egy adott r

az ij típusú atompárok sűrűsége egy 12 Å sugarú

referenciakörben. Ezek a függvények sokkal több adatra épülnek, mint az empirikus függvények, mivel csak a kristályszerkezetekben rejlő információkat használjuk fel, és nincs szükség kísérletileg meghatározott affinitás adatra. Az empirikus értékelőfüggvényekkel szemben a tudás-alapú függvények kevésbé érzékenyek az ideális szögektől való kis eltérésekre, ezért többségük a „lágy” csoportba tartozik.

2.2.3 Dúsulási tesztek Egy modell virtuális szűrésre való alkalmazhatóságát ún. dúsulási tesztekkel vizsgálhatjuk. Ezek a tesztek megmutatják, hogy a véletlen kiválasztáshoz képest mekkora hatékonysággal képes kiválasztani a modellünk aktív vegyületeket inaktívak

23

közül. Az inaktív molekulakészlet tipikusan diverz, gyógyszerszerű csalétek molekulákból áll. Ezek származhatnak például a célfehérjén végrehajtott nagy áteresztőképességű szűrésekből (HTS), ahol nem mutattak szignifikáns aktivitást. Amennyiben ilyen adatok nem állnak rendelkezésre, olyan csalétek molekulákat kell választanunk, amelyek affinitása az adott célfehérjéhez nem ismert. Ugyanakkor az átlagos HTS találati arányokat figyelembe véve (0.5-1 %) nagy eséllyel ezeket a vegyületeket is inaktívaknak tekinthetjük. A dúsulási faktorokat a következő képlet alapján számíthatjuk ki:

N aktív (% ) DF (% ) =

N (% ) N aktív N összes

ahol Naktív(%) az aktív molekulák száma a sorbarendezést követően a felső x %-ban; N(%) a tesztben szereplő molekulák felső x %-a; Naktív az összes aktív molekula száma a tesztben; Nösszes az aktív és inaktív molekulák együttes száma a tesztben. Mivel egy adott ligandum esetében a legjobb kötőkonformáció megtalálása, valamint az egyes kötőkonformációk pontozása két különböző feladat [78], ezért ezeket az értékelőfüggvények eltérő hatékonysággal tudják kezelni. Célszerű tehát a dúsulási tesztekben

mindkét

feladatra

felhasználni

az

összes

rendelkezésre

álló

értékelőfüggvényt. GPCR homológiamodelleken végzett dúsulási tesztek azt mutatták, hogy a modellek előrejelző képessége elmarad ugyan a kristályszerkezetekétől [79], azonban mint a HTS költséghatékony alternatívái sikerrel alkalmazhatók új alapszerkezetek felderítésére [80].

24

2.3 A hisztamin és a hisztamin receptorok felfedezése A hisztamin különböző emlős és növényi szövetekben, szövetnedvekben széles körben megtalálható, innen ered az elnevezése is (histos görögül = szövet). Biológiai hatását először Sir Henry Dale írta le 1910-ben [81]. A hisztamin felfedezését követően több mint 20 év telt el az első H1 antagonisták (antihisztaminok) megjelenéséig [82,83]. Az első antihisztaminokról szóló kutatási eredmények alapvetően kvalitatív jellegűek voltak [82], de rámutattak a hisztamin néhány alapvető funkciójára, és ekkor találták meg a H1 antagonisták közül a mepiramint (másnéven pirilamin), amelyet máig használnak a hisztamin receptorok jellemzésében. Daniel Bovet a kuráre és az antihisztaminok korai kutatásában elért eredményeiért 1957-ben Nobel díjban részesült. Ebben a kezdeti időszakban még nem állt rendelkezésre elegendő adat arról, hogy a hisztamin fiziológiás hatásait milyen módon fejti ki, így még az sem volt ismert, hogy ezek a funkciók különböző hisztamin receptor altípusokhoz kapcsolhatók. Az első antihisztaminok – H1 antagonista hatásuk révén – hatékonyan gátolták, pl. a simaizom összehúzódását. Ugyanakkor számos adat utalt arra, hogy a rendelkezésre álló antihisztaminok nem minden hisztamin hatást képesek blokkolni [84]. A hisztamin által stimulált szekréciót a gyomorban például több antihisztamin is képtelen volt gátolni [85]. Shild és kutatócsoportja megmutatta, hogy a hisztamin pozitív kronotróp hatása a szív jobb pitvarában és a simaizom összehúzó hatás a csípőbélben két különböző receptorral hozható összefüggésbe [86,87]. Ezt követően a csípőbéli simaizom összehúzó hatásért felelős receptort H1 receptornak, a szív pitvarában tapasztalt kronotróp hatásért felelős receptort pedig H2 receptornak nevezték el. 1972-ben Sir James W. Black jelentős eredményeket mutatott fel a H2 receptor jellemzésében [88]. Munkatársaival kifejlesztették az első klinikumban is sikeresen alkalmazott H2 antagonistát, a cimetidint, amely a gyomor peptikus fekélyének kezelésében bizonyult hatásosnak. Sir James W. Black-et a H2 antagonista cimetidin és a β-blokkoló propranolol kifejlesztéséért 1988-ban Nobel-díjjal tüntették ki. A H3 receptor létezését először 1983-ban egy funkcionális teszttel sikerült igazolni. Ebben a tesztben a hisztamin az agykéregben gátolta saját szintézisét és a vezikulákból történő felszabadulását. Ezt a hatást H1 ill. H2 ligandumok nem a H1 ill. H2 affinitásuknak megfelelően befolyásolták, ami egy új hisztamin receptor jelenlétét valószínűsítette

25

[89]. A H3 receptor klónozása azonban 1999-ig váratott magára [90]. A H3 receptornak számos izoformáját sikerült kimutatni, amelyek az IC3 hurok hosszában mutattak egymástól eltérést. A különböző H3 receptor izoformák intenzív kutatása vezetett a H4 receptor felfedezéséhez. Raible és kutatócsoportja már 1994-ben valószínűsítette egy olyan hisztamin receptor létezését, amely eozinofil granulocitákon fordul elő és nem azonos egyik korábbi hisztamin receptorral sem [91]. Végül, 2000-ben és 2001-ben több egymástól független kutatócsoport jelentette be a H4 receptor sikeres klónozását [9296].

2.4 A hisztamin receptorok farmakológiája Jóllehet, H1 receptor blokkolók már az 1930-as években rendelkezésre álltak, a humán H1 receptort csak 1993-ban sikerült klónozni [97]. Az első szelektív radioaktív H1 ligandumok előállítása fontos szerepet játszott a H1 receptor szöveti eloszlásának meghatározásában. A radioaktív [3H]-mepiramin 1977-es kifejlesztését követően [98] sikerült kimutatni H1 receptorok jelenlétét többek között az agyban, légutak simaizomszövetében, a gasztrointesztinális traktusban, a kardiovaszkuláris rendszerben, a mellékvesevelőben, endotél sejteken és limfocitákon [99]. A H1 receptor Gαq/11-típusú G-proteint köt. A legfontosabb H1 receptorhoz köthető hisztamin hatások közé tartozik a simaizom összehúzódás, a nitrogén-monoxid képződés stimulációja, az endotél sejtek kontrakciója, az érpermeabilitás növekedés, az értágulás és a negatív inotróp hatás a szívben [99]. Míg a H1 receptor agonistáival kapcsolatban nincs tudomásunk terápiás alkalmazásokról, H1 receptor gátlókat már 1945-től széles körben használtak allergiás tünetek (allergiás nátha, csalánkiütés) enyhítésére [100]. Az első generációs antihisztaminok ugyanakkor nem voltak mentesek a mellékhatásoktól. Erős nyugtató hatásuk komolyan visszavetette allergia elleni alkalmazásukat. Ugyanakkor éppen a nyugtató hatást igyekeztek kihasználni, pl. a difenhidramin (Daedalon®) esetében, amelyet napjainkban is alkalmaznak hányáscsillapítóként utazási rosszulléteknél. A nyugtató mellékhatás részben a központi idegrendszerben lévő H1 receptorokhoz, részben pedig perifériás muszkarinos kolinerg receptorokhoz köthető. A mepiramin tipikus képviselője az első generációs antihisztaminoknak. Nagy affinitása mellett jelentős nyugtató hatása van. A nyugtató hatást alapvetően a nagyfokú agyi penetráció,

26

és az agyban található H1 receptorokhoz való kötődés okozza. Számos első generációs antihisztamint ismerünk, amelyek csak kismértékben különböznek a mepiramin szerkezetétől (klórfeniramin, difenhidramin, tripelennamin, triprolidin, klórciklizin, kloropiramin) (2.4.1. ábra).

Cl O

+

N

+

H

Mepiramin

N

N

N

N

+

H

N

N

Klórfeniramin

H

Triprolidin

Cl

N

+

H

N

N

H N

N

+ Klórciklizin

Tripelennamin

Cl H N

+ N

H

N

O

+

N

Kloropiramin

Difenhidramin

2.4.1. ábra. A H1 antagonista mepiramin és szerkezeti analógjai.

Ezek a molekulák jellegzetesen két aril csoportot tartalmaznak. Az egyik fenil gyűrűhöz para helyzetben kis térkitöltésű szubsztituens kapcsolódhat. A protonált amin csoport 4-5 kötéstávolságnyira található az aromás gyűrűktől. Néhány fenotiazin származékról észrevették, hogy enyhítik az allergiás tüneteket. Ez a felfedezés új lendületet adott a H1 antagonista kutatásnak, és a fenotiazin

27

alapszerkezetből kiindulva számos tri- és tetraciklusos H1 antagonista vegyületet fejlesztettek ki (2.4.2. ábra). O

S

Cl N

N

+

+

H

H

N

N

N

Fenotiazin

Doxepin O O O

S

O

Loratadin

-

O

Cl

N

+

+

H

N

N

Prometazin

H N

+

Olopatadin

N H

Dezloratadin S O Cl

N

+

N H

S

N

+

N

N

H

Klórpromazin

Epinastin

+ N H

Ketotifen

2.4.2. ábra. Tri- és tetraciklusos H1 antagonisták.

A doxepin, az epinasztin és a ketotifen nagy affinitással kötődnek a H1 receptorhoz, de egyéb receptorokhoz is [101]. Néhány később megjelent vegyület azonban (dezloratadin [102], loratadin [103] és olopatadin [101]) a jelentős H1 affinitás mellett már szelektívnek bizonyult.

28

Az ikerionos H1 antagonisták (2.4.3. ábra) ugyancsak jelentős szelektivitást mutattak, amely specifikus kölcsönhatást valószínűsített ezen ligandumok karboxil csoportja és a hH1R valamely H-donorként viselkedő aminosava között.

Cl

+ N

H N

+ N

H

O

N O

O

O

O

Akrivasztin

Cetirizin

O

O

O

OH N+

OH

+

O H

H

N O

Olopatadin

Fexofenadin

2.4.3. ábra. Ikerionos H1 antagonisták.

Mutációs adatok alapján feltételezték, hogy ezek a ligandumok a Lys191 (5.39) aminosavval lépnek kölcsönhatásba [104]. Ez a második ionos kölcsönhatás megteremti a lehetőségét új, nagy affinitású és szelektív H1 antagonisták tervezésének, amelyek nem lépik át a vér-agy gátat. A H1 antagonisták második generációja már kevésbé vált ki nyugtató hatást, amely a nagyobb szelektivitás és a gátolt agyi penetráció következménye. Ugyanakkor ezek a vegyületek (pl. cetirizin, loratadin) jelentősen alacsonyabb H1 affinitással rendelkeznek, mint az első generációs mepiramin. Érdekes módon, a klinikai tapasztalatok alapján – a nagyobb szelektivitás és a gátolt agyi penetráció ellenére – ezek a vegyületek is enyhén nyugtató hatásúak. A klinikai alkalmazások során egy másik nagyon veszélyes mellékhatásra is fény derült. Két második generációs antihisztamin, az asztemizol

29

(Hismanal®) és a terfenadin (Seldane®, Triludan®, Teldane®) kardiotoxicitásuk miatt kerültek visszavonásra. A cetirizin (Zyrtec®) és a loratadin (Claritine®) továbbra is széles körben alkalmazott gyógyszerek az allergiás nátha kezelésében. Az utóbbi néhány évben új antihisztaminok is megjelentek a piacon, pl. dezloratadin (Aerius®), fexofenadin (Telfast®) és olopatadin (Pataday®). Általánosságban elmondható, hogy a H1 antagonisták alkalmazása jelentősen javítja az allergiában szenvedő betegek életminőségét, ugyanakkor egyes krónikus allergiás megbetegedésekben, mint például az asztma, kevéssé bizonyultak hatásosnak [105]. A H2 receptor jelentős mennyiségben fordul elő többek között az agyban, a szívben és a gyomor szöveteiben [99]. Terápiás szempontból a legjelentősebb a gyomorszövet sósav szekréciójának szabályozásában játszott szerepe [88,106,107]. A H2 receptor Gαstípusú G-proteint köt. A szelektív H2 antagonisták kifejlesztése klasszikus példája a racionális gyógyszerkutatásnak [88], jóllehet az első (kutya) H2 receptor klónozására csak 1991-ben került sor [108], amelyet nem sokkal később a patkány, humán, tengerimalac és egér H2 receptorok klónozása követett [109-112]. Az első vegyület, amely nagyobb affinitással kötődött a H2, mint a H1 receptorhoz a burimamid volt (2.4.4. ábra).

30

S

S N

S

N

N

N

N

N HN

+

NO2 H

N

Burimamid

Nizatidin

N HN N

N

N

N

S

S O

S

+

NO2 H

N

Metiamid Ranitidin

N

N

N

N

N

S

HN

S

S N

N

N N

N

N

N

N

Cimetidin

Tiotidin

O

O S N

N S

S

N

N N

N N

Famotidin 2.4.4. ábra. Néhány fontos H2 receptor ligandum szerkezete.

Később azonban kiderült, hogy ez a vegyület jóval hatékonyabban gátolja a H3 receptort [89]. Két újabb H2 antagonistát, a cimetidint (Tagamet®) és a metiamidot közvetlenül a burimamidból fejlesztették ki [113-115]. Azóta számos nagyobb affinitású, szelektív H2 antagonista jelent meg a gyógyszerpiacon [116]. Ezek közül néhányat a mai napig használnak főként a peptikus fekély és a gasztrooesophagealis-

31

reflux (GERD) kezelésében, ilyen a ranitidin (Zantac®), a famotidin (Quamatel®) és a nizatidin (Tazac®, Axid®). A H3 receptor preszinaptikus autoreceptorként gátolja saját szintézisét és felszabadulását a központi idegrendszerben, emellett egyéb neurotranszmitterek (szerotonin, dopamin, acetilkolin, noradrenalin, GABA) felszabadulását is szabályozza [100]. A H3 antagonisták potenciális terápiás indikációi között találjuk az elhízást, memória és tanulási zavarokat, az Alzheimer-kórt, az epilepsziát, a skizofréniát és az alvászavart [100]. A H3 receptor Gαi/o típusú G-proteinhez kapcsolódva csökkenti a cAMP szintet, serkenti a kálcium mobilizációt [117] és MAP kinázokat aktivál [118121]. A H3 receptort először a H1, illetve a H2 receptor ligandumaival jellemezték. Így derült ki, hogy a korábban H2 antagonistaként ismert burimamid nanomoláris H3 affinitással rendelkezik (2.4.5. ábra) [122].

32

+

NH3

N

N

CH3

N H

+N

N H

H

H

Immepip

(R)-alfa-metilhisztamin

S N

N

N

N

N N H

N H

N S

Burimamid

Tioperamid

N

H N

+

H

O

N

N H

H

ABT-239

Cipralizant (GT-2331)

+

O

N

H

+

O

N

N

H

O N H

JNJ-5207852

Ciproxifan

2.4.5. ábra. Néhány fontos H3 receptor ligandum szerkezete.

1987-ben Arrang és munkatársai megmutatták, hogy az (R)-α-metilhisztamin királisan szelektív H3 agonista, a tioperamid pedig egy szelektív kompetitív H3 antagonista [123]. Az (R)-α-metilhisztamin radioaktívan jelzett formáját a mai napig

33

használják a H3 receptor karakterizálására. A hisztamin affinitása a H3 receptorhoz a nanomoláris tartományba esik, amely lényegesen nagyobb, mint a H1 vagy H2 receptorok esetében. Az első H3 agonista, amelyet emberen is kipróbáltak az (R)-αmetilhisztamin előanyaga volt (BP2-94®), az első antagonista pedig a cipralizant (Perceptin®) [100]. Jelenleg is több H3 antagonistát tesztelnek klinikai vizsgálatokkal számos indikációban. Az imidazol gyűrűt tartalmazó H3 antagonisták esetében két komoly probléma merült fel. Az egyik, hogy ezen ligandumok átjutása a vér-agy gáton erősen gátolt, ugyanakkor a H3 antagonista gyógyszerek esetében a megfelelő in vivo hatás kiváltásához különösen fontos, hogy jelentős mértékben jussanak be a központi idegrendszerbe. Másrészt az imidazol gyűrű a citokróm P450 és néhány egyéb metabolizáló enzim szubsztrátja/gátlószere is lehet. Ezen felismerések után imidazol gyűrű nélküli H3 antagonistákat próbáltak azonosítani. Ennek első lépéseként Ganellin és kutatócsoportja az imidazol gyűrűt egy alifás amin láncra cserélte, amely számos későbbi H3 antagonista kiindulópontja lett [124]. Mára már számos imidazol gyűrű nélküli piperidin, pirrolidin és egyéb analóg szerkezetű H3 ligandumot publikáltak [125-127]. A hisztamin H4 receptor legközelebbi ismert rokon fehérjéje a H3 receptor. A nagyfokú homológia ellenére (58 % a TM régióban, 34-35 % a teljes szekvenciát tekintve) a szervezetbeni előfordulásuk teljesen eltérő [100]. A H4 receptor elsősorban a periférián fordul elő, főként immunsejtek expresszálják. Így sikerült kimutatni őket eozinofilek, bazofilek, dendritikus sejtek, T-sejtek és hízósejtek felszínén [105]. Ugyanakkor a központi idegrendszerben csak nagyon kis mértékben vannak jelen [94,95]. Fontos megjegyezni, hogy míg a H1 és H2 receptorok a szervezet számos szövetében megtalálhatók, addig a H3 és H4 receptorok előfordulása jóval behatároltabb [105]. Mai ismereteink szerint a H4 receptor fontos szerepet játszik az immunsejtek aktiválódásában és migrációjában, valamint citokin és kemokin termelésük szabályozásában [105]. Többek között bizonyították, hogy a H4 receptor befolyásolja a hisztamin-mediált kemotaxist a hízósejtekben és az eozinofilokban, és ezt a hatást szelektív H4 antagonistákkal blokkolni lehet [128-130]. Egy zymosan® által kiváltott neutrofil

gyulladási

modellben

H4

antagonisták

képesek

voltak

gátolni

a

polimorfonukleáris sejtek beáramlását [131]. Gantner és munkatársai kimutatták, hogy

34

CD8+ T sejteken a H4 és a H2 receptorok fontos szerepet játszanak az interleukin 16 szekréciójában [132]. Az expressziós mintázat és a biológiai funkciók alapján a H4 receptor jelentős szerepet játszhat az allergiás és gyulladási folyamatokban, ezért potenciális támadáspontul szolgálhat a gyógyszertervezésben [133]. Egyes szerzők szerint a H4 antagonisták lehetnek a jövő antihisztaminjai, amelyek önmagukban vagy H1 antagonistákkal kombinálva számos allergiás megbetegedésben, például asztmában is alkalmazhatók [134]. Az asztma korunk egyik legelterjedtebb betegsége, amely a légutak fokozott érzékenyégével (AHR) és krónikus gyulladásával jellemezhető. Az asztmás légutakban a jelenlévő hisztamin mennyisége arányos a betegség súlyosságával [135]. Ennek ellenére H1 és H2 antagonisták alkalmazása csak kis mértékben vagy egyáltalán nem bizonyult hatásosnak az asztma gyógyításában [105]. Egy rágcsáló modellben sikerült kimutatni, hogy a H4 antagonisták enyhítik a légutak gyulladását, míg a H1 antagonisták hatástalanok [136]. A H4 antagonisták képesek gyengíteni a dendritikus sejtek által közvetített Th2-típusú válaszokat, amelyek az asztma ismertetőjelei [136]. Egy másik publikációban igazolták, hogy a hisztamin által kiváltott viszketés hatékonyan csillapítható H4 antagonistákkal [137]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a H4 antagonisták valóban hatásosak lehetnek egyes allergiás esetek kezelésében. Irodalmi adatok alapján a H4 receptor, a H3 receptorhoz hasonlóan, Gαi/o típusú Gproteinhez kapcsolódik [96]. Aktiválódása növeli a Ca2+ beáramlást, gátolja a cAMP termelést és serkenti a MAP kinázok foszforilálását [95,128,129]. A H4 receptor jelentős homológiát mutat a H3 receptorral, ezért nem meglepő, hogy sok H3 ligandum szignifikáns H4 affinitással is rendelkezik, így például az immetit, az immepip, a klobenpropit, a jodofenpropit és a tioperamid (2.4.6. ábra) [100].

35

+

H N S

N N

N

N

N N H

Cl

N

Tioperamid

Klozapin

H

S

N H

+

S

+

N

H H N+

N S

N

N

N

N

N

N H

H

N H

Burimamid

Imetit

Dimaprit

N

N

N

N

HN

Cl

S

S

HN

N

N

I

Jodofenpropit

Klobenpropit

+

N H N

N Cl

N

HN

N

O N

N H

N

O H

H N+

JNJ-7777120

OUP-16 N

N S N HN

N N H

Impromidin

2.4.6. ábra. Néhány fontos H4 receptor ligandum szerkezete.

A hisztamin H4 affinitása – a H3 receptoron tapasztaltakkal összhangban – a nanomoláris tartományba esik. Néhány H2 agonista ugyancsak hat a H4 receptoron (pl.

36

dimaprit, impromidin), azonban a H2 antagonisták szinte mindegyike hatástalan, egyedül a H2/H3 antagonista burimamid rendelkezik jelentős H4 affinitással [138]. A klozapin, amely egy atipusos neuroleptikum, teljes agonistaként viselkedik a H4 receptoron,

ugyanakkor

szubmikromoláris

affinitása

elmarad

a

hisztaminétól

[93,94,129]. Két metilcianoguanidin származék, az OUP-13 és OUP-16, ugyancsak teljes H4 agonistaként viselkedik, és emellett mintegy 40-szeres szelektivitást mutat a H3 receptorral szemben [139]. Az első irodalomban leírt szelektív H4 antagonista a JNJ-7777120, amelyet HTS-sel találtak a Johnson & Johnson kutatói [140]. Ennek a vegyületnek a H4 receptorhoz való kötődése 4 nM-os Ki állandóval jellemezhető és mintegy 1000-szeres szelektivitást mutat a többi hisztamin receptorral szemben [141]. Rob Leurs és kutatócsoportja egy szénatom nitrogénre történő cseréjével jutott el a JNJ7777120 benzimidazol származékához (VUF-6002), amely tulajdonságaiban hasonló a JNJ-7777120-hoz, és mindkettő ígéretes vezérmolekula lehet egy H4 antagonista gyógyszer kifejlesztéséhez [142]. Egy 2005-ben megjelent publikációban Rob Leurs és kutatócsoportja megmutatta, hogy a 4-metilhisztamin egy nagyon hatásos (Ki = 40 nM) és szelektív H4 agonista [138]. Egy japán kutatócsoport arról számolt be, hogy a CCL16 kemokin nanomoláris affinitással kötődik a H4 receptorhoz [143], ezt az eredményt azonban más kutatók még nem erősítették meg.

