De betrokkenheid van mirnas in huidziekten

Academiejaren 2010 – 2012

De betrokkenheid van miRNAs in huidziekten

Lien DE SMET

Promotor: Dr. M. Van Gele

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot

MASTER IN DE GENEESKUNDE

Academiejaren 2010 – 2012

De betrokkenheid van miRNAs in huidziekten

Lien DE SMET

Promotor: Dr. M. Van Gele

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot

MASTER IN DE GENEESKUNDE

“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

I VOORWOORD Langs deze weg zou ik graag mijn promotor, Dr. Mireille Van Gele, bedanken om mij te helpen deze masterproef te realiseren. Tijdens onze veelvuldige afspraken gaf ze me telkens advies en volgde ze de voortgang van dit werk op. De eerlijke commentaren en verbeteringen hebben mij uitgedaagd om dit werk te verfijnen tot wat het nu geworden is. Mijn ouders verdienen een algemene bedanking voor hun grote steun tijdens mijn opleiding. Ze hielpen mij om de stressvolle momenten te relativeren maar herinnerden mij eveneens aan de naderende deadline. Mijn zus wil ik bedanken voor de steun en het herlezen van deze scriptie. Ook mijn vrienden verdienen een vermelding. Ze waren een luisterend oor wanneer ik het nodig had en zorgden voor de nodige ontspanning. Alvast veel leesgenot toegewenst.

I

II INHOUDSTAFEL I VOORWOORD ......................................................................................................................................... I II INHOUDSTAFEL ................................................................................................................................... II III LIJST VAN AFKORTINGEN ............................................................................................................. III IV ABSTRACT ........................................................................................................................................... 1 V INLEIDING ............................................................................................................................................. 2 1.

De ontdekking van RNA-afhankelijke interferentie.......................................................................... 2 1.1.

Historiek van miRNA ................................................................................................................ 3

2.

MiRNA versus siRNA....................................................................................................................... 4

3.

Biogenese van miRNA ...................................................................................................................... 6

4.

Functie van miRNA in normale ontwikkeling en pathologie ............................................................ 9

VI METHODOLOGIE .............................................................................................................................. 10 VII RESULTATEN................................................................................................................................... 11 1.

2.

3.

4.

MiRNAs in de normale huid ........................................................................................................... 11 1.1.

Structuur en functie van de huid .............................................................................................. 11

1.2.

MiRNAs en de ontwikkeling van de huid ............................................................................... 13

1.3.

Wondherstel............................................................................................................................. 15

Auto-immune huidaandoeningen .................................................................................................... 17 2.1.

Psoriasis ................................................................................................................................... 17

2.2.

Atopisch eczeem...................................................................................................................... 24

Huidkanker ...................................................................................................................................... 25 3.1.

Inleiding................................................................................................................................... 25

3.2.

Maligne melanoom .................................................................................................................. 26

3.3.

Spinocellulair carcinoom ......................................................................................................... 27

MiRNAs in diagnose en therapie .................................................................................................... 28 4.1.

MiRNAs als biomerker ........................................................................................................... 28

4.2.

MiRNAs als therapie ............................................................................................................... 29

VIII DISCUSSIE EN CONCLUSIE ......................................................................................................... 32 IX REFERENTIELIJST ............................................................................................................................ 35

II

III LIJST VAN AFKORTINGEN C.elegans

Caenorhabditis elegans

CLL

chronische lymfatische leukemie

CTLA-4

cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen

dsRNA

dubbelstrengig RNA

ECM

extracellulaire matrix

exp-5

exportin 5

FGFR

fibroblast growth factor receptor

GM-CSF

granulocyte-macrophagecolony stimulating factor

HF

haarfollikel

IGF-1R

insuline-like growth factor receptor

IMID

immune-mediated inflammatory disorder

MEK1

mitogen-activated protein kinase 1

MHC

major histocompatibility complex

miRNA

microRNA

MITF

microphtalmia-associated transcription factor

mRNA

messenger RNA

PCR

polymerase chain reaction

PDGF

platelet derived growth factor

pre-miRNA

precursor miRNA

pri-miRNA

primair miRNA

pRNA

Piwi-interacing RNA

rasiRNA

repeat-associated siRNA

RISC

RNA-induced silencing complex

RNA

ribo nucleic acid

RNAi

RNA-afhankelijke interferentie

SCC

squamous cell carcinoma

siRNA

small interfering RNA

SLE

systemische lupus erythematosus

SNP

single-nucleotide polymorphism

SOCS-3

suppressor of cytokine signalling 3

tasiRNA

trans-acting siRNA

TNFα

tumor necrosis factor α

UTR

untranslated region

III

IV ABSTRACT Achtergrond: MiRNAs zijn kleine (21-25 nucleotiden) endogene niet-coderende RNA-moleculen. Ze moduleren genexpressie door binding met een doelwit-mRNA. Deze vorm van post-transcriptionele genregulatie is reeds in verband gebracht met de ontwikkeling van de huid en diverse huidaandoeningen.

Methode: Dit is een review van de huidaandoeningen waarbij miRNAs een rol spelen. Studies werden gevonden op PubMed en via referentielijsten van andere artikels. Voor de inleiding en beschrijving van elk ziektebeeld werden via PubMed samenvattende studies en reviews opgezocht.

Resultaten: MiRNAs hebben veel gemeenschappelijke kenmerken met siRNAs (small interfering RNAs). De gelijkenissen en verschillen worden besproken, net zoals de biogenese van deze kleine RNAs. Vooraleer over te gaan tot de rol van miRNAs bij huidziekten, wordt deze eerst beschreven in de normale huid. Het sterk aangetaste fenotype van mutante muizen die sleutelenzymen (Dicer of Dgcr8) van de biogenese van miRNAs missen, bevestigt de essentiële functie van miRNAs bij de ontwikkeling van de huid. MiRNAs spelen ook een rol in de verschillende fasen van het wondherstel. Verschillende miRNAs komen verhoogd of verlaagd tot expressie bij bepaalde huidaandoeningen. Per ziektebeeld worden enkele miRNAs en hun potentiële doelwitgen(en) besproken. Deze worden nadien opgelijst in een tabel. De huidziekten die hier besproken worden zijn psoriasis, atopisch eczeem en melanoom. In de toekomst kunnen miRNAs nuttige hulpmiddelen zijn zowel bij de diagnose als bij de therapie van huidziekten. De begrippen ‘antagomirs’ en ‘mimics’ worden toegelicht.

Conclusie: De kleine miRNAs spelen een grote rol bij huidziekten. Onderzoeken naar de differentiële expressie van miRNAs en hun doelwitgenen bij huidaandoeningen zijn van belang. Zo kan een miRNAexpressieprofiel per huidziekte opgesteld worden. Dit biedt naar de toekomst toe veelbelovende diagnostische en therapeutische vooruitzichten.

1

V INLEIDING “The laws of genetics apply even if you refuse to learn them.” - Allison Plowden

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine, niet-coderende RNA-moleculen, met een karakteristieke lengte van 21 à 25 nucleotiden. Ze spelen een belangrijke rol in de regulatie van genexpressie. Door binding aan homologe sequenties in de 3’untranslated region (3’UTR) van hun doelwit, het messenger RNA (mRNA), onderdrukken ze de translatie [1, 2]. Elke miRNA kan binden op meerdere doelwitgenen en elk doelwitgen kan meerdere miRNA bindingsplaatsen hebben. Aangezien reeds meer dan 700 miRNAs aangetoond zijn bij de mens, is het dus niet verwonderlijk dat hun regulatieve functie zeer uitgebreid is [1, 3].

