EVALUATIE VAN ANANDAMIDE ANALOGEN ALS POTENTIËLE TRACERS VOOR IN VIVO EVALUATIE VAN FAAH IN DE HERSENEN

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2008-2009

EVALUATIE VAN ANANDAMIDE ANALOGEN ALS POTENTIËLE TRACERS VOOR IN VIVO EVALUATIE VAN FAAH IN DE HERSENEN

Ruben VAN MELCKEBEKE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor Prof. dr. Filip DE VOS

Commissarissen Prof. dr. Kevin BRAECKMANS Prof. dr. Linda THIENPONT

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2008-2009

EVALUATIE VAN ANANDAMIDE ANALOGEN ALS POTENTIËLE TRACERS VOOR IN VIVO EVALUATIE VAN FAAH IN DE HERSENEN

Ruben VAN MELCKEBEKE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor Prof. dr. Filip DE VOS

Commissarissen Prof. dr. Kevin BRAECKMANS Prof. dr. Linda THIENPONT

AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

20 mei 2009

Promotor

Auteur

Prof. dr. Filip DE VOS

Ruben VAN MELCKEBEKE

DANKWOORD Dit werk kon slechts tot stand komen dankzij de intensieve hulp en steun van een aantal mensen. Ik zou graag dank willen uitbrengen aan mijn promotor, Prof. De Vos, voor het aanreiken van het onderwerp en het kritisch evalueren van de tekst. Dankzij zijn goed advies heb ik me meer kunnen ontwikkelen in het wetenschappelijk schrijven. Daarnaast een speciaal woord van dank voor mijn begeleidster en doctoraatstudente Leonie wyffels, voor talloze dingen: het onbaatzuchtig nalezen van dit werk, de uitleg en suggesties, en de aanmoedigingen na het alweer mislukken van een experiment. Ik hoop dan ook van harte dat ze binnenkort mag slagen voor haar doctoraat. Hierbij zou ik ook dank willen betuigen aan mijn medestudenten, voor de steun die ik op sommige momenten hard nodig had. Tenslotte nog een dankwoord aan mijn familie en vrienden voor hun morele steun en interesse die ze mij geboden hebben bij het maken van dit werk.

INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING ..................................................................................................................................................... 1 1.1. HET ENDOCANNABINOIDSYSTEEM .............................................................................................................. 1 1.1.1. Cannabinoidreceptoren ....................................................................................................................... 1 1.1.2. Endocannabinoiden ............................................................................................................................. 2 1.1.3. Neuromodulatie ................................................................................................................................... 3 1.2. FAAH ............................................................................................................................................................ 4 1.2.1. Structuur .............................................................................................................................................. 4 1.2.2. Katalytisch mechanisme ...................................................................................................................... 5 1.2.3. Substraatspecificiteit en SAR ............................................................................................................... 6 1.2.4. Distributie ............................................................................................................................................ 7 1.3. HET ENDOCANABINOIDSYSTEEM EN NEUROLOGISCHE EN NEUROPSYCHIATRISCHE AANDOENINGEN...... 8 1.4. VISUALISATIE VAN ENZYMEN....................................................................................................................... 9 1.5. POSITRON EMISSIE TOMOGRAFIE ............................................................................................................. 11 2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................................................. 13 3. MATERIALEN EN METHODEN ..................................................................................................................... 15 3.1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ....................................................................... 15 3.2. DETECTIE VAN RADIOACTIVITEIT ............................................................................................................... 16 3.2.1. De dosiscalibrator .............................................................................................................................. 16 3.2.2. De vaste stof scintillatiedetector ....................................................................................................... 17 11

3.3. PRODUCTIE VAN HET C-ISOTOOP ............................................................................................................ 20 3.3.1. Het cyclotron...................................................................................................................................... 20 3.3.2. De target ............................................................................................................................................ 21 11

3.3.3. Synthese van een secundaire precursor: [ C]CH3I ............................................................................. 21 4. RESULTATEN ............................................................................................................................................... 22 4.1. AANTONEN VAN EEN SUBSTRAAT ............................................................................................................. 22 4.1.1. Experimentele uitvoering ................................................................................................................... 22 4.1.2. Resultaten en discussie ...................................................................................................................... 23 4.2. STABILITEITSTESTEN .................................................................................................................................. 23 4.2.1. Experimenteel gedeelte ..................................................................................................................... 24 4.2.2. Resultaten en discussie ...................................................................................................................... 24 4.3. MICHAËLIS-MENTEN KINETIEK .................................................................................................................. 25 4.3.1. Experimenteel gedeelte ..................................................................................................................... 28 4.3.1.1. Opstellen van de ijklijn ................................................................................................................................ 29 4.3.1.2. Opstellen van de progressiecurve ............................................................................................................... 29 4.3.1.3. Opstellen van de Michaëlis-Menten curve .................................................................................................. 29

4.3.2. Resultaten en discussie ...................................................................................................................... 30 4.4. CARBA5 ...................................................................................................................................................... 32 4.4.1. Radiosynthese .................................................................................................................................... 32 4.4.1.1. Experimenteel gedeelte............................................................................................................................... 32 4.4.1.2. Resultaten.................................................................................................................................................... 33

4.4.2. Bepaling van de distributiecoëfficiënt (log D) .................................................................................... 34 4.4.2.1. Experimenteel gedeelte............................................................................................................................... 34 4.4.2.2. Resultaten en discussie................................................................................................................................ 35

4.4.3. Validatie van de metaboliet bepalingsmethode ................................................................................ 35 4.4.3.1. Experimenteel gedeelte............................................................................................................................... 35 4.4.3.2. Resultaten en discussie................................................................................................................................ 36

5. CONCLUSIES ............................................................................................................................................... 37 6. LITERATUURLIJST ........................................................................................................................................ 39

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 2-AG: 2-arachidonylglycerol 2OCH3AA: 2-methoxyphenethylarachidonylamide 2OCH3LZ: 2-methoxyphenethyllinoleoylamide 3OCH3AA: 3-methoxyphenethylarachidonylamide 3OCH3LZ: 3-methoxyphenethyllinoleoylamide 4-IBA: 4-iodobenzylarachidonylamide 4-IPA: 4-iodophenethylarachidonylamide 4OCH3AA: 4-methoxyphenethylarachidonylamide 4OCH3LZ: 4-methoxyphenethyllinoleoylamide AA: arachidonzuur AA+I: N-(2-iodoethyl)arachidonylamide AC: adenylaatcyclase AChE: acetylcholinesterase AEA: arachidonylethanolamide of anandamide AS: amidase signature ATP: adenosine trifosfaat BHB: bloedhersenbarrière BSA: bovine serum albumin cAMP: cyclisch adenosine monofosfaat carba5: bifenyl-3-yl 4-methoxyfenylcarbamaat CBx-receptor: cannabinoid receptor type x DMF: dimethylformamide DPBS: Dulbecco's Phosphate Buffered Saline EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid FAAH: fatty acid amide hydrolase GABA: gamma-amino-boterzuur GPRC: G-proteïne gekoppelde receptor G-proteïne: guanine trifosfaat bindend proteïne

HPLC: high performance liquid chromatography IC50: 50% inhiberende concentratie KM: Michaëlis-Menten constante Lys: lysine LZ: linoleïnezuur LZ+I: N-(2-iodoethyl)linoleoylamide MAFP: methoxy arachidonyl fluorophosphonaat MAPK: mitogeen-geactiveerd proteïne kinase PET: positron emissie tomografie PKA: proteïne kinase A PMT: photomultiplier tube RP: reversed phase S.A.: specifieke activiteit SAR: structuur-activiteitsrelatie Ser: serine TrisHCl: tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride TRPV1: transient receptor potential vanilloid 1 UV/VIS detector: ultraviolet/visible detector Vmax: maximale snelheid van de enzymatische reactie

Inleiding |1

1. INLEIDING 1.1. HET ENDOCANNABINOIDSYSTEEM Hoewel

men

het

toen

nog

niet

wist,

begon

de

ontdekking

van

het

endocannabinoidsysteem al 4000 jaar geleden, toen in het Verre Oosten de therapeutische en psychotrope werking van de plant Cannabis sativa gedocumenteerd werd (Peters & Nahas, 1999). Grootschalig medicinaal, religieus en recreatief gebruik van cannabis doorheen de eeuwen heen zorgde vreemd genoeg niet voor wetenschappelijke interesse in dit onderwerp. Het is pas gedurende de laatste 40 jaar, nadat Gaoni en Mechoulam de psychoactieve component

uit

cannabis

endocannabinoidsysteem

ophelderden intensief

(Gaoni

onderzocht

&

Mechoulam, wordt.

1964),

dat

het

Cannabinoidreceptoren,

endocannabinoiden en de enzymen voor hun synthese en afbraak, vertegenwoordigen de elementen van dit nieuw endogeen signaalsysteem dat betrokken is in een plethora aan fysiologische functies (De Petrocellis, 2004).

1.1.1. Cannabinoidreceptoren Tot dusver werden er twee cannabinoidreceptoren geïdentificeerd en moleculair gekarakteriseerd, namelijk cannabinoid receptor type 1 (CB1-receptor) (Matsuda et al., 1990) en type 2 (CB2-receptor) (Munro et al., 1993). Deze receptoren behoren tot de superfamilie van de 7-transmembranaire G-proteïne gekoppelde receptoren (GPRCs). Terwijl de CB1receptor één van de meest voorkomende GPRC in de hersenen is (Herkenham et al., 1990) en ook voorkomt in verschillende perifere weefsels, zijn CB2-receptoren bijna exclusief terug te vinden in de cellen van het immuuniteitssysteem (Howlett et al., 2002a). Volgens sommige bronnen bestaan er nog andere cannabinoidreceptoren, dewelke tot nu toe nog niet gekloond werden (Begg et al., 2005). CB1-receptoren zijn gewoonlijk gekoppeld aan G-proteïnen van de Gi/o-klasse. Hun activatie leidt tot inhibitie van adenylaatcyclase met gedaalde cAMP vorming tot gevolg en tot verminderde Ca2+ influx. Via deze Gi/o-proteïnen worden ook K+ kanalen beïnvloed en wordt de mitogeen-geactiveerde proteïne kinase cascade geactiveerd (Figuur 1.1). CB1receptoren kunnen ook soms worden gekoppeld aan Gs en/of Gq/11, hoewel het fysiologisch belang van deze koppeling nog niet volledig gekend is (Demuth & Molleman, 2006).

Inleiding |2

FIGUUR 1.1: SIGNAALTRANDUCTIE VAN DE CANNABINOID RECEPTOREN (Di Marzo et al., 2004)

1.1.2. Endocannabinoiden In 1992 werd het eerste endogene cannabinoid, arachidonylethanolamide (AEA), ook anandamide genoemd, geïdentificeerd (Devane et al., 1992). Daaropvolgend werd een tweede endocannabinoid, 2-arachidonyl glycerol (2-AG), ontdekt (Mechoulam et al., 1995; Sugiura et al., 1995). Zoals geïllustreerd in Figuur 1.2, zijn beide verbindingen derivaten van arachidonzuur. Ze zijn in staat om, weliswaar met verschillende affiniteit en intrinsieke activiteit, te binden op CB1- en CB2-receptoren (Howlett, 2002b). Gedurende de laatste jaren werden er verschillende andere endocannabinoiden ontdekt waaronder 2-arachidonylglycerol ether (noladin ether), O-arachidonyl-ethanolamine (virodhamine) en N-arachidonoyldopamine (De Petrocellis, 2004).

FIGUUR 1.2: CHEMISCHE STRUCTUUR VAN DE TWEE MEEST BESTUDEERDE ENDOCANNABINOÏDEN

Zowel Ca2+ influx als de activatie van bepaalde metabotrope receptoren kunnen, hetzij coöperatief, hetzij onafhankelijk, een complex systeem activeren dat leidt tot het afsplitsen van membranaire fosfolipiden en uiteindelijk tot de synthese van endocannabinoiden. Verschillende enzymen zijn betrokken bij de synthese van verschillende endocannabinoiden, wat erop wijst dat de endocannabinoiden onafhankelijk van elkaar werkzaam zijn. Na hun

Inleiding |3 biosynthese worden AEA en 2-AG direct vrijgesteld in de extracellulaire ruimte om hun targets, vnl. de CB-recpetoren, te prikkelen. Het endocannabinoidsignaal wordt vervolgens beëindigd door een zeer efficiënt degradatieproces bestaande uit: gefaciliteerde opname vanuit de extracellulaire ruimte in de cel gevolgd door enzymatische afbraak door specifieke intracellulaire enzymen. De moleculaire structuur van de membraantransporter betrokken bij endocannabinoid opname werd nog niet opgehelderd. Daarentegen zijn de enzymen die instaan voor degradatie van endocannabinoiden, wel goed gekarakteriseerd. Fatty acid amide hydrolase (FAAH) is het enzym verantwoordelijk voor afbraak van AEA en afgeleide verbindingen (Giang & Cravatt, 1997), en monoacylglycerol lipase voor de afbraak van 2-AG (Dinh et al., 2002). Ook andere enzymen, zoals het FAAH homoloog FAAH-2 en N-acylethanolamine acid amidase, zijn gedeeltelijk betrokken bij de afbraak van deze verbindingen (voor een recente review, zie De Petrocellis, 2009).