2.5 A hisztamin receptorok szerkezete A humán H1R (hH1R) 487 aminosavból áll. A UniProt adatbázis [144] GPCR szekvenciaillesztése alapján a hH1R rendkívül nagy IC3 hurokkal (208 aminosav), valamint egy viszonylag rövid C-terminális véggel (17 aminosav) rendelkezik. Ugyancsak a szekvenciaillesztések alapján az Asn5 (1.10) és az Asn18 (1.23) aminosavak potenciális N-glikozilációs pontok, míg a Cys445 (7.30) aminosavhoz tioészter kötéssel palmitinsav kapcsolódhat. A hH1R két jelenleg ismert, emberekben előforduló pontmutációja az IC3 hurokban található: Gly270Glu és Asp385Glu. Utóbbi egy olyan szomatikus mutáció, amelyet vastag ill. végbélrákban mutattak ki [145]. A humán H2R (hH2R) 359 aminosavból áll. A legszembetűnőbb különbség a H1 receptorhoz képest a sokkal rövidebb IC3 hurok, amely a hH2R esetében mindössze 30 aminosavból áll. A C-terminális ugyanakkor lényegesen hosszabb, mint a H1 receptor

37

esetében (70 aminosav). A szekvenciaillesztések alapján az Asn4 (1.18) potenciális Nglikozilációs pont, míg a Cys305 (7.70) aminosavhoz tioészter kötéssel palmitinsav kapcsolódhat. A humán H3 receptornak (hH3R) számos izoformája ismert, amelyek az IC3 hurok hosszúságában térnek el egymástól. A C-terminális viszonylag rövid, 30 aminosavból áll. A hH3R-ban potenciális glikozilációs pont az Asn11 (1.13) aminosav. A humán H4R (hH4R) 390 aminosavból áll. A GPCR-ok aminosav szekvenciáinak illesztése alapján a hH4R hosszú IC3 hurokkal (111 aminosav), valamint egy viszonylag rövid C-terminális véggel (28 aminosav) rendelkezik. Ugyancsak a szekvenciaillesztések alapján az Asn5 (1.22) és az Asn9 (1.26) aminosavak potenciális N-glikozilációs pontok, míg a Cys374 (7.69) aminosavhoz tioészter kötéssel palmitinsav kapcsolódhat.

2.6 A hisztamin receptorok kötőhelye A H1 és a H2 receptorok szekvenciáinak illesztése alapján a hisztamin kötőhelyét a H1R-ban a TM3 és a TM5 hélixek között valószínűsítették [146,147]. Ezt a feltételezést később több mutációs adat is alátámasztotta. Elsőként Ohta és kutatócsoportja bizonyította a TM3-ban található Asp107 (3.32) aminosav esszenciális szerepét a hisztamin és néhány H1 antagonista kötésében [148]. Az Asp107(3.32)Ala mutáció szinte minden H1 ligandum esetében drámai affinitás csökkenést okoz, ugyanakkor az olopatadin a mutáns receptorhoz is viszonylag nagy affinitással képes kötődni, ami egyéb jelentős ligandum-receptor kölcsönhatásokra utal [101]. További GPCR mutációs adatok alapján a TM5-ben a Thr194 (5.42) és az Asn198 (5.46) aminosavak ligandumkötő szerepét valószínűsítették. A hH1R esetében a Thr194 (5.42) alaninra történő cseréje ugyanakkor nem befolyásolta jelentős mértékben sem az agonisták, sem az antagonisták kötődését [148,149]. Az Asn198(5.46)Ala mutáció viszont lényegesen csökkentette az agonisták affinitását, de nem befolyásolta az antagonisták kötődését [148,149]. A fentieknek megfelelő aminosavak mutációi a tengerimalac H1 receptorban (Thr203 (5.42) és Asn207 (5.46)) is hasonló hatásokat mutattak [150]. Érdemes megemlíteni, hogy az Asn207(5.46)Ala mutáció az egyes H1 agonisták esetében eltérő mértékben befolyásolta az affinitást [150]. A fenti mutációs adatok és a H1 receptor

38

szerkezetének modellezése alapján valószínűsíthető, hogy a hisztamin protonált etilamin csoportja az Asp107 (3.32) aminosavval, míg az N(3)-H csoport az Asn198 (5.46) aminosavval alakít ki kölcsönhatást. Ezt követően sikerült igazolni, azt a korábbi feltevést, hogy a hisztamin mindhárom nitrogén atomja kölcsönhatást alakít ki a receptoriális kötődés során: Leurs és kutatócsoportja megmutatta, hogy a tengerimalac H1 receptor Lys200 (5.39) aminosava a hisztamin N(1) atomjával alakít ki H-kötést, ugyanakkor nem játszik szerepet egyéb imidazol gyűrűt nem tartalmazó H1 agonisták kötésében [151]. Másrészről a tengerimalac H1 receptor aktivációjának szempontjából a Lys200 (5.39) mindegyik H1 agonista esetében fontosnak bizonyult [151]. Néhány karboxilát csoporttal rendelkező H1 antagonista esetében bizonyították, hogy ezek ionos kölcsönhatást alakítanak ki a humán H1 receptor Lys191 (5.39) aminosavával [104,152]. Egy további publikációban Wieland és kutatócsoportja a hisztamin kötődésében szerepet játszó lipofil kölcsönhatásokat igyekezett feltárni. A tengerimalac H1 receptorban a Trp167 (4.56), a Phe433 (6.52), és a Phe436 (6.55) aminosavakról bizonyították, hogy részt vesznek a hisztamin kötésében [104]. A Trp161(4.50)Ala mutáció során tapasztalható affinitáscsökkenés ugyanakkor valószínűleg a receptor expressziójának zavarával magyarázható, vagyis ez az aminosav nem vesz részt közvetlenül a hisztamin kötésében [104]. A H2 receptor és egyéb GPCR-ok aminosav szekvenciájának összehasonlítása alapján a TM3-ban található konzervált Asp98 (3.32), valamint a TM5-ben található Asp186 (5.42) és Thr190 (5.46) aminosavak ligandumkötő szerepét valószínűsítették [146]. Mutációs vizsgálatok bizonyították az Asp98 (3.32) esszenciális szerepét mind a H2 antagonista tiotidin kötésében, mind a H2 receptor aktivációjában [153]. Az Asp186 (5.42) mutáció hatására a tiotidin elvesztette H2 affinitását, viszont a hisztamin által stimulált cAMP akkumuláció nem változott jelentősen [153]. A mutációs vizsgálatok azt is megmutatták, hogy a Thr190 (5.46) mutációja szignifikáns hatással volt a ligandum kötésére és a H2 receptor aktivációjára [153]. Nederkoorn és munkatársai molekulamodellezéssel kapott eredményei azonban azt mutatták, hogy míg az Asp98 (3.32) és az Asp186 (5.42) aminosavak részt vesznek a hisztamin kötésében, addig a hisztamin harmadik nitrogénje nem a Thr190 (5.46) aminosavval, hanem a Tyr182 (5.38) aminosavval alakít ki kölcsönhatást [7]. Ezt az elméletet azonban mutációs adatokkal eddig még nem sikerült alátámasztani.

39

A H1 és H2 receptorok analógiáján a H3 receptor kötőhelyének kialakításában is a TM3 és a TM5 aminosavainak szerepét valószínűsítették. A Glu206 (5.46) aminosav mutációja számos ligandum esetében jelentősen csökkentette a H3 affinitást és a receptor aktivitását [154]. A TM5-ben néhány aminosav mutációja szignifikánsan növelte (Trp196(5.36)Ala, Thr204(5.44)Ala), illetve csökkentette (Leu199(5.39)Ala, Ala202(5.42)Gln, Phe207(5.47)Ala) a receptor aktivációját [154]. Ligneau és munkatársai a patkány és a humán H3 receptorok közötti eltéréseket vizsgálták a TM3 régióban [155]. Ebben a hélixben a két H3 receptor csupán két aminosavban különbözik egymástól (humán: Thr119 (3.37), Ala122 (3.40); patkány: Ala119 (3.37), Val122 (3.40)). Azoknál a ligandumoknál, amelyek eltérő affinitással kötődnek a vad-típusú humán, illetve patkány H3 receptorokhoz, ezen aminosavak mutációja szignifikáns változást okozott az affinitásban. Mivel a H4 és a H3 receptor aminosav szekvenciája jelentős homológiát mutat, feltételezhető, hogy kötőhelyük is hasonló. A H3 receptor analógiából kiindulva Shin és munkatársai 2002-ben irányított mutációs vizsgálatokkal próbálták feltérképezni a H4 receptor kötőhelyét [9]. A TM3-ban található Asp94 (3.32) aminosav, hasonlóan a többi hisztamin receptornál tapasztaltakhoz, esszenciálisnak bizonyult mind a hisztamin kötésében, mind a receptor aktiválódásában. A TM5-ben található Glu182 (5.46) aminosav ugyancsak kritikus a hisztamin kötésében és a receptor aktivációjában. Ez a két kölcsönhatás az elképzelések szerint a hisztamin protonált amin csoportját és az imidazol gyűrű N(3)-H csoportját horgonyozza le. Shin és munkatársai egy hH4R homológiamodell alapján további négy aminosav (Asn147 (4.57), Thr178 (5.42), Ser179 (5.43), Ser320 (6.52)) mutációját hajtották végre, amelyekről azt gyanították, hogy képesek lehetnek H-hidat kialakítani a hisztamin imidazol gyűrűjének N(1) atomjával. Másrészről feltételezték, hogy ezek az aminosavak elhelyezkedésük alapján befolyásolhatják a ligandumok kötését és/vagy a receptor aktivációját. Ezek a mutációk nem okoztak jelentős H4 affinitás csökkenést a hisztamin esetében, ugyanakkor az Asn147 (4.57) és Ser320 (6.52) aminosavak mutációi hatással voltak a receptor aktivációjára. Jongejan és munkatársai 2008 júniusában publikált munkájukban ugyancsak az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavak szerepét vizsgálták ligandumok kötésében. Az Asp94(3.32)Ala, Asp94(3.32)Asn és Glu182(5.46)Ala mutációk esetében a hisztamin és a szelektív H4 antagonista JNJ-7777120 egyaránt

40

elvesztette affinitását a hH4R-hoz. A Glu182(5.46)Gln mutáció hatására a hisztamin és a VUF-8430 (H4 agonista) affinitása jelentősen csökkent, ugyanakkor a JNJ-7777120 és a klozapin esetében az affinitás nem változott jelentős mértékben [156]. Lim és munkatársai H4 ligandumok humán és egér H4R-okon tapasztalt eltérő affinitásainak okait keresték [157]. Megmutatták, hogy a hH4R Phe169(5.33)Val mutációja a hisztamin, a klozapin és a VUF-8430 affinitását az egér H4R-ban tapasztalt szint közelébe csökkenti.

2.7 A hisztamin receptorok publikált szerkezeti modelljei Az 1990-es évektől a Vrije Universiteit kutatói Rob Leurs vezetésével számos elméleti és kísérleti eredményt publikáltak a H1 receptorról. Egy 1995-ben megjelent cikkben a hisztamint és közeli analógjait dokkolták a bakteriorodopszin alapján készült H1 receptor modelljükbe [6]. Ugyanebben az évben publikálták H1 antagonista farmakofór modelljüket, amelynek építéséhez a receptor kötőhelyének fontosabb aminosavaiból nyert információkat is felhasználtak [158]. 1999-ben ugyanez a kutatócsoport H1 antagonisták kötődését vizsgálta vad-típusú és mutáns tengerimalac H1 receptorokon. Az antagonisták kötődését dokkolási szimulációkkal modellezték, amelyhez a kötőhelyet a kísérleti mutációs adatok alapján határozták meg [104]. Egy későbbi publikációban a histaprodifen-hisztamin dimer kötődési módját vizsgálták a humán és a tengerimalac H1 receptorban, és megállapították, hogy a ligandum egy része az Asn84 (2.61) aminosav közelében helyezkedik el [159]. Egy másik publikációban ugyanez a kutatócsoport konstitutív aktivitást mutató humán H1 receptorok vizsgálatával megállapította, hogy az Ile420 (6.40) aminosav jelentős szerepet játszik a receptor aktivációjában. A kísérleti eredményeket vad-típusú és mutáns humán H1 receptor modellek alapján értelmezték [160]. Egy 2006-ban megjelent publikációban Strasser és Wittmann egy új számítógépes eljárással modellezte a hisztaprodifen bejutását a tengerimalac H1 receptor kötőhelyére [161]. Ugyanezek a szerzők 2008-ban publikálták a tengerimalac H1 receptor homológiamodelljét [162]. Ebben a munkában a receptort egy mesterséges POPC membránba illesztették, és ezen a rendszeren távolsági megszorítások mellett MD szimulációkat végeztek. Így létrehozták a tengerimalac H1 receptor aktív és inaktív

41

formájának modelljét. A szimulációkból arra következtettek, hogy a Phe425 (6.44), a Trp429 (6.48) és a Phe433 (6.52) aminosavak konformációváltozása az aktiváció fontos része. Ezen kívül a Ser123 (3.39) aminosav szerepére is felhívták a figyelmet, amelynek kölcsönhatási profilja az aktív és az inaktív receptor formában eltérő. Ahogy azt korábban említettük Nederkoorn és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy a hisztamin protonált amin csoportja az Asp98 (3.32) aminosavval, az imidazol gyűrű két nitrogénje pedig a Tyr182 (5.38) és az Asp186 (5.42) aminosavak oldalláncával alakít ki kölcsönhatást. 1996-ban megjelent kétrészes cikkük első részében a hisztamin kötődését a TM5 modellezésével, míg a másodikban az egész receptor figyelembevételével vizsgálták [7,163]. 2001-ben a MR kristályszerkezet alapján Kelley és munkatársai létrehozták a tengerimalac H2 receptor szerkezeti modelljét [164]. Ebben a munkában a szerzők a különböző fajok H2 receptorai közötti eltéréseket elemezték. A hH3R-ról számos homológiamodellt publikáltak. Az első hH3R modellt Stark és munkatársai közölték [8]. Ebben a munkában a különböző fajok H3 receptorai közötti farmakológiai eltérések okait vizsgálták. A szerzők által publikált ligandum-receptor komplexekben a ligandumok imidazol gyűrűje a TM5 felé nézett. Egy később publikált modellben, Üveges és munkatársai a TM5 régiót manuálisan módosították, hogy a ligandumok egyszerre alakítsanak ki kölcsönhatásokat a TM3 és a TM5 megfelelő aminosavaival [154]. Itt a hisztamint ugyancsak imidazol gyűrűjével a TM5 felé ábrázolták. Ugyanebben a munkában azonban megmutatták azt is, hogy az imidazol gyűrűt

nem

tartalmazó

jodoproxifen

affinitása

nem

változott

jelentősen

a

Glu206(5.46)Ala mutáció hatására, ami azt valószínűsíti, hogy az imidazol gyűrű – legalábbis a jodoproxifen esetében – nem a TM5 aminosavaihoz van közel. Jacobsen és kutatócsoportja azt találta, hogy azokra a ligandumokra volt legnagyobb hatással a Glu206 (5.46) aminosav mutációja, amelyek oldalláncukban a Glu206 (5.46) aminosavval kölcsönhatni képes csoportot tartalmaztak. Így ők arra a következtetésre jutottak, hogy az imidazol gyűrű – legalábbis a vizsgált ligandumok esetében – nem a TM5, hanem a TM3 felé néz. Yao és munkatársai egy újabb kötőkonformációt javasoltak, amelyben a TM2 és a TM3 aminosavai vesznek részt, a ligandumok pedig a hélixekkel párhuzamosan helyezkednek el [165]. Lorenzi és munkatársai a patkány H3 receptorról készítettek modellt, amelyet sikerrel használtak fel új, imidazol gyűrűt

42

tartalmazó H3 ligandumok fejlesztésére [166]. Szalma Sándor és munkatársai egy MD szimulációval relaxált modellt publikáltak a humán H3 receptorról [167]. Schlegel és munkatársai a humán H3 receptor modelljét explicit dipalmitoilfoszfatidilkolin (DPPC) membránba ágyazva szintén MD szimulációt végeztek, majd az így nyert modellt sikerrel használták fel virtuális szűrésre [168]. A Shin és munkatársai által publikált hH4R homológiamodellt, mint azt korábban említettük, elsősorban a kötőhely feltérképezését célzó mutációs vizsgálatok tervezésére alkalmazták [9]. A homológiamodellbe irányítottan dokkolták a hisztamint, amelynek protonált amin csoportja ionos kölcsönhatást alakított ki az Asp94 (3.32) karboxil csoportjával, míg az imidazol gyűrű N(3)-H csoportja és a Glu182 (5.46) karboxil csoportja között H-híd jött létre. Ebben a kötődési módban a hisztamin imidazol gyűrűje a TM5 irányába nézett, ami azt valószínűsítette, hogy a hisztamin imidazol gyűrűjének N(1) atomja a Thr178 (5.42), Ser179 (5.43) aminosavak valamelyikével alakít ki Hhidat. Ugyanakkor a mutációs adatok ezt az elméletet nem támasztották alá. Jongejan és munkatársai 2008 júniusában publikálták hH4R modelljüket [156]. Azt feltételezték, hogy a Glu182 (5.46) aminosav oldallánca a hH4R-ban döntően protonált formában van jelen. A hisztamint, H1 receptor modellekbe történő korábbi dokkolások alapján, a protonált amin csoportjával az Asp94 (3.32) felé dokkolták, és azt feltételezték, hogy a protonált Glu182 (5.46) a hisztamin N(1) atomjával alkot H-hidat. Ennek a kötődési módnak az analógiáján a klozapin és a VUF-8430 feltételezett kötőkonformációit is bemutatták.

43

3 Módszerek és anyagok 3.1 A számításokhoz felhasznált módszerek Szekvenciaillesztés. A hH1R esetében a hH1R és a MR szekvenciáját először automatikusan illesztettük a ClustalW 1.83 programmal [35]. A hH4R esetében a konzervált

szekvenciarészletek

illesztése

érdekében

három

automatikus

szekvenciaillesztést végeztünk a ClustalW programmal: a MR szekvenciáját illesztettük a hH4R szekvenciájához (i), a humán, az egér, a patkány, a sertés és a tengerimalac H4 receptorok szekvenciáihoz (ii) és a humán, az egér, a patkány, a sertés, a tengerimalac H4, illetve a humán, az egér, a patkány és a tengerimalac H3 receptorainak szekvenciáihoz (iii). A H3 receptor szekvenciákat azért választottuk, mert a GPCR-ok közül ezek mutatják a legnagyobb fokú homológiát a H4 receptorokkal. Az összes felhasznált aminosav szekvencia (H4 receptor: humán, egér, patkány, tengerimalac, sertés; H3 receptor: humán, patkány, egér, tengerimalac) az UniProt adatbázisból származott [144]. A hH4R esetében a szekvenciaillesztéseket a BioEdit 7.0.5.3 programmal elemeztük. Az automatikus szekvenciaillesztések után a konzervált aminosavak környezetében mind a hH1R, mind a hH4R esetében manuális módosításokat hajtottunk végre. Figyelembe vettük a MR-ban jelen lévő diszulfid-hidat alkotó Cys110 (3.25) és Cys187 (5.22) aminosavak helyzetét is. A szekvenciaillesztések alapján mindkét hisztamin receptor esetében arra a következtetésre jutottunk, hogy a MR-hoz hasonlóan megtalálható bennük ez a diszulfid-híd. Mivel a GPCR-ok TM régiója konzerváltabb, mint az IC vagy EC hurkok, ezért a manuális módosítások során a szekvenciaillesztésekben előforduló réseket igyekeztünk az IC ill. EC régiókba helyezni. A hH1R és a hH4R hosszú IC3 hurka nem volt modellezhető a MR kristályszerkezet alapján, mivel ez a szakasz a MR-ban mindössze 25 aminosav hosszúságú [144]. Mivel az ilyen hosszú hurkok konformációja jelenleg nem prediktálható megbízhatóan, az egyetlen lehetőség az adott hurok kihagyása a modellből [169]. Ugyanakkor az IC3 hurok távol esik a kötőhelytől, így elhagyásának nem volt jelentős hatása a modellek alkalmazhatósága szempontjából.

44

Modellépítés. A kiindulási modelleket mindkét fehérje esetében a MODELLER programmal építettük (verziószámok: hH1R esetében: 4.0, hH4R esetében 6.2). A modellépítéshez a MR 2000-ben meghatározott kristályszerkezetét használtuk fel (PDB azonosító: 1F88). A MODELLER alapértelmezett beállításokkal futott a hH1R esetében, míg a hH4R modellek építésekor részben módosított beállításokat alkalmaztunk, hogy alaposabban optimált modellekhez jussunk. Ez utóbbi esetben a következő beállításokat használtuk: (LIBRARY_SCHEDULE = 1: a konjugált gradiens alapú optimálás legalaposabb protokollja; MAX_VAR_ITERATIONS = 500: A konjugált grádiens alapú optimálás maximális iterációinak száma; MD_LEVEL = REFINE3: Az alapbeállításnál kiterjedtebb molekuladinamika alapú optimálás beállítása; RSTRS_REFINED = 2: A molekuladinamika alatt az összes definiált kényszerfeltétel megtartása; REPEAT_OPTIMIZATION = 5: A teljes optimálási ciklus 5-szöri megismétlése). Ezzel a protokollal az alapbeállításoknál magasabb szintű geometriai optimálást és MD szimulációt végeztünk a kiindulási modellépítés során. A MODELLER által megadott nehézatom szerkezetekre a hidrogén atomokat a SYBYL programmal illesztettük (verziószámok: a hH1R esetében: 6.9; a hH4R esetében 7.0) [38]. Modellvalidálás. Mindkét fehérje esetében először azt vizsgáltuk, hogy a modellek megfelelnek-e a rendelkezésre álló mutációs adatoknak. Ehhez az irodalomból összegyűjtöttünk minden adatot arra vonatkozólag, hogy mely aminosavak vesznek részt a ligandumok kötésében. Ezután a PROCHECK programmal elvégeztük a modellek fő geometriai paramétereinek analízisét.

A WHATIF programmal

megvizsgáltuk, hogy a modell egyes aminosavainak környezet mennyire felel meg a PDB adatbázisban előforduló fehérjékben tapasztaltaknak. A harmadik validálási teszt a hH1R esetében a PROSA programmal történt, ahol kiszámoltuk a modell aminosavainak kölcsönhatási energiáját. A hH4R esetében a HARMONY programmal vizsgáltuk hogy a modell egyes aminosavai olyan környezetben találhatók-e, amely gyakran fordul elő fehérjeszerkezetekben.