1. De ontdekking van RNA-afhankelijke interferentie De historiek van miRNAs begint in 1990 met de eerste documentatie van RNA-silencing. Toen werd per toeval een moleculair mechanisme ontdekt dat leidde tot onderdrukking van genexpressie bij planten. Dit fenomeen werd omschreven als Post-Transcriptional Gene Silencing of co-suppressie. In een poging om petunia’s met een donker paarse bloem te genereren, werd een gen coderend voor een pigmentproducerend enzym ingebracht. Maar in plaats van de donker paarse kleur, vertoonden de bloemen een sterke variatie aan paars en velen waren zelfs wit (figuur 1). Men ging er van uit dat door nucleïnezuurhomologie het antisense RNA zorgde voor verlies van functie. De mechanismen echter van deze stillegging van genen werden toen nog slecht begrepen [4].

Figuur 1: Fenotypes van een parenterale (links) en een transgene petunia na post-transcriptional gene silencing (rechts). Figuur aangepast uit [4].

2

Het gebruik van antisense RNA om specifieke genen te onderdrukken werd daarna voor het eerst getest bij dierenmodellen zoals de rondworm Caenorhabditis elegans (C. elegans). Hierbij werd het organisme geïnjecteerd met een antisense RNA-molecule complementair aan het mRNA-transcript van het doelwitgen. Complementaire hybridisatie tussen dit antisense RNA en het sense mRNA verhinderde translatie en productie van het desbetreffende proteïne [5, 6]. Andrew Fire en Craig Mello stelden in 1998 vast dat de combinatie van homologe sense en antisense RNAs, met vorming van een dubbelstrengige RNA-molecule (dsRNA), veel efficiënter was dan het inbrengen van een enkelstrengig antisense RNA [7]. Uit biochemische onderzoek bleek dat eens lange dsRNAs in de cel werden gebracht, ze in korte, dubbelstrengige stukjes van 22 nucleotiden geknipt werden; small interfering RNA (siRNA) [8, 9]. Deze bevindingen hebben geleid tot nieuwe inzichten in genregulatie. Ze definiëren RNA-afhankelijke interferentie (RNAi), wat staat voor dsRNA die gebruikt wordt om de expressie van specifieke genen te onderdrukken. Dit effect van RNAi is een waardevol werktuig bij biotechnologisch onderzoek. Door de ontdekking van deze nieuwe antisense technologie ontvingen A. Fire en G. Mello de Nobelprijs voor Geneeskunde in 2006. Wat toevallig ontdekt werd, bleek uiteindelijk een weerspiegeling te zijn van een biologisch fenomeen. Zo leidde het uitbouwen van de RNAi methode tot de ontdekking van de natuurlijk voorkomende miRNAs. Door parallelle studie van siRNA kan het concept miRNA beter begrepen worden. Deze twee klassen van kleine RNAs hebben namelijk een gelijkaardig werkingsmechanisme.

1.1. Historiek van miRNA Genetische studie van C. elegans mutanten met ontwikkelingsstoornissen leidde tot de ontdekking van de eerste endogene miRNAs. In 1993 ontdekten Lee, Feinbaum en Ambros dat lin-4, een gen die de timing tijdens de ontwikkeling van de rondworm C. elegans controleert, niet codeert voor een eiwit maar in plaats daarvan een paar kleine RNAs produceert. Deze lin-4 RNAs bleken complementair aan meerdere basen in de 3´UTR van lin-14 mRNA wat leidde tot de onderdrukking van lin-14. Door deze onderdrukking werd er dus minder lin-14 eiwit aangemaakt. Dit resulteerde in het falen van de correcte ontwikkeling van de worm. Zo kwam men tot het moleculair model dat de translatie van lin-14 mRNA geïnhibeerd werd door binding van de kleine lin-4 RNA molecule. De eerste kleine endogene RNAmolecule die translatie regelt door RNA-RNA-interactie kwam zo aan het licht [10].

3

In 2000, bijna 7 jaar na de vondst van lin-4, werd een tweede miRNA ontdekt; let-7. Deze miRNAmolecule leidde eveneens tot een onderbreking van de post-embryonale ontwikkeling van C. elegans maar dan in een later stadium. De identificatie van let-7 zorgde niet enkel voor een tweede voorbeeld van regulatie van ontwikkeling door kleine RNA moleculen, maar opende eveneens perspectieven dat dit soort RNAs ook kon aanwezig zijn in andere soorten, naast de nematoden. Men vond namelijk dat let-7 evolutionair geconserveerd bleef van de rondworm naar andere diersoorten, waaronder ook de mens [11, 12]. Sinds de ontdekking van lin-4 en let-7, zijn er meer dan tienduizend miRNAs geïdentificeerd in verscheidene organismen zoals virussen, wormen en primaten. In het menselijk genoom zijn er naar schatting meer dan duizend miRNAs aanwezig die meer dan zestig procent van onze genen als doelwit hebben. Al deze miRNAs kunnen opgezocht worden in miRNA databanken zoals de miRBase (http://www.mirbase.org/) [13].

2. MiRNA versus siRNA SiRNA en miRNA hebben veel gemeenschappelijke kenmerken en kunnen nauwelijks van elkaar onderscheiden worden op basis van hun moleculaire karakteristieken, biogenese of functie. Toch hebben beide klassen belangrijke verschillen, vooral op basis van hun oorsprong, evolutief behoud en het type genen die ze onderdrukken [14]. Eerst en vooral is miRNA een puur endogene molecule, natuurlijk voorkomend in het menselijk genoom. Terwijl siRNA vooral exogeen van oorsprong is; afkomstig van virussen, transposons of transgene triggers. Biologische siRNAs afkomstig van lange endogene dsRNA-molecules werden ook reeds ontdekt bij de mens maar deze zijn zeldzaam [15]. Ten tweede hebben miRNAs een stem-loop precursor met een incompleet dubbelstrengig karakter. SiRNAs daarentegen zijn afkomstig van lange, volledig complementair dsRNAs [16]. Als derde verschil kunnen we de wijze van repressie aanbrengen. MiRNAs binden meestal aan doelwit 3’UTRs door imperfecte complementariteit wat resulteert in translationele repressie. Terwijl siRNAs steeds perfect binden met hun doelwit op één plaats en zo verantwoordelijk zijn voor mRNA degradatie [15] (figuur 4). Ten laatste hebben siRNAs elk één gen als doelwit terwijl van een miRNA voorspeld wordt dat het zich richt op 100 tot 200 genen [17].

4

Tabel 1: Vergelijking tussen de eigenschappen van siRNAs en miRNAs.