1.1.3. Neuromodulatie In tegenstelling tot de klassieke neurotransmitters zijn de endocannabinoiden retrograde neurotranmitters. Ze worden vrijgesteld uit de postsynaptische neuronen en verplaatsen zich in tegengestelde richting naar de presynaptische axonen, om daar CB1receptoren te stimuleren. Activatie van de CB1-receptoren vermindert de exciteerbaarheid van het presynaptisch neuron door inhibitie van Ca2+ kanalen, waardoor de vrijstelling van klassieke neurotransmitters, zoals glutamaat en GABA, wordt onderdrukt (Figuur 1.3).

FIGUUR 1.3: ENDOCANNABINOIDEN ALS RETROGRADE NEUROTRANSMITTERS (Wilson & Nicoll, 2002)

Inleiding |4

1.2. FAAH FAAH is het voornaamste enzym dat instaat voor het de afbraak van AEA door hydrolyse van de amide binding (Figuur 1.4). Dit werd duidelijk door de ontwikkeling van FAAH knock-out muizen, die zeker 10 tot 15 keer hogere spiegels van AEA vertonen ter hoogte van verschillende hersenweefsels in vergelijking met normale muizen (Cravatt et al., 2001).

FIGUUR 1.4: ENZYMATISCHE HYDROLYSE VAN AEA DOOR FAAH

FAAH is een integraal membraangebonden enzym dat vooral in de microsomale en mitochondriale fracties teruggevonden wordt. Het enzym is het meest actief bij een alkalische pH (tussen 8,5 en 10) en bij een temperatuur van ongeveer 37°C. De hydrolyse van AEA door dit enzym volgt Michaelis-Menten kinetiek, met een KM-waarde gaande van 0,8 tot 180 µM afhankelijk van de gebruikte enzymbereiding (Deutsch et al., 2002). Katayaman et al. (1999) toonden aan dat FAAH over de unieke eigenschap beschikt om ook de omgekeerde hydrolysereactie te katalyseren, dus condensatie van arachidonzuur en ethanolamine. Zeer hoge concentraties ethanolamine en arachidonzuur zijn echter nodig voor deze synthase pathway, waardoor verondersteld wordt dat deze reactie niet doorgaat onder fysiologische condities. Uit studies van databanken met de aminozurensequentie van FAAH bleek dat dit enzym behoort tot een grote groep van enzymen die we de amidase signature (AS) familie noemen. Alle leden van deze enzymfamilie bezitten de kenmerkende ‘AS sequentie’, d.i. een gebied over ongeveer 160 aminozuren met sterke homologie in de sequentie. Er werden al meer dan 100 leden van deze enzymfamilie geïdentificeerd waarvan de meesten van bacteriële of fungale oorsprong zijn (McKinney & Cravatt, 2005).

1.2.1. Structuur In 2002 werd m.b.v. X-stralendiffractie de kristalstructuur van rat FAAH in complex met de irreversibele inhibitor methoxy arachidonyl fluorophosphonaat (MAFP) opgehelderd tot een resolutie van 2,8 Å (Bracey et al., 2002) (Figuur 1.5).

Inleiding |5

FIGUUR 1.5: KRISTALSTRUCTUUR VAN HET FAAH-DIMEER IN ASSOCIATIE MET MAFPINHIBITOR (GEEL). KANALEN DIE DE KRISTALSTRUCTUUR DOORKRUISEN WORDEN GETOOND IN HET LICHTBLAUW (McKinney & Cravatt, 2005)

FAAH kristalliseert uit als een dimeer enzym waarvan beide monomeren elk 63 kDa groot zijn. Het enzym bezit in z`n structuur een drietal kanaaltjes waardoor de actieve site van het enzym simultane toegang heeft tot zowel de membraan als het cytosol van de cel. Één van de kanaaltjes bevindt zich tussen het oppervlak van het enzym en de substraatbindingsplaats. Deze substraattoegangsweg heeft een amfifiel karakter om substraten, die een polaire vetzuuramide kopgroep bevatten, gemakkelijker tot de actieve site van het enzym toe te laten. De acylketen van het substraat zit gebonden in een tweede kanaaltje, dat naar de actieve site van het enzym leidt, en bijna volledig uit hydrofobe residuen bestaat die helpen bij de substraatherkenning. Ten slotte is er nog een derde kanaaltje dat leidt van de substraatbindingsplaats naar het cytosol van de cel. Door de aanwezigheid van deze kanaaltjes is FAAH voorzien van een goed geolied mechanisme voor substraatbinding en productvrijstelling. Hierbij komen vetzuuramiden eerst binnen via de membraan naar de substraatbindingsplaats. Na hydrolyse verlaten het vrijgekomen vetzuur (hydrofoob) en amine (hydrofiel) het enzym, resp. via het membraan- en het cytosol-toegangskanaal (McKinney & Cravatt, 2005).

1.2.2. Katalytisch mechanisme De actieve site van FAAH bestaat uit een serine-serine-lysine katalytische triade, in tegenstelling tot de klassieke serine-histidine-aspartaat triade zoals bij de meeste serine hydrolasen. Deze drie aminozuren (Ser241-Ser217-Lys142), die men ook terugvindt bij andere leden van de AS familie, liggen dichtbij mekaar gelokaliseerd ter hoogte van de

Inleiding |6 substraatbindingsplaats en vervullen elk hun specifieke taak bij het hydrolyseren van vetzuuramiden. Het Ser241 heeft een -OH groep die als nucleofiel kan optreden. Lys142 speelt een dubbele rol: eens als base om Ser241 te activeren en eens als zuur dat deelneemt bij het protoneren van de substraat leaving group. Ser217 overbrugt de twee andere leden van de triade door dienst te doen als "protonenshuttle", zoals weergegeven in Figuur 1.6.

FIGUUR 1.6: ACYLATIESTAP VAN DE AMIDE HYDROLYSE GEKATALYSEERD DOOR FAAH (McKinney & Cravatt, 2005)

Het hele mechanisme verloopt in twee stappen. De eerste stap is een acylatiestap, waarbij er een nucleofiele aanval van het katalytisch nucleofiel Ser241 FAAH op de carbonylgroep van het substraat optreedt en bijna tegelijkertijd wordt de leaving group geprotoneerd en uitgestoten. In een tweede stap wordt het vetzuuramide-FAAH intermediair naar zijn oorspronkelijke toestand gebracht door tussenkomt van een molecule water (McKinney & Cravatt, 2005).

1.2.3. Substraatspecificiteit en SAR Één van de meest opvallendste eigenschappen van FAAH is zijn mogelijkheid om verschillende types vetzuuramides of -esters als substraat te herkennen. Deze flexibiliteit heeft tot gevolg dat de twee best gekende endocannabinoiden (AEA en 2-AG, respectievelijk een amide en een ester) gehydrolyseerd worden door hetzelfde enzym. Verschillende SAR-studies werden opgezet om de structurele vereisten voor substraatinteractie met FAAH te vinden. De belangrijkste resultaten uit deze studies kunnen als volgt worden samengevat (Bisogno et al., 2002): (i)

Er moet op zijn minst één cis-dubbele binding aanwezig zijn op C-9 van de acylketen. Zijn er twee, drie of vier dubbele bindingen in de acylketen aanwezig, des te sterker de interactie met het enzym. Dit wijst erop dat een correcte buiging van het vetzuurgedeelte noodzakelijk is voor een optimale interactie van de carbonyl-amide groep met de actieve serinegroep van het enzym.

(ii) De amidegroep moet primair of secundair zijn. Primaire amides zijn betere substraten dan ethanolamides. Tertiaire amides zijn geen goede substraten voor FAAH.

Inleiding |7 (iii) Introductie van een methylgroep op de C-2, C-1' of C-2' positie van AEA leidt tot metabool stabielere analogen. In sommige gevallen, zal de hydrolysesnelheid bij deze analogen afhangen van de stereochemie van de chirale centra. (iv) AEA-analogen met een elektronegatieve groep (bv. hydroxyl of fluor) op de C-2' positie zijn gevoeliger voor hydrolyse dan hun alkylcongeneren. Door de elektronegatieve groep wordt de carbonylgroep namelijk meer elektrofiel, en dit begunstigt de enzymatische hydrolyse. In het geval we de ethanol kopgroep substitueren met fenol, dan moet de hydroxylgroep in ortho- of metapositie staan voor goede interactie met FAAH. (v) Bij substitutie van de amidegroep met functies die elektrofiele koolstofatomen bevatten, zoals in de sulfonylfluoride- en methylfluorofosfonylderivaten, worden krachtige inhibitoren van FAAH verkregen. (vi) Introductie van een heteroatoom alfa t.o.v. de carbonylgroep verhoogt de stabiliteit, mogelijk door stabilisatie van de reagerende carbonylgroep. (vii) Gamma-keto-heterocyclische derivaten van AEA hebben een varieërende affinteit voor FAAH afhankelijk van het type heteroatomen en substituenten aanwezig in de heterocyclische groep.

1.2.4. Distributie De orgaandistributie van FAAH verschilt tussen de species onderling. Zo vindt men bij ratten FAAH voornamelijk terug in de lever, de dunne darm, de hersenen, de testis, de uterus, de nieren, het oogweefsel en de milt, maar niet in de skeletspieren of in het hart. Daarentegen is FAAH bij mensen voornamelijk terug te vinden in de pancreas, de hersenen, de nieren, de skeletspieren, de placenta en in mindere mate in de lever (Vandevoorde & Lambert, 2005). De regionale locatie van FAAH werd ook reeds onderzocht in rattenhersenen en deze werd vergeleken met de CB1-receptor distributie in de hersenen. We onderscheiden drie verschillende soorten regio`s. Als eerste zijn er een groot aantal hersenregio's (o.a. de cerebellaire

cortex,

de

hippocampus

en

de

neocortex)

met

een

complementair

expressiepatroon van FAAH en CB1-receptoren. Hierbij zijn FAAH bevattende neuronale somata en dendrieten postsynaptisch gelegen t.o.v. axonen, die de CB1-receptor tot expressie brengen. Dit complementair expressiepatroon legde de basis voor de hypothese dat endocannabinoiden zowel postsynaptisch gesynthetiseerd als afgebroken worden en functioneren

als

retrograde

signaalmoleculen

om

de

vrijstelling

van

klassieke

Inleiding |8 neurotranmitters, zoals GABA en glutamaat, te inhiberen. Daarop volgende studies bevestigden deze hypothese. Verder onderscheiden we een aantal regio's in de hersenen (o.a. de globus pallidus en de substantia nigra pars reticulata) waar er enorm veel CB1-receptor expressie is, maar met weinig tot geen geassocieerde FAAH-expressie. In deze hersengebieden kan FAAH dus veel minder tot niet de endocannabinoid signalering controleren. Ten slotte bestaan er ook nog hersenregio's waar FAAH bevattende neuronen en/of oligodendrocyten voorkomen in afwezigheid van CB1-receptoren. In zulke hersenregio's is de rol van FAAH waarschijnlijk niet met CB1-afhankelijke endocannabinoid signaalmechanismen gerelateerd. Zo heeft AEA ook nog andere targets in de hersenen, verschillend van de CB1-receptor. AEA zal in deze hersengebieden bijvoorbeeld als endogeen ligand voor de TRPV1-receptoren dienen (Egertová et al., 2003).

1.3. HET ENDOCANABINOIDSYSTEEM EN NEUROLOGISCHE EN NEUROPSYCHIATRISCHE AANDOENINGEN Een toenemende hoeveelheid studies toont aan dat de symptomen van verschillende neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen veroorzaakt zouden kunnen worden door stoornissen in de biosynthese en/of afbraak van endocannabinoiden (wyffels et al., 2009). Tabel 1.1 geeft een beknopt overzicht. TABEL 1.1: OVERZICHT VAN NEUROLOGISCHE EN NEUROPSYCHIATRISCHE AANDOENING DIE GERELATEERD ZIJN MET EEN DEFECT IN DE ENDOCANNABINOID SYNTHESE EN/OF AFBRAAK

Aandoening

Bevindingen

Bronnen

Angststoornissen

Endogene cannabinoiden kunnen bijdragen tot het beheersen van emoties. Wanneer de afbraak van AEA verhinderd wordt door FAAH-inhibitie, zullen emotionele toestanden zoals angst beter onder controle zijn. Sommige anekdotes beweren dat cannabisgebruik de symptomen van een depressie kan verlichten. Blokkade van het FAAH-enzym versterkt de werking van endogene cannabinoiden en vertoont antidepressieve effecten. Endocannobinoiden zijn anticonvulsief. Patiënten met moeilijk te controleren symptomen van multiple sclerose, behelpen zichzelf soms door cannabisgebruik. Inderdaad, cannabinoiden (plantaardige, endogene of synthetische) reduceren tremor en spasticiteit in een diermodel van multiple sclerose.