45

A kötőhely vizsgálata. A fehérje TM régióban található üregeit a SYBYL „Multi Channel Surfaces” moduljával jelenítettük meg alapértelmezett beállítások mellett. A hH4R modell lipofil és a hidrogén-kötési felszíneit ugyancsak a fent említett modul segítségével készítettük el. Ligandum előkészítése. Az aktív ligandumokat mindkét fehérje esetében a SYBYL programmal építettük fel és energiaminimálást végeztünk rajtuk. Az energiaminimálás a következő beállítások mellett történt: SYBYL program, Powell algoritmus, MMFF94 erőtér [170] és MMFF94 töltések, nemkötő kölcsönhatások határa: 8 Å, távolság-függő dielektromos állandó (ε = r). A H1 ligandumok protonáltsági állapotának meghatározásánál részben irodalmi adatokra támaszkodtunk (hisztamin, mepiramin, dezloratadin, loratadin), részben pedig a CompuDrug Pallas programjával [171] számolt pKa értéket használtuk fel (akrivasztin). A dúsulási tesztekben használt ismert H4 aktív vegyületek protonáltsági állapotát Pallas pKa számolások eredményei alapján határoztuk meg, valamint a hisztamin és analógjai esetében a rendelkezésre álló irodalmi adatokra is támaszkodtunk. Az inaktívnak tekintett vegyületek esetében a MOE programot [172] alkalmaztuk a megfelelő protonáltságú forma előállítására. Az inaktívak 3D-szerkezetét a SYBYL programban található Concord 4.0 modullal [173] állítottuk elő. A virtuális szűréshez a molekulák egy részét a ZINC [174] adatbázisból gyűjtöttük össze. Ezek a molekulák kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, kivéve a National Cancer Institute (NCI) molekulakönyvtárát, amely csak egyetemi ill. akadémiai szervezetek számára elérhető. A ZINC adatbázisban a vegyületek több tautomer és protomer

formája

is

megtalálható,

saját

adatbázisunkhoz

ezek

mindegyikét

felhasználtuk. A beszállítóktól megrendelhető molekulák listáját lehetőség szerint frissítettük. Azoknál a cégeknél, ahol a ZINC verzióhoz képest jelentősen megváltozott a

molekulakönyvtár

összetétele,

közvetlenül

a

beszállítóktól

származó

molekulakönyvtárat használtuk fel. A ZINC vegyületek dokkolásra kész állapotban tölthetők le, további előkészítést nem igényelnek. A többi molekula esetében – amelyek közvetlenül a beszállítóktól származtak – egy kétlépcsős előkészítést hajtottunk végre. Először, a MOE programot alkalmaztuk a megfelelő protonáltságú forma előállítására, majd ezt követően a SYBYL programban található Concord modullal 3D-szerkezeteket generáltunk. Ezeknek a vegyületeknek csak a legvalószínűbb tautomer, illetve protomer

46

állapotát használtuk fel a virtuális szűréshez. Összességében 8743666 3D-szerkezetet tartalmazott az adatbázisunk beszállítók szerint rendezve mol2 fájlformátumban, amely 5066235 egyedi szerkezetnek felel meg. Ligandumok dokkolása flexibilis fehérje oldalláncokkal. A hH1R modell esetében minden ligandumnál, míg a hH4R modell esetében a JNJ-7777120-nál flexibilis dokkolást alkalmaztunk, vagyis a fehérje kötőhelyén lévő aminosavak oldalláncainak is volt lehetőségük alkalmazkodni a ligandumokhoz. A dokkolást a genetikus algoritmuson alapuló FlexiDock programmal végeztük. A dokkolás alapértelmezett beállításokkal történt, a következő paraméterek kivételével (zárójelben az alapértelmezett beállítás): szigetek száma = 50 (1); szigetenként elmentendő megoldások száma = 50 (20); a populációk száma = 1500 (500); a teljes mutáció valószínűsége génenként = 0.3 (0.1). Ezek a módosítások lehetővé tették, hogy a ligandumok lehetséges kötődési konformációinak szélesebb terét vizsgálhassuk a dokkolás során. Ligandumok dokkolása rigid fehérje oldalláncokkal. A hH4R modell esetében a JNJ-7777120 kivételével a ligandumokat a FlexX programmal dokkoltuk a kötőhelyre (verziószámok: dúsulási teszteknél: 1.13.5; virtuális szűrésnél: 2.0.1), amely a fehérjét mereven, a ligandumot flexibilisen kezeli. A dokkolások során a kötőhelyet az Asp94 (3.32), a Glu182 (5.46) és az Asn350 (7.45) aminosavak 5 Å-ös környezeteként definiáltuk. A FlexX program alapértelmezett beállításokkal futott, egyes esetekben farmakofór kényszerfeltételek alkalmazása mellett. Amikor farmakofór megkötést alkalmaztunk, a ligandumoknak legalább egy kölcsönhatást kellett kialakítaniuk az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavak valamelyikének karboxil csoportjával. Azért választottuk ezeket az aminosavakat, mert irodalmi adatok bizonyítják, hogy a hisztamin kötésében fontos szerepet játszanak [9]. A hH4R modellen végzett virtuális szűrés dokkolási részét a „ClusterGrid” projekt keretében végeztük, amely a Nemzeti Információs Infrastruktúra Fejlesztési Intézet fejlesztése. A „ClusterGrid” egy olyan grid hálózat, amely magyarországi egyetemek számítógépeit köti össze, és használja fel jelentős számítógépes kapacitást igénylő számolások elvégzéséhez. Ezek a számítógépek abban az esetben, amikor nem egyetemi

47

feladatokat

látnak el, számítógépes erőforrásként állnak rendelkezésre nagy

számolásokhoz. A FlexX program licenszét 1000 számítógépre a BioSolveIT GmbH bocsátotta rendelkezésünkre. A tesztelendő molekulakönyvtárat 300 molekulás csomagokban dokkoltuk a kötőhelyre. A dokkolásból nyert kötőkonformációk pontozása a SYBYL program CScore moduljával történt. Az in vitro találatok csoportosítása. Azokat a molekulákat, amelyek a virtuális szűrést követő in vitro teszteken szignifikáns H4 affinitást mutattak, a ChemTK Lite 4.0.2 [175] programmal csoportosítottuk különböző szempontok (gyűrűrendszerek, elágazó fragmensek és farmakofórok) szerint. A végső csoportok felállítása a ChemTK által adott eredményeken alapult. Energiaminimálás. A hH1R modell esetében a dokkolásból nyert ligandum-receptor komplexeket további energiaminimálásnak vetettük alá, a következő beállítások alkalmazásával: SYBYL program, Powell algoritmus, MMFF94 erőtér és MMFF94 töltések, nemkötő kölcsönhatások határa: 9 Å, távolság-függő dielektromos állandó (ε = 4r). A főláncatomok az optimálás során nem mozoghattak. A hH4R modellnél a „C”, „D”, „E” és „F” modellek esetében ugyancsak optimálást végeztünk a következő beállításokkal:

MOE

konvergencia

grádiens

program, kritérium:

CHARMM22 0.01

erőtér,

kcal/mol,

CHARMM22

minden

egyéb

töltések, paraméter

alapértelmezett volt. A hH4R esetében egyaránt végeztünk minimálásokat úgy, hogy a főláncatomok nem mozoghattak és úgy is, hogy a rendszer minden atomja szabadon mozoghatott. Dúsulási tesztek. A hH4R modellek virtuális szűrésre való alkalmasságát ún. dúsulási tesztekkel vizsgáltuk. A tesztekhez három feltételezhetően inaktív molekulakészletet használtunk, hogy megvizsgáljuk a különböző inaktív készletek hatását a dúsulási eredményekre. Mivel további céljaink között szerepelt egy virtuális szűrés megvalósítása valamelyik hH4R modellen, ezért az inaktív molekulákat két beszállító cég

(Otava:

www.otavachemicals.com;

Enamine:

www.enamine.net)

diverz,

gyógyszerszerű molekulakészleteiből válogattuk ki. Az Otava cég esetében egy 999 molekulát tartalmazó molekulakészletet (Otava1) és egy 3002 molekulából álló

48

molekulakészletet (Otava2) használtunk, míg az Enamine cégnél egy 1483 molekulát tartalmazó könyvtárat (Enamine). Figyelembe véve, hogy a HTS átlagos találati aránya 0.5-1 % között mozog, az inaktívak közé 14 jelentős hH4R affinitással rendelkező molekulát kevertünk [96,133,140]. A dúsulási teszteket mindegyik inaktív készletre hat hH4R modellen végeztük el. Farmakofór megkötések melletti teszteket ugyancsak hat hH4R modellen végeztünk két inaktív készlet alkalmazásával (Otava1, Enamine). A kötőkonformációk értékeléséhez a FlexX dokkoló program saját értékelőfüggvénye mellett felhasználtuk a CScore programban elérhető további négy értékelőfüggvényt is (D-Score, G-Score, PMF-Score, ChemScore).

3.2 A kísérletekben használt módszerek és anyagok Anyagok. A hisztamin dihidrokloridot és a tioperamidot a Sigma cégtől (St. Louis, MO) rendeltük. Az imetit dihidrobromidot, a jodofenpropit dihidrobromidot, a dimaprit dihidrokloridot,

a

klobenpropit

dihidrobromidot,

és

az

(R)-α-metilhisztamin

dihidrobromidot a Tocris Bioscience cégtől vásároltuk (Ellisville, MO). A kísérletekben használt hH4R-ral stabilan transzfektált SK-N-MC sejtvonalat korábban irodalomban már leírták [94]. A [3H]hisztamin dihidrokloridot (52.0 Ci/mmol) az Amersham cégtől (U. K.) rendeltük. A JNJ-7777120 vegyületet a Johnson & Johnson Pharmaceutical Research and Development, LLC (San Diego, CA) bocsátotta rendelkezésünkre. Radioligandum kötődési tesztek. A hH4R-ral stabilan transzfektált SK-N-MC sejteket PBS-ben összegyűjtöttük, majd 3000 g-vel, 4 °C-on, 10 percig centrifugáltuk. Az üledéket összegyűjtöttük és homogenizáltuk 50 mM Tris, 5 mM EDTA pufferben (pH = 7.5). Ezután újabb centrifugálás következett 40000 g-vel, 4 °C-on, 25 percig. Az üledéket ismét 50 mM Tris, 5 mM EDTA pufferben homogenizáltuk, majd Eppendorfcsövekbe szétosztottuk és felhasználásig -70 °C-on tároltuk. A hH4R leszorítási teszteknél a sejtmembránt 10 nM [3H]hisztaminnal 25 °C-on, 60 percig inkubáltuk 50 mM Tris, 5 mM EDTA pufferben (pH = 7.5) a tesztelt vegyület jelenlétében, ill. anélkül. A nemspecifikus kötődést 100 µM jelöletlen hisztamin jelenlétében határoztuk meg. Az inkubáció után a membránokat 0.5 % polietiléniminnel előkezelt GF/C típusú szűrőpapíron át szűrtük egy M48-as Brandel szűrőberendezéssel. A szűrőpapírokat

49

szcintillációs koktélba (OPTIPHASE “HISAFE” 3) helyeztük, és a membránhoz kötődött [3H]hisztamin-ból származó radioaktivitást fényfelvillanások formájában egy Tri-Carb 2900TR típusú folyadékszcintillációs készülék segítségével detektáltuk. Az eredményeket a GraphPad Prism [176] programjával értékeltük ki. A Ki értékeket a Cheng-Prusoff egyenlet segítségével számítottuk ki:

Ki =

IC50 L 1 + Kd

ahol Ki a tesztelt vegyület gátlási állandója, IC50 a tesztelt vegyület azon koncentrációja, amelyben a radioligandum 50 %-át leszorítja a kötőhelyről, L a radioligandum koncentrációja, Kd a radioligandumnak az adott kötőhelyre vonatkozó disszociációs állandója. A számolt gátlási százalékokat, a Kd és a Ki értékeket (átlag ± S.D.) legalább három független mérés eredményéből számoltuk, kivéve ahol ezt külön jeleztük.

50

4 Eredmények és értékelésük 4.1 A humán hisztamin H1 receptor (hH1R) modell 4.1.1 Homológiamodellezés és validálás A hH1R és a MR automata szekvenciaillesztését követően manuálisan módosításokat hajtottunk végre a konzervált GPCR aminosavak pozíciójának figyelembevételével. Ezek után jutottunk el a 4.1.1.1. ábrán látható szekvenciaillesztéshez, amelyet a homológiamodellek építéséhez használtunk fel.

4.1.1.1. ábra. A hH1R és a MR szekvenciaillesztése. A konzerválódott aminosavak vastag betűkkel, a TM régiók sárga háttérrel láthatók. Jelölések: * azonos aminosav; : nagyon hasonló aminosav; . hasonló aminosav; - rés.

51

A hurkokban található betoldások és törlések mellett a TM részben mindössze egy rést detektáltunk a hH1R TM4 hélixében. Fontos megemlítenünk ugyanakkor, hogy ez a rés a MR „AAPPLV” szekvenciájára esik, ahol a prolin aminosavak megzavarják a hélix helicitását. Másrészről pedig a hH1R aminosav szekvenciája ezen a részen csak egy prolint tartalmaz („VIP_IL”). A szekvenciaillesztés alapos vizsgálata után azt találtuk, hogy az összes olyan aminosav, amely a hisztamin kötődése szempontjából kritikus, a modellben ép volt, és a kötőhely belseje felé nézett. Ezek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a 4.1.1.1. ábrán bemutatott szekvenciaillesztést felhasználva megfelelő minőségű modell építhető a hH1R kötőhelyének vizsgálatára. Hat kiindulási modellt készítettünk a MODELLER programmal, majd ezeknek a fő geometriai tulajdonságait a PROCHECK programmal vizsgáltuk. A 4.1.1.1. táblázatban láthatók a PROCHECK vizsgálat legfontosabb eredményei. 4.1.1.1. táblázat. A hat kiindulási hH1R modell PROCHECK által meghatározott fő geometriai paraméterei.

Mivel a Ramachandran eloszlás csak néhány aminosav esetében jelzett kifogásolható főlánc Φ/Ψ szögpárt, ezért ezek alapján mindegyik modell elfogadható minőségű. A kovalens és nemkovalens kölcsönhatásokat jellemző G-faktorok alapján az 1-es, 2-es és 5-ös számú modellek kedvezőbbnek tűntek, mint a többi modell. A többi vizsgált paramétert is figyelembe véve az 1-es számú modell optimális választásnak tűnt, ezért ezt a modellt újabb validálási teszteknek vetettük alá. Az 1-es számú modell Ramachandran eloszlása azt mutatta, hogy a modellben szereplő 282 aminosavból mindössze két aminosav (0.8 %) került a „nem megengedett” régióba (4.1.1.2. ábra). Mindkét aminosav (Thr172 (4.70) és Asn443 (6.63)) a hH1R EC részén található.

52

4.1.1.2. ábra. A hH1R modell Ramachandran eloszlása: piros (legkedvezőbb régió), sárga (megengedett régió), vajszín (lehetséges régió), fehér (nem megengedett régió).

Összehasonlítva ezeket az eredményeket a MR Ramachandran eloszlásában tapasztaltakkal azt találtuk, hogy a MR kristályszerkezetben egy aminosav, a Cterminálisban található Glu341 (7.88) került a „nem megengedett” régióban. Ezek alapján a hH1R modellünk minősége közel olyan jónak mondható, mint a MR kristályszerkezet. A következő tesztben a PROSA programmal megvizsgáltuk az egyes aminosavak és környezetük kölcsönhatási energiáit. A hH1R modell és a MR kristályszerkezet PROSA eloszlását a 4.1.1.3. ábra mutatja.

53

4.1.1.3. ábra. A hH1R modell (vastag vonal) és a MR kristály (vékony vonal) PROSA kölcsönhatási energiáinak eloszlása

Látható, hogy a két görbe lefutása hasonló, ugyanakkor a hH1R modell 170-180 közötti szekvenciája jelentős mértékben kedvezőtlen kölcsönhatásokat mutat. Mivel ez a szakasz a hH1R EC2 hurkát alkotja, és nincs adatunk arról, hogy részt venne a ligandumok kötésben, vagy a receptor aktivációjában, ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a modellünk összességében a MR-hoz hasonló minőségű és alkalmazható ligandumok dokkolására és a kötőhely vizsgálatára. A harmadik tesztben a WHATIF program segítségével (Coarse Packing Quality Control) megvizsgáltuk, hogy a hH1R modellben és a MR kristályszerkezetben az egyes aminosavak olyan kölcsönhatásokat alakítanak-e ki, amelyek gyakran előfordulnak a PDB adatbázis jó felbontású kristályszerkezeteiben. Ebben a tesztben a 5-nél alacsonyabb pontszámot kapó aminosavakat tekintjük problémásnak. Ezek alapján a modellünk 5 aminosav esetében kapott -5-nél rosszabb pontszámot (Glu131 (3.47), Arg134 (3.50), Tyr135 (3.51), Leu163 (4.61), Arg281 (7.71)), miközben a MR kristályszerkezetben a teszt 9 ilyen aminosavat jelzett (Met1, Lys16 (1.11), Arg21 (1.16), His100 (2.67), Lys141 (3.56), Met143 (3.58), Asn145 (3.60), Arg147 (3.62), Lys325 (7.72)) (4.1.1.4. ábra).

54

4.1.1.4. ábra. A hH1R (vastag vonal) és a MR (vékony vonal) aminosavainak WHATIF pontszámai.

A WHATIF teszt által problémásnak talált aminosavak minkét fehérje esetében az EC illetve az IC oldalon találhatóak. Ezek az aminosavak a valóságban elsősorban vízmolekulákkal és a membránban lévő lipidek fejcsoportjaival alakítanak ki kölcsönhatásokat, amelyek a hH1R modellből és a MR kristályszerkezetből egyaránt hiányoznak. Ezek alapján azt mondhatjuk, hogy a hH1R modellünk a MR kristályszerkezettel összehasonlítva elfogadható minőségűnek bizonyult a WHATIF teszten. Összességében elmondhatjuk, hogy a hH1R modellünket három különböző kritérium alapján vizsgáltuk, és az eredmények alapján a főlánc konformáció (PROCHECK), az aminosavak kölcsönhatási energiája (PROSA) és kapcsolódása a fehérje többi részéhez (WHATIF) megfelelő minőségű hH1R modellt jeleznek, amely alkalmas a kötőhely elemzésére és ligandumok dokkolására.

4.1.2 Az agonista kötőhely feltérképezése A hisztamin természetes kötőkonformációjának feltérképezésére a molekulát az irodalmi mutációs adatok alapján valószínűsített aminosavak által alkotott üregbe

55

dokkoltuk. Ezeknek az aminosavaknak (Asp107 (3.32), Trp158 (4.56), Asn198 (5.46) és Lys191 (5.39)) az oldallánc konformációit úgy módosítottuk, hogy a hisztaminnal könnyebben tudjanak kölcsönhatásokat kialakítani. Ezek az oldalláncok a kötőhely ürege felé néztek, tehát nagy volt a konformációs szabadságuk. Fontos megemlíteni, hogy

a

homológiamodellezésben

az

oldalláncok

állásáról

viszonylag

kevés

információval rendelkezünk, ezért ezek konformációja bizonytalanabb. Így, indokolt esetben a fehérjemodell oldalláncainak konformációja megváltoztatható. A módosítások után azt tapasztaltuk, hogy a hisztamin jóval kedvezőbb pozícióban dokkolható a kötőhelyre, miközben ionos és H-hidas kölcsönhatásokat alakíthat ki az Asp107 (3.32) és az Asn198 (5.46) aminosavakkal, továbbá az imidazol gyűrű lipofil kölcsönhatásba léphet a Trp158 (4.56) aminosavval. A Lys191 (5.39) aminosav ugyanakkor távolabb helyezkedett el annál, mint ami egy erős H-kötéshez szükséges lett volna. A TM hélixek egymáshoz képesti helyzetének vizsgálatával arra a következtetésre jutottunk, hogy a TM3 és a TM5 néhány Å-mel távolabb van egymástól, mint ami optimális lenne a hisztamin kötéséhez. A modell alapján a Lys191 (5.39) oldalláncának protonált amin csoportján lévő hidrogének 11-12 Å távolságban vannak az Asp107 (3.32) karboxilát oxigénjeitől. Ez túl nagy távolság ahhoz, hogy a hisztamin protonált aminja sóhidat képezzen az Asp107 (3.32) aminosavval és az imidazol gyűrű N(1) atomja egyidejűleg H-hidat hozzon létre a Lys191 (5.39) protonált amin csoportjával, hiszen a hisztamin ezen két része alig több mint 5 Å távolságra van egymástól. Amennyiben a hisztamint megpróbáljuk úgy pozícionálni, hogy a Lys191 (5.39) és az Asn198 (5.46) aminosavak oldalláncaival alakítson ki H-hidakat, akkor a hisztamin protonált amin csoportja távol kerül az Asp107 (3.32) karboxilát csoportjától. Ter Laak és munkatársai hasonló tapasztalatokról számoltak be a tengerimalac H1 receptor modellezésekor [6], azonban ők ezt a bakteriorodopszin alapú homológiamodelljük minőségével magyarázták. Mivel mi a nagy-felbontású MR kristályszerkezet alkalmazásával ugyanerre a következtetésre jutottunk, ezért a hisztamint kötő aminosavak nem megfelelő pozíciója nem lehet kizárólag a bakteriorodopszin alapú modellezés következménye. Elképzelésünk szerint a TM3 és a TM5 közötti nagyobb távolság oka abban keresendő, hogy hH1R modellünk az inaktív MR kristályszerkezetre épült. Mivel az agonisták aktivációs mechanizmusa révén a GPCR-ok jelentős konformációváltozáson mennek keresztül, ezért agonistákat nem minden esetben lehet sikeresen dokkolni egy inaktív jellegű receptormodellbe. Az

56

IC3 régió a C-terminálissal együtt a GPCR-ok G-protein kötő régiója, és ezért kiemelt jelentőségű a GPCR-ok aktivációjában. A hH1R esetében a C-terminális meglehetősen rövid, ugyanakkor az IC3 hurok rendkívül hosszú. Ez a hurok különösen gazdag foszforilálható aminosavakban: 23 szerin és 10 treonin található benne. A hH1R aktivációjában tehát minden valószínűség szerint lényeges szerepet játszik az IC3 hurok konformációváltozása. Az IC3 hurok a TM5 IC folytatása. A TM5 elmozdulása a hisztamin kötődése következtében jelentős változásokat idézhet elő az IC3 hurokban. A mutációs adatok szerint az Asp107 (3.32) és az Asn198 (5.46) aminosavak szerepe a legfontosabb a hisztamin kötésében. Ezek az aminosavak kedvező pozícióban vannak ahhoz, hogy kölcsönhatást alakítsanak ki a hisztamin protonált amin és imidazol N(3)-H csoportjaival. Ezek alapján az Asp107 (3.32) és az Asn198 (5.46) aminosavak pozíciója megfelelő a hisztamin horgonyzásához, ugyanakkor a Lys191 (5.39) nem képes a hisztamin imidazol gyűrűjének N(1) atomjához közel kerülni. A tengerimalac H1 receptoron végzett mutációs kísérletek azonban magyarázatot adhatnak erre [150,151]. Ezekben a kísérletekben az Asn207(5.46)Ala (az Asn198 megfelelője tengerimalacban) mutáció következtében a hisztaminnak gyakorlatilag megszűnt az affinitása, ami azt mutatja, hogy az Asp107 (3.32) aminosav mellett a H1 receptornak ez a másik legfontosabb horgonyzó pontja – ezek hiányában a hisztamin nem tud kötődni a H1 receptorhoz és ennek következtében a hisztamin receptor stimulációja is lehetetlen. A Lys191 (5.39) hiányában a hisztamin affinitása még mindig jelentős volt, ugyanakkor a receptor stimuláló hatás az 1/50-ed részére csökkent. Ezek alapján a Lys191 (5.39) aminosavnak jelentős szerepe van a receptor aktivációjában. Amennyiben a kötőhelyen az Asp107 (3.32) és Asn198 (5.46) aminosavak pozícióját fixen tartjuk, és a Lys191 (5.39) aminosavat elmozdítjuk a TM3 irányába, akkor ez a TM5 EC részének a receptor belseje felé történő elmozdulásával fog járni, és ezzel egyidejűleg a TM5 IC része – amelynek folytatása a receptor G-protein kötő doménje – az ellenkező irányba mozdulhat el (4.1.2.1. ábra).

57

4.1.2.1. ábra. A hH1R-ban a hisztamin által indukált, feltételezett TM5 elmozdulás sematikus ábrája.