Bouw

siRNA dubbelstrengig

miRNA enkelstrengig

Oorsprong

exogeen

endogeen

Aantal doelwitgenen

één

meerdere

Complementariteit aan doelwit mRNA

perfect

imperfect

Effect op mRNA

degradatie

translationele repressie

In feite is dit onderscheid tussen miRNA en siRNA slechts arbitrair; de grens tussen beide klassen wordt steeds onduidelijker. Zo zijn er ook siRNAs die handelen als repressor en miRNAs die resulteren in degradatie. En aangezien endogene siRNAs kunnen aangetoond worden bij de mens valt ook dit verschil weg [15, 16]. Ondanks de verschillen blijkt uit de gelijkaardige lengte en functie onmiddellijk dat ze verwant zijn in hun biogenese. Beide klassen van small-RNAs zijn afhankelijk van twee families eiwitten: Dicer-enzymen om ze van hun precursor af te knippen en Ago-proteïne van het RISC om hun onderdrukkende functie te ondersteunen. De biogenese wordt verder uitvoerig besproken (figuur 4). Door de vele aandacht dat naar deze kleine RNA-moleculen uitgaat, kwam men tot de ontdekking dat er nog andere RNA moleculen van dit type bestaan. Hiertoe behoren de trans-acting siRNAs (tasiRNA) die tot nog toe enkel in planten gezien werden; repeat-associated siRNAs (rasiRNA) die blijken een rol te hebben bij de bescherming van de stabiliteit van het genoom en Piwi-interacting RNAs (pRNA) die tot expressie komen in dierlijke cellen en die een rol hebben in de leefbaarheid van kiembaanstamcellen [1820].

5

3. Biogenese van miRNA De eerste stap in de biogenese van miRNAs is de synthese van een primair transcript (pri-miRNA) gestuurd door RNA Polymerase II of III. Deze primaire transcripten hebben net zoals een mRNA een cap-structuur aan het 5’ uiteinde en een poly-A-staart aan het 3’ uiteinde (figuur 3). Ze komen steeds voor als een haarspeldstructuur. Transcriptie van miRNAs kan gebeuren vanuit verschillende genomische locaties. MiRNA-genen kunnen zich bevinden in introns van coderende of niet-coderende genen, in exons van niet-coderende genen of in de intergenische regio’s. De meeste miRNA-genen komen afzonderlijk voor, andere komen voor in clusters [16, 21].

Figuur 2: miRNA expressievormen: miRNAs kunnen overgeschreven worden van genen die in clusters of afzonderlijk liggen.

In de nucleus knipt het complex Drosha-RNAse III en zijn cofactor Dgcr8 haarspeldstructuren (70 – 100 nucleotiden lang) uit het pri-miRNA met vorming van precursor-miRNA (pre-miRNA). Deze premiRNAs bezitten steeds 3’OH overhangende uiteinden van 2 tot 3 nucleotiden [22]. Vervolgens zorgt exportin-5 (Exp-5) voor het transport van pre-miRNA uit de nucleus. Eens in het cytoplasma splitst een RNAse III endonuclease, Dicer, de pre-miRNAs in korte RNA-duplexen. Dit enzym is werkzaam als een pseudo-dimeer waarbij beide katalytische plaatsen één streng van het RNAduplex knippen. Door binding van het PAZ-domein op het uiteinde van het pre-miRNA met een 3’overhangend einde, is Dicer in staat om 21 tot 25 nucleotiden af te meten en op die plaats beide strengen te knippen. Dit resulteert in een mature miRNA-streng en een complementaire streng die wordt gedegradeerd [16].

6

In de effectorstap binden de mature miRNAs aan de 3’UTR van het mRNA in een proteïnecomplex, RNAinduced silencing complex (RISC) genoemd. Dit complex staat in voor het verknippen of onderdrukken van het doelwit mRNA. Wanneer de complementariteit perfect is, wordt het mRNA gedegradeerd. Is de complementariteit daarentegen niet volledig homoloog dan is er regulatie door translationele repressie [16].

Figuur 3 : Structuur van een mRNA: 3’UTR is de bindingsplaats van miRNA op het doelwitgen.

7

Figuur 4: Biogenese van miRNAs en siRNAs. Pri-miRNA wordt door Drosha in stukken van ongeveer 70 nucleotiden geknipt in de kern. Pre-miRNA wordt vervolgens door exportin-5 naar het cytoplasma getransporteerd en wordt in korte miRNA-duplexen geknipt door Dicer. Dicer knipt ook lange dsRNA moleculen in korte stukjes siRNA-duplexen. Samen met RISC zorgt miRNA of siRNA ofwel voor degradatie ofwel voor translationele repressie van mRNA, afhankelijk van de graad van complementariteit. ORF: open reading frame [23].

8

4. Functie van miRNA in normale ontwikkeling en pathologie Sinds de ontdekking van lin-4 en let-7 is het duidelijk geworden dat miRNAs een essentiële rol hebben in zowel de normale ontwikkeling als in verschillende pathologieën. MiRNAs zijn van belang bij o.a. de stamceldifferentiatie, hart- en skeletspierontwikkeling, ontwikkeling van het zenuwstelsel en hematopoiesis. Ze zijn eveneens betrokken in verschillende fysiologische processen zoals insulinesecretie, cholesterol metabolisme, immuunreacties en hartziekten [24]. Onderbreking van de miRNA-doelwitinteractie door single-nucleotide polymorfismen (SNPs) in het miRNA-gen of in de 3’UTR regio van het doelwit mRNA kan resulteren in overexpressie of verlies van de miRNA functie, wat dus kan leiden tot ziekte. Dit is reeds aangetoond bij het Tourette syndroom [25]. MiRNAs blijken ook een rol te hebben in carcinogenese. Dit kan door verminderde miRNA expressie in kankerweefsel in vergelijking met normaal weefsel. Overexpressie van miRNA-genen kunnen ook tumorsupressorgenen onderdrukken. En mutaties in miRNAs kunnen proto-oncogene mRNAs overactiveren. Dit werd onderzocht bij chronische lymfatische leukemie (CLL) [24]. Deze masterproef vat de gekende miRNAs die differentieel tot expressie komen in huidziekten samen. Eerst wordt de betrokkenheid van miRNAs in de normale morfogenese van de huid verduidelijkt. Daarna wordt de link gelegd tussen miRNAs en de pathogenese van verscheidene huidziekten zoals psoriasis. Naar de rol van miRNA in huidkanker is er reeds veel onderzoek verricht. Aangezien dit niet de focus van deze verhandeling is, wordt deze topic niet in detail besproken.