Fabricio et al., 2008; Kathuria et al., 2003; Naderi et al., 2008 Bortolato et al., 2007; Gobbi et al., 2005

Depressie

Epilepsie Multiple Sclerose

Wallace et al., 2002 Baker et al., 2000; Baker et al., 2001; Pertwee, 2002

Inleiding |9 TABEL 1.1 (VERVOLG): OVERZICHT VAN NEUROLOGISCHE EN NEUROPSYCHIATRISCHE AANDOENING DIE GERELATEERD ZIJN MET EEN DEFECT IN DE ENDOCANNABINOID SYNTHESE EN/OF AFBRAAK

Aandoening

Bevindingen

Bronnen

Schizofrenie

Hyperactiviteit van het centrale endocannabinoidsysteem Malone et al., 2008; zou in verband staan met schizofrenie. Ujike & Morita, 2004 Verslaving DRUGSVERSLAVING Basavarajappa et Een missense mutatie in het FAAH-gen is geassocieerd met al., 2006; problematisch druggebruik. Basavarajappa, ALCOHOLISME 2007; Blednov et FAAH speelt een directe rol in het regelen van het al., 2007; Chiang et alcoholconsumptiegedrag bij muizen. Wanneer de al., 2004; Sipe et functionaliteit van FAAH beschadigd is, verhoogt het al., 2002 drankgedrag, verminderd de gevoeligheid voor Vinod et al., 2008 alcoholgeïnduceerde sedatie en treed sneller herstel op van alcoholgeïnduceerde motorische incoördinatie. Ziekte van Alzheimer Post-mortem onderzoek bij Alzheimerpatiënten wees op Benito et al., 2003; verhoogde FAAH-activiteit in plaques ter hoogte van Micale et al., 2007 neuronen, voornamelijk ter hoogte van astrocyten en microglia. Ziekte van Onderzoek bij Huntingtonpatiënten wees op zowel een Lastres-Becker et Huntington verlies aan cannabinoidreceptoren als een vermindering al., 2002; Micale et van endocannabinoiden in bepaalde hersenstructuren, al. 2007 zoals de basale ganglia. Toedienen van verbindingen die de endocannabinoid activiteit verhogen (reuptake-inhibitiren, FAAH-inhibitoren) zorgt voor activatie van de overblijvende fractie cannabinoidreceptoren en aldus een duidelijke verbetering van bepaalde symptomen. Ziekte van Parkinson Een verhoogde endogene cannabinoidconcentratie in de Di Marzo et al., basale ganglia is geassocieerd met Parkinson. 2000; Gubellini et al., 2002

Om de relatie tussen het FAAH-endocannabinoidsysteem en neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen beter te begrijpen, en om meer inzicht te verwerven over veranderingen in de expressie/activiteit van FAAH en pathologische aandoeningen, kan het in vivo visualiseren van FAAH nuttig zijn (wyffels et al., 2009).

1.4. VISUALISATIE VAN ENZYMEN In vivo visualisatie en bepalen van de activiteit van een enzym met behulp van nietinvasieve medische beeldvormingstechnieken zoals positron emissie tomografie, levert ons heel wat informatie op. Zo zal men onder andere de lokalisatie en expressiegraad van dat

I n l e i d i n g | 10 bepaald enzym in het organisme kunnen achterhalen. Als een enzym verantwoordelijk is voor een bepaalde aandoening, dan kan men via activiteitsmeting ervan een éénduidige diagnose stellen, het mechanisme van de ziekte achterhalen, de progressie van de ziekte opvolgen en farmaca die inwerken op het enzym evalueren (Brooks, 2005). Metabolic trapping en het gebruik van gemerkte enzyminhibitoren zijn twee methoden om enzymen in de hersenen te visualiseren m.b.v. radio-isotopen. De eerste methode berust op het principe van ‘metabolic trapping’ (Figuur 1.7). Hierbij wordt een lipofiel, radioactief gemerkt substraat van het te onderzoeken enzym dat in staat is om de bloedhersenbarrière (BHB) te passeren toegediend. Na opname in de hersenen, wordt het substraat door het enzym gemetaboliseerd. Hierbij ontstaat een radioactief gemerkt product dat omwille van hydrofiliciteit of ionisatie de BHB niet meer kan passeren en aldus gevangen zit in de hersenen. Met behulp van PET kan dan de radioactieve metaboliet in beeld gebracht worden om een idee te krijgen over de enzymactiviteit en lokalisatie van het enzym in de hersenweefsels (wyffels et al., 2009).

FIGUUR 1.7: METABOLIC TRAPPING PRINCIPE OM FAAH TE VISUALISEREN

Metabolic trapping werd bijvoorbeeld al met succes toegepast voor het bepalen van de acetylcholinesterase (AChE)-activiteit: [11C]-N-methylpiperidin-4-yl acetaat ([11C]MP4A) wordt door AChE omgezet tot het hydrofiele [11C]MP4A hydroxide. Dit product blijft gevangen in de hersenen waar de omzetting plaatsvindt, waardoor het mogelijk wordt om de regionale AChE-activiteit te bepalen (Namba et al., 2002). Andere goed gekende voorbeelden zijn het gebruik van [18F]-2-fluorodeoxyglucose ([18F]-FDG) om het cerebraal glucoseverbruik te bepalen voor detectie van hersentumoren, epileptische centra en de ziekte van

I n l e i d i n g | 11 Alzheimer, en het gebruik van [99mTc]-ethyleen cysteïne dimeer ([99mTc]-ECD) voor het bestuderen van de regionale cerebrale perfusie (Kung, 1991). Een alternatieve methode om enzymen te visualiseren, is het gebruik van selectieve, radioactief gemerkte inhibitoren van een bepaald enzym. Na binding van deze inhibitoren ter hoogte van het enzym, kan met behulp van beeldvormingstechnieken het enzym gevisualiseerd worden. Het nadeel van deze techniek is dat er zo alleen regionale verschillen in enzymdensiteit kunnen gedetecteerd worden, zonder dat informatie verkregen wordt over de functionaliteit van het enzym (wyffels et al., 2009). Door het gebruik van radioactieve inhibitoren kon men bijvoorbeeld AchE visualiseren met behulp van de competitieve inhibitor [11C]-fysostigmine. AChE is wel in staat om fysostigmine af te breken, maar aan een veel lagere snelheid in vgl. met acetylcholine, waardoor AChE ergens tussen reversibel en niet-reversibel geïnhibeerd wordt (Tavitian et al., 1993a). Een andere mogelijkheid om AchE te visualiseren is met behulp van de niet-competitieve inhibitor [11C]-methyltacrine (Tavitian et al., 1993b).

1.5. POSITRON EMISSIE TOMOGRAFIE Positron

emissie

tomografie

(PET)

is

een

niet-invasieve

medische

beeldvormingstechniek waarbij een radiofarmacon, gemerkt met een positronstraler, wordt toegediend aan de patiënt. Positronstralers vervallen met vrijstelling van een positron of β+ deeltje dat annihileert met een elektron (Figuur 1.8a), waarbij twee fotonen in een hoek van 180° worden vrijgesteld. Deze fotonen worden geregistreerd door een ring van detectoren die de patiënt omgeven (Figuur 1.8b). Als twee fotonen tegelijk gedetecteerd worden door twee detectoren die 180° tegenover elkaar liggen, zijn ze afkomstig van het verval van hetzelfde positron, dat zich dus op een rechte lijn tussen de detectiepunten moet hebben bevonden (http://nl.wikipedia.org/wiki/Positronemissietomografie). Het PET-beeld toont het aantal vervalgebeurtenissen of counts die in elk van de ‘voxels’ (d.i. de driedimensionale uitbreiding van pixels) voorkomen (Hendee & Ritenour, 2002).

I n l e i d i n g | 12

FIGUUR 1.8: (A) ANNIHILATIE (B) EEN TYPISCHE PET-OPSTELLING

Bij PET worden isotopen met een kort halfleven gebruikt zoals

11

C (~20 min) en

18

F

(~110), waardoor ook de stralingsbelasting voor de patiënt vermindert. Positronstralers worden geproduceerd in een cyclotron. Aangezien deze isotopen een heel kort halfleven hebben, impliceert dit dat de cyclotron en de scanner dichtbij mekaar moeten gelokaliseerd zijn. Zowel het bouwen van deze toestellen, als het bedienend personeel ervan, dragen bij tot de hoge kostprijs van PET (Hendee & Ritenour, 2002).

O b j e c t i e v e n | 13

2. OBJECTIEVEN In de literatuur wordt meer en meer melding gemaakt van een verband tussen FAAH en verschillende neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen. Door visualisatie, met behulp van PET, van de functionaliteit van FAAH via het principe van ‘metabolic trapping’, kunnen de precieze mechanismen die FAAH linken met deze aandoeningen opgehelderd worden en kan de diagnose van die psychiatrische ziekten veel objectiever gesteld worden dan nu soms het geval is. In voorafgaand werk werden er een aantal structuuranalogen van het endocannabinoid AEA gesynthetiseerd die mogelijks bruikbaar kunnen zijn als metabolic trapping liganden (zie bijlage 1) (wyffels et al., ingezonden voor review). Om bruikbaar te zijn als metabolic trapping ligand is het is noodzakelijk dat deze verbindingen een substraat zijn voor het te onderzoeken enzym, wat momenteel nog niet geweten is. Om aan te tonen dat de verbindingen wel degelijk substraat zijn voor FAAH, wordt gebruik gemaakt van een HPLC-methode om de vorming van arachidonzuur (AA) of linoleïnezuur (LZ) op te sporen ten gevolge van enzymatische omzetting van de componenten na incubatie met FAAH. Eveneens in voorafgaande experimenten werden de metabolic trapping liganden gedurende drie uur geïncubeerd met FAAH (wyffels et al., ingezonden voor review). De stabiliteit van deze verbindingen in het incubatiemedium bij 37°C moest echter nog nagegaan worden. Het doel is dus, om via HPLC-analyse, bewijs te leveren dat de metabolic trapping liganden weinig tot geen afbraak vertonen tijdens die experimenten. De Michaëlis-Menten kinetiek voor de FAAH-gekatalyseerde hydrolyse van de twee meest belovende metabolic trapping liganden, 4-methoxyphenethylarachidonylamide en 4-methoxyphenethyllinoleoylamide, zal eveneens bepaald worden met behulp van HPLC. Daartoe wordt eerst een kalibratiecurve van AA of LZ opgesteld om de FAAH-activiteit te kunnen kwantificeren. Hierna wordt een progressiecurve van de metabolisatie van de substraten door FAAH opgesteld, om dan uiteindelijk de Michaëlis-Menten curve op te stellen. Een andere methode om enzymen te visualiseren, naast het principe van metabolic trapping, is het gebruik van gelabelde inhibitoren voor het te onderzoeken enzym. In deze masterproef zal de radiosynthese beschreven worden van [11C]-carba5 (een inhibitor van FAAH) uitgaande van een desmethylprecursor door reactie met [11C]CH3I onder basische

O b j e c t i e v e n | 14 omstandigheden. Door middel van de ‘shake flask’-methode zal de distributiecoëfficiënt bepaald worden. Een laatste experiment bestaat uit de validatie van de metaboliet bepalingsmethode en het bepalen van het extractierendement van [11C]-carba5 uit plasma en hersenen. De metabolietbepaling zelf zal niet besproken worden in deze masterproef.

M a t e r i a l e n e n M e t h o d e n | 15

3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) HPLC is één van de meest krachtige methoden in de analytische chemie waarmee stoffen van elkaar kunnen worden gescheiden en gedetecteerd. De scheiding van componenten in een staal vindt plaats in een HPLC-kolom. Dit is een kolom gevuld met kleine, adsorberende deeltjes, die de stationaire fase wordt genoemd. Afhankelijk van de polariteit van de te scheiden componenten kunnen stationaire fases worden gekozen met verschillende polaire eigenschappen. Door deze kolom wordt, onder hoge druk, vloeistof gepompt, die de mobiele fase wordt genoemd. De scheiding van componenten in het staal vindt plaats door verschil in verdeling van deze componenten tussen de mobiele en stationaire fase. Afhankelijk van de affiniteit voor de stationaire fase (afhankelijk van de polariteit) en de oplosbaarheid in de mobiele fase zullen componenten selectief vertraagd worden en elueren met een verschillende snelheid. De vloeistofstroom uit de HPLC-kolom wordt door een detector geleidt. Er zijn verschillende typen detectoren beschikbaar zoals UV/VIS, fluorescentie en geleidbaarheid. Welk type detector wordt gebruikt hangt af van de detecteerbare eigenschappen van de componenten.

.

http://www.icn.nl/nl/kenniscentrum/onderzoeksmethoden/hplc Tijdens deze onderzoeksstage werd een Reversed Phase (RP-) HPLC methode gebruikt. Hierbij is de stationaire fase apolair en de mobiele fase relatief polair. RP-HPLC is geschikt voor het scheiden van componenten van apolaire aard, aangezien deze dan langer weerhouden worden op de kolom. De HPLC-opstelling die gebruikt werd bestaat uit een Gilson 307 pomp, een Waters 2487 Dual λ Absorbance detector (λ = 204 nm) en een injector met 100µL loop. Een Shimadzu C-R8A Chromatopac integrator werd aangesloten op het systeem om de data te verwerken. Scheidingen gebeurden over een Alltech GraceSmart C18 kolom (dimensies: 250 x 4,6 mm, deeltjesgrootte: 5 µm). Als mobiele fase werd een mengsel van MeCN:H2O:HCOOH (90:10:0,1 v/v) gebruikt bij een flow van 1 mL/min. Kwantificatie gebeurde op basis van de geïntegreerde piekoppervlakten.

M a t e r i a l e n e n M e t h o d e n | 16

3.2. DETECTIE VAN RADIOACTIVITEIT Detectie van radioactiviteit is gebaseerd op interactie met materie. Afhankelijk van het type interactie wordt er onderscheid gemaakt tussen verschillende types detectoren. Detectoren voor detectie van ioniserende straling kunnen ingedeeld worden in scintillatie- en ionisatiedetectoren (Figuur 3.1). Bij scintillatiedetecoren ontstaan er lichtflitsen doordat invallende straling de atomen in een kristal exciteert, waarna deze terug deëxciteren. Een photomultiplier tube converteert, via het fotoëlektrisch effect, de lichtflitsen tot fotonelektronen die vervolgens versterkt worden tot een elektrische stroom of puls. Bij ionisatiedetectoren worden gasmoleculen geïoniseerd bij doorgang van ioniserende straling. De vrije elektronen die hierbij gevormd worden migreren onder invloed van een aangelegd elektrisch veld naar de anode waardoor een elektrische stroom geproduceerd wordt.