4.1.3 Az antagonista kötőhely feltérképezése Az irodalmi mutációs adatok alapján az Asp107 (3.32), a Trp158 (4.56), a Phe432 (6.52) és a Phe435 (6.55) aminosavak fontos szerepet játszanak az antagonista kötőhely kialakításában [104]. A hH1R modellben a Trp158 (4.56), a Phe432 (6.52) és a Phe435 (6.55) aminosavak kedvező pozícióban voltak ahhoz, hogy a kötődő ligandumokkal lipofil kölcsönhatásokat alakítsanak ki. A Trp165 (4.63) és a Phe434 (6.54) aminosavak oldalláncai ugyanakkor a membrán felé néztek, összhangban a tengerimalac H1 receptoron végzett mutációs tesztekkel, ahol a Trp174(4.63)Ala (a Trp165 megfelelője tengerimalacban) és Phe435(6.54)Ala (a Phe434 megfelelője a tengerimalacban) mutációk nem okoztak jelentős változást az antagonisták affinitásában a vad-típushoz képest [104]. A Trp152 (4.50) aminosav oldallánca ugyancsak a membrán felé nézett, ráadásul a kötőhelytől messze helyezkedett el, ugyanakkor a mutációs adatok alapján ez az aminosav esszenciális a hH1R megfelelő működéséhez [104]. A Trp152 (4.50) mutációja minden H1 ligandum esetében az affinitás elvesztését eredményezte. Ez azzal magyarázható, hogy a Trp152 (4.50) esszenciális szerepet tölt be a GPCR-okra jellemző speciális szerkezet kialakításában. Ez a triptofán számos GPCR-ban megtalálható, és szerepe van annak az interhelikális H-híd rendszernek a kialakításában, amely a GPCR-

58

ok szerkezeti integritását biztosítja. Ezen felül, erős lipofil kölcsönhatást képes kialakítani a sejtmembránnal [177]. Emiatt a Trp152(4.50)Ala mutáns H1 receptornak jelentősen módosult a térszerkezete, amely szabad átjárást biztosít a kisméretű ligandumoknak a sejt belsejébe [104]. Egyes ikerionos H1 antagonisták esetében az irodalmi mutációs adatok azt valószínűsítették, hogy a Lys191 (5.39) aminosav sóhidat alakít ki ezen ligandumok karboxil csoportjával [104]. A hH1R modellünkben a Lys191 (5.39) aminosav pozíciója megfelelőnek tűnt egy ilyen kölcsönhatás kialakításához. A hH1R modellünk alapján számos olyan aromás oldalláncot tartalmazó aminosav része a kötőhelynek, amelyek ligandum-kötő szerepéről nem találtunk irodalmi adatot: Tyr108 (3.33), Phe184 (5.32), Phe190 (5.38), Phe199 (5.47), Phe424 (6.44), Trp428 (6.48) és Tyr431 (6.51). Ezek mindegyike jelentősen hozzájárult a kötőhely lipofil jellegének kialakításához.

4.1.4 H1 antagonisták kötődési módjának vizsgálata A dokkolási szimulációkhoz négy olyan H1 antagonistát választottunk, amelyek a ma ismert H1 antagonisták szerkezeti terét jelentős részben lefedik. Az első generációs diaril antihisztaminok közül a mepiramint, a második generációs tri- és tetraciklusos antihisztaminok közül a dezloratadint és a loratadint, és a második generációs ikerionos ligandumok közül az akrivasztint választottuk ki. A kötőhely azonosításához irodalmi mutációs adatokat használtunk fel. A mepiramin a dokkolás során erős ionos kölcsönhatást alakított ki az Asp107 (3.32) aminosavval, és két aril csoportja szépen illeszkedett az aromás gyűrűket tartalmazó kötőzsebbe (Tyr108 (3.33), Trp158 (4.56), Phe184 (5.32), Phe190 (5.38), Phe199 (5.47), Phe424 (6.44), Trp428 (6.48), Tyr431 (6.51), Phe432 (6.52), és Phe435 (6.55)), ahol erős lipofil kölcsönhatásokat alakított ki (4.1.4.1. ábra).

59

4.1.4.1. ábra. A mepiramin feltételezett kötődési módja a hH1R aktív helyén. A kötődésben résztvevő aminosavak oldalláncai ibolya, a mepiramin sárga színnel látható. A mepiramin van der Waals felszíne átlátszó szürkészöld színnel látható.

Ez a kötődési mód megfelel a mutációs adatoknak, amelyek azt mutatták, hogy az Asp107 (3.32), a Trp158 (4.56), a Phe432 (6.52) és a Phe435 (6.55) aminosavak esszenciálisak vagy rendkívül fontosak a mepiramin kötésében [104]. Ugyanakkor a mepiramin nem került kölcsönhatásba a Lys191 (5.39), a Thr194 (5.42) és az Asn198 (5.46) aminosavakkal, amelyek mutációs adatok alapján nem játszanak szerepet a mepiramin kötésében [150, 152]. A második dokkolt ligandum a dezloratadin volt, amely egy erős és szelektív, meglehetősen merev szerkezetű H1 antagonista, amelyben nem található forgatható kötés [178]. A dokkolt dezloratadin sóhidat képzett az Asp107 (3.32) aminosavval és

60

lipofil gyűrűrendszere illeszkedett az aromás aminosavak által alkotott lipofil üregbe (4.1.4.2. ábra).

4.1.4.2. ábra. A dezloratadin feltételezett kötődési módja a hH1R aktív helyén. A kötődésben résztvevő aminosavak oldalláncai ibolya, a dezloratadin sárga színnel látható. A dezloratadin van der Waals felszíne átlátszó szürkészöld színnel látható.

A dezloratadinhoz nagyon hasonló loratadint is dokkoltuk a hH1R modellbe. A két molekula csak egy etilészter csoportban különbözik egymástól, ugyanakkor a

61

dezloratadin affinitása 153-szor nagyobb a H1 receptorhoz, mint a loratadiné. A két molekula mért pKa értékei közötti különbség alapján (loratadin: 4.85; dezloratadin: 8.65) azt gyanítottuk, hogy a jelentős affinitásbeli különbség oka a két molekula eltérő protonáltsági állapotában keresendő, a loratadin amid csoportjának nitrogénje ugyanis deprotonált állapotban van jelen, és így képtelen sóhidat képezni az Asp107 (3.32) aminosavval. Ennek megfelelően, a loratadin a dokkolás során nem alakított ki kölcsönhatást az Asp107 (3.32) aminosavval, és a mutációs adatokkal összhangban a Lys191 (5.39) és a Thr194 (5.42) aminosavakkal sem került kölcsönhatásba [150], ugyanakkor lipofil gyűrűrendszere továbbra is illeszkedett a hH1R lipofil kötőzsebébe (4.1.4.3. ábra).

62

4.1.4.3. ábra. A loratadin feltételezett kötődési módja a hH1R aktív helyén. A kötődésben résztvevő aminosavak oldalláncai ibolya, a loratadin sárga színnel látható. A loratadin van der Waals felszíne átlátszó szürkészöld színnel látható.

Néhány H1 antagonista (akrivasztin, cetirizin, olopatadin, fexofenadin) közös sajátsága, hogy szabad karboxil csoportot tartalmaznak. Ez a tulajdonság jelentősen csökkenti a mellékhatások esélyét, mivel ezen vegyületek a vér-agy gáton csak korlátozott mértékben juthatnak át. Két szabad karboxil csoportot tartalmazó ikerionos

63

H1 antagonista (akrivasztin, cetirizin) esetében mutációs kísérletek a Lys200 (5.39) kötődésben játszott szerepét valószínűsítették [104]. Az ikerionos H1 antagonisták közül az akrivasztint választottuk, mivel affinitása nagyobb a H1 receptorhoz, mint a cetiriziné és a Lys200(5.39)Ala mutáció 6-7-szer nagyobb hatást gyakorolt rá, mint a cetirizinre. A dokkolás eredményeképpen két ionos kölcsönhatás jött létre az akrivasztin és a hH1R modell között: az egyik az akrivasztin protonált amin csoportja és az Asp107 (3.32) aminosav karboxil csoportja között, a másik pedig az akrivasztin karboxilát csoportja és a Lys191 (5.39) aminosav oldalláncának protonált amin csoportja között (4.1.4.4. ábra).

4.1.4.4. ábra. Az akrivasztin feltételezett kötődési módja a hH1R aktív helyén. A kötődésben résztvevő aminosavak oldalláncai ibolya, az akrivasztin sárga színnel látható. Az akrivasztin van der Waals felszíne átlátszó szürkészöld színnel látható.

A ligandum két aromás gyűrűje lipofil kölcsönhatásokat alakított ki a hH1R kötőhelyének aromás oldalláncaival.

64

4.2 A humán hisztamin H4 receptor (hH4R) modell 4.2.1 Homológiamodellezés és validálás A hH4R esetében három szekvenciaillesztést hajtottunk végre, majd ezeket a konzervált szekvenciák helyzetének figyelembevételével manuálisan módosítottuk. A végső illesztés a 4.2.1.1. ábrán látható.

4.2.1.1. ábra. A hH4R és a MR szekvenciaillesztése. A konzerválódott aminosavak vastag betűkkel, a TM régiók sárga háttérrel láthatók. Jelölések: * azonos aminosav; : nagyon hasonló aminosav; . hasonló aminosav; - rés.

A szekvenciaillesztés felhasználásával hat kiindulási hH4R homológiamodellt építettünk, amelyek mindegyikében kialakult a MR szerkezetében is megtalálható diszulfid-híd a Cys87 (3.25) és a Cys164 (5.28) aminosavak között. Mindegyik modellre ráhelyeztük a hidrogéneket és megjelenítettük a fehérje belsejében lévő

65

üregeket. A mutációs adatoknak megfelelően az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavak körül azonosítottuk a hH4R kötőhelyét. Négy modellben a Tyr95 (3.33) pozíciója lehetetlenné tette a ligandumok számára, hogy egyszerre alakítsanak ki kölcsönhatást az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal, ami ellentmond a mutációs adatoknak [9]. A másik két modell közül az egyik kötőhelye sokkal kedvezőbbnek tűnt, mivel az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) oldalláncainak pozíciója és a kötőhely nagysága lehetővé tette ligandumok dokkolását. Ez utóbbi modellt („A” modell) számos validálási tesztnek vetettük alá. A Ramachandran eloszlás felvételéhez a PROCHECK programot használtuk (4.2.1.2. ábra).

4.2.1.2. ábra. A hH4R modell Ramachandran eloszlása: piros (legkedvezőbb régió), sárga (megengedett régió), vajszín (lehetséges régió), fehér (nem megengedett régió).

66

A Φ/Ψ szögpárok eloszlása alapján az aminosavak 97.5 %-a a két legkedvezőbb régióba sorolható, és mindössze 5 (Val120 (3.58), Glu165 (5.29), Phe183 (5.47), Glu294 (6.26), Lys376 (7.71)), illetve 2 (Thr124 (3.62), Ile375 (7.70)) aminosav került a „lehetséges” ill. a „nem megengedett” régióba. A MR kristályszerkezethez hasonlóan ezeknek az aminosavaknak a nagy része az IC vagy EC régióban található, kivéve a Phe183 (5.47) aminosavat. Ez az aminosav a modellben kifelé néz, ami azt valószínűsíti, hogy a Phe183 (5.47) lipofil kölcsönhatásokat alakít ki a sejtmembránnal, és így hozzájárul a fehérje membránban való stabilizálásához. A Phe183 (5.47) szokatlan Φ/Ψ szögpárját a modellünkben valószínűleg a membránkörnyezet hiánya okozza. A PROCHECK analízis alapján modellünk sztereokémiai minősége összemérhető a templátéval. A dokkolások és az azt követő minimálások után minden végső hH4R modell Ramachandran eloszlását megvizsgáltuk, és az összes olyan aminosav, amely a ligandumok kötésében részt vett, a „legkedvezőbb” és a „megengedett” régióba került. A WHATIF „Coarse Packing Quality Control” tesztjével megvizsgáltuk, hogy a hH4R modellben, illetve a MR kristályszerkezetben az egyes aminosavak olyan kölcsönhatásokat alakítanak-e ki, amelyek gyakran előfordulnak a PDB adatbázis jó felbontású kristályszerkezeteiben. A modell (-1.022) és a templát (-1.020) átlagos minősége ebben a vizsgálatban közel azonosnak adódott. A hH4R modellben 8 problémás aminosav fordul elő, míg a MR-ban 9, ahogy azt a hH1R modell validásánál már jeleztük (4.2.1.3. ábra).

67

4.2.1.3. ábra. A hH4R (zöld, vékony vonal) és a MR (kék, vastag vonal) aminosavainak a WHATIF program által számított pontszáma.

Ezen aminosavak kivétel nélkül az EC vagy IC régiókban találhatóak. A WHATIF tesztek eredménye alapján a hH4R modell aminosavainak környezete a templáthoz hasonló minőségű. Ez után a HARMONY programmal azt vizsgáltuk, hogy a modell egyes aminosavai milyen gyakran fordulnak elő abban a környezetben, amely a modellben körülveszi őket. Ez alapján a modell és a templát hasonló minőségűnek tűnt, azonban mindkettőben találhatók problémás szakaszok és ezek részben átfednek egymással (4.2.1.4. ábra).

68

4.2.1.4. ábra. A MR (A) és a hH4R (B) HARMONY programmal generált szerkezeti ábrája. A színek jelentése: fehér - helyes szerkezet, sárga – ritka szerkezet, piros - problémás szerkezet.

A problémásnak jelzett szakaszok oka valószínűleg abban keresendő, hogy a HARMONY tanítókészletében viszonylag kevés számú membránfehérje van [179]. Összességében elmondhatjuk, hogy a hH4R kiindulási modellünk összhangban van az elérhető mutációs adatokkal és a validálási tesztek alapján megfelelő minőségű.

4.2.2 A hH4R kötőhelyének vizsgálata, referenciavegyületek dokkolása A kiindulási modellbe elsőként a hisztamint próbáltuk meg dokkolni a FlexX dokkoló programmal. A számított kötőkonformációk egyike sem felelt meg a mutációs adatoknak, mivel a hisztamin csak egy kölcsönhatást alakított ki az Asp107 (3.32), Glu182 (5.46) aminosavak valamelyikével. A dokkolási eredmények alaposabb vizsgálata után arra a következtetésre jutottunk, hogy az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavak karboxilát csoportjai túlságosan messze vannak egymástól ahhoz, hogy a hisztamin H-donor csoportjaival (protonált amin, imidazol N(3)-H) egyidejűleg

69

alakítsanak ki kölcsönhatást. A Glu182 (5.46) oldalláncának konformációját nem lehetett úgy módosítani, hogy az Asp94 (3.32) aminosavhoz közelebb kerüljön, ugyanakkor úgy tűnt, hogy az Asp94 (3.32) aminosav oldallánca nagyobb konformációs szabadsággal rendelkezik. Ezért, az Asp94 (3.32) karboxilát csoportját elforgattuk a CαCβ tengely mentén, így téve kedvezőbbé a hisztamin számára a kötőhelyet. A hisztamin dokkolása ebbe a modellbe („B” modell) jobb kötőkonformációkat eredményezett, ugyanis a hisztamin egyszerre alakított ki kölcsönhatást az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal. A kötőkonformációkra a FlexX által számított, a kötődési szabadentalpiával arányos, pontszámok ugyancsak kedvezőbb kölcsönhatásokat jeleztek a „B” modell esetében. A 4.2.2.1. A és B ábrák a hH4R modell („B” modell) kötőhely és a hisztamin H-kötő felszínét mutatják.

4.2.2.1. ábra. A hH4R kötőhely (A) és a hisztamin (B) a H-kötő felszíne. A potenciális Hakceptor csoportok kék, míg a H-donor csoportok piros színnel vannak jelölve. A hH4R kötőhely (C) és a hisztamin (D) a lipofil felszíne. A lipofil részek barna, a közepesen lipofil részek zöld és a lipofób részek kék színnel vannak jelölve.

70

Az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavak H-akceptor régiók, míg a hisztamin protonált amin és imidazol N(3)-H csoportjai potenciális H-donor funkciók. Ez alapján a hisztaminnak két lehetséges kötődési módját különböztethetjük meg: a hisztamin protonált amin csoportja vagy a Glu182 (5.46) oldalláncával (1. kötődési mód) vagy az Asp94 (3.32) oldalláncával (2. kötődési mód) hozhat létre sóhidat. Mivel azonban az Asp94 (3.32) környezete jóval lipofilabb, ezért a hisztamin imidazol gyűrűje számára ez a környezet kedvezőbb lehet és így az 1. kötődési mód tűnik valószínűbbnek (4.2.2.1. C és D). Ezt megerősítették a dokkolási eredmények is, ugyanis a kötőkonformációk 97 %-ában a hisztamin protonált etilamin oldallánca a Glu182 (5.46) karboxilát csoportjával, míg az imidazol N(3)-H csoportja az Asp94 (3.32) karboxilát csoportjával alakított ki kölcsönhatást (1. kötődési mód). Ezután mindkét hisztamin-hH4R komplexet optimáltuk. Az optimálást rögzített és szabadon mozgó főláncatomokkal is elvégeztük. Amikor a fehérje főláncatomjai nem mozoghattak planaritási problémákat és van der Waals ütközéseket tapasztaltunk a hisztamin és egyes aromás oldalláncok (Tyr95 (3.33), Tyr319 (6.51), Trp348 (7.43)) között. Ezért a továbbiakban csak azoknak az optimálásoknak az eredményeit használtuk fel, amelyekben a főláncatomok szabadon mozoghattak. Az optimált ligandum-receptor komplexek elemzésénél a legfontosabb szempont az volt, hogy a kialakult komplex megfeleljen a rendelkezésre álló kísérleti mutációs adatoknak, vagyis a hisztamin egyidejűleg alakítson ki kölcsönhatást az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal. Mindkét optimált modell megőrizte a specifikus GPCR sajátságokat, a diszulfid-híd és a hélixek is épek maradtak. A 2. kötődési mód esetében a hisztamin és az Asp94 (3.32) közötti sóhíd ép maradt, viszont az imidazol N(3)-H messzire eltávolodott a Glu182 (5.46) oldalláncától. Az 1. kötődési módban mindkét kölcsönhatás megmaradt az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal, és a hisztamin N(1) atomja kialakított egy új H-hidat a Thr323 (6.55) aminosav oldalláncával („C” modell) (4.2.2.2. ábra).

71

4.2.2.2. ábra. A hisztamin a hH4R kötőhelyen. Az Asp94 (3.32), Glu182 (5.46) és Thr323 (6.55) aminosavakkal kialakult kölcsönhatásokat sárga szaggatott vonalakkal jelöltük.

Ez az eredmény megerősíti az 1. kötődési mód valószínűségét. Kísérleti adatok bizonyítják, hogy a MR fotóaktivációja során a TM3 és a TM6 IC része jelentősen eltávolodik egymástól [15]. Mivel a Thr323 (6.55) a TM6-ban található, elképzelhető, hogy a receptor aktivációjában is szerepet játszik. A Thr323 (6.55) megfelelője a MRban az Ala272 (6.55) aminosav. Az Ala272 (6.55) főlánc nitrogénje a MR-ban H-hidat alkot a Tyr268 (6.51) főlánc nitrogénjével. A Tyr268 (6.51) aminosavról azt feltételezik, hogy a receptor aktivációja során jelentősen megváltozik a konformációja [180]. Ezek alapján a Thr323 (6.55) aminosavnak a ligandumok kötése mellett közvetetten szerepe lehet a hH4R aktivációjában is, mivel azonban a Thr323 (6.55) aminosavról jelenleg nem áll rendelkezésre mutációs adat, ezért ennek alátámasztására további számolások és kísérletek szükségesek. Az ionos és H-hidas kölcsönhatások

72

mellett a hisztamin és a Trp316 (6.48) valamint a Tyr319 (6.51) aminosavak között lipofil kölcsönhatások alakultak ki. A fenti eredmények alapján az 1. kötődési mód megvalósulása látszik valószínűbbnek, ahol a hisztamin protonált etilamin csoportja a Glu182 (5.46) aminosavval, míg az imidazol N(3)-H csoport az Asp94 (3.32) aminosavval lép kölcsönhatásba. Shin és munkatársai a hisztamint a hH4R receptor kötőhelyén a 2. kötődési módban modellezték, és azt feltételezték, hogy a hisztamin imidazol gyűrűjének N(1) atomja a Thr178 (5.42), Ser179 (5.43) aminosavak valamelyikével lép kölcsönhatásba [9]. A kísérleti eredmények azonban nem támasztották alá ezt a feltételezést [9]. A 2. kötődési mód nagyon hasonló ahhoz, amely a feltételezések szerint a H1 és H2 receptorok esetében megvalósul. Irányított mutációs kísérletek azt mutatták, hogy a hisztamin protonált etilamin csoportja a H1 és a H2 receptor esetén az Asp (3.32) aminosavval alkot sóhidat. Az imidazol gyűrű N(3)-H és N(1) csoportja a H1 receptorban az Asn198 (5.46) [148] és a Lys191 (5.39) [151] aminosavakkal, míg a H2 receptorban az Asp186 (5.42) és a Thr190 (5.46) aminosavakkal [153] alkot Hhidakat. Ugyanakkor, a H4 receptor nagyjából akkora hasonlóságot mutat a H1 és H2 receptorokhoz, mint bármely más GPCR-hoz [94]. Ez az alacsony hasonlóság a H4, H1 és H2 receptorok konvergens filogenetikai fejlődését valószínűsíti, ezért a hisztamin kötőhelyi orientációja a H1 és a H2 receptorokban nem biztos, hogy alkalmazható a H4 receptor esetében. Ezt támasztják alá Shin mutációs kísérleti eredményei is [9]. A hH4R modell kötőhelyének további jellemzése érdekében összesen 14 ismert H4 agonistát és antagonistát dokkoltunk FlexX-szel (4.2.2.3. ábra).

73

+N

H

S N N

N

N

N N H

Cl

N

Tioperamid

Klozapin

N

H

+N

H

+ N H

H

S

S

S

N

N

+

N

N

N

N

N H

H

N H

Burimamid

Imetit

Dimaprit

N

N

N

N

HN

Cl

S

S

N

HN

N

I

Jodofenpropit

+N

Klobenpropit H N

N Cl

HN

N

N

O N

N N H

H H N+

O

N

JNJ-7777120

OUP-16

N S N

HN

N N H

Impromidin

+ NH

3

HN

N

Hisztamin

H

+ NH

H

HN

+

N

+

3

HN

N

N

N-metilhisztamin

(R)-alfa-metilhisztamin

H HN

N

Immepip

4.2.2.3. ábra. A hH4R modell kötőhelyére dokkolt H4 ligandumok szerkezete.

74

H

N

A hisztamin esetében tapasztaltakkal összhangban, a „B” modellel minden ligandum esetében jobb dokkolási eredményeket értünk el mind a pontozás, mind az Asp94 (3.32) – Glu182 (5.46) szimultán kölcsönhatások tekintetében, mint az „A” modellel. Az OUP-16 volt az első H4 agonista, amely számottevő szelektivitást mutatott a H3 receptorral szemben [139]. Annak érdekében, hogy az OUP-16 kötőkonformációját a hisztaminéval összevethessük, a legjobb pontszámot kapott OUP-16-hH4R komplexet optimáltuk („D” modell). Az optimálás során az Asp94 (3.32) – imidazol N(3)-H és Glu182 (5.46) – guanidin kölcsönhatások változatlanok maradtak, és akárcsak a hisztamin esetében itt is létrejött egy harmadik H-híd, a Thr323 (6.55) aminosavval (4.2.2.4. ábra).

4.2.2.4. ábra. Az OUP-16 a hH4R kötőhelyen. Az Asp94 (3.32), Glu182 (5.46) és Thr323 (6.55) aminosavakkal kialakult kölcsönhatásokat sárga szaggatott vonalakkal jelöltük.