9

VI METHODOLOGIE Na een verkennend gesprek met Dr. M. Van Gele omtrent het onderwerp werd er gezocht naar specifieke artikels in zoekmachines zoals Pubmed, Google Scholar en ISI Web of Science. Volgende trefwoorden werden gecombineerd: microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), skin, cutaneous disease. Om meer over het onderwerp te weten te komen werden eerst enkel de reviews bekeken, via de functie see reviews. Bij de zoektermen “MicroRNA” AND “skin” werden er in Pubmed 94 artikels bekomen. Na het instellen van de limiet ‘published in the last 5 years’ verschenen er 92 artikels. Dit bevestigt dat onderzoek omtrent miRNAs in de huid nog volop bezig is. Dit was ook de reden waarom er beslist werd om een e-mail update in te stellen via Pubmed. Zo bleef ik via email op de hoogte van recente onderzoeken i.v.m. miRNAs. Na het lezen van enkele algemene artikels over miRNAs en de huid werd duidelijk bij welke huidziekten miRNAs betrokken zijn. Volgende zoektermen werden bekomen: psoriasis, skin inflammation, wound healing, skin morphogenesis, atopic dermatitis, lupus erythematosus, Kaposi sarcoma, squamous cell carcinoma, malignant melanoma, etc. Ook werd duidelijk welke specifieke miRNAs bij welke ziekte voorkomen; vb: miR-203 bij psoriasis. Zo werd het onderzoek specifieker verder gezet. Via het toepassen van het sneeuwbaleffect (raadplegen van literatuurreferenties in bestaande artikels) werden er vervolgens steeds meer artikels bijgevonden. Daarnaast werden e-mails gestuurd naar de auteurs van artikels waarvan enkel het abstract ter beschikking stond. Op deze manier werden een viertal artikels verkregen. Een drietal recente artikels die eveneens niet elektronisch beschikbaar waren, vond ik in de tijdschriften die aanwezig waren in de dermatologiebibliotheek op het UZ. Ook de zoekmachine Google Books werd geraadpleegd, vooral om de biogenese van miRNA en siRNA te verhelderen. Om op een correcte manier te refereren werd het programma Endnote gebruikt. Elk artikel die aanleunde bij het onderwerp van deze masterproef werd dan ook meteen in dit programma geïmporteerd. Na het vastleggen van een algemene indeling van deze masterproef werd er per onderwerp nog verder specifiek opzoekingswerk verricht tijdens het schrijven.

10

VII RESULTATEN 1. MiRNAs in de normale huid 1.1. Structuur en functie van de huid De huid is het grootste orgaan van het lichaam, zowel in gewicht (16% van het lichaamsgewicht) als in oppervlakte (1,8 m2). De huid bestaat uit 3 lagen: epidermis (opperhuid), dermis (cutis) en hypodermis (subcutis) [26]. De epidermis is een meerlagig verhoornd epitheel die in staat is tot zelfvernieuwing zowel bij homeostase als bij verwonding, door de aanwezigheid van mitotisch actieve cellen in haarfollikels en in de binnenste basale laag [27]. De epidermis bestaat voornamelijk uit keratinocyten waartussen melanocyten, Langerhanscellen en Merkelcellen liggen. De dermis bevat collageen- en elastinevezels in een grondstof of matrix. De cellen die zich in de dermis bevinden zijn fibroblasten, mastcellen, macrofagen en lymfocyten. Deze laatste 2 spelen een belangrijke rol in de immunologische afweer. In de hypodermis tenslotte bevinden zich vetkwabjes door bindweefselsepta van elkaar gescheiden [26] (figuur 5).

De epidermis is afkomstig van het embryonaal ectoderm. Op dag 17.5 in de embryonale ontwikkeling (E17.5) is bij de muis de epidermis volledig gedifferentieerd. De huidaanhangsels zijn haren, nagels, talg- en zweetklieren. Haarfollikels ontstaan foetaal als instulpingen van de primitieve epidermis en ontwikkelen zich in de richting van de dermis. Ze groeien net zoals de epidermis gedurende de volledige levensduur van de mens [28]. De haarfollikel heeft een complexe structuur met meer dan twintig verschillende celtypes verdeeld in zes hoofdcompartimenten; de bindweefsel schede, de dermale papil, uitwendige haarschede, inwendige haarschede, haarschacht en de sebumklier [29]. Daarenboven heeft de haarfollikel een reservoir van pluripotente stamcellen, gelegen in een gebied dat de bulge wordt genoemd, die ook de epidermis kunnen regenereren [30] (figuur 5).

11

Figuur 5: Anatomie van de huid [31].

De rol van de huid is niet enkel de bescherming van de interne organen maar daarnaast ook UV-protectie, het vormen van een epidermale barrière, thermoregulatie, zweten, lubrificatie, pijnsensatie en gevoel, pigmentatie en de synthese van vitamine D. De huid maakt eveneens deel uit van het immunologisch stelsel [32]. De barrièrefunctie van de huid is van uiterst belang in het behoud van het milieu intérieur. Ionen en vocht kunnen het lichaam niet ongecontroleerd uit. Dit werd geïllustreerd bij transgene dieren met barrièredefecten die kort na de geboorte stierven door transepidermaal waterverlies [33]. Een andere illustratie is de dodelijke situatie van uitgebreide brandwonden.

12

1.2. MiRNAs en de ontwikkeling van de huid Vooraleer over te gaan tot de rol van miRNAs bij huidziekten, wordt deze eerst beschreven in de normale huid. Twee onafhankelijke groepen Yi et al. en Andl et al. toonden aan dat muizen met epidermis-specifieke deleties van Dicer niet te onderscheiden zijn van de controlegroep bij de geboorte, maar kort na de geboorte verliezen ze gewicht en sterven uiteindelijk zonder het ontwikkelen van een vacht [34, 35] (figuur 6).

Figuur 6: Dicer-deficiënte muis (mutant) op de zevende dag postnataal (P7) vergeleken met een normale controlemuis [35].

Histologisch onderzoek onthulde dat haarfollikels (HF) van de pasgeboren Dicer-deficiënte muizen onderontwikkeld waren en in plaats van te invagineren in de dermis, stulpten ze uit in de epidermis. Een paar dagen later werden deze bedekt door epitheelcellen wat resulteerde in de vorming van haarcysten [34, 35] (figuur 7).

Figuur 7: Histologische analyse van de huid van een muis met deficiënte expressie van Dicer op de zevende dag postnataal P7 (rechts) vergeleken met de huid van een normale muis op hetzelfde tijdstip (links). De histologische coupe rechts toont een abnormale HF met de vorming van cysten (gele pijl) [35].

Deze abnormale ontwikkelingen van de HF zijn gerelateerd aan het verlies van folliculaire stamcellen. Dit was namelijk te zien door een tekort aan stamcelmerkers, zoals K15 en CD34, in de bulge [35]. In 13

tegenstelling tot de verstoorde HF-morfogenese, bleek wel dat de epidermale haarcysten alle componenten van een mature haarfollikel bevatten in een concentrisch patroon; haarschacht, inwendige haarschede en dermale papilcellen in het midden. Ook de interfolliculaire epidermis van Dicer-deficiënte muizen bleef grotendeels onaangetast met behoud van een normale differentiatie. De bevindingen van Yi et al. en Andl et al. geven weer dat zeker enkele miRNAs (of hun doelwit genen) specifiek zijn voor stamcellen van de HF maar niet voor die van de interfolliculaire epidermis [34, 35]. Desondanks zorgt de folliculaire evaginatie voor een storing in de epidermale barrièrefunctie. Dit verklaart de dehydratatie en vroege sterfte van de Dicer-deficiënte muizen [34]. Omdat Dicer naast miRNAs ook betrokken is bij ander klassen van kleine RNAs, werden dezelfde onderzoeken gedaan maar nu met epidermis-specifieke deletie van Dgcr8. Dgcr8 is een cofactor van Drosha in de biogenese van miRNAs. Deze muizen hadden hetzelfde fenotype als de Dicer-deficiënte muizen; inclusief neonatale sterfte, gedehydrateerde huid en de aanwezigheid van haarcysten [36]. Dit bevestigt de betrokkenheid van miRNAs bij de ontwikkeling van de huid.