FIGUUR 3.1: BASISPRINCIPE VAN (A) SCINTILLATIE- EN (B) IONISATIEDETECTOREN (Zanzonico & Heller, 2007)

3.2.1. De dosiscalibrator Een dosiscalibrator is een type gasionisatiedetector, waarbij het potentiaalverschil tussen de anode en de kathode gelegen is rond de 150 – 200 V. Bij dit potentiaalverschil worden alle elektronen afkomstig van gasionisatie door gammastraling, gecollecteerd aan de anode om een stroompuls te geven. De intensiteit van deze stroompuls is evenredig met de

M a t e r i a l e n e n M e t h o d e n | 17 hoeveelheid energie die de ioniserende straling in de detector heeft afgestaan. De stroompulsen zijn te klein zijn om individueel te meten, zodat in de praktijk een hoeveelheid stroom (debiet) geregistreerd wordt. De gemeten elektrische stroom is afhankelijk van zowel de energie van de straling als van de totale activiteit. De dosiscalibrator wordt vaak gebruikt om de activiteit van radiofarmaca te bepalen. Het toestel is opgebouwd uit een metalen cilinder waarin centraal een holte zit om het te meten monster in te brengen. De cilinder is opgevuld met een edelgas. De buitenste metalen mantel en een stroomdraad in de holle cilinder fungeren als elektroden (Figuur 3.2). In deze masterproef werd gebruik gemaakt van een Capintec CRC 15-R dosiscalibrator (Capintec, Inc., Ramsey, USA).

FIGUUR 3.2: DOSISCALIBRATOR (afbeelding links: http://www.capintec.com/products/crc-25r.jpg)

3.2.2. De vaste stof scintillatiedetector Dit type detector (Figuur 3.3) bestaat in essentie uit twee onderdelen: een scintillator kristal (meestal een thallium gedopeerd natriumiodide [NaI(Tl)] kristal) en een photomultiplier tube.

M a t e r i a l e n e n M e t h o d e n | 18

FIGUUR 3.3: BASISPRINCIPE VAN EEN SCINTILLATIEKRISTAL EN EEN PMT (Zanzonico & Heller, 2007)

In het NaI-kristal bevinden de elektronen zich in energiebanden, die zijn samengesteld uit een groot aantal energieniveau’s die energetisch gezien zeer dicht bij elkaar liggen. De volledig met elektronen gevulde valentieband is gescheiden van een lege conductieband, en een energetisch verboden zone ligt tussen hen. Wanneer nu radioactieve straling doorheen het kristal migreert, zal ze elektronen exciteren naar de conductieband. Daaropvolgend keren de elektronen terug naar de valentieband waarbij energie wordt vrijgegeven onder de vorm van een lichtfoton of onder de vorm van thermische energie. Bij een zuiver NaI-kristal kan de vrijgestelde energie opnieuw geabsorbeerd worden waarbij elektronen terug naar de conductieband geëxciteerd worden. Hierdoor zijn zuivere NaI-kristallen geen efficiënte scintillatoren, en moeten er dus kleine hoeveelheden thallium (activator genoemd) toegevoegd worden. Dit thallium zorgt voor een wijziging in de energieniveau’s van het kristal. Zo worden er activator valentiebanden geïntroduceerd waarvan het energieniveau hoger is dan de valentieband van het kristal. Daarnaast zijn er activator conductiebanden waarvan het energieniveau lager is dan de conductieband van het kristal. In aanwezigheid van een activator verloopt het scintillatieproces veel efficiënter (Figuur 3.4). Radioactieve straling exciteert een elektron naar de conductieband, waardoor een gat in de valentieband van NaI ontstaat. Dit gat migreert naar een plaats in het kristalrooster waar zich een activator atoom bevindt en zal daar meteen opgevuld worden door een elektron uit de valentieband van thallium, met vrijstelling van thermische energie. Vervolgens zal het elektron van de conductieband van NaI terugkeren naar de conductieband

M a t e r i a l e n e n M e t h o d e n | 19 van thallium, met vrijstelling van thermische energie. Vervolgens wordt een lichtfoton vrijgesteld als het elektron van de geëxciteerde toestand in thallium, terugkeert naar de grondtoestand. De energie-inhoud van het lichtfoton is niet voldoende om een elektron van de valentieband van het kristal te exciteren.

FIGUUR 3.4: SCINTILLATIEPROCES IN EEN NaI(Tl)-KRISATAL. Ee EN Eg ZIJN RESPECTIEVELIJK DE GEËXCITEERDE TOESTAND EN GRONDTOESTAND VAN DE ACTIVATOR.

STELT

VRIJSTELLING VAN THERMISCHE ENERGIE VOOR

Een photomultiplier tube (PMT) werkt als volgt: wanneer een foton via het toegangsvenster invalt op de neutraal geladen fotokathode, wordt een foto-elektron losgeslagen. Dit elektron wordt aangetrokken en versneld richting het eerste van een reeks positief geladen metalen plaatjes, dynoden genoemd. Bij impact van een elektron met het oppervlak van de dynode worden verschillende elektronen losgeslagen. De positieve lading neemt bij elke volgende dynode toe, en bijgevolg zal de gegenereerde stroom (onder de vorm van de elektronen) gradueel toenemen, om op het einde van de PMT aanleiding te geven tot een meetbare stroompuls. De hoogte van de gegenereerde stroompulsen is proportioneel met de intensiteit van het geproduceerde licht in het kristal en dus evenredig met de energie van de invallende straling. Een discriminator maakt onderscheid tussen de intensiteit van de stroompulsen en enkel deze pulsen met een bepaalde pulshoogte (d.w.z. energie) worden geteld. Vaste stof scintillatietelling is een zeer gevoelige techniek, die men dan ook terugvindt in de detectoren van een PET-camera. In deze masterproef werd gebruik gemaakt van een Packard Cobra Auto-gamma (Packard Instruments, Canberra)

M a t e r i a l e n e n M e t h o d e n | 20

3.3. PRODUCTIE VAN HET 11C-ISOTOOP In deze masterproef werd gebruik gemaakt van het

11

C-isotoop.

11

C bezit een

neutronendeficiënte nucleus (d.w.z. een exces aan protonen), die snel vervalt door positron afgifte. Aanmaken van een dergelijk isotoop gebeurt dus door aan een stabiele kern protonen toe te voegen. Aangezien het doelnuclide en het aanvallende proton beiden positief geladen zijn, zullen er op korte afstand zeer grote repulsiekrachten (Coulombkrachten) ontstaan. Om deze te overwinnen, moet het proton voldoende kinetische energie bezitten. Dit gebeurt met behulp van een cyclotron.

3.3.1. Het cyclotron Een cyclotron is een deeltjesversneller om protonen voldoende kinetische energie mee te geven zodat zij de Coulombbarrière kunnen overwinnen en kernreacties kunnen aangaan met het te bestralen materiaal. Het cyclotron bestaat uit drie belangrijke onderdelen: een elektromagnetisch veld, een paar D-vormige elektroden (D`s genaamd) gelegen tussen de polen van de magneet en een ionenbron om negatieve ionen te produceren (Figuur 3.5). De volledige constructie van het cyclotron wordt onder hoog vacuüm gehouden. Nadat waterstofgas door de ionenbron geïoniseerd werd, worden de ionen (H+ en H-) geïnjecteerd in het centrum van de spleet tussen de D`s. Wanneer nu een oscillerend potentiaalverschil tussen de D`s wordt aangelegd, zullen de negatieve ionen aangetrokken en versneld worden richting de positief geladen D. Door de aanwezigheid van een magnetisch veld loodrecht op het vlak van de D`s waarin de deeltjes bewegen, zullen negatieve ionen een cirkelvormig spoor volgen, waarvan de straal afhankelijk is van de snelheid van de deeltjes. Van zodra het deeltje een U-bocht gemaakt heeft in de D en opnieuw in de spleet terecht komt, wordt het potentiaalverschil omgekeerd, en wordt het deeltje nogmaals versneld. Telkens wanneer de spleet tussen de D`s gepasseerd wordt winnen de ionen aan energie terwijl ze een excentrische spiraalvormige beweging beschrijven. Eens de deeltjes voldoende versneld zijn, worden ze uit de cyclotron geëxtraheerd met behulp van een ‘stripper’. Dit is een uiterst dunne folie die de elektronen van de H- ionen afstript waardoor uiteindelijk hoog energetische protonen (orde van MeV) ontstaan waarmee de target bestraald wordt.

M a t e r i a l e n e n M e t h o d e n | 21

FIGUUR 3.5: SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN EEN CYCLOTRON

Voor de productie van de radioisotopen werd gebruik gemaakt van een IBA cyclotron type Cyclone® 18/9.

3.3.2. De target De target voor de productie van 11C is gevuld met niet-radioactief N2-gas onder druk. Door het toevoegen van kleine hoeveelheden (< 10%) H2 zal de chemische vorm waaronder 11

C geproduceerd wordt [11C]CH4 zijn. Het target wordt beschoten met de hoogenergetische

protonenstraal afkomstig van het cyclotron. Introductie van een proton in een

14

N-kern

veroorzaakt een verhoging van het massagetal en het atoomgetal met één eenheid waardoor 15

O ontstaat, dat zeer onstabiel is en meteen omgezet wordt tot

11

C door verlies van een α-

deeltje.

3.3.3. Synthese van een secundaire precursor: [11C]CH3I Het in het cyclotron geproduceerde [11C]CH4 wordt vervolgens in een hotcell omgezet tot een meer bruikbare secundaire precursor [11C]CH3I. Voor de productie van [11C]CH3I werd in deze masterproef gebruik gemaakt van de ‘gasfase methode’. Hierbij wordt radioactief methaan doorheen een joodoven gestuurd waarbij [11C]CH3I gevormd wordt. Het gevormde [11C]CH3I wordt dan getrapped op een porapak en het niet gereageerde [11C]CH4 wordt hergecirculeerd door de oven om het rendement van de reactie te verhogen.

R e s u l t a t e n | 22

4. RESULTATEN 4.1. AANTONEN VAN EEN SUBSTRAAT De vooraf gesynthetiseerde AEA-analogen (wyffels et al., ingezonden voor review) moeten, om bruikbaar te zijn als metabolic trapping ligand, substraat zijn voor FAAH, wat momenteel

nog

niet

geweten

4-methoxyphenethylarachidonylamide (4OCH3LZ),

is.

In

deze

(4OCH3AA),

testen

werd

(2OCH3AA),

(3OCH3LZ),

of

4-methoxyphenethyllinoleoylamide

3-methoxyphenethylarachidonylamide

3-methoxyphenethyllinoleoylamide

onderzocht

(3OCH3AA),

2-methoxyphenethylarachidonylamide

2-methoxyphenethyllinoleoylamide

(2OCH3LZ),

N-(2-iodoethyl)arachidonylamide (AA+I) en N-(2-iodoethyl)linoleoylamide (LZ+I) substraat zijn voor FAAH. Om dit aan te tonen werd gebruik gemaakt van een HPLC-methode om de vorming van AA of LZ op te sporen ten gevolge van enzymatische omzetting van de componenten na incubatie met FAAH. Ter validatie van deze methode werd een experiment met AEA, een gekend substraat van FAAH, uitgevoerd. Om de spontane vorming van AA of LZ gedurende incubatie uit te sluiten, werden er ook blanco stalen geanalyseerd. Er werden eveneens incubaties uitgevoerd in aanwezigheid van MAFP, een potente irreversibele inhibitor van FAAH. Pre-incubatie van FAAH met MAFP blokkeert de enzymatische activiteit, waardoor er geen AA of LZ meer kan gevormd worden in het geval de component een substraat voor FAAH is.

4.1.1. Experimentele uitvoering Voor de metabolisatie assay werd 11,4 nmol component geïncubeerd met 80 µg rFAAH in een totaal volume van 500 µL buffer (50 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA; pH 7,4) gedurende 15 min bij 37°C in een schudincubator. Blanco’s bevatten buffer in plaats van rFAAH. De reactie werd beëindigd door toevoegen van 500 µL koud MeCN. Het buisje werd gevortexed en gecentrifugeerd (6000 rpm, 2 min) om de proteïnen neer te slaan. 100 µL van deze oplossing werd geanalyseerd via HPLC, zoals beschreven onder sectie 3.1. Een identieke incubatie met AEA werd uitgevoerd om de methode te valideren. Voor de FAAH inhibitie assay werd 80 µg rFAAH 15 min geïncubeerd met 40 nM MAFP in een totaal volume van 500 µL buffer (50 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA; pH 7,4) bij 37°C in een schudincubator. Daarna werd 11,4 nmol component toegevoegd en

R e s u l t a t e n | 23 verder geïncubeerd gedurende 30 min bij 37°C. 100 µL van deze oplossing werd geanalyseerd via HPLC, zoals beschreven onder sectie 3.1.