A hisztaminnal ellentétben azonban nem az imidazol gyűrű N(1) atomja, hanem az ugyancsak negatívan polározott nitril csoport nitrogénje lépett kölcsönhatásba a Thr323

75

(6.55) aminosavval. A kötőhelyen az OUP-16 lipofil kölcsönhatásokat is kialakított a Tyr95 (3.33), Trp157 (4.67), Trp316 (6.48), Tyr319 (6.51) és Phe344 (7.39) aminosavakkal. A JNJ-7777120 volt az első szelektív H4 antagonista, amelyet irodalomban leírtak [140]. Szerkezet-hatás összefüggés (SAR) vizsgálatok megmutatták, hogy a JNJ7777120 protonált piperazin nitrogénje és az indol gyűrű NH csoportja egyaránt fontos a nagy H4 affinitás eléréséhez [140,142]. Mivel a JNJ-7777120 a hisztaminhoz hasonlóan két H-donor funkcióval rendelkezik, azt feltételeztük, hogy a hisztaminhoz hasonlóan egy ionos és egy H-hidas kölcsönhatást alakít ki az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal. A JNJ-7777120 dokkolásakor azonban csak a piperazin nitrogén és a Glu182 (5.46) között alakult ki egy kölcsönhatás, amely független volt az Asp94 (3.32) oldallánckonformációjától („A” modell és „B” modell). A molekula indol része nem alakított ki kölcsönhatást a receptorral. A ligandum-receptor komplex optimálása után a Glu182 (5.46) aminosavval kialakított kölcsönhatás is megszűnt. Mivel a JNJ7777120 dokkolása a kötőhelyre a FlexX programmal sikertelen volt, azt feltételeztük, hogy ennek oka a fehérje konformációs flexibilitásának hiánya lehetett. Ezért a JNJ7777120-t megpróbáltuk a FlexiDock programmal is dokkolni a kötőhelyre. Itt a dokkolás során a kötőhely összes aminosavának oldallánca szabadon mozoghatott. Az eredményül kapott ligandum-receptor komplexben két fontos kölcsönhatás alakult ki: a JNJ-7777120 indol része és az Asp94 (3.32) aminosav, valamint a JNJ-7777120 piperazin része és a Glu182 (5.46) aminosav között. Miután optimáltuk ezt a komplexet, mindkét kölcsönhatás változatlan maradt, és végül egy olyan JNJ-7777120–hH4R komplexet kaptunk, amely megfelelt az irodalmi SAR adatoknak („E” modell) (4.2.2.5. ábra).

76

4.2.2.5. ábra. Az JNJ-7777120 a hH4R kötőhelyen. Az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal kialakult kölcsönhatásokat sárga szaggatott vonalakkal jelöltük.

A JNJ-7777120 és számos hidrofób aminosav (Val64 (2.53), Phe312 (6.44), Trp316 (6.48), Tyr319 (6.51) és Trp348 (7.43)) között lipofil kölcsönhatások alakultak ki. Fontos megemlítenünk, hogy a két agonista ligandummal szemben a JNJ-7777120 nem alakított ki kölcsönhatást a Thr323 (6.55) aminosavval. A JNJ-7777120 általunk feltételezett kötőkonformációjának publikálása után jelent meg 2008 júniusában Jongejan és munkatársainak cikke, amelyben mutációs vizsgálatok bizonyították az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavak esszenciális szerepét a JNJ-7777120 kötésében [156]. A Glu182(5.46)Ala mutációval szemben a Glu182(5.46)Gln mutáció nem okozott számottevő affinitáscsökkenést a JNJ-7777120 esetében. Ennek egy lehetséges magyarázata, hogy a glutamin oldalláncában lévő oxo csoport képes helyettesíteni a glutaminsav karboxilát csoportjának H-akceptor funkcióját.

77

4.2.3 Dúsulási tesztek Dúsulási tesztjeink során azt vizsgáltuk, hogy a különböző H4 agonisták és antagonisták dokkolásával nyert hH4R modellek (A-F) mennyiben alkalmasak virtuális szűrésre. Vizsgáltuk továbbá a modellépítéshez használt ligandumok (hisztamin, OUP16, JNJ-7777120), a farmakofór kényszerek (FlexX-Pharm) és a különböző értékelőfüggvények (FlexX-Score, D-Score, PMF-Score, G-Score, ChemScore) alkalmazásának hatását a szűrési hatékonyságra. Végül elemeztük a különböző inaktív molekulakészletek hatását az eredményekre. A dúsulási tesztekhez a FlexX dokkoló programot használtuk, amelyet az irodalomban már számos esetben alkalmaztak sikerrel szerkezet-alapú virtuális szűrésekhez [181-186]. Vizsgálataink során összesen hat különböző fehérjeszerkezetet teszteltünk (4.2.3.1. táblázat). 4.2.3.1. táblázat. A dúsulási tesztekhez használt hat hH4R modell. “A” modell “B” modell “C” modell “D” modell “E” modell “F” modell

MODELLER nyers szerkezet MODELLER nyers szerkezet módosított Asp94 (3.32) oldallánc konformációval „B” modellbe FlexX-szel dokkolt hisztamin, majd optimálás „B” modellbe FlexX-szel dokkolt OUP-16, majd optimálás „B” modellbe FlexiDock-kal dokkolt JNJ-7777120, majd optimálás MODELLER nyers szerkezet, majd optimálás

Minden ligandum esetében 30 kötőkonformációt állítottunk elő a FlexX-szel. A FlexX saját és a CScore modulban található négy értékelőfüggvényt felhasználva összesen 25 értékelőfüggvény kombinációra számoltuk ki a dúsulási faktorokat. A legnagyobb dúsulást a szűrt adatbázis 0.5 %-ánál tapasztaltuk (4.2.3.1. táblázat).

78

4.2.3.1. táblázat. A hat hH4R modellel elért legmagasabb dúsulási faktorok a molekula adatbázis 0.5, 1, 5 és 10 %-ánál. A dúsulási teszteket három különböző inaktív molekulakészleten végeztük (Otava1, Enamine, Otava2).

Az eredmények azt mutatták, hogy a különböző inaktív molekulakészletek csekély mértékben befolyásolták mind a legnagyobb elérhető dúsulási faktort, mind azt a minimális molekulaszámot, amely szükséges volt az összes aktív vegyület megtalálásához (4.2.3.1. ábra).

79

4.2.3.1. ábra. A hat hH4R modellel elért legmagasabb dúsulási faktorok (A), és a molekula adatbázis azon minimális %-a, amelyet szűrni kellett az összes aktív megtalálásához (B). A dúsulási teszteket három különböző inaktív molekulakészleten végeztük (Otava1, Enamine, Otava2).

A különböző molekulakészletekkel kapott hasonló dúsulások azt jelentik, hogy hasonló következtetéseket tudtunk levonni 1.38 %, 0.94 % vagy 0.46 % aktív vegyületet tartalmazó tesztek eredményeiből. Ezek az eredmények abban is megerősítettek bennünket, hogy az elért dúsulási értékek valóban összefüggésben állnak a modellek minőségével és nem véletlenül adódtak. Az „A” modell és ennek optimált változata („F” modell) jól teljesített az elérhető legmagasabb dúsulási faktorok tekintetében, ugyanakkor ezeknél a modelleknél a teljes molekulakészlet 60-65 %-át kellett tesztelni,

80

hogy az összes aktív vegyületet megtaláljuk. Az Asp94 (3.32) oldalláncának módosítása („B” modell) szignifikánsan javított a dúsulási faktorokon, sőt a teljes molekulakészlet 25-30 %-ának tesztelése elegendő volt az összes aktív visszanyeréséhez. Az OUP-16 ligandummal optimált modell („D” modell) nem jelentett előrelépést az „A” és „F” modellekhez képest. A JNJ-7777120 felhasználásával készült modell („E” modell) pedig meglehetősen gyengén szerepelt a többivel összehasonlítva. Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a dúsulási teszteken a hisztamin jelenlétében optimált modell („C” modell) szerepelt a legjobban, a legmagasabb dúsulási faktorok itt 60-70 körül voltak. Ez után megvizsgáltuk, hogy farmakofór kényszerek alkalmazásával lehet-e tovább javítani a dúsulást. Farmakofór kényszerek alkalmazása mellett az „F” modell esetében számos aktív vegyületet nem sikerült megtalálnunk, mivel a FlexX nem tudott olyan kötőkonformációt előállítani, amely megfelelt volna a farmakofór feltételeknek. Ez valószínűleg a ligandum nélküli fehérjeoptimálás következménye, ugyanis az optimálás során a kötőzsebet alkotó aminosavak oldalláncai kitöltötték a rendelkezésükre álló tér nagy részét, és ez a kötőhely méretének jelentős csökkenését eredményezte. Így mindössze a három legkisebb aktív ligandumot lehetett a farmakofór feltételeknek megfelelően dokkolni. Érdekes módon az „Otava1” készletből mindössze négy ligandumot, az „Enamine” molekulakészletből pedig egyetlen ligandumot sem lehetett dokkolni a „F” modell kötőhelyére a farmakofór kényszerek teljesítésével. Ezért ehhez a modellhez farmakofór kényszerek mellett nem számítottunk dúsulási faktorokat. A többi modell esetében kis mértékű javulást tapasztaltunk a dúsulási faktorok tekintetében, amely a „C” és a „D” modellek esetében volt számottevő (4.2.3.2. táblázat). 4.2.3.2. táblázat. Farmakofór kényszerek nélkül (FlexX) és azok alkalmazásával (FlexXPharm) elért legmagasabb dúsulási faktorok.

“A” modell “B” modell “C” modell “D” modell “E” modell

Otava1 inaktív készlet FlexX FlexX-Pharm 28.9 31.2 43.4 50.7 72.4 92.1 28.9 50.7 14.5 16.9

81

Enamine inaktív készlet FlexX FlexX-Pharm 30.6 32.9 45.8 49.9 61.1 77.8 30.6 35.6 15.3 17.8

Ugyanakkor fontos megemlíteni, hogy az összes aktív vegyületet csak a „B” modell esetében tudtuk visszanyerni, míg az „A”, „C”, „D” és „E” modellekkel 13, 11, 12, illetve 12 aktívat találtunk meg a molekulakészletben lévő 14-ből. Ez azt jelenti, hogy egy virtuális szűrés farmakofór kényszerek mellett ezeken a modelleken néhány aktív vegyület elvesztésével járhat. Ugyanakkor a „C” modell farmakofór kényszerek nélküli alkalmazásakor is szükséges a teljes adatbázis 25 %-ának leszűrése ahhoz, hogy minden aktívat visszanyerjük. Mivel azonban egy virtuális szűrés során általában a molekulakészlet legjobb 0.5-2 %-át vizsgáljuk meg biológiai tesztekben, így az aktívak egy részét mindenképpen elveszítjük. Ezért a legjobb választás valószínűleg annak a protokollnak az alkalmazása, amely a legmagasabb dúsulási faktorokat adja az adatbázis 0.5-2 %-ánál („C” modell, FlexX-Pharm) (4.2.3.2. ábra).

4.2.3.2. ábra. A „C” modellhez 25 különböző értékelőfüggvény kombináció alkalmazásával számított dúsulási faktorok. Az ábrán az „Otava1” inaktív készlethez tartozó értékek láthatók.

Az általunk vizsgált rendszereken a FlexX-FlexX, ChemScore-FlexX, G-ScoreFlexX értékelőfüggvény kombinációk működtek legjobban, ami összhangban van Schulz-Gasch és munkatársainak tapasztalataival [78]. Ezek a szerzők úgy találták,

82

hogy a FlexX-hez hasonló módszeren alapuló dokkoló programokkal eredményesen alkalmazhatók

az

ún.

„erős”

értékelőfüggvények,

amilyen

a

FlexX

saját

értékelőfüggvénye és annak közeli rokona a ChemScore. Összehasonlítva a hH4R homológiamodellekkel elért dúsulási faktorokat, más irodalomban megjelent GPCR homológiamodellek teljesítményével, azt mondhatjuk, hogy modelleink jó teljesítményt nyújtottak. Egy összehasonlító virtuális HTS tanulmányban Evers és munkatársai négy GPCR homológiamodell hatékonyságát vizsgálták dúsulási tesztekkel [187]. A számított dúsulási faktorok a felső 1, 5 és 10 %nál 4 és 12 között mozogtak. Egy másik cikkben Evers és munkatársai az alfa1A adrenerg receptor homológiamodelljét publikálták, amely a dúsulási teszteken 13.1-es dúsulási faktort ért el a felső 1 %-nál [66]. Bár a különböző csoportok által különböző protokollokkal elért dúsulási faktorokat nehéz összehasonlítani, azt kijelenthetjük, hogy hH4R modelljeink legalább az irodalomban közölt hatékonysággal képesek kiválasztani H4 aktív vegyületeket inaktívak közül. A „C” és az „E” modellt két különböző ligandum (hisztamin és JNJ-7777120) jelenlétében történő optimálással kaptuk. A dúsulási teszteken a legnagyobb különbség eközött a két modell között volt, ezért összehasonlítottuk az aktív és az inaktív vegyületekre kapott pontszámokat. A „C” modellnél a 14-ből 12 aktív vegyület jobb pontszámokat kapott az értékelőfüggvények kombinációinak többsége alapján. Egyedül a JNJ-7777120 és a klozapin szerepelt jobban az „E” modellben. Másrészről, a dokkolt inaktívak 67.1 %-a (Otava1), 63.3 %-a (Enamine) és 68.0 %-a (Otava2) kapott jobb pontszámot az értékelőfüggvények többségétől az „E” modell esetében. Ezután összehasonlítottuk azoknak az inaktívaknak a számát, amelyeket nem lehetett a modellekbe dokkolni. A „C” modell esetében 2.46-szer (Otava1), 2.14-szer (Enamine) és 2.39-szer (Otava2) több ilyet találunk, mint az „E” modellnél. Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a fehérjeszerkezet szempontjából mi lehet ezeknek az eredményeknek a hátterében és három lényeges eltérést tapasztaltunk a két modell kötőhelye között (4.2.3.3. ábra).

83

4.2.3.3. ábra. A legfontosabb szerkezeti különbségek a hisztamin („C” modell, sárga) és a JNJ-7777120 („E” modell, piros) jelenlétében optimált hH4R modellek között.

Az egyik különbség az Asp94 (3.32) aminosav oldalláncának orientációja. A hisztamin jelenlétében optimált modell („C” modell) esetében az Asp94 (3.32) aminosav oldallánca a kötőhely belseje felé néz, és így jelentősen csökkenti a kötőhely méretét az „E” modellhez képest. Egy másik fontos különbség, hogy a Trp316 (6.48) aminosav az „E” modellben eltérő konformációban van, mint a „C” modellben. Ez a konformáció jelentősen növeli az „E” modell kötőhelyének méretét. A harmadik lényeges különbség, hogy a „C” modellben a Cys98 (3.36) aminosav H-hidat képez a Glu182 (5.46) aminosav egyik karboxilát oxigénjével, így a ligandumok csak a másik oxigénnel tudnak kölcsönhatást kialakítani, ez pedig csökkenti a kötőhelyen a lehetséges kötőkonformációk számát. Véleményünk szerint ez a három különbség jelentősen hozzájárul a „C” modell nagyobb szelektivitásához, mivel kevesebb inaktív ligandum tudja elfoglalni a „C” modell lényegesen kisebb kötőhelyét. A Glu182 (5.46) aminosav nehezebb hozzáférhetősége ugyancsak megnehezíti az inaktívak dokkolását. Másrészről azt feltételezzük, hogy az aktívak jobb kötődése a „C” modellhez elsősorban

84

az Asp94 (3.32) aminosav és részben a Trp316 (6.48) aminosav eltérő konformációjának a következménye. A „C” modellben az Asp94 (3.32) megfelelő pozícióban van ahhoz, hogy az aktívak nagy részével kölcsönhatást alakítson ki, míg a Trp316 (6.48) aromás gyűrűje a dokkolt ligandumok jelentős részénél lipofil kölcsönhatásokban vehet részt. A Cys98 (3.36) – Glu182 (5.46) kölcsönhatás magyarázatul szolgálhat a Glu182(5.46)Gln mutáció eltérő hatására a hisztamin és a JNJ-7777120 esetében [156]. A mutáns fehérjében ez a kölcsönhatás és a hisztamin – Gln182 (5.46) kölcsönhatás nem jöhet létre egyidejűleg, ami összhangban van a hisztamin affinitásának több mint két nagyságrenddel történő csökkenésével. A JNJ-7777120 esetében ugyanakkor továbbra is megvalósulhat a Gln182 (5.46) kölcsönhatás, ezért az affinitás nem csökken jelentősen a vad-típushoz képest.

4.2.4 Virtuális szűrés Miután meggyőződtünk róla, hogy a kifejlesztett hH4R homológiamodellek alkalmasak lehetnek a tervezett virtuális szűrés megvalósítására, összeállítottunk egy ehhez szükséges kismolekulákból álló adatbázist. Ebbe az adatbázisba – a későbbi kísérleti megerősítés szempontját figyelembe véve – elsősorban olyan vegyületeket válogattunk be, amelyek kereskedelmi forgalomból beszerezhetőek, vagy akadémiai ill. egyetemi szervezetek számára hozzáférhetőek. A virtuális szűrésre alkalmas molekulákat elsőként a gyógyszerszerű vegyületek között kerestük. A „gyógyszerszerű” és a „nem-gyógyszerszerű” vegyületek között azonban nehéz meghúzni a határt, amelyet jól mutat a „gyógyszerszerűség” számos különböző irodalomban elterjedt definíciója [188-190]. Másrészről, számos olyan gyógyszermolekuláról hordoznak.

tudunk,

Fialkowski

molekulatömeg

eloszlása

és

amelyek

munkatársai gyakorlatilag

„nem-gyógyszerszerű” megmutatták, megegyezik

hogy a

tulajdonságokat a

gyógyszerek

Beilstein

adatbázis

molekulatömeg eloszlásával [191]. Ez ellentmondani látszik annak az elméletnek, hogy a „gyógyszerszerű” vegyületek molekulatömeg eloszlása különbözik a véletlenszerűen kiválasztott vegyületek esetében tapasztalt eloszlástól [189]. Egy másik nagyon fontos szempont, hogy az in vitro találattól a vezérmolekuláig tartó fejlesztési folyamat során a

85

molekulák „gyógyszerszerűségét” jelentősen lehet javítani. Ezen okokból kifolyólag nem alkalmaztunk „gyógyszerszerűség” alapon történő előszűrést az adatbázisunkon, hogy ne zárjunk ki eleve molekulákat, amelyek továbbfejlesztve teljesíteni tudják a gyógyszermolekulákkal szemben támasztott követelményeket. A virtuális szűréshez előkészített adatbázis 8743666 3D-szerkezetet tartalmazott. Amennyiben a különböző protonáltsági és tautomer állapotokat nem tekintjük külön molekuláknak, akkor az adatbázis összesen 5066235 egyedi szerkezetből állt. Ez a megfigyelés összhangban van Baurin és munkatársainak tapasztalataival [192], akik egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető molekulákból álló 2.7 millió 3D-szerkezetet tartalmazó kémiai adatbázist elemeztek, ahol azonban csak 1.6 millió egyedi szerkezet volt azonosítható. A virtuális szűrés időpontjában még nem állt rendelkezésünkre az összes 4.2.3.1. táblázatban leírt hH4R modell, így a virtuális szűrést az akkor legalkalmasabb „B” modellen hajtottuk végre. A vizsgálat során összesen 8743666 3D-szerkezetet dokkoltunk sikeresen a FlexX programmal a hH4R kötőhelyére (4.2.5.1. táblázat).

86

4.2.5.1. táblázat. A virtuális szűréshez előkészített adatbázis összetétele, a virtuális találatok, a megrendelt molekulák és az in vitro találatok száma.

a

Az ACB-Eurochem céggel a virtuális

szűrést követően nem tudtuk felvenni a kapcsolatot, majd nem sokkal a virtuális szűrés után az ACB-Eurochem molekulákat törölték a ZINC adatbázisból. b A Chemical Block cég adatbázisát ugyan nem szűrtük virtuálisan a hH4R modellen, viszont néhány virtuális találatot kedvezőbb áron tudtunk beszerezni ettől a cégtől, mint az eredeti beszállítótól.

A sikeresen dokkolt és pontozott ligandumokat a dúsulási teszteken leghatékonyabb értékelőfüggvény kombináció alapján (ChemScore-FlexX-Score) rendeztük sorba. A dokkolási eredmények elemzése során számos érdekes tapasztalatra tettünk szert. A prediktált kötődési módokat megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a FlexX néhány ligandumot részben vagy egészben a kötőhelyen kívülre dokkolt. Ez egyrészt azzal magyarázható, hogy a modellben a membránkörnyezet nem volt reprezentálva, így a dokkoló program részben ezeket, a valóságban foszfolipidekkel kölcsönhatásban lévő felszíneket is felhasználta a dokkolás során. Másrészt a modell kötőhelye meglehetősen

87

szűk, amely jelentős részben az inaktív MR kristályszerkezet alapú modellezés következménye, ugyanis ebben a kristályban az EC2 hurok mélyen behajlik a TM régióba, és így a kötőhely méret is csökken. Számos olyan ligandumot találtunk, amelyet a MOE nem megfelelően protonált. Az egyik tipikus hiba a piperazin gyűrűk mindkét nitrogénjének protonálása volt. Ez a módszer tehát kevésbé pontosan becsli a ligandumok protonáltságát, ugyanakkor több millió molekula esetében a számolás időigénye nem teszi lehetővé ennél megbízhatóbb módszerek alkalmazását. Fontos viszont megjegyezni, hogy a MOE eljárás alkalmazása nélkül például a tercier amin csoportot tartalmazó ligandumok semleges formában nem alakíthattak volna ki ionos kölcsönhatást az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal, amely számos elvesztett, hamis negatív találatot eredményezett volna. A ZINC adatbázis molekuláit több protomer és tautomer formában dokkoltuk. A dokkolási eredményeket megvizsgálva számos olyan molekulát találtunk, amelyeknek valószínűtlen protomerjei is megjelentek az adatbázisban. Gyakran fordultak elő például protonált piridinek, amelyek általában csak pH = 5 alatt vannak túlsúlyban a deprotonált formával szemben. Véleményünk szerint a protonáltság és a tautomerizáció megfelelő kezelése a jövőben is fontos szerepet fog játszani a virtuális szűrések hatékonyságában. A virtuális szűrés befejezése után a legígéretesebb vegyületeket egy kétlépcsős protokoll segítségével választottuk ki biológiai tesztelésre. Először, a pontozás alapján legjobb 2000 vegyület számított kötődési módját elemeztük. Ellenőriztük, hogy a ligandum egésze a kötőhelyen belül helyezkedik el és a ligandum protomer és tautomer állapota reális. Előnyben részesítettük azokat a ligandumokat, amelyek kölcsönhatást alakítottak ki az Asp94 (3.32), Glu182 (5.46) aminosavak valamelyikével. Így összesen 128 vegyületet választottunk ki biológiai tesztelésre, amelyek közül a beszállítóknál csak 66 vegyület volt raktáron, és érkezett meg laboratóriumunkba (a továbbiakban „felső_2000” néven hivatkozunk rájuk). Míg az első kiválasztásnál a ligandumoknak egy kisebb hányadát vizsgáltuk meg részletesen, a második kiválasztás során a pontozás alapján legjobb 45000 vegyületet elemeztük. A kiválasztott molekulák számát ebben az esetben a dúsulási tesztek alapján határoztuk meg, ugyanis az előzetes vizsgálatok alapján a legjobb dúsulási faktorokat az adatbázis felső 0.5 %-ánál kaptuk. Mivel 45000 vegyület kötőkonformációját nem

88

tudjuk egyenként megvizsgálni, itt kiválasztottuk azokat a molekulákat, amelyek legalább egy protonált amin csoporttal és legalább egy másik potenciális H-donor csoporttal rendelkeztek. Összesen 461 molekula felelt meg ezeknek a kritériumoknak. Ezután előállítottuk a vegyületek MACCS szerkezeti kulcsát és a maximális Tanimoto koefficienst 0.7-nek választva egy diverz molekulakészletet hoztunk létre, amely 229 vegyületből állt. Ezek közül a beszállító cégeknél 166 vegyület volt elérhető (a továbbiakban „felső_45000”). 23 további esetben az eredeti vegyület már nem volt kapható, ugyanakkor közeli analógok elérhetőek voltak. Mivel ezek az alapszerkezetek ígéretesnek tűntek H4 agonisták illetve antagonisták kifejlesztéséhez, ezért 23 analóg vegyületet is megrendeltünk (a továbbiakban „felső_45000_analóg”).