1.2.1. Expressie van individuele miRNAs in de huid Om de functies van deze nieuwe klasse regulatoren te begrijpen, is het van belang hun expressiepatronen te onderzoeken. In tegenstelling tot mRNAs die coderen voor proteïnen, zijn mature miRNAs klein, ongeveer 21 tot 25 nucleotiden lang, en hebben ze geen 5’cap en 3’Poly-A-staart. Daarom werden verschillende methoden ontwikkeld om de expressiepatronen van miRNAs in kaart te brengen. Dergelijke differentiële expressieanalyses zijn gebaseerd op één of meerdere methoden zoals moleculair klonen, sequencing, microarrays, polymerase chain reaction (PCR), in situ hybridisatie en Northern blot [37]. Verschillende miRNAs met een specifieke functie in de huid, werden aangetoond [37, 38]. Yi et al. isoleerden en kloonden een groot aantal miRNAs afkomstig van E17.5 epidermis en van HF [34]. Andle et al. behaalden dezelfde resultaten met een andere techniek, namelijk microarray-analyse [35]. MiR-203 werd in epidermale en folliculaire fracties gevonden in de hierboven vermelde studies van Yi en Andl [34, 35]. In een andere studie was miR-203 nauwelijks detecteerbaar in E13.5 huid (wanneer het nog een éénlagig epitheel is), maar bleek dan wel één van de meest voorkomende miRNAs te zijn na E15.5 (op dit moment begint de stratificatie). Dit suggereert dat de expressie van miR-203 geïnduceerd wordt tijdens de differentiatie en stratificatie van de huid [39]. Uit in situ hybridisatie van de volgroeide huid bleek dat miR-203 alleen in gedifferentieerde cellen tot expressie kwam zoals die van de suprabasale epidermis of die van de inwendige haarschede van de HF, maar niet in de voorlopercellen zoals in de basale epidermis, in de bulge van de HF of in de matrix van de HF [39]. Interessant is dat dit ook werd aangetoond in menselijke huid. Men vond een verminderde aanwezigheid van miR-203 in de buitenste 14

lagen van de huid [40]. Door gebruik van bio-informatica werd aangetoond dat miR-203 rechtstreeks de expressie van p63 onderdrukt, wat er voor zorgt dat cellen in de basale laag de celcyclus verlaten en overgaan naar de suprabasale laag [39, 41]. De transcriptiefactor p63 is een essentiële regulator van het behoud van stamcellen in meerlagige epithelen [42]. Naast miR-203 hebben ook miR-31 (controle in de haarcyclus) [43] en miR-125 (repressie van stamceldifferentiatie) [44] een belangrijke functie in de huid. In een andere publicatie bespreken Hildebrand en collega’s negen extra miRNAs die tot expressie komen tijdens de differentiatie van de huid, namelijk miR-23b, miR-95, miR-210, miR-224, miR-26a, miR-200a, miR-27b, miR-328 en miR376a [45].

1.3. Wondherstel Het herstel van de huid is een fysiologisch proces wat ruim ingedeeld kan worden in 3 overlappende fasen. De inflammatoire fase (hemostase en inflammatie), de proliferatiefase (angiogenese en vorming van granulatieweefsel en collageen) en de maturatiefase (collageenformaties vestigen zich zelfs maanden nadat de wonde gesloten is). Inductie van expressie en/of repressie van deze processen zijn sleutelmechanismen van het regeneratieproces. MiRNAs spelen meer en meer een belangrijke rol in het proces van de wondheling. Er is recent veel vooruitgang geboekt in het begrijpen van de genetische basis van wondherstel. Veel informatie is verkregen door microarray-studies die de verschillende onderdelen van het wondhelingsproces hebben ontleed. Tijdens het proces van wondheling zijn er veranderingen in de expressie van specifieke miRNAs. Afwijkende regulatie van deze miRNAs kunnen leiden tot abnormale wondheling [46].

1.3.1. De rol van miRNAs in de inflammatoire fase De inflammatoire respons begint met het passief lekken van neutrofielen en andere leukocyten door beschadigde bloedvaten in de wonde. Dit wordt gevolgd door vrijlating van cytokines zoals plateletderived growth factor (PDGF) [47]. Deze cytokines regelen o.a. de angiogenese. Vorming van nieuwe bloedvaten is essentieel voor de regeneratie van het weefsel. Slechte angiogenese kan een oorzaak zijn van chronische wonden. Dit is het geval bij wonden van diabetespatiënten [48]. MiRNAs spelen een rol bij de angiogenese. Wanneer men namelijk Dicer en Drosha uitschakelt, wordt de vorming van nieuwe bloedvaten verhinderd [49, 50]. Zo kan een afwijkende regulatie van miRNAs resulteren in een abnormale heling van chronische wonden [46].

15

1.3.2. De rol van miRNAs in de proliferatieve fase Een belangrijk aspect in deze fase is de re-epithelialisatie. Dit gebeurt door migratie en proliferatie van keratinocyten vanaf de wondranden [51]. MiR-210 beïnvloedt deze keratinocytenproliferatie sterk en heeft op die manier een invloed op de wondheling. MiR-210 behoort tot de ‘hypoxamiRs’. Dit zijn miRNAs die geïnduceerd worden in zuurstofarme situaties. In een wonde hebben deze hypoxamiRs via hun doelwitgenen een negatief effect op de heling. Bijvoorbeeld een inductie van de expressie van miR-210 zorgt voor silencing van het doelwitgen E2F3, wat een belangrijke regulator van celproliferatie is [52, 53].

1.3.3. De rol van miRNAs in de maturatiefase Afzetting van collageen is een belangrijk aspect van deze fase. Een ideale wondheling is deze zonder littekenvorming. MiR-29b en miR-29c onderdrukken verschillende proteïnen van de extracellulaire matrix (ECM), antifibrotic transforming growth factor β (TGF-β) en andere eiwitten die betrokken zijn in pathways die van belang zijn voor littekenvrij wondherstel. Dit werd onderzocht in de maturatiefase na een acuut myocardinfarct, waar littekenvorming nefast is voor de hartcontractiliteit. Deze bevindingen zouden geëxtrapoleerd kunnen worden naar andere aandoeningen met weefselfibrose [54] Samengevat, spelen miRNAs een rol in de regulatie van vele factoren betrokken bij de wondheling. Dit is veelbelovend voor een eventuele nieuwe therapeutische aanpak van bijvoorbeeld chronische wonden.

16

2. Auto-immune huidaandoeningen 2.1. Psoriasis 2.1.1. Inleiding Psoriasis is een chronische, niet-infectieuze, inflammatoire huidziekte die gekenmerkt wordt door intense proliferatie en abnormale differentiatie van keratinocyten. De ziekte komt voor bij ongeveer 1,5 tot 3 % van de Westerse populatie uit Noord-Europa en Scandinavië, maar is minder frequent in China en Afrika. De incidentie bij man en vrouw is ongeveer gelijk. Psoriasis kan op elke leeftijd ontstaan, zelfs bij ouderen. De gemiddelde leeftijd van aanvang wordt geschat op 33 jaar [55]. Psoriasis vulgaris, de meest voorkomende vorm, wordt gekenmerkt door rode plaques die bedekt zijn door zilverkleurige schilfers. Het komt klassiek voor op bepaalde plaatsen zoals ellebogen, knieën en hoofdhuid. Het kan gelokaliseerd blijven of uitbreiden na verloop van tijd (Figuur 8). Psoriasis guttate is een acute eruptie van kleine verspreide papels, meestal op de romp en ledematen. Deze vorm is mogelijks gelinkt aan een streptokokkeninfectie. Deze vorm is zelflimiterend maar een verhoogd risico om later klassieke psoriasis plaques te ontwikkelen is gekend. Psoriasis inversa tast de oksel, submammaire area’s en liezen aan. De huid is rood en glimmend, maar schilfert niet af. Deze vorm komt vooral voor bij ouderen [55-57].