4.1.2. Resultaten en discussie 30 min incubatie van AEA met rFAAH resulteert in de vorming van AA, wat kon verwacht worden gezien AEA een gekend substraat is voor FAAH. Uit de HPLC-analyse kan worden afgeleid dat ook alle geteste componenten substraat zijn voor FAAH. Na 30 min incubatie kan voor 4OCH3AA, 4OCH3LZ, 3OCH3AA, 3OCH3LZ, 2OCH3AA, 2OCH3LZ, AA+I en LZ+I de vorming van AA of LZ gezien worden (zie bijlage 2). Uit de blanco experimenten blijkt dat de componenten stabiel blijven gedurende 30 min incubatie. Het feit dat MAFP in staat is om de vorming van metabolieten te blokkeren, bewijst dat de afbraak FAAH-gemedieerd is. In een controle-experiment waarbij AA+I, opgelost in MeCN, zonder incubatie geïnjecteerd werd op HPLC kan afgeleid worden dat AA+I reeds een onzuiverheid bevatte (zie bijlage 2). Uit de blanco experimenten blijkt dat AA+I en LZ+I gevoelig zijn aan afbraak door het medium. Voor AA+I is er vorming van AA en een extra metaboliet met retentietijd van 5,3 min. Na incubatie in buffer zonder aanwezigheid van rFAAH kan voor LZ+I de vorming van LZ en een extra metaboliet met retentietijd van 5,0 min worden waargenomen. Na incubatie in aanwezigheid van enzym kan wel een duidelijke daling in hoeveelheid onveranderde component waargenomen worden, wat aantoont dat er ook een FAAHgemedieerde afbraak van AA/LZ+I is. Uit deze experimenten kan dus worden afgeleid dat 4OCH3AA, 4OCH3LZ, 3OCH3AA, 3OCH3LZ, 2OCH3AA, 2OCH3LZ, AA+I en LZ+I substraten zijn voor FAAH.

4.2. STABILITEITSTESTEN In reeds uitgevoerde experimenten werden de AEA-analogen 4OCH3AA, 4OCH3LZ, 3OCH3AA, 3OCH3LZ, 2OCH3AA, 2OCH3LZ, 4-iodobenzylarachidonylamide (4-IBA) en 4-iodophenethylarachidonylamide (4-IPA) gedurende 3 uur geïncubeerd om interactie met FAAH na te gaan (wyffels et al., ingezonden voor review). Het doel van deze testen was aantonen dat de testcomponenten stabiel blijven tijdens deze 3 uur durende incubatie in buffer bij 37°C. Met andere woorden wilden we aantonen dat de gemiddelde hoeveelheid testcomponent na 3 uur incubatie bij 37°C nog steeds dezelfde is als bij het begin van de

R e s u l t a t e n | 24 incubatie. Om dit te bewijzen werd er gebruik gemaakt van foutenbalkjes die 95% betrouwbaarheidsintervallen voorstellen en van de gepaarde t-test.

4.2.1. Experimenteel gedeelte Vier buisjes met elk 45,6 nmol testcomponent in een totaal volume van 500 µL buffer (50 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA; pH 7,4) werden gedurende 0, 1, 2 en 3 uur geïncubeerd bij 37°C in een schudincubator. Na incubatie werd 4,4 mL koud MeCN aan de suspensie toegevoegd om de proteïnen neer te slaan. Uiteindelijk werd er dus een oplossing met 10% buffer en 90% MeCN verkregen. 100 µL van deze oplossing werd geanalyseerd via HPLC, zoals beschreven onder sectie 3.1. De stabiliteitstesten werden in het drievoud uitgevoerd. De hoeveelheid testcomponent werd telkens uitgedrukt als een percentage van de hoeveelheid startmateriaal op tijdstip nul. Met behulp van SPSS Statistics 17.0 werden de 95% betrouwbaarheidsintervallen berekend en werd een gepaarde t-test uitgevoerd.

4.2.2. Resultaten en discussie

FIGUUR 4.1: GEMIDDELDE HOEVEELHEID TESTCOMPONENT. FOUTENBALKJES STELLEN 95% BETROUWBAARHEIDSINTERVALLEN VAN HET GEMIDDELDE VOOR

In figuur 4.1 kan gezien worden dat de hoeveelheid startmateriaal na 1u, 2u en 3u valt binnen de respectievelijke betrouwbaarheidsintervallen (zie stippellijn op Figuur 4.1). Hieruit kan worden afgeleid dat de gemiddelde hoeveelheid testcomponent na 1u, 2u of 3u incubatie in buffer niet verschilt van de hoeveelheid testcomponent op tijdstip nul. Dit wijst erop dat de testcomponenten ten minste drie uur stabiel blijven onder de gebruikte testcondities (37°C en pH 7,4).

R e s u l t a t e n | 25 TABEL 4.1: GEPAARDE

T-TEST

OM

NA TE GAAN

OF GEMIDDELDE

HOEVEELHEID

TESTCOMPONENT VERSCHILT NA 0 UUR EN NA 3 UUR INCUBATIE

Uit de gepaarde t-test blijkt dat we de nulhypothese (gemiddelde hoeveelheid testcomponent na 0 uur = gemiddelde hoeveelheid testcomponent na 3 uur) niet kunnen verwerpen aangezien p > 0,05 (Tabel 4.1). Er is dus geen verschil in gemiddelde hoeveelheid testcomponent na 0 uur en na 3 uur. Dit bewijst dat de testcomponenten ten minste drie uur stabiel blijven onder de gebruikte testcondities (37°C en pH 7,4).

4.3. MICHAËLIS-MENTEN KINETIEK Sommige enzymen, waaronder ook het FAAH-enzym volgen een zeer typische kinetiek die we de Michaëlis-Menten kinetiek noemen. Dit kinetisch model kunnen we alleen gebruiken wanneer het enzym een eenvoudig werkingsmechanisme heeft (Figuur 4.2). Hierbij komt substraat (S) in contact met het enzym (E) zodat een enzym-substraat complex (ES) gevormd wordt. Dit complex kan dan terug dissociëren zonder dat er reactie heeft plaatsgevonden, of kan verder reageren waarbij substraat wordt omgezet in product (P) en het enzym terug vrij komt.

FIGUUR 4.2: EENVOUDIGSTE WERKINGSMECHANISME VAN EEN ENZYM

k1, k-1 en k2 zijn de snelheidsconstanten voor respectievelijk de associatie tussen enzym en substraat, de dissociatie van onveranderd substraat van het enzym-substraat complex en de vrijstelling van product uit het enzym-substraat complex. De omgekeerde reactie, waarbij het ES-complex gevormd wordt uit E en P, wordt verwaarloosd aangezien we

R e s u l t a t e n | 26 de initiële reactiesnelheid beschouwen, d.w.z. waarbij er nog onvoldoende product gevormd is om de omgekeerde reactie te laten doorgaan. De totale reactiesnelheid (v) wordt steeds bepaald door de traagste stap in het reactiemechanisme. In dit geval is de omzetting van ES-complex tot E + P de limiterende stap. De snelheid van deze stap is afhankelijk van de snelheidsconstante k2 en de concentratie van het ES-complex. We kunnen dus schrijven dat 𝑣𝑣 = 𝑘𝑘2 [𝐸𝐸𝐸𝐸]

(Vergelijking 4.1)

In het specifieke geval van steady-state waarbij ES-complex even snel gevormd als afgebroken wordt (dus [ES] blijft constant) kunnen we schrijven: 𝑘𝑘1 [𝐸𝐸][𝑆𝑆]

𝑘𝑘−1 [𝐸𝐸𝐸𝐸]

=

𝑘𝑘2 [𝐸𝐸𝐸𝐸]

+

vorming van ES-

afbraak van ES-complex

afbraak van ES-complex

complex

tot enzym en substraat

tot enzym en product

Deze vergelijking kan als volgt herschikt worden: 𝑘𝑘1 [𝐸𝐸][𝑆𝑆] = (𝑘𝑘−1 + 𝑘𝑘2 )[𝐸𝐸𝐸𝐸]

<=>

𝑘𝑘 1 [𝐸𝐸][𝑆𝑆]

(𝑘𝑘 −1 +𝑘𝑘 2 )

= [𝐸𝐸𝐸𝐸]

De verhouding van de snelheidsconstanten wordt gecombineerd tot de Michaëlis-

Menten constante (KM) (𝑘𝑘 −1 +𝑘𝑘 2 ) 𝑘𝑘 1

= 𝐾𝐾𝑀𝑀

We kunnen nu voorgaande vergelijking herschrijven als: [𝐸𝐸𝐸𝐸][𝑆𝑆] 𝐾𝐾𝑀𝑀

= [𝐸𝐸𝐸𝐸]

(Vergelijking 4.2)

De totale hoeveelheid enzym blijft constant, en is gelijk aan de som van de hoeveelheid ongebonden enzym en de hoeveelheid gebonden enzym: [𝐸𝐸0 ] = [𝐸𝐸] + [𝐸𝐸𝐸𝐸]

<=>

[𝐸𝐸] = [𝐸𝐸0 ] − [𝐸𝐸𝐸𝐸]

([𝐸𝐸0 ]−[𝐸𝐸𝐸𝐸])[𝑆𝑆]

<=>

[𝐸𝐸0 ][𝑆𝑆] − [𝐸𝐸𝐸𝐸][𝑆𝑆] = 𝐾𝐾𝑀𝑀 [𝐸𝐸𝐸𝐸]

Wanneer we nu deze definitie van [E] substitueren in Verglijking 4.2 krijgen we:

𝐾𝐾𝑀𝑀

= [𝐸𝐸𝐸𝐸]

R e s u l t a t e n | 27 [𝐸𝐸0 ][𝑆𝑆] = (𝐾𝐾𝑀𝑀 + [𝑆𝑆])[𝐸𝐸𝐸𝐸]

<=>

<=>

[𝐸𝐸0 ][𝑆𝑆]

[𝑆𝑆]+𝐾𝐾𝑀𝑀

= [𝐸𝐸𝐸𝐸]

Substitutie van deze linkerhelft in Vergelijking 4.1 resulteert in: [𝐸𝐸 ][𝑆𝑆]

0 𝑣𝑣 = 𝑘𝑘2 [𝑆𝑆]+𝐾𝐾

𝑀𝑀

De maximale snelheid van de reactie (Vmax) wordt bereikt wanneer alle enzymmoleculen substraat gebonden hebben. Wanneer we nu veronderstellen dat [S] >> [E], kunnen we zeggen dat alle enzym onder de vorm van enzym-substraat complex voorkomt. Met andere woorden is [E0] = [ES]. Dit invullen in Vergelijking 4.1 geeft ons: 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 = 𝑘𝑘2 [𝐸𝐸0 ]

𝑘𝑘2 [𝐸𝐸0 ] staat ook in voorgaande vergelijking, dus kunnen dit vervangen door Vmax, wat

resulteert in de Michaëlis-Menten vergelijking: 𝑣𝑣 =

𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆] 𝐾𝐾𝑀𝑀 +[𝑆𝑆]

De Michaëlis-Menten curve wordt weergegeven in figuur 4.3.

FIGUUR 4.3: MICHAELIS-MENTEN CURVE

KM en Vmax noemen we de kinetische parameters, dewelke uniek zijn voor een reactie gekatalyseerd door een bepaald enzym en met een bepaald substraat. Vmax is de maximale snelheid van de reactie, KM is de Michaëlis-Menten constante en deze is gelijk aan de substraatconcentratie waarbij de reactie aan de helft van de maximale snelheid doorgaat. Fysisch gezien is KM een maat voor de affiniteit van het enzym voor het substraat, en dus

R e s u l t a t e n | 28 voor de stabiliteit van het ES-complex.

.

http://www.le.ac.uk/by/teach/biochemweb/tutorials/michment2print.html 4OCH3AA en 4OCH3LZ zijn twee componenten waarvan in vroegere in vitro experimenten reeds werd aangetoond dat het substraten zijn voor FAAH (wyffels et al., ingezonden voor review). In deze studie werd via Michaelis-Menten kinetiek de affiniteit van FAAH voor deze substraten bepaald. Hiervoor werden de Michaëlis-Menten curve en de kinetische parameters KM en Vmax bepaald voor de FAAH-gekatalyseerde hydrolyse van 4OCH3AA en 4OCH3LZ.

4.3.1. Experimenteel gedeelte Het experimenteel gedeelte kunnen we opsplitsen in drie delen. In het eerste deel werd er een ijklijn opgesteld om de hoeveelheid metaboliet, nl. AA of LZ voor 4OCH3AA en 4OCH3LZ respectievelijk, die gevormd werd na incubatie met FAAH te kunnen bepalen. In het tweede deel werd de progressiecurve van de metabolisatie van 4OCH3AA en 4OCH3LZ door FAAH opgesteld. Figuur 4.4 toont een typische progressiecurve voor een enzymatische reactie.

FIGUUR 4.4: PROGRESSIECURVE VOOR EEN ENZYMATISCHE REACTIE

Enzymen produceren product aan een lineaire startsnelheid bij het begin van de reactie. Daarna vertraagt de snelheid naarmate substraat opgebruikt wordt (of producten accumuleren). De richtingscoëfficiënt in het eerste deel van de progressiecurve = v0. Michaelis-Menten kinetiek beschrijft hoe deze richtingscoëfficiënt varieert met veranderende substraatconcentraties. In het derde deel werd de Michaëlis-Menten curve voor 4OCH3AA en 4OCH3LZ opgesteld, hiervoor kozen we een incubatietijd binnen het lineair gebied van de progressiecurve.