4.2.5 Radioligandum kötődési tesztek A specifikus kötődési teszt beállításához először a [3H]hisztamin kötődését vizsgáltuk hH4R-t túlexpresszáló SK-N-MC sejtekből készített membránpreparátumon. A Scatchard analízis alapján megállapítottuk, hogy a [3H]hisztamin nagy affinitással kötődik az SK-N-MC sejtekben kifejezett hH4R-hoz (Kd = 12.8 nM ± 3.5) (4.2.6.1. ábra).

4.2.6.1. ábra. A [3H]hisztamin kötődése a hH4R-ral stabilan transzfektált SK-N-MC sejtekhez. A sejteket [3H]hisztamin növekvő koncentrációjával inkubáltuk. A nemspecifikus kötődést 100 µM jelöletlen hisztamin jelenlétében határoztuk meg. A Kd értéket három független kísérletből határoztuk meg. Az ábrán szereplő adatok az egyik reprezentatív mérésből származnak.

89

Ezután 8 ismert H4 receptor ligandum kötődését vizsgáltuk meg, és a mért Ki értékeket összevetettük az irodalomban található értékekkel (4.2.6.2. ábra).

4.2.6.2. ábra. H4 referencia vegyületek Ki értékei (zárójelben az irodalmi Ki értékek). A mérések során a sejteket 10 nM [3H]hisztaminnal inkubáltuk. A Ki értéket három független kísérletből határoztuk meg.

90

A [3H]hisztamin Ki értéke 13.4 nM ± 8.4-nak adódott, ami összhangban van a telítési kísérletekben meghatározott Kd értékkel. Az összes meghatározott Ki érték jó egyezést mutatott az irodalmi adatokkal [94-96,141]. Ezután a virtuális szűrés legígéretesebb vegyületeit 5 µM-os koncentrációban radioligandum kötődési tesztben vizsgálatuk. Összesen 255 vegyületet teszteltünk (66 db “felső_2000”, 166 db “felső_45000” és 23 db “felső_45000_analóg”). Ezek közül 16 vegyület mutatott szignifikáns (> 20 %) [3H]hisztamin leszorítást, amely a kísérletileg vizsgált vegyületekre számítva 6.3 %-os találati aránynak felel meg (4.2.6.3. ábra).

4.2.6.3. ábra. Az in vitro találatok leszorítási százalékainak eloszlása.

A találatok közül 3 a „felső_2000”, 12 a „felső_45000 és 1 a „felső_45000_analóg” csoportból került ki. A 60 %-nál magasabb leszorítási értéket mutató ligandumok esetében (találat1, találat2, találat3, találat8 és találat9) a Ki értékeket is meghatároztuk (4.2.6.4. ábra).

91

4.2.6.4. ábra. A [3H]hisztamin kötődése a hH4R-ral stabilan transzfektált SK-N-MC sejtekhez a virtuális szűrés találatainak jelenlétében. A mérések során a sejteket 10 nM [3H]hisztaminnal inkubáltuk. Az in vitro találatok Ki értékeit két (találat1, találat2, találat3) illetve három (találat8, találat9) független kísérletből határoztuk meg: találat1, 1.48 µM ± 0.11; találat2, 1.24 µM ± 0.33; találat3, 897 nM ± 77; találat8, 85 nM ± 34; találat9, 219 nM ± 44. Az ábrán szereplő adatok az egyik reprezentatív mérésből származnak.

A virtuális találatok elemzése során megállapítottuk, hogy közöttük szignifikánsan magasabb az NCI vegyületek aránya: 10.2 % a legjobb 2000 vegyületben, és 4.6 % a legjobb 45000 vegyületben. Az in vitro NCI találatok között is magasabb volt az aktívak aránya (8.6 % – 5 in vitro találat / 58 tesztelt virtuális találat) az átlagosnál (6.3 %). Összességében 5 NCI molekula volt a 16 in vitro találat között (31.3 %). Az NCI adatbázis majdnem 250000 molekulát tartalmaz, de a teljes adatbázisunk csak mintegy 2.9 %-át adta. Tapasztalataink szerint az NCI adatbázis meglehetősen diverz, számos teljesen egyedi szerkezetet tartalmaz, ezért eredményesen alkalmazható virtuális szűrésekhez. A 16 in vitro találat közül 7 besorolható két csoportba, míg a többi 9 „egyedi” találat. Az in vitro találatok 1. csoportja öt elemből áll (4.2.6.1. táblázat).

92

4.2.6.1. táblázat. Az in vitro találatok 1. csoportja.

Az 1. csoportba tartozó molekulák két guanidin csoportot tartalmaznak, amelyeket egy lipofil lánc vagy gyűrűrendszer köt össze. A két pozitív centrum között akár egy meglehetősen nagy lipofil rendszer is megengedett (találat1). A molekulák ezen része számos szubsztitúciós lehetőséget rejt magában, amelyeket az optimálás során ki lehet használni. Érdemes megemlíteni, hogy a találat3 és a találat5 mindössze egy metil csoportban különbözik egymástól, ugyanakkor ez a metil csoport jelentősen

93

befolyásolja a ligandum affinitását. A két molekula kötődési módjának elemzése ugyanakkor nem jelzett jelentős eltérést a kötőhelyi orientációban (4.2.6.5. ábra).

4.2.6.5. ábra. A találat3 és a találat5 kötőkonformációja a hH4R homológiamodell kötőhelyén. Az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal kialakított ionos kölcsönhatásokat sárga szaggatott vonalakkal jelöltük.

Mindkét vegyület két ionos kölcsönhatást alakít ki az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal, és a ligandumok középső része a kötőhely lipofil üregébe illeszkedik, amelyet többek között a Tyr95 (3.33), Trp157 (4.67), Leu175 (5.39), Trp316 (6.48) és Tyr319 (6.51) aminosavak alkotnak. Ezek alapján a lipofil karakter növelése ezen a részen jelentősen növelheti az affinitást. Az 1. csoportba sorolt ligandumok mindegyike legalább egy ionos kölcsönhatást alakított ki az Asp94 (3.32), Glu182 (5.46) aminosavak valamelyikével. A 2. csoportba tartozó két vegyület hasonló [3H]hisztamin leszorítást mutatott (4.2.6.2. táblázat).

94

4.2.6.2. táblázat. Az in vitro találatok 2. csoportja.

Ezek a vegyületek egy protonált guanidin csoportot és egy lipofil aromás rendszert tartalmaznak. A dokkolási eredmények alapján mindkettő ionos kölcsönhatást alakít ki a Glu182 (5.46) aminosavval, és az aromás gyűrűik illeszkednek a Leu91 (3.29), Tyr95 (3.33), Trp157 (4.67), Leu175 (5.39), Trp316 (6.48), Tyr319 (6.51) és Phe344 (7.40) aminosavak lipofil környezetébe. A találat7 hidroxil csoportja egy további H-kötést hozott létre a Glu182 (5.46) aminosavval (4.2.6.6. ábra).

4.2.6.6. ábra. A találat7 kötőkonformációja a hH4R homológiamodelljének kötőhelyén. A Glu182 (5.46) aminosavval kialakított ionos ill. H-hidas kölcsönhatásokat sárga szaggatott vonalakkal jelöltük.

95

A két leghatékonyabb vegyület (találat8, találat9) az egyedi szerkezetek között található, ezek 90 % feletti [3H]hisztamin leszorítást mutattak (4.2.6.3. táblázat). 4.2.6.3. táblázat. Az egyedi in vitro találatok.

A modellünk alapján a találat10 protonált piperazin gyűrűje a Glu182 (5.46) aminosavval hoz létre kölcsönhatást, míg a molekula többi része a hH4R kötőhelyének lipofil aminosavaival (Tyr95 (3.33), Trp157 (4.67), Phe183 (5.47), Val184 (5.48), Trp316 (6.48), Tyr319 (6.51) és Ile324 (6.56)) hat kölcsön (4.2.6.7. ábra).

96

4.2.6.7. ábra. A találat10 kötőkonformációja a hH4R homológiamodelljének kötőhelyén. A Glu182 (5.46) aminosavval kialakított ionos kölcsönhatást sárga szaggatott vonallal jelöltük.

A találat11 közeli rokona az első irodalomban leírt, szelektív H4 antagonistának, a JNJ-7777120-nak. A különbség a hiányzó 5-klór szubsztituens az indol gyűrűn, és a 4metil-piperazin gyűrű, amelyet a találat11-ben egy alifás etilamin lánc helyettesít. A JNJ-7777120 és számos közeli rokonának affinitását Terzioglu és munkatársai vizsgálták [142]. Ebben a munkában olyan vegyületekre is közöltek pKi értékeket, ahol a piperazin gyűrűt flexibilis oldalláncokkal helyettesítették. Utóbbi vegyületek mintegy 2 nagyságrenddel mutattak gyengébb affinitást, mint a JNJ-7777120. Ez a tapasztalat összhangban van a mi eredményeinkkel is, ugyanis a [3H]hisztamin leszorítás alapján a találat11 affinitása a µM-os tartományba esik. Adatbázisunk elkészítésekor nem tudtunk arról, hogy a JNJ-7777120 egyik közeli analógja bekerült az adatbázisba, ugyanakkor modellünk ezt a molekulát helyesen a legjobb 0.5 %-os tartományba sorolta. A találat11 a hH4R kötőhelyen egy ionos és további két H-hidas kölcsönhatást alakít ki a Glu182 (5.46) aminosavval, továbbá lipofil kölcsönhatások formálódnak a Tyr95 (3.33), Trp157 (4.67), Trp316 (6.48), és Tyr319 (6.51) aminosavakkal (4.2.6.8. ábra).

97

4.2.6.8. ábra. A találat11 kötőkonformációja a hH4R homológiamodelljének kötőhelyén. A Glu182 (5.46) aminosavval kialakított ionos ill. H-hidas kölcsönhatásokat sárga szaggatott vonalakkal jelöltük.

A találat16 egy virtuális találat analógjaként lett megrendelve, és viszonylag gyenge, de mégis szignifikáns [3H]hisztamin leszorítást mutatott (4.2.6.3. táblázat). Az in vitro azonosítás után találat16-ot dokkoltuk a hH4R modell kötőhelyére, majd a kapott pontszámot és a kötőkonformációt összevetettük az eredeti molekula esetén tapasztaltakkal. A kötőkonformációban lényeges eltéréseket tapasztaltunk: az eredeti molekula karboxilát és fenolos hidroxil csoportjai kölcsönhatást alakítanak ki a Thr178 (5.42) és a Glu182 (5.46) aminosavakkal, ugyanakkor ezek a kölcsönhatások hiányoznak az analóg (találat16) esetén. Ezek alapján nem meglepő, hogy a két molekula kötőkonformációjának pontozásában is jelentős eltérés mutatkozott (4.2.6.3. táblázat). A kötőkonformáció és a pontozás alapján azt mondhatjuk, hogy az eredeti molekula valószínűleg nagyobb affinitással kötődik a hH4R-hoz, mint a ténylegesen vizsgált analóg (találat16). Összegezve az in vitro találatok kötőkonformációinak elemzését, mindegyik vegyület kialakított legalább egy kölcsönhatást az Asp94 (3.32), Glu182 (5.46) aminosavak valamelyikével. Ez megerősíti azt a feltételezést, hogy ezek az aminosavak a hH4R-hoz történő kötődés szempontjából kulcsfontosságúak.

98

Az in vitro tesztek alapján átlagosan 6.3 %, ezen belül a „felső_2000” vegyületeknél 4.6 %, a „felső_45000” vegyületeknél 7.2 %, míg a „felső_45000_analóg” vegyületeknél 4.3 % volt a találati arány. Amellett, hogy a „felső_45000” kiválasztás adta a legjobb találati arányt, a két leghatékonyabb vegyület is ezzel a módszerrel került kiválasztásra. Az eredmények alapján elmondható, hogy számos új alapszerkezetet találtunk, amelyek új H4 ligandumok kifejlesztésének lehetnek kiindulópontjai. A hH4R homológiamodellen végzett sikeres virtuális szűrés megerősíti Evers és munkatársainak kedvező tapasztalatait [187] az amin-kötő GPCR célpontokon végzett szerkezet-alapú szűrések vonatkozásában.

99

5 Következtetések, új tudományos eredmények Homológiamodellezés alkalmazásával elkészítettük a hH1R térszerkezeti modelljét. Megvizsgáltuk a kötőhely azon aminosavainak szerepét, amelyek mutációs adatok alapján részt vesznek az agonisták és antagonisták kötésében. A kötőhely feltérképezésével számos olyan aromás kölcsönhatási lehetőséget találtunk (Tyr108 (3.33), Phe184 (5.32), Phe190 (5.38), Phe199 (5.47), Phe424 (6.44), Trp428 (6.48), Tyr431 (6.51)), amelyek részt vehetnek antagonisták kötésében. Ezek az új kölcsönhatások felhasználhatók új H1 antagonisták tervezéséhez. A hH1R modellünkbe négy ismert H1 antagonista ligandumot dokkoltunk sikerrel. Ezek közül az ikerionos akrivasztin két ionos kölcsönhatást alakított ki az Asp107 (3.32) és a Lys191 (5.39) aminosavakkal. A dokkolási eredmények összhangban vannak a kísérleti, irányított mutációs vizsgálatok eredményeivel. Elkészítettük

a

hH4R

homológiamodelljét,

amelyet

ligandumokból

nyert

információkkal, dokkolással és energiaminimálással finomítottunk. Két H4 agonista ligandum (hisztamin, OUP-16) kölcsönhatást alakított ki az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46), valamint a Thr323 (6.55) aminosavakkal. A H4 antagonista JNJ-7777120 ugyanakkor csak az Asp94 (3.32) és Glu182 (5.46) aminosavakkal lépett kölcsönhatásba. Az elkészült modellek összhangban voltak az irodalmi mutációs adatokkal. Eredményeink azt mutatják, hogy a hisztamin más orientációban kötődik a hH4R-hoz, mint ahogy azt eddig feltételezték. Ennek a kötődési módnak és a Thr323 (6.55) szerepének tisztázására további vizsgálatok szükségesek. Hat különböző hH4R modellen öt értékelőfüggvénnyel és három különböző inaktív molekulakészlettel végeztünk dúsulási teszteket. Tapasztalataink alapján a ligandum által hordozott információ felhasználása jelentősen befolyásolhatja a homológiamodellek virtuális szűrésekben

mutatott

teljesítményét.

Ugyanakkor

a

különböző

inaktív

molekulakészletek nem befolyásolták lényegesen a maximális elérhető dúsulást. A hH4R modelljeink által elért dúsulási faktorok alapján kijelenthető, hogy néhány modell alkalmas virtuális szűrések megvalósítására, amellyel új H4 ligandumokat találhatunk. Az egyik általunk készített hH4R modellen („B” modell) virtuális szűrést valósítottunk meg, amelynek során több mint 8.7 millió kismolekulát vizsgáltunk dokkolással. Tudomásunk szerint ez volt az egyik legnagyobb publikált szerkezet-alapú

100

virtuális szűrés, amelynek találatait in vitro biológiai vizsgálatokkal is megerősítették. Ez volt továbbá az első, irodalomban leírt, szerkezet-alapú vizsgálat, amelyet a hH4Ron valósítottak meg. A virtuális szűrést követően számos jelentős H4 affinitással rendelkező ligandumot sikerült azonosítanunk. Ezek a szerkezetek kiindulópontként szolgálhatnak új, hatékony és szelektív H4 ligandumok kifejlesztéséhez.

101

6 Összefoglalás Kutatásunk során homológiamodellezéssel elkészítettük a humán hisztamin H1 receptor (hH1R) térszerkezeti modelljét. Felvázoltuk a hisztamin által indukált receptoraktiváció lehetséges mechanizmusát, melynek lényege, hogy a hisztamin kötődése során a Lys191 (5.39) elmozdul a hisztamin irányába, ezzel a TM5 hélixben és a hozzá kapcsolódó G-protein-kötő régióban (IC3 hurok) jelentős konformációs változásokat hozhat létre. Négy különböző szerkezetű H1 antagonistát dokkoltunk a kötőhelyre az oldalláncok flexibilitásának figyelembevételével. Ezek a ligandumreceptor komplexek egyrészt felhasználhatóak H1 antagonisták kötődésének további optimálására (pl. a kötőhely egyes újonnan azonosított lipofil részeinek kiaknázásával), másrészt új H1 antagonisták tervezésére. A dokkolások rámutattak számos olyan aminosav ligandum-kötő szerepére, amelyeket irodalomban még nem írtak le: Tyr108 (3.33), Phe184 (5.32), Phe190 (5.38), Phe199 (5.47), Phe424 (6.44), Trp428 (6.48), Tyr431 (6.51). Kutatásunk folytatásaként elkészítettük a humán hisztamin H4 receptor (hH4R) térszerkezeti modelljét is. A dokkolási eredmények, a felszínek elemzése és a ligandumreceptor komplexek optimálása, valamint Shin és munkatársainak kísérleti adatai [9] a korábban irodalomban leírttól eltérő kötőkonformációt valószínűsítettek. Az agonista hisztamin és OUP-16 esetében a dokkolást követő optimálás során az Asp94 (3.32) és a Glu182 (5.46) kölcsönhatások mellett kialakult egy harmadik H-híd is a Thr323 (6.55) oldalláncával. Ezzel szemben az antagonista JNJ-7777120 esetében nem jött létre kölcsönhatás a Thr323 (6.55) aminosavval. Összesen hat különböző protokoll szerint készült hH4R modell alkalmazhatóságát vizsgáltuk meg virtuális szűrésre dúsulási tesztekkel. Azt találtuk, hogy a felhasznált ligandum, a farmakofór kényszerek és a különböző értékelőfüggvények alkalmazása jelentősen befolyásolták a dúsulási faktorokat. Összeállítottunk egy több mint 8.7 millió 3D-szerkezetet tartalmazó adatbázist, amelyet virtuálisan szűrtünk az egyik hH4R modellen. Összesen 255 virtuális találatot teszteltünk radioligandum kötési tesztekkel. Ezek közül 16 szignifikáns H4 aktivitást mutatott 5 µM-os koncentrációban. Ezek a vegyületek kiindulópontjai lehetnek hatékony és szelektív H4 agonisták és antagonisták fejlesztésének.

102

7 Summary We developed the structural model of the human histamine H1 receptor (hH1R) by means of homology modeling. We proposed a possible activation mechanism of hH1R induced by histamine. Briefly, the binding of histamine causes a movement of Lys191 (5.39) in the direction of histamine, consequently significant conformational changes occur in helix TM5 and in the subsequent G-protein binding part (IC3 loop) of the receptor. Four structurally different H1 antagonists were docked to the binding site with flexible receptor side chains. These ligand-receptor complexes can be used in the improvement of H1 antagonists (e.g. by exploiting newly identified lipophil sites of the binding cavity), as well as in the development of novel H1 ligands. Docking results pointed out the ligand-binding role of several residues that have not been analyzed in the literature so far: Tyr108 (3.33), Phe184 (5.32), Phe190 (5.38), Phe199 (5.47), Phe424 (6.44), Trp428 (6.48), Tyr431 (6.51). We have also developed the structural model of the human histamine H4 receptor (hH4R). Docking results, surface analysis and the optimization of the ligand-receptor complexes as well as the experimental results of Shin et al. [9] suggested a novel binding mode compared to the previously proposed one in literature. Optimization of the histamine-hH4R and OUP-16-hH4R complexes resulted in interactions with Asp94 (3.32) and Glu182 (5.46). Furthermore, these agonists formed an additional H-bond with Thr323 (6.55). The H4 antagonist JNJ-7777120, however, did not form any interaction with Thr323 (6.55). In summary, six hH4R models developed by different protocols were evaluated for virtual screening by enrichment tests. We found that the choice of the ligand, the pharmacophore constraints and the scoring functions had a great influence on the enrichment factors. We compiled a database containing more than 8.7 millions of compounds. This database was screened virtually on one of the hH4R models. In summary, 255 virtual hits were tested by a radioligand binding assay. Sixteen of these showed significant H4 activity in a concentration of 5 µM. These compounds can be used as starting points in the development of potent and selective H4 agonists and antagonists.

103

8 Irodalomjegyzék 8.1 Az értekezés alapját képező közlemények E1.

Kiss, R.; Kovári, Z.; Keserű, G. M. Homology modelling and binding site mapping of the human histamine H1 receptor. Eur. J. Med. Chem. 2004, 39, 959-967.

E2.

Kiss, R.; Noszál, B.; Rácz, Á.; Falus, A.; Erős, D.; Keserű, G. M. Binding mode analysis and enrichment studies on homology models of the human histamine H4 receptor. Eur. J. Med. Chem. 2008, 43, 1059-1070.

E3.

Kiss, R.; Kiss, B.; Könczöl, Á.; Szalai, F.; Jelinek, I.; László, V.; Noszál, B.; Falus, A.; Keserű, G. M. Discovery of Novel Human Histamine H4 Receptor Ligands by LargeScale Structure-based Virtual Screening. J. Med. Chem. 2008, 51, 3145-3153.

8.2 Az értekezés témaköréhez kapcsolódó saját közlemény T1.

Jójárt, B.; Kiss, R.; Viskolcz, B.; Keserű, G. M. Activation Mechanism of the Human Histamine H4 Receptor – An Explicit Membrane Molecular Dynamics Simulation Study. J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 1199-1210.