Figuur 8: Psoriasis vulgaris: Typische erythematosquameuze plaque [58].

17

De precieze oorzaak van psoriasis is grotendeels onbekend, maar verschillende genetische, omgevings- en immunologische factoren dragen bij tot het ontstaan van de ziekte. De incidentie van psoriasis is groter bij eerstegraads verwanten dan bij tweedegraads verwanten van patiënten. Dat genetische factoren hiervoor verantwoordelijk kunnen zijn, wordt ook gesuggereerd door tweelingenstudies die aantonen dat het risico op psoriasis twee tot drie keer hoger is bij monozygote tweelingen dan bij dizygote tweelingen. Genetisch onderzoek heeft al verschillende chromosomale loci geïdentificeerd die geassocieerd zijn met een verhoogde kans op psoriasis; waaronder PSORS1 tot PSORS9. Het belangrijkste gen blijkt het HLA-Cw9 gen te zijn. Dit gen ligt in de PSOR-1 regio in het major histocompatibility complex (MHC) op chromosoom 6p en komt voor bij ongeveer 35-50% van de psoriasispatiënten. Andere genen met een relevante immunologische functie die door genetisch onderzoek ontdekt werden, zijn: IL23R, IL12B, IL23A, IL4/IL13, TNFAIP3 en TNIP1. Daarnaast zijn er zijn nog lopende studies die bijkomende loci aan het licht brengen [59, 60]. Er zijn ook enkele uitlokkende factoren die een rol spelen bij psoriasis. Zo is er het Koebner fenomeen: trauma aan de epidermis en dermis, zoals een wondje of chirurgisch litteken, kan psoriasis uitlokken in de beschadigde huid. Psoriasis kan ook ontstaan na een infectie, zoals een streptokokkenkeelontsteking. Daarnaast zijn ook sommige medicijnen beschreven als uitlokkende factor, zoals bètablokkers, lithium en antimalariapillen. Stress, sigaretten en alcohol zijn eveneens nefast omdat ze de conditie verergeren [61, 62]. Een verstoord immuunsysteem speelt een functionele rol bij psoriasis. Een verhoogd aantal immuuncellen wordt gevonden in psoriasislaesies. Er is een verhoogde productie van dendritische cellen en Tlymfocyten, die migreren van de dermis naar de epidermis. Daar hechten ze zich vast door α1β1 integrin; een signaalmolecule in het collageen. In de epidermis stimuleren deze dendritische cellen en T-lymfocyten de keratinocyten tot proliferatie o.a. door secretie van interferon-γ, IL-17 en Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α). Psoriasiskeratinocyten secreteren antimicrobiële peptiden TNF-α, IL1, IL6. Deze activeren op zich meerdere inflammatoire cellen. Dus pro-inflammatoire cytokines leiden tot een abnormale activatie en proliferatie van keratinocyten, die na activatie ook cytokines gaan produceren. Zo is er dus een vicieuze cirkel van ontsteking in de huid [60]. Waar de T-cellen en dendritische cellen op afkomen in een psoriasislaesie is nog onbekend. We kunnen dus niet spreken van een echte auto-immuunziekte aangezien een lichaamseigen antigeen nog niet is aangetoond. Psoriasis behoort wel tot de ‘immune-mediated inflammatory disorders’ (IMID).

18

2.1.2. De rol van miRNAs in psoriasis Reeds verschillende studies toonden aan dat de deregulatie van miRNAs betrokken is in de pathogenese van psoriasis. Een eerste belangrijke studie werd in 2007 gepubliceerd door Sonkoly et al. [63]. Met behulp van microarray-analyse toonden ze aan dat psoriasishuid een specifiek miRNA-expressieprofiel heeft. Sommige miRNAs hebben een verhoogde of verlaagde expressie na vergelijking met gezonde huid of huid met atopisch eczeem (een andere chronisch inflammatoire huidziekte) (figuur 9). De resultaten werden nadien bevestigd door een real-time PCR analyse. In deze studie kwam men tot de bevindingen dat miR-203, miR-146, miR-21 en miR-125b differentieel tot expressie worden gebracht in psoriasishuid.

Figuur 9: MiRNA-expressieprofiel van psoriasis, atopisch eczeem en gezonde huid. MiRNA-array vergelijking van huidbiopten van 4 gezonde individuen (healty = H), laesiebiopten van 3 patiënten met psoriasis (PSO) en 3 patiënten met atopisch eczeem (AE). Rood staat voor de hoogste expressiewaarde en fel groen voor de laagste. De gennamen zijn rechts opgelijst [63].

19

MiR-203 toont een verhoogd expressieprofiel bij psoriasishuid in vergelijking met de huid van gezonde personen of met de huid van personen met atopische dermatitis. Het wordt uitsluitend tot expressie gebracht door keratinocyten, we spreken van een keratinocyt-specifiek miRNA. Deze opregulatie is gelinkt met een neerregulatie van ‘suppressor of cytokine signalling-3’ (SOCS-3). SOCS-3 is een enzym betrokken bij inflammatoire processen en de functies van keratinocyten (figuur 10). Het is niet waarschijnlijk dat de functie van miR-203 in psoriasis enkel het resultaat is van de suppressie van dit enzym. Meerdere targetgenen van dit miRNA kunnen een rol spelen [63].

Figuur 10: SOCS-3 is een mogelijk moleculair

doelwit

van

de

posttranscriptionele repressie van miR-203. In situ hybridisatie toont de verhoogde expressie van miR-203 aan in de epidermis van psoriasishuid en parallel daarmee het verlies van het SOCS-3-eiwit [63].

Ook miR-146a komt verhoogd tot expressie in psoriasislaesies, maar niet in huidletsels van atopische dermatitis, in vergelijking met normale huid. MiR-146a wordt tot expressie gebracht door immuuncellen en beïnvloed de functie van T-lymfocyten in psoriasishuid. Het inhibeert de eiwitten IRAK-1 en TRAF-6; dit zijn regulatoren van de TNF-α-pathway [63]. Dus zowel miR-146 als miR-203 spelen een specifieke rol bij psoriasis maar niet algemeen bij huidinflammatie (zoals atopisch eczeem). Een derde miRNA die opgereguleerd is bij psoriasis is miR-21. En dit is, in tegenstelling tot de vorige twee miRNAs, het geval bij zowel psoriasis als atopisch eczeem versus normale huid. MiR-21 wordt tot expressie gebracht door zowel structurele huidcellen (keratinocyten, fibroblasten en melanocyten) als inflammatoire cellen [63].