R e s u l t a t e n | 29

4.3.1.1. Opstellen van de ijklijn Er werd een verdunningsreeks van AA of LZ in MeCN gemaakt (0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 en 5 µM). 100 µL van elke verdunning werd geanalyseerd via HPLC, zoals beschreven onder sectie 3.1. De ijklijn werd in het drievoud bepaald. Voor het berekenen van een ongekende concentratie AA of LZ uit de ijklijn werd de piekoppervlakte gebruikt. De juistheid van de ijklijn werd gecontroleerd met een gekende concentratie AA of LZ (3 µM).

4.3.1.2. Opstellen van de progressiecurve 11,4 nmol component werd geïncubeerd met 80 µg rFAAH voor 4OCH3AA of 40 µg rFAAH voor 4OCH3LZ in een totaal volume van 500 µL buffer (50 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA; pH 7,4) bij 37°C in een schudincubator. De incubatietijd varieerde van 0 tot 20 min, met tussenstappen van 5 min. Na incubatie werd 4,4 mL koud MeCN aan de suspensie toegevoegd om de proteïnen neer te slaan. Uiteindelijk werd er dus een oplossing met 10% buffer en 90% MeCN verkregen. 100 µL van deze oplossing werd geanalyseerd via HPLC, zoals beschreven onder sectie 3.1. De hoeveelheid metaboliet gevormd werd berekend aan de hand van de ijklijn opgesteld voor AA of LZ en uitgezet t.o.v. de incubatietijd.

4.3.1.3. Opstellen van de Michaëlis-Menten curve Verschillende hoeveelheden 4OCH3AA (0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 en 100 nmol) werden 10 min geïncubeerd met 80 µg rFAAH in een totaal volume van 500 µL buffer (50 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA; pH 7,4) bij 37°C in een schudincubator. Hetzelfde werd gedaan voor 4OCH3LZ waarbij we 0; 2,5; 5; 10; 25; 50; 100 en 200 nmol lieten incuberen met 40 µg rFAAH. Na incubatie werd 4,4 mL koud MeCN aan de suspensie toegevoegd om de proteïnen neer te slaan. Uiteindelijk werd er dus een oplossing met 10% buffer en 90% MeCN verkregen. 100 µL van deze oplossing werd geanalyseerd via HPLC, zoals beschreven onder sectie 3.1. De experimenten werden in het tweevoud uitgevoerd. De hoeveelheid metaboliet gevormd werd berekend aan de hand van de ijklijn voor AA of LZ. De resultaten werden verder verwerkt met Graphpad Prism software en uitgedrukt als FAAHactiviteit, nl. nmol AA of LZ gevormd per minuut en per mg rFAAH (nmol/min/mg proteïne) in functie van [substraat].

R e s u l t a t e n | 30

4.3.2. Resultaten en discussie 4000

ijklijn arachidonzuur y = 684,49x + 39,966 R² = 0,9997

3500

Piekoppervlakte

3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0

1

2

3

4

5

6

5

6

[AA] (µM)

1600

ijklijn linoleïnezuur

y = 280,07x + 24,155 R² = 0,9994

1400

Piekoppervlakte

1200 1000 800 600 400 200 0 0

1

2

3

4

[LZ] (µM)

FIGUUR 4.5: IJKLIJN VAN AA (BOVEN) EN LZ (ONDER). HET RODE PUNT STELT DE GEKENDE CONCENTRATIE VOOR DIE GEÏNJECTEERD WERD TER CONTROLE VAN DE IJKLIJN. FOUTENBALKJES STELLEN DE STANDAARDDEVIATIE VOOR

R e s u l t a t e n | 31 Voor AA werd een ijklijn bekomen met als vergelijking y = 684,49x + 39,966 met R2 = 0,9997. De vergelijking voor de ijklijn van LZ is y = 280,07x + 24,155 met R2 = 0,9994. Uit de progressiecurven voor 4OCH3AA en 4OCH3LZ kon worden afgeleid dat we best 10 min incuberen voor het opstellen van de Michaëlis-Menten curve. Dit is namelijk een tijdspunt binnen het eerste lineaire gedeelte van de progressiecurve, waar de startsnelheid ongeveer gelijk blijft. Met behulp van de ijklijn werd de hoeveelheid gevormd AA of LZ berekend, door de piekoppervlakten te relateren aan de corresponderende concentratie (in µM) vetzuur. Uit de resultaten kan afgeleid worden dat voor beide substraten de FAAHgemedieerde hydrolyse reactie via Michaëlis-Menten kinetiek beschreven kan worden. Figuur 4.6 toont de Michaëlis-Menten curve voor 4OCH3AA (links) en 4OCH3LZ (rechts).

FIGUUR 4.6: MICHAËLIS-MENTEN CURVE VOOR 4OCH3AA (LINKS) EN 4OCH3LZ (RECHTS)

Met behulp van Graphpad software werden de kinetische parameters Vmax en KM berekend voor de FAAH-gekatalyseerde hydrolyse van 4OCH3AA en 4OCH3LZ (Tabel 4.2). De KM-waarden voor 4OCH3AA en 4OCH3LZ zijn resp. 18,21 µM en 10,38 µM, terwijl de Vmax-waarden resp. 11,69 nmol/min/mg proteïne en 19,05 nmol/min/mg proteïne zijn. TABEL 4.2: KINETISCHE PARAMETERS

Component

KM (µM)

Vmax (nmol/min/mg proteïne)

4OCH3AA

18,21

11,69

4OCH3LZ

10,38

19,05

Aangezien de Michaëlis-Menten constante van 4OCH3AA groter is dan deze van 4OCH3LZ, kunnen we afleiden dat 4OCH3LZ een hogere affiniteit heeft voor FAAH. Deze resultaten zijn in overeenstemming met vroeger uitgevoerde experimenten waarbij de interactie van beide componenten met FAAH bepaald werd (wyffels et al., ingezonden voor

R e s u l t a t e n | 32 review). Hierbij werd bekomen dat 4OCH3LZ een lichtjes betere interactie met FAAH vertoont dan 4OCH3AA (IC50 waarde van 2,3 µM voor 4OCH3LZ t.o.v. van een IC50 waarde van 2,8 µM voor 4OCH3AA). De bekomen resultaten zijn echter niet consistent met hetgeen men zou verwachten uit SAR-studies. Deze studies zeggen namelijk dat componenten met een arachidonylgroep een beter substraat zijn voor FAAH dan componenten met een linoleoylgroep.

4.4. CARBA5 Bifenyl-3-yl 4-methoxyfenylcarbamaat (carba5) is een gekende inhibitor van FAAH. Het mechanisme dat voorgesteld wordt voor FAAH-inhibitie door carba5 is carbamylatie van het katalytisch nucleofiel (Ser241) van FAAH waardoor de N-fenylgroep covalent gebonden wordt aan het enzym (Figuur 4.7).

11

C labeling van carba5 in dit fenyl-gedeelte maakt

visualisatie van FAAH mogelijk omdat deze 11C gelabelde leaving group covalent gebonden blijft aan het enzym, waardoor visualisatie van het enzym mogelijk wordt met behulp van PET.

FIGUUR 4.7: PET VISUALISATIE VAN CEREBRAAL FAAH MET BEHULP VAN [11C]-CARBA5

4.4.1. Radiosynthese 4.4.1.1. Experimenteel gedeelte [11C]-carba5 werd bereid door radiomethylatie van de overeenkomstige desmethyl precursor (Figuur 4.8). 1 mg (3 µmol) desmethyl precursor werd opgelost in 250 µL DMF, gevolgd door toevoegen van 10 µL NaH (1M; 0,5 g/20 mL DMF). Het vaatje met het reactiemengsel werd gekoeld in een ijsbad en het geproduceerde [11C]CH3I (zie sectie 3.3) werd doorheen het vaatje gebubbeld tot de radioactiviteit een plateau bereikte. Het vaatje werd uit het ijsbad verwijderd en gedurende 10 min bij 30°C opgewarmd. De oplossing werd

R e s u l t a t e n | 33 verdund met 200 µL HPLC mobiele fase en geïnjecteerd in een semi-preparatief HPLCsysteem. De kolom (Grace Discovery Econosphere C18 column, 250 x 10 mm, deeltjesgrootte 10 µm + Grace Discovery Econosphere C18 guard 33 x 7 mm, deeltjesgrootte 10 µm) werd geëlueerd met een mengsel van MeCN:H2O:HCOOH (65:35:0,1 v/v) bij een flow van 4 mL/min. Op het einde van de kolom werd een Knauer Smartline 2500 UV-detector (λ = 254 nm) geplaatst in serie met een eigengemaakte radiodetector met fotodiode. De radioactieve piek overeenkomend met [11C]-carba5 (tR = 9 min) werd opgevangen en verdund met Dulbecco`s fosfaat buffer (DPBS; 0,0095 M (PO4); pH 7,4; 45 mL). Dit mengsel werd over een Sep-Pak C18 cartridge gestuurd, dewelke vooraf geactiveerd werd met ethanol en water. Daarna werd de cartridge gespoeld met 10 mL water en werd [11C]-carba5 geëlueerd met 1 mL ethanol. Een aliquot (20 µL) werd geanalyseerd via HPLC (GraceSmart RP 18 column, 250 x 4,6 mm, deeltjesgrootte 5 µm, geëlueerd met MeCN:H2O:HCOOH (60:40:0,1 v/v) als mobiele fase) voor het bepalen van de radiochemische zuiverheid en van de specifieke radioactiviteit.

FIGUUR 4.8: RADIOSYNTHESE VAN [11C]-CARBA5

4.4.1.2. Resultaten [11C]-carba5 werd bekomen in een radiochemisch rendement van 35% (gebaseerd op de totale hoeveelheid [11C]CH3I getrapped in het reactie vaatje). De radiochemische zuiverheid en de specifieke activiteit (S.A.) werden bepaald door analytische HPLC. De S.A. werd berekend door de piekoppervlakte van de tracer op het UV-chromatogram (na injectie van een gekende hoeveelheid tracer radioactiviteit) te relateren met de piekoppervlakten van een ijklijn, bekomen door injectie van verschillende hoeveelheden koud niet-gelabeled carba5. De S.A. bedroeg 260 GBq/µmol en de radiochemische zuiverheid was > 99%. Coelutie met 1 µg koud carba5 bevestigde de product identiteit.

R e s u l t a t e n | 34

4.4.2. Bepaling van de distributiecoëfficiënt (log D) Log D is de logaritmische verhouding van de evenwichtsconcentraties van alle vormen (geïoniseerd en niet-geïoniseerd) van een molecule in twee niet mengbare vloeistoffen bij een bepaalde temperatuur, in dit geval octanol en DPBS buffer (pH 7,4) bij 25°C. log 𝐷𝐷

𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷

=

𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜

𝑔𝑔𝑔𝑔 ï𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜

𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷

𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 −𝑔𝑔𝑔𝑔 ï𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜

+𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷

waarin: log 𝐷𝐷 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 /𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷 : octanol-DPBS distributiecoëfficiënt 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 : concentratie van de stof in octanol 𝑔𝑔𝑔𝑔 ï𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜

𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷

: concentratie van de geïoniseerde stof in DPBS buffer

𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 −𝑔𝑔𝑔𝑔ï𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜

𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷

: concentratie van de niet-geïoniseerde stof in DPBS buffer

De log D-waarde is een maat voor de verdeling van de stof tussen het bloed (DPBS buffer) en de hersenen (octanol). De log D-waarde zal bepalen of een molecule al dan niet de BHB kan passeren. Over het algemeen wordt een log D-waarde tussen 1 en 4 beschouwd als ideaal voor hersenopname doorheen de BHB (Fagerholm, 2007). Een veel gebruikte methode om de log D te bepalen is de zogehete ‘shake flask’methode (Wilson et al., 2001). Het doel van deze studie was het bepalen van de log D-waarde van [11C]-carba5, met behulp van de ‘shake flask’-methode.

4.4.2.1. Experimenteel gedeelte Er werd 0,925-3,7 MBq [11C]-carba5 overgebracht in een buisje met 3 mL octanol en 3 mL DPBS buffer. Het buisje werd gevortexed (± 1 min) en daarna gecentrifugeerd (4000 rpm, 5 min). Na faseafscheiding werd 0,5 mL van beide fasen overgebracht in twee aparte buisjes. De resterende 2,5 mL DPBS buffer werd uit het buisje gehaald en er werd 2,5 mL verse DPBS buffer toegevoegd. Opnieuw werd er gevortexed, gecentrifugeerd en, na faseafscheiding, 0,5 mL van beide fasen overgebracht in twee aparte buisjes. De resterende hoeveelheid DPBS buffer werd eraf gehaald en er werd 2 mL verse DPBS buffer toegevoegd. Dezelfde procedure werd nog tweemaal herhaald, zodat er uiteindelijk van elke fase 4 keer 0,5 mL in een buisje bekomen werd. De radioactiviteit in de buisjes werd geteld m.b.v. een scintillatie teller. Bij het bereken van log D werden de buisjes van de eerste stap niet meegerekend.