8.3 Más témákhoz kapcsolódó saját közlemények M1. Erős, D.; Szántai-Kis, C.; Kiss, R.; Kéri, G.; Hegymegi-Barakonyi, B.; Kövesdi, I.; Őrfi, L. Structure-activity relationships of PDE5 inhibitors. Curr. Med. Chem. 2008, 15, 15701585. M2. Várkondi, E.; Pintér, F.; Kiss, R.; Schwab, R.; Breza, N.; Őrfi, L.; Kéri, G.; Peták, I. Biochemical assay-based selectivity profiling of clinically relevant kinase inhibitors on mutant forms of EGF receptor. J. Recept. Signal Transduct. Res. 2008, 28, 295-306. M3. Hegymegi-Barakonyi, B.; Székely, R.; Varga, Z.; Kiss, R.; Borbélya, G.; Németh, P.; Bánhegyi, J.; Pató, Z.; Greff, Z.; Horváth, G.; Mészáros, J.; Marosfalvi, D.; Erős, D.; Szántai-Kis, Cs.; Breza, S.; Garavaglia, S.; Perozzi, S.; Rizzi, M.; Hafenbradl, D.; Ko, M.; Av-Gay, Y.; Klebl, B. M.; Őrfi, L.; Kéri, G. Signalling inhibitors against Mycobacterium tuberculosis – early days of a new therapeutic concept in tuberculosis Curr. Med. Chem. (közlésre benyújtva)

104

8.4 Hivatkozott irodalmak jegyzéke 1. 2. 3. 4. 5. 6.

7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

Nissinen, M. J.; Karlstedt, K.; Castren, E.; Panula, P. Expression of histidine decarboxylase and cellular histamine-like immunoreactivity in rat embryogenesis. J. Histochem. Cytochem. 1995, 43, 1241-1252. Fürst, Zs. Farmakológia. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2001 Noszal, B.; Rabenstein, D. L. Nitrogen-protonation microequilibria and C(2)deprotonation microkinetics of histidine, histamine, and related compounds. J. Phys. Chem. 1991, 95, 4761-4765. Lagunoff, D. Analysis of dye binding sites in mast cell granules. Biochemistry 1974, 13, 3982-3986. Rabenstein, D. L.; Ludowyke, R.; Lagunoff, D. Proton nuclear magnetic resonance studies of mast cell histamine. Biochemistry 1987, 26, 6923-6926. Ter Laak, A. M.; Timmerman, H.; Leurs, R.; Nederkoorn, P. H.; Smit, M. J.; Donné-Op den Kelder, G. M. Modelling and mutation studies on the histamine H1-receptor agonist binding site reveal different binding modes for H1-agonists: Asp116 (TM3) has a constitutive role in receptor stimulation. J. Comput. Aided Mol. Des. 1995, 9, 319-330. Nederkoorn, P. H.; van Gelder, E. M.; Donné-Op den Kelder, G. M.; Timmerman, H. The agonistic binding site at the histamine H2 receptor. II. Theoretical investigations of histamine binding to receptor models of the seven alpha-helical transmembrane domain. J. Comput. Aided Mol. Des. 1996, 10, 479-489. Stark, H.; Sippl, W.; Ligneau, X.; Arrang, J. M.; Ganellin, C. R.; Schwartz, J. C.; Schunack, W. Different antagonist binding properties of human and rat histamine H3 receptors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 951-954. Shin, N.; Coates, E.; Murgolo, N. J.; Morse, K. L.; Bayne, M.; Strader, C. D.; Monsma, F. J. Molecular modeling and site-specific mutagenesis of the histamine-binding site of the histamine H4 receptor. Mol. Pharmacol. 2002, 62, 38-47. Ratnala, V. R.; Kiihne, S. R.; Buda, F.; Leurs, R.; de Groot, H. J.; DeGrip, W. J. Solidstate NMR evidence for a protonation switch in the binding pocket of the H1 receptor upon binding of the agonist histamine. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 867-872. Ramirez, F. J.; Tunon, I.; Collado, J. A.; Silla, E. Structural and vibrational study of the tautomerism of histamine free-base in solution J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2328-2340. Collado, J. A.; Tunon, I.; Silla, E.; Ramirez, F. J. Vibrational Dynamics of Histamine Monocation in Solution: An Experimental (FT-IR, FT-Raman) and Theoretical (SCRFDFT) Study J. Phys. Chem. 2000, 104, 2120-2131. Ganellin, C. R. The tautomer ratio of histamine. J. Pharm. Pharmacol. 1973, 25, 787-792. Ballesteros, J. A.; Weinstein, H. Integrated methods for the construction of threedimensional models and computational probing of structure-function relations in G protein-coupled receptors. Methods Neurosci. 1995, 25, 366-428. Farrens, D. L.; Altenbach, C.; Yang, K.; Hubbell, W. L.; Khorana, H. G. Requirement of rigid-body motion of transmembrane helices for light activation of rhodopsin. Science 1996, 274, 768-770. Sealfon, S. C.; Chi, L.; Ebersole, B. J.; Rodic, V.; Zhang, D.; Ballesteros, J. A.; Weinstein, H. Related contribution of specific helix 2 and 7 residues to conformational activation of the serotonin 5-HT2A receptor. J. Biol. Chem. 1995, 270, 16683-16688. Lu, Z. L.; Saldanha, J. W.; Hulme, E. C. Transmembrane domains 4 and 7 of the M(1) muscarinic acetylcholine receptor are critical for ligand binding and the receptor activation switch. J. Biol. Chem. 2001, 276, 34098-34104. Wang, C. D.; Buck, M. A.; Fraser, C. M. Site-directed mutagenesis of alpha 2Aadrenergic receptors: identification of amino acids involved in ligand binding and receptor

105

19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27.

28.

29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.

activation by agonists ligand binding and receptor activation by agonists. Mol. Pharmacol. 1991, 40, 168-179. Zhou, W.; Flanagan, C.; Ballesteros, J. A.; Konvicka, K.; Davidson, J. S.; Weinstein, H.; Millar, R. P.; Sealfon, S. C. A reciprocal mutation supports helix 2 and helix 7 proximity in the gonadotropin-releasing hormone receptor. Mol. Pharmacol. 1994, 45, 165-170. Teller, D. C.; Okada, T.; Behnke, C. A.; Palczewski, K.; Stenkamp, R. E. Advances in determination of a high-resolution three-dimensional structure of rhodopsin, a model of G-protein-coupled receptors (GPCRs). Biochemistry 2001, 40, 7761-7772. Zhang, Y.; Devries, M. E.; Skolnick, J. Structure modeling of all identified G proteincoupled receptors in the human genome. PLoS Comput. Biol. 2006, 2, e13. Takeda, S.; Kadowaki, S.; Haga, T.; Takaesu, H.; Mitaku, S. Identification of G proteincoupled receptor genes from the human genome sequence. FEBS Lett. 2002, 520, 97-101. Collins, F. S. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 2004, 431, 931-945. Henderson, R.; Baldwin, J. M.; Ceska, T. A.; Zemlin, F.; Beckmann, E.; Downing, K. H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryomicroscopy. J. Mol. Biol. 1990, 213, 899-929. Palczewski, K.; Kumasaka, T.; Hori, T.; Behnke, C. A.; Motoshima, H.; Fox, B. A.; Le Trong, I.; Teller, D. C.; Okada, T.; Stenkamp, R. E.; Yamamoto, M.; Miyano M. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science 2000, 289, 739-745. Okada, T.; Sugihara, M.; Bondar, A. N.; Elstner, M.; Entel, P.; Buss, V. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 2004, 342, 571-583. Rasmussen, S. G.; Choi, H. J.; Rosenbaum, D. M.; Kobilka, T. S.; Thian, F. S.; Edwards, P. C.; Burghammer, M.; Ratnala, V. R.; Sanishvili, R.; Fischetti, R. F.; Schertler, G. F.; Weis, W. I.; Kobilka, B. K. Crystal structure of the human beta2 adrenergic G-proteincoupled receptor. Nature 2007, 450, 383-387. Cherezov, V.; Rosenbaum, D. M.; Hanson, M. A.; Rasmussen, S. G.; Thian, F. S.; Kobilka, T. S.; Choi, H. J.; Kuhn, P.; Weis, W. I.; Kobilka, B. K.; Stevens, R. C. Highresolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science 2007, 318, 1258-1265. Warne, T.; Serrano-Vega, M. J.; Baker, J. G.; Moukhametzianov, R.; Edwards, P. C.; Henderson, R.; Leslie, A. G.; Tate, C. G.; Schertler, G. F. Structure of a beta1-adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature 2008, 454, 486-491. Needleman, S. B.; Wunsch, C. D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 1970, 48, 443-453. Smith, T. F.; Waterman, M. S. Identification of Common Molecular Subsequences. J. Mol. Biol. 1981, 147, 195-197. Pearson, W. R.; Lipman, D. J. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988, 85, 2444-2448. Altschul, S. F.; Gish, W.; Miller, W.; Myers, E. W.; Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410. Higgins, D. G.; Sharp, P. M. CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 1988, 73, 237-244. Thompson, J. D.; Higgins, D. G.; Gibson, T. J.; CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic. Acids Res. 1994, 22, 4673-4680. Sali, A.; Blundell, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J. Mol. Biol. 1993, 234, 779-815. Arnold, K.; Bordoli, L.; Kopp, J.; Schwede, T. The SWISS-MODEL Workspace: A webbased environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics 2006, 22, 195-201. SYBYL; Tripos Inc.: St. Louis, MO

106

39. 40. 41. 42. 43.

44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58.

Maestro; Schrödinger: New York, NY Brooks, B. R.; Bruccoleri, R. E.; Olafson, B. D.; States, D. J.; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM: A Program for Macromolecular Energy, Minimization, and Dynamics Calculations. J. Comp. Chem. 1983, 4, 187-217. Evers, A.; Gohlke, H.; Klebe, G. Ligand-supported homology modelling of protein binding-sites using knowledge-based potentials. J. Mol. Biol. 2003, 334, 327-345. Evers, A.; Klebe, G. Ligand-supported homology modeling of g-protein-coupled receptor sites: models sufficient for successful virtual screening. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004, 43, 248-251. Urzhumtsev, A.; Tete-Favier, F.; Mitschler, A.; Barbanton, J.; Barth, P.; Urzhumtseva, L.; Biellmann, J. F.; Podjarny, A.; Moras, D. A 'specificity' pocket inferred from the crystal structures of the complexes of aldose reductase with the pharmaceutically important inhibitors tolrestat and sorbinil. Structure 1997, 5, 601-612. Laskowski, R. A.; MacArthur, M. W.; Moss, D. S.; Thorton, J. M. Main-chain bond lengths and bond angles in protein structures. J. Appl. Crystallogr. 1993, 26, 283-291. Sippl, M. J. Boltzmann's principle, knowledge-based mean fields and protein folding. An approach to the computational determination of protein structures. J. Comp. Aided Mol. Des. 1993, 7, 473-501. Pugalenthi, G.; Shameer, K.; Srinivasan, N.; Sowdhamini, R. HARMONY: a server for the assessment of protein structures. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W231-W234. Vriend, G.; Sander, C. Quality control of protein models: Directional atomic contact analysis. J. Appl. Crystallogr. 1993, 26, 47-60. Pedretti, A.; Elena Silva, M.; Villa, L.; Vistoli, G. Binding site analysis of full-length alpha1a adrenergic receptor using homology modeling and molecular docking. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 319, 493-500. Johren, K.; Holtje, H. D. A model of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor. J. Comput. Aided Mol. Des. 2002, 16, 795-801. Furse, K. E.; Lybrand, T. P. Three-dimensional models for beta-adrenergic receptor complexes with agonists and antagonists. J. Med. Chem. 2003, 46, 4450-4462. Broer, B. M.; Gurrath, H. D.; Holtje, J. Molecular modelling studies on the ORL1receptor and ORL1-agonists. Comput. Aided Mol. Des. 2003, 17, 739-754. Costanzi, S.; Mamedova, L.; Gao, Z. G.; Jacobson, K. A. Architecture of P2Y nucleotide receptors: structural comparison based on sequence analysis, mutagenesis, and homology modeling. J. Med. Chem. 2004, 47, 5393-5404. Clark, D. E.; Higgs, C.; Wren, S. P.; Dyke, H. J.; Wong, M.; Norman, D.; Lockey, P. M.; Roach, A. G. A virtual screening approach to finding novel and potent antagonists at the melanin-concentrating hormone 1 receptor. J. Med. Chem. 2004, 47, 3962-3971. Salo, O. M.; Lahtela-Kakkonen, M.; Gynther, J.; Jarvinen, T.; Poso, A. Development of a 3D model for the human cannabinoid CB1 receptor. J. Med. Chem. 2004, 47, 3048-3057. Montero, C.; Campillo, N. E.; Goya, P.; Paez, J. A. Homology models of the cannabinoid CB1 and CB2 receptors. A docking analysis study. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 75-83. Kim, S. K.; Gao, Z. G.; Jeong, L. S.; Jacobson, K. A. Docking studies of agonists and antagonists suggest an activation pathway of the A3 adenosine receptor. J. Mol. Graph. Model. 2006, 25, 562-577. Braden, M. R.; Parrish, J. C.; Naylor, J. C.; Nichols, D. E. Molecular interaction of serotonin 5-HT2A receptor residues Phe339(6.51) and Phe340(6.52) with superpotent Nbenzyl phenethylamine agonists. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 1956-1964. Freddolino, P. L.; Kalani, M. Y.; Vaidehi, N.; Floriano, W. B.; Hall, S. E.; Trabanino, R. J.; Kam, V. W.; Goddard, W. A. Predicted 3D structure for the human beta 2 adrenergic receptor and its binding site for agonists and antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 2736-2741.

107

59. 60. 61. 62. 63.

64. 65. 66. 67.

68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75.

76. 77.

Chambers, J. J.; Nichols, D. E. A homology-based model of the human 5-HT2A receptor derived from an in silico activated G-protein coupled receptor. J. Comput. Aided Mol. Des. 2002, 16, 511-520. Xie, X. Q.; Chen, J. Z.; Billings, E. M. 3D structural model of the G-protein-coupled cannabinoid CB2 receptor. Proteins 2003, 53, 307-319. Gutierrez-de-Teran, H.; Centeno, N. B.; Pastor, M.; Sanz, F. Novel approaches for modeling of the A1 adenosine receptor and its agonist binding site. Proteins 2004, 54, 705-715. Onuffer, J.; McCarrick, M. A.; Dunning, L.; Liang, M.; Rosser, M.; Wei, G. P.; Ng, H.; Horuk, R. Structure function differences in nonpeptide CCR1 antagonists for human and mouse CCR1. J. Immunol. 2003, 170, 1910-1916. Mouillac, B.; Chini, B.; Balestre, M. N.; Elands, J.; Trumpp-Kallmeyer, S.; Hoflack, J.; Hibert, M.; Jard, S.; Barberis, C. The binding site of neuropeptide vasopressin V1a receptor. Evidence for a major localization within transmembrane regions. J. Biol. Chem. 1995, 270, 25771-25777. Hibert, M. F.; Trumpp-Kallmeyer, S.; Bruinvels, A.; Hoflack, J. Three-dimensional models of neurotransmitter G-binding protein-coupled receptors. Mol. Pharmacol. 1991, 40, 8-15. Evers, A.; Klebe, G. Successful virtual screening for a submicromolar antagonist of the neurokinin-1 receptor based on a ligand-supported homology model. J. Med. Chem. 2004, 47, 5381-5392. Evers, A.; Klabunde, T. Structure-based drug discovery using GPCR homology modeling: successful virtual screening for antagonists of the alpha1A adrenergic receptor. J. Med. Chem. 2005, 48, 1088-1097. Varady, J.; Wu, X.; Fang, X.; Min, J.; Hu, Z.; Levant, B.; Wang, S. Molecular modeling of the three-dimensional structure of dopamine 3 (D3) subtype receptor: discovery of novel and potent D3 ligands through a hybrid pharmacophore- and structure-based database searching approach. J. Med. Chem. 2003, 46, 4377-4392. Richards, W. G. Virtual screening using grid computing: the screensaver project. Nat. Rev. Drug Discovery 2002, 1, 551-555. Kuntz, I. D.; Blaney, J. M.; Oatley, S.J.; Langridge, R; Ferrin, T.E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. J. Mol. Biol. 1982, 161, 269-288. Rarey, M.; Kramer, B.; Lengauer, T.; Klebe, G. A fast flexible docking method using an incremental construction algorithm. J. Mol. Biol. 1996, 261, 470-489. Abagyan, R. A.; Totrov, M. M.; Kuznetsov, D. N. ICM - a new method for protein modeling and design. Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation. J. Comp. Chem. 1994, 15, 488-506. Baxter, C. A.; Murray, C. W.; Clark, D. E.; Westhead, D. R.; Eldridge, M. D. Flexible docking using Tabu search and an empirical estimate of binding affinity. Proteins 1998, 33, 367-382. Jones, G.; Willett, P.; Glen, R. C. Molecular recognition of receptor sites using a genetic algorithm with a description of desolvation. J. Mol. Biol. 1995, 245, 43-53. Miller, M. D.; Kearsley, S. K.; Underwood, D. J.; Sheridan, R. P. FLOG: a system to select 'quasi-flexible' ligands complementary to a receptor of known three-dimensional structure. J. Comput. Aided Mol. Des. 1994, 8, 153-174. Eldridge, M. D.; Murray, C. W.; Auton, T. R.; Paolini, G. V.; Mee, R. P. Empirical scoring functions: I. The development of a fast empirical scoring function to estimate the binding affinity of ligands in receptor complexes. J. Comput. Aided Mol. Des. 1997, 11, 425-45. Muegge, I.; Martin, Y. A general and fast scoring function for protein-ligand interactions: a simplified potential approach. J. Med. Chem. 1999, 42, 791-804. Gohlke, H.; Hendlich, M.; Klebe, G. Knowledge-based scoring-function to predict protein-ligand interactions. J. Mol. Biol. 2000, 295, 337-356.

108

78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94.

95.

96.

97.

Schulz-Gasch, T.; Stahl, M. Binding site characteristics in structure-based virtual screening: evaluation of current docking tools. J. Mol. Model. 2003, 9, 47-57. McGovern, S. L.; Shoichet, B. K. Information decay in molecular docking screens against holo, apo, and modeled conformations of enzymes. J. Med. Chem. 2003, 46, 2895-2907. Jenkins, J. L.; Kao, R. Y.; Shapiro, R. Virtual screening to enrich hit lists from highthroughput screening: a case study on small-molecule inhibitors of angiogenin. Proteins 2003, 50, 81-93. Barger, G.; Dale, H. H. Chemical structure and sympathomimetic action of amines. J. Physiol. (Lond.) 1910, 41, 19-59. Bovet, D.; Staub, A. Action protectrice des e´thers phe´noliques au cours de l’intoxication histaminique. C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 1936, 124, 547-549. Bovet, D. Introduction to antihistamine agents and antergan derivatives. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1950, 50, 1089-1126. Loew, E. R. Pharmacology of antihistamine compounds. Physiol. Rev. 1947, 27, 542-573. Ashford, C. A.; Heller, H.; Smart, G. A. The action of histamine on hydrochloric acid and pepsin secretion in man. Br. J. Pharmacol. 1949, 4, 153-161. Arunlakshana, O.; Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. 1959, 14, 48-58. Trendelenburg, U. The action of histamine and 5-hydroxytryptamine on isolated mammalian atria. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1960, 130, 450-460. Black, J. W.; Duncan, W. A. M.; Durant, C. J.; Ganellin, C. R.; Parsons, E. M. Definition and antagonism of histamine H2-receptors. Nature (Lond.) 1972, 236, 385-390. Arrang, J. M.; Garbarg, M.; Schwartz, J. C. Auto-inhibition of brain histamine release mediated by a novel class (H3) of histamine receptor. Nature (Lond.) 1983, 302, 1-5. Lovenberg, T. W.; Roland, B. L.; Wilson, S. J.; Jiang, X.; Pyati, J.; Huvar, A.; Jackson, M. R.; Erlander, M. G. Cloning and functional expression of the human histamine H3 receptor. Mol. Pharmacol. 1999, 55, 1101-1107. Raible, D. G.; Lenahan, T.; Fayvilevich, Y.; Kosinski, R.; Schulman, E. S. Pharmacologic characterization of a novel histamine receptor on human eosinophils. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994, 149, 1506-1511. Nguyen, T.; Shapiro, D. A.; George, S. R.; Setola, V.; Lee, D. K.; Cheng, R.; Rauser, L.; Lee, S. P.; Lynch, K. R.; Roth, B. L.; O'Dowd, B. F. Discovery of a novel member of the histamine receptor family. Mol. Pharmacol. 2001, 59, 427-433. Oda, T.; Morikawa, N.; Saito, Y.; Masuho, Y.; Matsumoto, S. Molecular cloning and characterization of a novel type of histamine receptor preferentially expressed in leukocytes. J. Biol. Chem. 2000, 275, 36781-36786. Liu, C.; Ma, X.; Jiang, X.; Wilson, S. J.; Hofstra, C. L.; Blevitt, J.; Pyati, J.; Li, X.; Chai, X.; Carruthers, N.; Lovenberg, T. W. Cloning and pharmacological characterization of a fourth histamine receptor (H(4)) expressed in bone marrow. Mol. Pharmacol. 2001, 59, 420-426 Morse, K. L.; Behan, J.; Laz, T. M.; West, R. E. Jr.; Greenfeder, S. A.; Anthes, J. C.; Umland, S.; Wan, Y.; Hipkin, R. W.; Gonsiorek, W.; Shin, N.; Gustafson, E. L.; Qiao, X.; Wang, S.; Hedrick, J. A.; Greene, J.; Bayne, M.; Monsma, F. J. Jr. Cloning and characterization of a novel human histamine receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, 296, 1058-1066. Zhu, Y.; Michalovich, D.; Wu, H.; Tan, K. B.; Dytko, G. M.; Mannan, I. J.; Boyce, R.; Alston, J.; Tierney, L. A.; Li, X.; Herrity, N. C.; Vawter, L.; Sarau, H. M.; Ames, R. S.; Davenport, C. M.; Hieble, J. P.; Wilson, S.; Bergsma, D. J.; Fitzgerald, L. R. Cloning, expression, and pharmacological characterization of a novel human histamine receptor. Mol. Pharmacol. 2001, 59, 434-441. Debacker, M. D.; Gommeren, W.; Moereels, H.; Nobels, G.; Vangompel, P.; Leysen, J. E.; Luyten, W. H. Genomic cloning, heterologous expression and pharmacological

109

98. 99. 100. 101. 102.

103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110.

111. 112. 113. 114. 115.

characterization of a human histamine H1 receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 197, 1601-1608. Hill, S. J.; Young, J. M.; Marrian, D. M. Specific binding of 3Hmepyramine to histamine H1-receptors in intestinal smooth muscle. Nature (Lond.) 1977, 270, 361-363. Hill, S. J. Distribution, properties and functional characteristics of three classes of histamine receptor. Pharmacol. Rev. 1990, 42, 45-83. Parsons, M. E.; Ganellin, C. R. Histamine and its receptors. Br. J. Pharmacol. 2006, 147, Suppl 1, S127-135. Nonaka, H.; Otaki, S.; Ohshima, E.; Kono, M.; Kase, H.; Ohta, K.; Fukui, H.; Ichimura, M. Unique binding pocket for KW-4679 in the histamine H1 receptor. Eur. J. Pharmacol. 1998, 345, 111-117. Kreutner, W.; Hey, J. A.; Anthes, J.; Barnett, A.; Young, S.; Tozzi, S. Preclinical pharmacology of desloratadine, a selective and nonsedating histamine H1 receptor antagonist. 1st communication: receptor selectivity, antihistaminic activity, and antiallergenic effects. Arzneimittelforschung 2000, 50, 345-352. Mauser, P. J.; Kreutner, W.; Egan, R. W.; Chapman, R. W. Selective inhibition of peripheral histamine responses by loratadine and terfenadine. Eur. J. Pharmacol. 1990, 182, 125-129. Wieland, K.; Ter Laak, A. M.; Smit, M. J.; Kuhne, R., Timmerman, H.; Leurs, R. Mutational analysis of the antagonist-binding site of the histamine H(1) receptor. J. Biol. Chem. 1999, 274, 29994-30000. Zhang, M.; Thurmond, R. L.; Dunford, P. J. The histamine H(4) receptor: A novel modulator of inflammatory and immune disorders. Pharmacol. Ther. 2007, 113, 594-606. Black, J. W.; Shankley, N. P. How does gastrin act to stimulate oxyntic cell secretion? Trends. Pharmacol. Sci. 1987, 8, 486-490. Soll, A.H.; Berglindh, T. Physiology of isolated gastric glands and parietal cells: Receptors and effectors regulating function. Physiology of the Gastrointestinal Tract, 1987, 883-909. Gantz, I.; Schäffer, M.; DelValle, J.; Logsdon, C.; Campbell. V.; Uhler, M.; Yamada, T. Molecular cloning of a gene encoding the histamine H2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991, 88, 429-433. Ruat, M.; Traiffort, E.; Arrang, J. M.; Leurs, R.; Schwartz, J. C. Cloning and tissue expression of a rat histamine H2-receptor gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 1470-1478. Traiffort, E.; Vizuete, M. L.; Tardivel-Lacombe, J.; Souil, E.; Schwartz, J. C.; Ruat, M. The guinea-pig histamine H2 receptor-gene cloning, tissue expression and chromosomal localization of its human counterpart. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 211, 570577. Kobayashi, T.; Inoue, I.; Jenkins, N. A.; Gilbert, D. J.; Copeland, N. G.; Watanabe, T. Cloning, RNA expression and chromosomal location of a mouse histamine H2-receptor gene. Genomics 1996, 37, 390-394. Gantz, I.; Munzert, G.; Tashiro, T.; Schäffer, M.; Wang, L.; DelValle, J.; Yamada, T. Molecular cloning of the human histamine H2 receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 178, 1386-1392. Black, J. W.; Durant, G. J.; Emmett, J. C.; Ganellin, C. R. Sulphurmethylene isosterism in the development of metiamide, a new histamine H2-receptor antagonist. Nature (Lond.) 1974, 248, 65-67. Brimblecombe, R. W.; Duncan, W. A.; Durant, G. J.; Emmett, J. C.; Ganellin, C. R.; Parsons, M. E. Cimetidine: a non-thiourea H2 receptor antagonist. J. Int. Med. Res. 1975, 3, 86-92. Ganellin, C. R. Selectivity and the design of histamine H2-receptor antagonists. J. Appl. Chem. Biotechnol. 1978, 28, 183-200.