20

Tenslotte werd ook een miRNA aangetoond die verlaagd tot expressie komt; miR-125b. Dit zowel bij psoriasis als bij atopisch eczeem versus normale huid. Dit miRNA wordt tot expressie gebracht door structuurcellen [63]. MiR-125b is net zoals miR-146a geassocieerd met de TNF-α-productie. Het zorgt voor directe posttranscriptionele repressie van TNF-α. Een verlaagde expressie van dit miRNA zorgt dus voor een gestegen productie van TNF-α [64, 65]. In psoriasis is een verstoring van de TNF-α-pathway een essentieel element in de pathologie, dit blijkt uit het succes van TNF-α-blokkers in de behandeling van psoriasis. Bovenstaande pionierstudie werd op basis van recente onderzoeken i.v.m. miRNAs betrokken bij psoriasis verder aangevuld. Lerman et al. onderzochten in 2011 de expressie van miRNAs in de huid van normale individuen versus aangetaste en niet-aangetaste huid van psoriasispatiënten. Hierbij vonden ze eveneens verhoogde expressie van miR-203 in een psoriasislaesie, zoals in de hierboven besproken studie. Maar onverwacht vonden ze een verminderde expressie van miR-203 in niet-aangetaste huid van een psoriasispatiënt. Dit zou kunnen betekenen dat de neerregulatie van miR-203 in niet-aangetaste psorasishuid, keratinocyten aanzet tot hyperproliferatie [66]. Verder onderzoek is nodig om deze hypothese te bevestigen. In een recente studie werd nogmaals miR-125b onder de loep genomen. De bovenstaande resultaten van Sonkoly et al. uit 2007 werden bevestigd. Daarenboven onderzocht men de functie en de potentiele rol van dit miRNA in psoriasis. MiR-125b is een negatieve regulator van keratinocytenproliferatie en een positieve regulator van keratinocytendifferentiatie. Zijn doelwitgen is ‘fibroblast growth factor receptor-2’ (FGFR-2), een receptor die tot overexpressie komt in de huid bij psoriasis. Dus een neerregulatie van miR-125b in psoriasis leidt tot hyperproliferatie en een verstoorde differentiatie [67]. Daarnaast werd ook de interactie van miR-221 en miR-222 met ‘tissue inhibitor of metalloprotease 3’ (TIMP3) onderzocht. In vitro overexpressie van miR-221 en miR-222 leidde tot degradatie van het mRNA TIMP3 in keratinocyten wat resulteerde in een lager TIMP3-eiwitniveau [68]. Ook miR-205 kwam significant verhoogd tot expressie in een psoriasislaesie, dit in vergelijking met nietaangetaste huid van diezelfde patiënt of huid van een gezond individu [68]. Een ander aan psoriasis gerelateerd miRNA die aan het licht kwam is miR-99a. Het is betrokken in de differentiatie van keratinocyten via regulatie van ‘insuline-like growth factor 1 receptor’ (IGF-1R). MiR99a is neergereguleerd in psoriasis, en dit leidt tot een stijging van IGF-1R waardoor de keratinocyten prolifereren. Als fysiologische respons is er een verhoogde expressie van miR-99a wat resulteert in verminderde keratinocytproliferatie en verhoogde differentiatie. Men suggereert met deze resultaten dat er 21

coregulatie is van miR-99a en IGF-1R. Ze functioneren samen om de balans te behouden tussen de proliferatie en differentiatie van keratinocyten [66] (figuur 11).

Figuur 11: Voorgesteld model die de relatie weergeeft tussen miR-99a en IGF-1R [66].

In eerste instantie werden miRNAs enkel uit weefsel geïsoleerd. Recent werden ook miRNAs onderzocht in het serum van psoriasispatiënten. MiR-424 komt verlaagd tot expressie in psoriasishuid in vivo. Ook de serumconcentratie leek gedaald, hoewel niet significant, bij patiënten met psoriasis in vergelijking met gezonde controles. Het voorspelde doelwitgen van miR-424 is ‘mitogen-activated proteïne kinase 1’ (MEK1). Dit resulteert in keratinocytenhyperproliferatie [69]. Patiënten met gedaalde expressie van miR-424 in het serum hebben ernstiger symptomen. De expressie van miR-424 in het serum van psoriasispatiënten zou mogelijks een ziektemerker kunnen zijn die de proliferatieactiviteit van de keratinocyt weerspiegelt [69]. De expressie van miR-1266 in het serum van psoriasispatiënten werd eveneens onderzocht. IL-17 is gestegen in letsels en serum van psoriasispatiënten [70]. IL-17 is hoofdzakelijk verantwoordelijk voor de activatie van neutrofielen en de stimulatie van keratinocyten om cytokines te secreteren. Dit zorgt voor inflammatie. Het onderliggend mechanisme voor deze IL-17 stijging is nog onduidelijk. Men dacht dat miRNAs hiervoor verantwoordelijk konden zijn. Via TargetScan, een database die doelwitgenen van miRNAs voorspelt (versie 5.1, http://www.targetscan.org/), werd de focus gelegd op miR-1266 als één van de regulatoren van IL-17 [71]. Een daling van miR-1266 werd dus verwacht, met een inductie van IL17 als gevolg. Integendeel, men zag een verhoogde expressie van miR-1266. IL-17 is dus hoogst waarschijnlijk geen direct doelwitgen van dit miRNA. Om miR-1266 in het serum van psoriasispatiënten als potentiele ziektemerker te gebruiken, is verder onderzoek naar zijn doelwitmoleculen nodig [72].

22

De expressie van miRNAs kan ook bekeken worden vanuit de verschillende processen die betrokken zijn in de pathogenese van psoriasis [73]. Bijvoorbeeld miR-21, miR-31 en miR-378, die verhoogd tot expressie komen in psoriasishuid, hebben een invloed op de angiogenese. Want deze ‘angiomiRs’ hebben als doelwit negatieve regulatoren in de angiogenese signaaltransductieweg [74]. Dit is interessant aangezien er bij psoriasis een neiging is tot neovascularisatie. Daarnaast zijn miR135b, miR-205 en miR203 betrokken bij de epidermale differentiatie. En miR-142 speelt een rol bij inflammatie [73]. Het is duidelijk dat vele miRNAs bijdragen tot de pathogenese van psoriasis. Deze miRNAs kunnen potentiële targets zijn in de therapie van psoriasis. Tabel 2: Enkele miRNAs betrokken bij psoriasis.

miRNA

Level

Gevolg

Potentieel doelwitgen

Referentie

miR-203

↑

Keratinocytenproliferatie

SOCS-3

[63]

miR-146

↑

TNF-α ↑

IRAK-1, TRAF-6

[63]

miR-21

↑

/

/

[63]

miR-125b

↓

Keratinocytenproliferatie

FGFR2

[67]

miR-221/222

↑

Reductie van TIMP3

TIMP3

[68]

miR-99a

↓

Keratinocytenproliferatie

IGF-1R

[66]

miR-424

↓

Keratinocytenproliferatie

MEK1

[69]

miR-21/31/378

↑

Neo-angiogenese

/

[73]

23

2.2. Atopisch eczeem Atopisch eczeem of atopische dermatitis is een vaak voorkomende chronische huidaandoening. Kenmerkend is de activatie van T-cellen en daarmee samenhangend de activatie van inflammatoire cytokines. De aandoening uit zich door jeukende, rode, droge huid en heeft een grote impact op de kwaliteit van leven. Bij kinderen is het vaak een eerste symptoom van allergie dat zich dan later kan uiten als allergische rhinitis en/of astma [75]. Het ziektebeeld heeft enkele gemeenschappelijke kenmerken met psoriasis, zoals de immunologische factoren en de centrale rol van keratinocyten. De pathogenese van atopisch eczeem en psoriasis is toch verschillend. Een defecte huidbarrière kan het ziekteproces inzetten [76]. Figuur 11: Atopisch eczeem [77]