R e s u l t a t e n | 35

4.4.2.2. Resultaten en discussie TABEL 4.3: LOG D-BEPALING UIT DRIE EXPERIMENTEN

Experiment 1 1 2 3 Experiment 2 1 2 3 Experiment 3 1 2 3

Octanol 398071 388386 364208 325988 324347 314007 716113 695483 694916

DPBS 2049,7 2125,2 1536,4 1945,6 2099,7 704,7 9068,1 2677 1649,5

log D 2,29 2,26 2,37 2,22 2,19 2,65 1,90 2,41 2,62

gem. log D ± SD 2,31 ± 0,06

2,35 ± 0,26

2,31 ± 0,37

De gemiddelde log D-waarde uit deze drie experimenten bedraagt 2,32 ± 0,23. Aangezien voor optimale hersenpenetratie de log D-waarde tussen 1 en 4 moet liggen, betekent dit dat carba5 goed zal opgenomen worden in de hersenen.

4.4.3. Validatie van de metaboliet bepalingsmethode Bij een metabolietbepaling gaat men na of de tracer afbraak vertoont in het plasma en of er metabolieten gevormd worden in de hersenen. Hiertoe wordt een in vivo experiment uitgevoerd waarbij tracer geëxtraheerd wordt uit plasma en hersenen, en onderworpen wordt aan een HPLC-analyse. Om na te gaan of [11C]-carba5 geen afbraak vertoond door de gebruikte methode werd de methode gevalideerd. Eveneens werden de extractierendementen uit hersenen en plasma bepaald.

4.4.3.1. Experimenteel gedeelte Ter validatie van de metaboliet bepalingsmethode werd gebruik gemaakt van bloed en hersenen van onbehandelde muizen. Aan 200 µL plasma en aan de hersenen werd er 1 MBq [11C]-carba5 toegevoegd. De behandelingen die de stalen verder ondergingen zijn identiek als bij de metaboliet bepaling. 800 µL MeCN werd aan het plasma toegevoegd en het staal werd gevortexed en gecentrifugeerd (4000 rpm, 3 min). 500 µL MeCN werd aan de hersenen toegevoegd waarna gehomogeniseerd werd met een stamper. Vervolgens werd nogmaals 500 µL MeCN toegevoegd gevolgd door vortexen en centrifugatie (4000 rpm, 3 min). Na de centrifugatie werd de radioactiviteit in deze stalen geteld met een automatische γ-camera en werden pellet en supernatans van elkaar gescheiden. De radioactiviteit werd in beiden geteld met een automatische γ-camera. Het extractierendement werd uitgedrukt als percentage radioactiviteit aanwezig in het supernatans ten opzichte van de totale hoeveelheid

R e s u l t a t e n | 36 radioactiviteit aanwezig in het plasma of de hersenen. De stabiliteit van de tracer bij deze behandelingen werd bepaald door analyse van het supernatans met behulp van HPLC: 500 µL supernatans werd op een semi-prep kolom gebracht (Grace Discovery Econosphere C18 column, 250 x 10 mm, deeltjesgrootte 10 µm + Grace Discovery Econosphere C18 guard 33 x 7 mm, deeltjesgrootte 10 µm), als mobiele fase werd MeCN:H2O:HCOOH (65:35:0,1 v/v) gebruikt bij een flow van 4 mL/min. Het HPLC-eluaat werd opgevangen in fracties van 30 s en hun radioactiviteit werd geteld met een automatische γ-camera.

4.4.3.2. Resultaten en discussie validatie metabolieten [11C]carba 5 250000,0

200000,0

150000,0 radioactiviteit (cpm)

hersenen plasma

100000,0

50000,0

0,0 0

5

time (min)

10

15

FIGUUR 4.9: VALIDATIE METABOLIETEN

Uit de bekomen chromatogrammen (Figuur 4.9) kan worden afgeleid dat enkel intact [11C]-carba5 (retentietijd = 11,5 min) wordt teruggevonden, dus dat [11C]-carba5 niet wordt afgebroken door de gebruikte extractiemethode. Het extractierendement van [11C]-carba5 uit plasma bedraagt 95% en dit uit hersenen 87%. Deze extractierendementen wijzen erop dat de binding van [11C]-carba5 aan plasmaproteïnen reversibel is.

C o n c l u s i e s | 37

5. CONCLUSIES FAAH is het voornaamste enzym dat instaat voor de afbraak van het endocannabinoid AEA. In de literatuur wordt meer en meer melding gemaakt van een verband tussen FAAH en verschillende neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen. De bedoeling van deze masterproef was het in vitro evalueren van een aantal potentiële metabolic trapping liganden (zie bijlage 1) om de functionaliteit van FAAH, m.b.v. PET, te visualiseren in de hersenen. Door deze visualisatie wordt het mogelijk om de precieze mechanismen die FAAH linken aan deze aandoeningen op te helderen. Het tweede doel van deze masterproef was de radiosynthese en evaluatie van [11C]-carba5, een gekende FAAH-inhibitor, waarmee we eveneens FAAH trachten te visualiseren in de hersenen. Het nadeel van visualisatie met inhibitoren is dat er zo geen informatie over de functionaliteit van het enzym verkregen wordt. De anandamide-analogen 4OCH3AA, 4OCH3LZ, 3OCH3AA, 3OCH3LZ, 2OCH3AA, 2OCH3LZ, AA+I en LZ+I moeten, om bruikbaar te zijn als metabolic trapping liganden, substraat zijn voor FAAH, wat momenteel nog niet geweten is. Om aan te tonen dat deze verbindingen wel degelijk substraat zijn voor FAAH, werd gebruik gemaakt van een HPLCmethode om de vorming van AA of LZ op te sporen ten gevolge van enzymatische omzetting van de componenten na incubatie met FAAH. Uit de HPLC-analyses bleek dat na incubatie van de componenten met het enzym vetzuur gevormd wordt waaruit kan besloten worden dat alle verbindingen substraat zijn voor FAAH. Het feit dat deze AEA-analogen substraat zijn voor FAAH, maakt dat ze potentieel bruikbaar zijn als metabolic trapping liganden voor visualisatie van FAAH. In reeds uitgevoerde experimenten (wyffels et al., ingezonden voor review) werden de AEA-analogen 4OCH3AA, 4OCH3LZ, 3OCH3AA, 3OCH3LZ, 2OCH3AA, 2OCH3LZ, 4-IBA en 4-IPA gedurende 3 uur geïncubeerd om interactie met FAAH na te gaan. De stabiliteit van deze verbindingen in het incubatiemedium bij 37°C moest echter nog nagegaan worden. Het doel was dus, om via HPLC-analyse, bewijs te leveren dat de metabolic trapping liganden weinig tot geen afbraak vertonen tijdens die experimenten. We hebben statistisch aangetoond dat de componenten gedurende ten minste drie uur stabiel blijven bij een temperatuur van 37°C en pH 7,4. Uit deze stabiliteitstesten blijkt dat in voorgaande in vitro testen de componenten werden afgebroken door het enzym en niet door instabiliteit in het reactiemidden.

C o n c l u s i e s | 38 De Michaëlis-Menten curve en de kinetische parameters KM en Vmax voor de FAAHgekatalyseerde hydrolyse van 4OCH3AA en 4OCH3LZ, werden eveneens bepaald met behulp van HPLC. Daartoe werd eerst een kalibratiecurve van AA of LZ opgesteld om de FAAHactiviteit te kunnen kwantificeren. Hierna werd een progressiecurve van de metabolisatie van de substraten door FAAH opgesteld, om dan uiteindelijk de Michaëlis-Menten curve op te stellen en de kinetische parameters hieruit te berekenen. Uit de kinetische parameters blijkt dat 4OCH3LZ een hogere affiniteit heeft voor FAAH (KM = 10,38) dan 4OCH3AA (KM = 18,21). 4OCH3LZ is dus het meest bruikbaar is als metabolic trapping ligand. De radiosynthese voor [11C]-carba5, uitgaande van zijn desmethylprecursor werd beschreven. [11C]-carba5 werd bekomen met een radiochemisch rendement van 35%, de S.A. was 260 GBq/µmol en de radiochemische zuiverheid was > 99%. Met behulp van de ‘shake flask’-methode werd de log D-waarde voor [11C]-carba5 bepaald. Er werd een log D-waarde van 2,32 ± 0,23 bekomen, wat erop wijst dat [11C]-carba5 waarschijnlijk goed in de hersenen zal worden opgenomen. Na extractie van [11C]-carba5 met MeCN uit plasma en hersenen trad geen afbraak op, zoals aangetoond werd met behulp van HPLC. Het extractierendement voor het plasma is 95% en voor de hersenen 87%, wat erop wijst dat de binding van [11C]-carba5 aan plasmaproteïnen reversibel is. In toekomstige experimenten moet nog de opname van carba5 in de hersenen bepaald worden in een biodistributie experiment en moet de retentie van radioactiviteit in de hersenen bepaald worden. Eveneens moet het metabolietprofiel nagegaan worden om te kijken welke metabolieten van carba5 er in het lichaam gevormd worden.

L i t e r a t u u r l i j s t | 39

6. LITERATUURLIJST Baker, D.; Pryce, G.; Croxford, J. L.; Brown, P.; Pertwee, R. G.; Huffman, J. W.; Layward, L. (2000). Cannabinoids control spasticity and tremor in a multiple sclerosis model. Nature, 404, 84 Baker, D.; Pryce, G.; Croxford, J. L.; Brown, P.; Pertwee, R. G.; Makriyannis, A.; Khanolkar, A.; Di Marzo, V. (2001). Endocannabinoids control spasticity in a multiple sclerosis model. FASEB J., 10, 300-302 Balsavarajappa, B. S. (2007). Critical Enzymes Involved in Endocannabinoid Metabolism. Protein & Peptide Letters, 17, 237-246 Basavarajappa, B. S.; Yalamanchili, R.; Cravatt, B. F.; Cooper, T. B.; Hungund, B. L . (2006). Increased ethanol consumption and preference and decreased ethanol sensitivity in female FAAH knockout mice. Neuropharmacology, 50, 834-844 Begg, M.; Pacher, P.; Batkai, S.; Osei-Hyiaman, D.; Offertaler, L.; Mo, F. M.; Liu, J.; Kunos, G. (2005). Evidence for novel cannabinoid receptors. Pharmacol Ther, 106, 133-145 Benito, C.; Núñez, E.; Tolón, R. M.; Carrier, E. J.; Rábano, A.; Hillard, C. J.; Romero, J. (2003). Cannabinoid CB2 Receptors and Fatty Acid Amide Hydrolase Are Selectively Overexpressed in Neuritic Plaque-Associated Glia in Alzheimer’s Disease Brains. The Journal of Neuroscience, 23(35), 11136-11141 Bisogno, T.; De Petrocellis, L.; Di Marzo, V. (2002). Fatty acid amide hydrolase, an enzyme with many bioactive subsrates. Possible therapeutic implications. Curr Pharm Des, 8, 533-47 Blednov, Y. A.; Cravatt, B. F.; Boehm II, S. L.; Walker, D.; Harris, R. A. (2007). Role of Endocannabinoids in Alcohol Consumption and Intoxication: Studies of Mice Lacking Fatty Acid Amide Hydrolase. Neuropsychopharmacology, 32, 1570-1582 Bortolato, M.; Mangieri, R. A.; Fu, M.; Kim, J. H.; Arguello, O.; Duranti, A.; Tontini, A.; Mor, M.; Tarzia, G.; Piomelli, D. (2007). Antidepressant-like Activity of the Fatty Acid Amide Hydrolase Inhibitor URB597 in a Rat Model of Chronic Mild Stress. Biol Psychiatry, 62, 1103-1110 Bracey, M. H.; Hanson, M. A.; Masuda, K. R.; Stevens, R. C.; Cravatt B. F. (2002). Structural adaptations in a membrane enzyme that terminates endocannabinoid signaling. Science, 298, 1793-6

L i t e r a t u u r l i j s t | 40 Brooks, D. J. (2005). Positron emission tomography and single-photon emission computed tomography in central nervous system drug development. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, 2, 226-236 Chiang, K. P.; Gerber, A. L.; Sipe, J. C.; Cravatt, B. F. (2004). Reduced cellular expression and activity of the P129T mutant of human fatty acid amide hydrolase: evidence for a link between defects in the endocannabinoid system and problem drug use. Human Molecular Genetics, 13, 2113-2119 Cravatt, B. F.; Demarest, K.; Patricelli, M. P.; Bracey, M. H.; Giang, D. K.; Martin, B. R.; Lichtman, A. H. (2001). Supersensitivity to anandamide and enhanced endogenous cannabinoid signaling in mice lacking fatty acid amide hydrolase. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 9371-9376 De Petrocellis, L.; Cascio, M. G.; Di Marzo, V. (2004). The endocanabinoid system: a general view and latest additions. Br J Pharmacol, 141, 765-774 De Petrocellis, L.; Di Marzo, V. (2009). An introduction to the endocannabinoid system: from the early to the latest concepts. Best Practices & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, 23, 1-15 Demuth, D. G.; Molleman, A. (2006). Cannabinoid signaling. Life Sciences, 78, 549-563 Deutsch, D. G.; Ueda, N.; Yamamoto, S. (2002). The fatty acid amide hrdrolase. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 66, 201-10 Devane, W. A.; Hanus, L.; Breuer, A.; Pertwee, R. G.; Stevenson, L. A.; Griffin, G.; Gibson, D.; Mandelbaum, A.; Etinger, A.; Mechoulam, R. (1992). Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science, 258, 1946-1949 Di Marzo, V.; Bifulco, M.; De Petrocellis, L. (2004). The endocannabinoidsystem and its therapeutic exploitation. Nat. Rev. Drug Discov., 3, 771-784 Di Marzo, V.; Hill, M. P.; Bisogno, T.; Crossman, A. R.; Brotchie, J. M. (2000). Enchanced levels of endogenous cannabinoids in the globus pallidus are associated with a reduction in movement in an animal model of Parkinson’s disease. FASEB J., 14, 1432-1438 Dinh, T. P.; Carpenter, D.; Leslie, F. M.; Freund, T.F.; Katona, I.; Sensi, S. L.; Kathuria, S.; Piomelli, D. (2002). Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation. Proc Natl Acad Sci USA, 99, 10819-10824

L i t e r a t u u r l i j s t | 41 Egertová, M.; Cravatt, B. F.; Elphick, M. R. (2003). Comparative analysis of fatty acid amide hydrolase and CB1 cannabinoid receptor expression in the mouse brain: evidence of a widespread role for fatty acid amide hydrolase in regulation of endocannabinoid signaling. Neuroscience, 119, 481-95 Fagerholm, U. (2007). The highly permeable blood-brain barrier: an evaluation of current opinions about brain uptake capacity. Drug Discovery Today, 12, 1076-1082 Gaoni, Y.; Mechoulam, R. (1964). Structure and partial synthesis of an active constituent of hashisch. J Am Chem Soc, 86, 1646-1647 Giang, D. K.; Cravatt, B. F. (1997). Molecular characterization of human and mouse fatty acid amide hydrolases. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 2238-2242 Gobbi, G.;Bambico, F. R.; Mangieri, R.; Bortolato, M.; Campolongo, P.; Solinas, M.; Cassano, T.; Morgese, M. G.; Debonnel, G.; Duranti, A.; Tontini, A.; Tarzia, G.; Mor, M.; Trezz, V.; Goldberg, S. R.; Cuomo,V. (2005). Antidepressant-like activity and modulation of brain monoaminergic transmission by blockade of anandamide hydrolysis. PNAS, 102, 1862018625 Gubellini, P.; Picconi, B.; Bari, M.; Battista, N.; Calabresi, P.; Centonze, D.; Bernardi, G.; Finazzi-Agro,

A.;

Maccarone,

M.