110

116. Ganellin, C. R. Pharmacochemistry of H1 and H2 receptors, The Histamine Receptor, Wiley-Liss, 1992, 1-56. 117. Krueger, K. M.; Witte, D. G.; Ireland-Denny, L.; Miller, T. R.; Baranowski, J. L.; Buckner, S.; Milicic, I.; Esbenshade, T. A.; Hancock, A. A. G protein-dependent pharmacology of histamine H3 receptor ligands: evidence for heterogeneous active state receptor conformations. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 314, 271-281. 118. Oike, M.; Kitamura, K.; Kuriyama, H. Histamine H3-receptor activation augments voltage-dependent Ca2+ current via GTP hydrolysis in rabbit saphenous artery. J. Physiol. 1992, 448, 133-152. 119. Clark, M. A.; Korte, A.; Egan, R. W. Guanine nucleotides and pertussis toxin reduce the affinity of histamine H3 receptors on AtT-20 cells. Agents Actions 1993, 40, 129-134. 120. Laitinen, J. T.; Jokinen, M. Guanosine 5′-(gamma-[35S]thio)triphosphate autoradiography allows selective detection of histamine H3 receptor dependent G protein activation in rat brain tissue sections. J. Neurochem. 1998, 71, 808-816. 121. Drutel, G.; Peitsaro, N.; Karlstedt, K.; Wieland, K.; Smit, M. J.; Timmerman, H.; Panula, P.; Leurs, R. Identification of rat H3 receptor isoforms with different brain expression and signaling properties. Mol. Pharmacol. 2001, 59, 1-8. 122. Schwartz, J. C. Histamine as a transmitter in the brain. Life Sciences 1975, 17, 503-518. 123. Arrang, J. M.; Garbarg, M.; Lancelot, J. C.; Lecomte, J. M.; Pollard, H.; Robba, M.; Schunack, W.; Schwartz, J. C. Highly potent and selective ligands for histamine H3receptors. Nature 1987, 327, 117-123. 124. Ganellin, C. R.; Leurquin, F.; Piripitsi, A.; Arrang, J. M.; Garbarg, M.; Ligneau, X.; Schunack, W.; Schwartz, J. C. Synthesis of potent non-imidazole histamine H3-receptor antagonists. Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998, 331, 395-404. 125. Cowart, M.; Altenbach, R.; Black, L.; Faghih, R.; Zhao, C.; Hancock, A. A. Medicinal chemistry and biological properties of non-imidazole histamine H3 antagonists. Mini Rev. Med. Chem. 2004, 4, 979-992. 126. De Esch, I. J.; Belzar, K. J. Histamine H3 receptor agonists. Mini Rev. Med. Chem. 2004, 4, 955-963. 127. Meier, G.; Apelt, J.; Reichert, U.; Graßmann, S.; Ligneau, X.; Elz, S.; Leurquin, F.; Ganellin, C. R.; Schwartz, J. C.; Schunack, W.; Stark, H. Influence of imidazole replacement in different structural classes of histamine H(3)-receptor antagonists. Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 13, 249-259. 128. Hofstra, C. L.; Desai, P. J.; Thurmond, R. L.; Fung-Leung, W. P. Histamine H4 receptor mediates chemotaxis and calcium mobilization of mast cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 305, 1212-1221. 129. Buckland, K. F.; Williams, T. J.; Conroy, D. M. Histamine induces cytoskeletal changes in human eosinophils via the H(4) receptor. Br. J. Pharmacol. 2003, 140, 1117-1127. 130. Ling, P.; Ngo, K.; Nguyen, S.; Thurmond, R. L.; Edwards, J. P.; Karlsson, L.; FungLeung, W. P. Histamine H4 receptor mediates eosinophil chemotaxis with cell shape change and adhesion molecule upregulation. Br. J. Pharmacol. 2004, 142, 161-171. 131. Takeshita, K.; Sakai, K.; Bacon, K. B.; Gantner, F. Critical role of histamine H4 receptor in leukotriene B4 production and mast cell-dependent neutrophil recruitment induced by zymosan in vivo. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 307, 1072-1078. 132. Gantner, F.; Sakai, K.; Tusche, M. W.; Cruikshank, W. W.; Center, D. M.; Bacon, K. B. Histamine h(4) and h(2) receptors control histamine-induced interleukin-16 release from human CD8(+) T cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002, 303, 300-307. 133. De Esch, I. J.; Thurmond, R. L.; Jongejan, A.; Leurs, R. The histamine H4 receptor as a new therapeutic target for inflammation. Trends Pharmacol. Sci. 2005, 26, 462-469. 134. Fung-Leung, W. P.; Thurmond, R. L.; Ling, P.; Karlsson, L. Histamine H4 receptor antagonists: the new antihistamines? Curr. Opin. Investig. Drugs 2004, 5, 1174-1183.

111

135. Jarjour, N.; Calhoun, W.; Schwartz, L.; Busse, W. Elevated bronchoalveolar lavage fluid histamine levels in allergic asthmatics are associated with increased airway obstruction. Am. Rev. Respir. Dis. 1991, 144, 83-87. 136. Dunford, P. J.; O'Donnell, N.; Riley, J. P.; Williams, K. N.; Karlsson, L.; Thurmond, R. L. The histamine H4 receptor mediates allergic airway inflammation by regulating the activation of CD4+ T-cells. J. Immunol. 2006, 176, 7062-7070. 137. Dunford, P. J.; Williams, K. N.; Desai, P. J.; McQueen, D.; Karlsson, L.; Thurmond, R. L. Histamine H4 receptor antagonists are superior to traditional antihistamines in the attenuation of experimental pruritus. J. Allergy Clin. Immunol. 2007, 119, 176-183. 138. Lim, H. D.; van Rijn, R. M.; Ling, P.; Bakker, R. A.; Thurmond, R. L.; Leurs, R. Evaluation of histamine H1-, H2-, and H3-receptor ligands at the human histamine H4 receptor: identification of 4-methylhistamine as the first potent and selective H4 receptor agonist. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 314, 1310-1321. 139. Hashimoto, T.; Harusawa, S.; Araki, L.; Zuiderveld, O. P.; Smit, M. J.; Imazu, T.; Takashima. S.; Yamamoto, Y.; Sakamoto, Y.; Kurihara, T.; Leurs, R.; Bakker, R. A.; Yamatodani, A. A selective human H4-receptor agonist:( )-2-cyano-1-methyl-3-[(2R,5R)5-[1H-imidazol-4(5)yl]tetrahydrofuran- 2-y] methylguanidine. J. Med. Chem. 2003, 46, 3162-3165. 140. Jablonowski, J. A.; Grice, C. A.; Chai, W.; Dvorak, C. A.; Venable, J. D.; Kwok, A. K.; Ly, K. S.; Wei, J.; Baker, S. M.; Desai, P. J.; Jiang, W.; Wilson, S. J.; Thurmond, R. L.; Karlsson, L.; Edwards, J. P.; Lovenberg, T. W.; Carruthers, N. I. The first potent and selective non-imidazole human histamine H4 receptor antagonists. J. Med. Chem. 2003, 46, 3957-3960. 141. Thurmond, R. L.; Desai, P. J.; Dunford, P. J.; Fung-Leung,W. P.; Hofstra, C. L.; Jiang, W.; Nguyen, S.; Riley, J. P.; Sun, S.; Williams, K. N.; Edwards, J. P.; Karlsson, L. A potent and selective histamine H4 receptor antagonist with anti-inflammatory properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309, 404-413. 142. Terzioglu, N.; van Rijn, R. M.; Bakker, R. A.; De Esch, I. J.; Leurs, R. Synthesis and structure-activity relationships of indole and benzimidazole piperazines as histamine H(4) receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 5251-5256. 143. Nakayama, T.; Kato, Y.; Hieshima, K.; Nagakubo, D.; Kunori, Y.; Fujisawa, T.; Yoshie O. Liver-Expressed Chemokine/CC Chemokine Ligand 16 Attracts Eosinophils by Interacting with Histamine H4 Receptor1 J. Immunol. 2004, 173, 2078-2083. 144. UniProt Consortium. The Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 2007, 35, D193-197. 145. Sjöblom, T.; Jones, S.; Wood, L. D.; Parsons, D. W.; Lin, J.; Barber, T. D.; Mandelker, D.; Leary, R. J.; Ptak, J.; Silliman, N.; Szabo, S.; Buckhaults, P.; Farrell, C.; Meeh, P.; Markowitz, S. D.; Willis, J.; Dawson, D.; Willson, J. K.; Gazdar, A. F.; Hartigan, J.; Wu, L.; Liu, C.; Parmigiani, G.; Park, B. H.; Bachman, K. E.; Papadopoulos, N.; Vogelstein, B.; Kinzler, K. W.; Velculescu, V. E. The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 2006, 314, 268-274. 146. Birdsall, N. J. M. Cloning and structure: function of the H2 histamine receptor. Trends Pharmacol. Sci. 1991, 12, 9-10. 147. Timmerman, H. Cloning of the H1 histamine receptor. Trends Pharmacol. Sci. 1992, 13, 6-7. 148. Ohta, K.; Hayashi, H.; Mizuguchi, H.; Kagamiyama, H.; Fujimoto, K.; Fukui, H. Sitedirected mutagenesis of the histamine H1-receptor: roles of aspartic acid107, asparagine198 and threonine194. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 203, 10961101. 149. Moguilevsky, N.; Varsalona, F.; Guillaume, J. P.; Noyer, M.; Gillard, M.; Daliers, J.; Henichart, J. P.; Bollen, A. Pharmacological and functional characterization of the wildtype and site-directed mutants of the human H1-histamine receptor stably expressed in CHO cells. J. Recept. Signal. Transduct. Res. 1995, 15, 91-102.

112

150. Leurs, R.; Smit, M. J.; Tensen, C. P.; Ter Laak, A. M.; Timmerman, H. Site-directed mutagenesis of the histamine H1-receptor reveals a selective interaction of asparagine207 with subclasses of H1-receptor agonists. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 201, 295-301. 151. Leurs, R.; Smit, M. J.; Meeder, R.; Ter Laak, A. M.; Timmerman, H. Lysine200 located in the fifth transmembrane domain of the histamine H1-receptor interacts with histamine but not with all H1 agonists. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 214, 110-117. 152. Gillard, M.; Van Der Perren, C.; Moguilevsky, N.; Massingham, R.; Chatelain, P. Binding characteristics of cetirizine and levocetirizine to human H(1) histamine receptors: contribution of Lys(191) and Thr(194). Mol. Pharmacol. 2002, 61, 391-399. 153. Gantz, I.; DelValle, J.; Wang, L. D.; Tashiro, T.; Munzert, G.; Guo, Y. J.; Konda, Y.; Yamada, T. Molecular basis for the interaction of histamine with the histamine-H2 receptor. J. Biol. Chem. 1992, 267, 20840-20843. 154. Üveges, A. J.; Kowal, D.; Zhang, Y.; Spangler, T. B.; Dunlop, J.; Semus, S.; Jones, P. G. The role of transmembrane helix 5 in agonist binding to the human H3 receptor J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002, 301, 451-458. 155. Ligneau, X.; Morisset, S.; Tardivel-Lacombe, J.; Gbahou, F.; Ganellin, C. R.; Stark, H.; Schunack, W.; Schwartz, J. C.; Arrang, J. M. Distinct pharmacology of rat and human histamine H3 receptors: role of two amino acids in the third transmembrane domain. Br J. Pharmacol. 2000, 131, 1247-1250. 156. Jongejan, A.; Lim, H. D.; Smits, R. A.; de Esch, I. J. P.; Haaksma, E.; Leurs, R. Delineation of Agonist Binding to the Human Histamine H4 Receptor Using Mutational Analysis, Homology Modeling, and ab Initio Calculations J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 1455-1463. 157. Lim, H. D.; Jongejan, A.; Bakker, R. A.; Haaksma, E.; de Esch, I. J.; Leurs, R. Phenylalanine169 in the second extracellular loop of the human histamine H4 receptor is responsible for the difference in agonist binding between human and mouse H4 receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008 158. Ter Laak, A. M.; Venhorst, J.; Donné-Op den Kelder, G. M.; Timmerman, H. The histamine H1-receptor antagonist binding site. A stereoselective pharmacophoric model based upon (semi-)rigid H1-antagonists and including a known interaction site on the receptor. J. Med. Chem. 1995, 38, 3351-3360. 159. Bruysters, M.; Jongejan, A.; Gillard, M.; van de Manakker, F.; Bakker, R. A.; Chatelain, P.; Leurs, R. Pharmacological differences between human and guinea pig histamine H1 receptors: Asn84 (2.61) as key residue within an additional binding pocket in the H1 receptor. Mol. Pharmacol. 2005, 67, 1045-1052. 160. Bakker, R. A.; Jongejan, A.; Sansuk, K.; Hacksell, U.; Timmerman, H.; Brann, M. R.; Weiner, D. M.; Pardo, L.; Leurs, R. Constitutively active mutants of the histamine H1 receptor suggest a conserved hydrophobic asparagine-cage that constrains the activation of class A G protein-coupled receptors. Mol. Pharmacol. 2008, 73, 94-103. 161. Strasser, A.; Wittmann, H. J. LigPath: a module for predictive calculation of a ligand’s pathway into a receptor-application to the gpH1-receptor. J. Mol. Model. 2007, 13, 209218. 162. Strasser, A.; Wittmann, H. Analysis of the activation mechanism of the guinea-pig Histamine H1-receptor. J. Comput. Aided Mol. Des. 2007, 21, 499-509. 163. Nederkoorn, P. H.; van Lenthe, J. H.; van der Goot, H.; Donné-Op den Kelder, G. M.; Timmerman, H. The agonistic binding site at the histamine H2 receptor. I. Theoretical investigations of histamine binding to an oligopeptide mimicking a part of the fifth transmembrane alpha-helix. J. Comput. Aided Mol. Des. 1996, 10, 461-478. 164. Kelley, M. T.; Bürckstümmer, T.; Wenzel-Seifert, K.; Dove, S.; Buschauer, A.; Seifert, R. Distinct interaction of human and guinea pig histamine H2-receptor with guanidine-type agonists. Mol. Pharmacol. 2001, 60, 1210-1225.

113

165. Yao, B. B.; Hutchins, C. W.; Carr, T. L.; Cassar, S.; Masters, J. N.; Bennani, Y. L.; Esbenshade, T. A.; Hancock, A. A. Molecular modeling and pharmacological analysis of species-related histamine H(3) receptor heterogeneity. Neuropharmacology 2003, 44, 773-786. 166. Lorenzi, S.; Mor, M.; Bordi, F.; Rivara, S.; Rivara, M.; Moroni, G.; Bertoni, S.; Ballabeni, V.; Barocelli, E.; Placi, P. V. Validation of a histamine H3 receptor model through structure-activity relationships for classical H3 antagonists. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5647-5657. 167. Axe, F. U.; Bembenek, S. D.; Szalma, S. Three-dimensional models of histamine H3 receptor antagonist complexes and their pharmacophore. J. Mol. Graph. Mod. 2006, 24, 456-464. 168. Schlegel, B.; Laggner, C.; Meier, R.; Langer, T.; Schnell, D.; Seifert, R.; Stark, H.; Höltje, H. D.; Sippl, W. Generation of a homology model of the human histamine H3 receptor for ligand docking and pharmacophore-based screening. J. Comput. Aided Mol. Des. 2007, 21, 437-453. 169. Schlegel, B.; Sippl, W.; Höltje, H. D. Molecular dynamics simulations of bovine rhodopsin: influence of protonation states and different membrane-mimicking environments. J. Mol. Model. 2005, 12, 49-64. 170. Halgren, T. A. Maximally diagonal force constants in dependent angle-bending coordinates. 2. Implications for the design of empirical force fields. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4710-4723. 171. Pallas, 3.1 verzió; CompuDrug International, Inc., 115 Morgan Drive, Sedona, AZ 86351, USA. 172. „Washing” procedure, Molecular Operating Environment (MOE), Version 2005.06, Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Canada; 2005. 173. Pearlman, R. S. "Concord" distributed by Tripos International, St. Louis, Missouri, 63144, USA. 174. Irwin, J. J.; Shoichet, B. K. ZINC - A free database of commercially available compounds for virtual screening. J. Chem. Inf. Model. 2005, 45, 177-182. 175. Miller, D. W. A chemical class-based approach to predictive model generation. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2003, 43, 568-578. 176. Graph-Pad Software, San Diego, CA 177. Lomize, A. L.; Pogozheva, I. D.; Mosberg, H. I. Structural organization of G-proteincoupled receptors. J. Comput. Aided Mol. Des. 1999, 13, 325-353. 178. Anthes, J. C.; Gilchrest, H.; Richard, C.; Eckel, S.; Hesk, D.; West, R. E.; Williams, S. M.; Greenfeder, S.; Billah, M.; Kreutner, W.; Egan, R. E. Biochemical characterization of desloratadine, a potent antagonist of the human histamine H(1) receptor. Eur. J. Pharmacol. 2002, 449, 229-237. 179. Patny, A.; Desai, P. V.; Avery, M. A. Homology modeling of G-protein-coupled receptors and implications in drug design. Curr. Med. Chem. 2006, 13, 1667-1691. 180. Spooner, P. J.; Sharples, J. M.; Goodall, S. C.; Bovee-Geurts, P. H.; Verhoeven, M. A.; Lugtenburg, J.; Pistorius, A. M.; Degrip, W. J.; Watts, A. The ring of the rhodopsin chromophore in a hydrophobic activation switch within the binding pocket. J. Mol. Biol. 2004, 343, 719-730. 181. Polgar, T.; Keseru, G. M. Virtual screening for beta-secretase (BACE1) inhibitors reveals the importance of protonation states at Asp32 and Asp228. J. Med. Chem. 2005, 48, 37493755. 182. Patel, D. S.; Bharatam, P. V. New leads for selective GSK-3 inhibition: pharmacophore mapping and virtual screening studies. J. Comput. Aided Mol. Des. 2006, 20, 55-66. 183. Lyne, P. D.; Kenny, P. W.; Cosgrove, D. A.; Deng, C.; Zabludoff, S.; Wendoloski, J. J.; Ashwell, S. Identification of compounds with nanomolar binding affinity for checkpoint kinase-1 using knowledge-based virtual screening. J. Med. Chem. 2004, 47, 1962-1968.

114

184. Guichou, J. F.; Viaud, J.; Mettling, C.; Subra, G.; Lin, Y. L.; Chavanieu, A. Structurebased design, synthesis, and biological evaluation of novel inhibitors of human cyclophilin A. J. Med. Chem. 2006, 49, 900-910. 185. Forino, M.; Jung, D.; Easton, J. B.; Houghton, P. J.; Pellecchia, M. Virtual docking approaches to protein kinase B inhibition. J. Med. Chem. 2005, 48, 2278-2281. 186. Stahl, M.; Rarey, M. Detailed analysis of scoring functions for virtual screening. J. Med. Chem. 2001, 44, 1035-1042. 187. Evers, A.; Hessler, G.; Matter, H.; Klabunde, T. Virtual screening of biogenic aminebinding G-protein coupled receptors: comparative evaluation of protein- and ligand-based virtual screening protocols. J. Med. Chem. 2005, 48, 5448-5465. 188. Lipinski, C. A.; Lombardo, F.; Dominy, B. W.; Feeney, P. J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv. Drug Deliv. Rev. 2001, 46, 3-26. 189. Oprea, T. I. Property distribution of drug-related chemical databases. J. Comput. Aided Mol. Des. 2000, 14, 251-264. 190. Kelder, J.; Grootenhuis, P. D.; Bayada, D. M.; Delbressine, L. P.; Ploemen, J. P. Polar molecular surface as a dominating determinant for oral absorption and brain penetration of drugs. Pharm. Res. 1999, 16, 1514-1519. 191. Fialkowski, M.; Bishop, K. J. M.; Chubukov, V. A.; Campbell, C. J.; Grzybowski, B. A. Architecture and evolution of organic chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 72637269. 192. Baurin, N.; Baker, R.; Richardson, C.; Chen, I.; Foloppe, N.; Potter, A.; Jordan, A.; Roughley, S.; Parratt, M.; Greaney, P.; Morley, D.; Hubbard, R. E. Drug-like annotation and duplicate analysis of a 23-supplier chemical database totaling 2.7 million compounds. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 643-651.

115

9 Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Keserű Györgynek (Richter) önzetlen szakmai és lelki támogatásáért, amellyel 2002 óta segítette munkámat, és jelentős mértékben hozzájárult a bemutatott eredmények eléréséhez. Köszönet illeti témavezetőmet, Dr. Józan Miklóst munkám töretlen támogatásáért és a bátorításért. Köszönöm Dr. Noszál Bélának, a Gyógyszerészi Kémiai Intézet vezetőjének, hogy már diákkörösként és a doktori munkám során is figyelemmel kísérte fejlődésemet, és szakmai, anyagi és nem utolsó sorban baráti támogatást biztosított kutatómunkámhoz. Köszönöm Dr. Falus Andrásnak, a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet vezetőjének a remek kutatási téma ötleteket, a mindvégig érezhető szakmai és anyagi támogatást, valamint a baráti beszélgetéseket. Köszönet illeti Kiss Bélát (Richter) a radioligandum kötődési tesztek alapjainak elsajátításában nyújtott kiemelkedő segítségért, és a folyamatos bíztatásért. Köszönöm Dr. Robin L. Thurmond-nak a J&J San Diego-i kutatójának, hogy 2006 nyarán 1 hónapig tanulmányozhattam és gyakorolhattam a humán H4 receptor radioligandum kötődési tesztjének náluk kifejlesztett eljárását. Szeretném megköszönni Dr. Kovári Zoltánnak a homológiamodellezés alapjainak elsajátításában nyújtott segítségét. Külön szeretném kiemelni Dr. Béni Szabolcs, Rácz Ákos, Bubenyák Máté, Dr. Kökösi József, Dr. Hosztafi Sándor (Gyógyszerészi Kémiai Intézet), Jelinek Ivett, László Valéria, Farkasné Nagy Krisztina (Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet) és Molnár László, Magdó Ildikó, Sándor Márk, Kiss Györgyi, Gere Anikó, Könczöl Árpád és Rill Attila (Richter), valamint Polgár Tímea (Servier), Erős Dániel (Vichem) és Szalai Ferenc (NIIF) munkámhoz nyújtott segítségét. Köszönet illeti a Gyógyszerészi Kémiai Intézet és a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet és a Richter Gedeon Nyrt. valamennyi munkatársát a támogatásukért és a baráti légkörért, amellyel nagyban hozzájárultak kutatásom sikeréhez. Végezetül köszönöm családomnak a töretlen bíztatást és támogatást, amivel segítették doktori munkámat.

116