(2002).

Experimental

Parkinsonism

Alters

Endocannabinoid Degradation for Striatal Glutamatergic Transmission. The Journal of Neuroscience, 22, 6900-6907 Hendee, W.R.; Ritenour E.R. (2002). Medical Imaging Physics, Fourth Edition. Wiley-Liss, New York, USA, Chapter 12 Herkenham, M.; Lynn, A. B.; Little, M. D.; Johnson, M. R.; Melvin, L. S.; De Costa, B. R.; Rice, K. C. (1990). Cannabinoid receptor localization in brain. Proc Natl Acad Sci USA, 87, 1932-1936 Howlett, A. C. (2002b). The cannabinoid receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 6869, 619-631 Howlett, A. C.; Barth, F.; Bonner, T. I.; Cabral, G.; Casellas, P.; Devane, W. A.; Felder, C. C.; Herkenham, M.; Mackie, K.; Martin, B. R.; Mechoulam, R.; Pertwee, R. G. (2002a). International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol Rev, 54, 161-202

L i t e r a t u u r l i j s t | 42 http://nl.wikipedia.org/wiki/Positronemissietomografie, 21 mei 2009 http://www.capintec.com/products/crc-25r.jpg, 23 mei 2009 http://www.icn.nl/nl/kenniscentrum/onderzoeksmethoden/hplc, 23 mei 2009 http://www.le.ac.uk/by/teach/biochemweb/tutorials/michment2print.html, 01 juni 2009 Katayama, K.; Ueda, N.; Katoh, I.; Yanamoto, S. (1999). Equilibrium in the hydrolysis and synthesis of cannabimimetic anandamide demonstrated by a purified enzyme. Biochim Biophys Acta, 1440, 205-214 Kathuria, S.; Gaetani, S.; Fegley, D.; Valino, F.; Duranti, A.; Tontini, A.; Mor, M.; Tarzia, G.; La Rana, G.; Calignano, A.; Giustino, A.; Tattoli, M.; Palmery, M.; Cuomo, V.; Piomelli, D. (2003). Modulation of anxiety through blockade of anandamide hydrolysis. Nature Medicine, 9, 76-81 Kung, H. F. (1991). Overview of radiopharmaceuticals for diagnosis of central nervous disorders. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 28, 269-286 Malone, D. T.; Kearn, C. S.; Chongue, L.; Mackie, K., Taylor, D. A. (2008). Effect of Social Isolation on CB1 and D2 Receptor and Fatty Acid Amide Hydrolase Expression in Rats. Neuroscience, 152, 265-272 Matsuda, L. A.; Lolait, S. J.; Brownstein, M.J.; Young, A. C.; Bonner, T. I. (1990). Structure of an cannabinoid receptor and fuctional expression of the cloned cDNA. Nature, 346, 561564 McKinney, M. K.; Cravatt, B. F. (2005). Structure andfunction of fatty acid amide hydrolase. Annu Rev Biochem, 74, 411-32 Mechoulam, R.; Ben-Shabat, S.; Hanus, L.; Ligumsky, M.; Kaminsky, N. E.; Schatz, A. R.; Gopher, A.; Almog, S.; Martin, B. R.; Compton, D. R.; Pertwee, R. G.; Griffin, G.; Bayewitch, M. Barg, J.; Vogel, Z. (1995). Identification of an endogenous 2-monoglyceride, present in canine gut, that binds to cannabinoid receptors. Biochem Pharmacol, 50, 83-90 Micale, V.; Mazzola, C.; Drago, F. (2007). Endocannabinoids and neurodegenerative diseases. Pharmacological Research, 56, 382-392 Moreira, F. A.; Kaiser, N.; Monory, K.; Lutz, B. (2008). Reduced anxiety-like behavior induced by genetic and pharmacological inhibition of the endocannabinoid-degrading enzyme

L i t e r a t u u r l i j s t | 43 fatty acid amide hydrolase (FAAH) is mediated by CB1 receptors. Neuropharmacology, 54, 141-150 Moreira, F. A.; Kaiser, N.; Monory, K.; Lutz, B. (2008). Reduced anxiety-like behavior induced by genetic and pharmacological inhibition of the endocannabinoid-degrading enzyme fatty acid amide hydrolase (FAAH) is mediated by CB1 receptors. Neuropharmacology, 54, 141-150 Munro, S.; Thomas, K. L.; Abu-Shaar, M. (1993). Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature, 365, 61-65 Naderi, N.; Haghparast, A.; Saber-Tehrani, A.; Rezaii, N.; Alizadeh, A-M.; Khani, A.; Motamedi, F. (2008). Interaction between cannabinoid compounds and diazepam on anxietylike behavior of mice. Pharmacology, Biochemistry and Behaviour, 89, 64-75 Namba, H.; Fukushi, K.; Nagatsuka, S.; Iyo, M.; Shinotoh, H.; Tanada, S.; Irie, T. (2002). Positron emission tomography: quantitative measurement of brain acetylcholinesterase activity using radiolabeled substrates. Methods, 27, 242-250 Pertwee, R. G. (2002). Cannabinoids and multiple sclerosis. Pharmacology and Therapeutics, 95, 165-174 Peters, H.; Nahas, G. G. (1999). A brief history of four millennia (B.C. 2000-A.D. 1971). In: Marihuana and medicine, Nahas, G. G.; Sutin, K. M.; Harvey, D.; Agurell, S. (Eds.), Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 3-7 Sipe, J. C.; Chiang, K.; Gerber, A. L.; Beutler, E.; Cravatt, B. F. (2002). A missense mutation in human fatty acid amide hrdrolase associated with problem drug use. PNAS, 99, 8394-8399 Sugiura, T.; Kondo, S.; Sukagawa, A.; Nakane, S.; Shinoda, A.; Itoh, K.; Yamashita, A.; Waku, K. (1995). 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain. Biochem Biophys Res Commun, 215, 89-97 Tavitian, B.; Pappata, S.; Bonnotlours, S.; Prenant, C.; Jobert, A.; Crouzel, C.; Digiamberardino,

L.

(1993b).

Positron

emission

tomography

study

of

[11C]methyltetrahydroaminoacridine (methyl-tacrine) in baboon brain. Eur. J. Pharmacol., 236, 229-238

L i t e r a t u u r l i j s t | 44 Tavitian, B.; Pappata, S.; Planas, A. M.; Jobert, A.; Bonnot-Lours, S.; Crouzel, C.; DiGiamberardino, L. (1993a). In vivo visualization of acetylcholinesterase with positron emission tomography. NeuroReport, 4, 535-538 Ujike, H.; Morita, Y. (2004). New Perspectives in the Studies on Endocannabinoid and Cannabis: Cannabinoid Receptors and Schizophrenia. J Pharmacol Sci, 96, 376-381 Vandevoorde, S.; Lambert, D. M. (2005). Focus on the Three Key Enzymes Hydrolysing Endocannabinoids as New Drug Targets. Current Pharmaceutical Design, 11, 2647-2668 Vinod, K. Y.; Sanguino, E.; Yalamanchili, R.; Manzanares, J.; Hungund, B. L. (2008). Manipulation of fatty acid amide hydrolase fuctional activity alters sensitivity and dependence to ethanol. Journal of Neurochemistry, 104, 233-243 Wallace, M. J.; Martin, B. R.; Delorenzo, R. J. (2002). Evidence for a physiological role of endocannabinoids in the modulation of seizure threshold and severity. European Journal of Pharmacology, 452, 295-301 Wilson, A. A.; Jin, L.; Garcia, A.; DaSilva, J. N.; Houle, S. (2001). An admonition when measuring the lipophilicity of radiotracers using counting techniques. Applied Radiation and Isotopes, 54, 203-208 Wilson, R. I.; Nicoll, R. A. (2002). Endocannabinoid Signalling in the Brain. Science, 296, 678-683 wyffels, L.; De Bruyne, S.; Blanckaert, P.; Lambert, D. M.; De Vos, F. (2009). Radiosynthesis, in vitro and in vivo evaluation of

123

I-labeled anandamide analogues for

mapping brain FAAH. Bioorganic & Medical Chemistry, 17, 49-56 Zanzonico, P.; Heller S. (2007). Physics, Instrumentation, and Radiation Protection In: Clinical Nuclear Medicine, Biersack, H. -J.; Freeman L. M. (Ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Germany, pp. 1-33

MICHAËLIS-MENTEN

EXACTE MASSA EN MOLAIR GEWICHT

AANTONEN VAN EEN SUBSTRAAT

COMPONENT

STABILITEITSTESTEN

BIJLAGE 1

Exact Mass: 437,3294 Mol. Wt.: 437,6572

V

V V

Exact Mass: 413,3294 Mol. Wt.: 413,6358

V

V V

Exact Mass: 437,3294 Mol. Wt.: 437,6572

V

V

Exact Mass: 413,3294 Mol. Wt.: 413,6358

V

V

Exact Mass: 437,3294 Mol. Wt.: 437,6572

V

V

Exact Mass: 413,3294 Mol. Wt.: 413,6358

V

V

2-methoxyphenethylarachidonylamide (2OCH3AA)

2-methoxyphenethyllinoleoylamide (2OCH3LZ)

3-methoxyphenethylarachidonylamide (3OCH3AA)

3-methoxyphenethyllinoleoylamide (3OCH3LZ)

4-methoxyphenethylarachidonylamide (4OCH3AA)

4-methoxyphenethyllinoleoylamide (4OCH3LZ)

4-iodobenzylarachidonylamide (4-IBA) Exact Mass: 519,1998 Mol. Wt.: 519,5012

V

Exact Mass: 533,2155 Mol. Wt.: 533,5278

V

4-iodophenethylarachidonylamide (4-IPA)

N-(2-iodoethyl)arachidonylamide (AA+I) Exact Mass: 457,1842 Mol. Wt.: 457,4318

V

Exact Mass: 433,1842 Mol. Wt.: 433,4104

V

N-(2-iodoethyl)linoleoylamide (LZ+I)

BIJLAGE 2 4-methoxyphenethylarachidonylamide (4OCH3AA)

A

B

C

D

4-methoxyphenethyllinoleoylamide (4OCH3LZ)

A

A = metabolisatie assay C = blanco zonder 30 min incubatie

B

B = blanco met 30 min incubatie D = inhibitie assay

BIJLAGE 2

C

D

3-methoxyphenethylarachidonylamide (3OCH3AA)

A

B

C

D

A = metabolisatie assay C = blanco zonder 30 min incubatie

B = blanco met 30 min incubatie D = inhibitie assay

BIJLAGE 2 3-methoxyphenethyllinoleoylamide (3OCH3LZ)

A

B

C

D

2-methoxyphenethylarachidonylamide (2OCH3AA)

A

A = metabolisatie assay C = blanco zonder 30 min incubatie

B

B = blanco met 30 min incubatie D = inhibitie assay

BIJLAGE 2

C

D

2-methoxyphenethyllinoleoylamide (2OCH3LZ)

A

B

C

D

A = metabolisatie assay C = blanco zonder 30 min incubatie

B = blanco met 30 min incubatie D = inhibitie assay

BIJLAGE 2 N-(2-iodoethyl)arachidonylamide (AA+I)

A

B

C

D

N-(2-iodoethyl)linoleoylamide (LZ+I)

A

A = metabolisatie assay C = blanco zonder 30 min incubatie

B

B = blanco met 30 min incubatie D = inhibitie assay

BIJLAGE 2

C

A = metabolisatie assay C = blanco zonder 30 min incubatie

D

B = blanco met 30 min incubatie D = inhibitie assay