2.2.1. De rol van miRNAs in atopisch eczeem MiR-125b komt, net zoals bij psoriasis, verlaagd tot expressie in de huid met atopisch eczeem en is in verband gebracht met de regulatie van de TNF-α-pathway [63, 65]. Recent werd miR-155 bij deze aandoening onderzocht. Dit miRNA komt tot overexpressie in CD4+ Tcellen van patiënten met atopisch eczeem. Deze overexpressie zou leiden tot een onderdrukking van ‘cytotoxic T lymphocyte-asscociated antigen’ (CTLA-4), een belangrijke regulator bij de balans van de immuunrespons. Dus een verhoogde expressie van miR-155 onderdrukt CTLA-4 wat resulteert in een toegenomen proliferatie [63, 78]. Tabel 3: MiRNA bestrokken bij atopisch eczeem

miRNA

Level

Gevolg

Potentieel doelwitgen

Referentie

miR-155

↑

Celproliferatie

CTLA-4

[78]

24

3. Huidkanker 3.1. Inleiding Huidkanker is een vaak voorkomende vorm van kanker in België. Het is de tiende meest frequente tumor bij mannen en de vijfde meest frequente tumor bij vrouwen. Er zijn drie grote types van huidkanker. In 75% van de gevallen gaat het om een basocellulair carcinoom en in 13% van de gevallen gaat het om een spinocellulair carcinoom (SCC = squamous cell carcinoma). Beide zijn afkomstig van epitheelcellen. Melanomen, 10% van de huidkankers, ontstaan uit melanocyten. Daarnaast komen er in 2% van de gevallen ook nog zeldzame huidtumoren voor, zoals sarcomen. De afgelopen jaren werd er een sterke stijging van het aantal gevallen van huidkanker gezien. Recente bevindingen wijzen op een mogelijke verdubbeling van de incidentie elke tien tot twintig jaar. In Nederland spreekt men van een ware ‘huidkankerepidemie’. Deze stijging van het aantal diagnosen wordt deels veroorzaakt door een toegenomen neiging tot histologische bevestiging van de klinische diagnose en dus betere registratie. Aangezien huidtumoren vooral bij ouderen voorkomen, zal ook de vergrijzing een rol spelen. Daarnaast is er ook een verandering in zon- en reisgedrag [79-81].

A.

B.

C.

Figuur 12: A: basocellulair carcinoom [82], B: spinocellulair carcinoom [83] en C: maligne melanoom [83].

Zoals eerder beschreven spelen miRNAs een essentiële rol in de morfogenese van de huid en de haarfollikels. Het is dus niet verwonderlijk dat een verstoring van de expressie van miRNAs gezien kan worden in verscheidene maligne huidletsels. Sommige miRNAs die instaan voor een negatieve regulatie van oncoproteïnen komen verminderd tot expressie terwijl andere miRNAs die het mRNA van tumorsuppressors als doelwit hebben, verhoogd tot expressie komen. Deze miRNAs worden respectievelijk ‘tumorsuppressor-miRNAs’ en ‘oncogene miRNAs’ (‘oncomiRs’) genoemd [84]. Voorlopig werd de betrokkenheid van miRNAs vooral bij het maligne melanoom, de meest agressieve vorm van huidkanker, bestudeerd. 25

3.2. Maligne melanoom Reeds vele studies omtrent de differentiële expressie van miRNAs bij melanoom werden uitgevoerd. Initiële data van miRNA-expressie in melanoom dateren uit 2005. Hierin onderzochten Lu et al. de expressie van miRNAs in stalen afkomstig van tumorweefsel van verschillende soorten kankers. Stalen met normale melanocyten werden echter niet onderzocht. De differentiële expressie van miRNAs in melanoomcellen in vergelijking met gezonde cellen kon hieruit dus niet vastgesteld worden [85]. In de daaropvolgende jaren werd er verder informatie gepubliceerd omtrent miRNAs en melanoom, eveneens in studies die weefsels van verschillende types kanker analyseerden [86, 87]. In 2008 werd voor het eerst een link gelegd tussen de gedereguleerde expressie van een specifiek miRNA en zijn functie in de oncogenese van een melanoom [88]. Verhoogde expressie van miR-137 onderdrukt ‘microphtalmia-associated transcription factor’ (MITF). Dit is een belangrijke regulator bij de ontwikkeling, maturatie, apoptose en pigmentatie van melanocyten. Inductie van MITF, zoals bij UVblootstelling, zou onze huid beschermen tegen DNA-schade [89]. Ook miR-182 heeft MITF als doelwit. Verhoogde expressie van dit miRNA in melanoom is geassocieerd met invasie, en dus verhoogd risico op metastasen [90]. Het valt echter buiten het bestek van deze review om de expressie van alle miRNAs die betrokken zijn bij melanoom uitvoerig te bespreken. Wel worden enkele van deze miRNAs en hun doelwitgenen samengevat in tabel 4. Recente ontwikkelingen in het domein van miRNAs en melanoom zijn het bepalen van een miRNAprofiel. Hierbij zou de expressie van bepaalde sets van miRNAs de prognose bepalen. Deze miRNAprofielen kunnen van belang zijn als klinisch relevante biomerker van de prognose in gemetastaseerde melanomen. Dit zou de standaardcriteria van stagering kunnen verbeteren [91]. Deze miRNA-signatures worden niet enkel gevonden in kankerweefsel maar ook in bloed. De detectie van miRNAs in bloed, biedt vooruitzichten voor een niet-invasieve biomerker voor de prognose van maligne melanoom [92]. Er is een goeie kans op herstel van patiënten met melanoom wanneer het primaire letsel vroeg gedetecteerd wordt. Maar er ontbreekt een goede therapeutische aanpak eens het melanoom vergevorderd is. MiRNAs zouden als moleculaire merkers, in aanvulling op het huidige morfologische systeem van stagering, hoogst waarschijnlijk nuttig zijn voor de identificatie van patiënten met een hoog risico op het ontwikkelen van een melanoom.

26

Tabel 4: Enkele miRNAs betrokken bij melanoom.

miRNA

Level

Gevolg

Potentieel doelwitgen

Referentie

miR-137

↑

Neerregulatie van MITF

MITF

[88]

miR-182

↑

Migratie en metastase

MITF, FOXO3

[90]

miR-221/222

↑

Celproliferatie, migratie en invasie

P27, c-Kit receptor

[93]

Let-7a

↓

Invasie

Integrin β3

[94]

Let-7b

↓

Proliferatie

Cyclin D1, Bsg

[95, 96]

miR-196a

↓

Migratie

HOX-B7, HOX-C8

[97, 98]

miR-193b

↓

Proliferatie

Cyclin D1

[99]

miR-205

↓

Proliferatie

E2F1

[100]

3.3. Spinocellulair carcinoom In tegenstelling tot melanoom is nog heel weinig onderzoek verricht naar de betrokkenheid van miRNA bij de andere vormen van huidkanker. In een recent rapport werd gepubliceerd dat miR-21 en miR-184 verhoogd tot expressie komen in SCC, terwijl miR-203 verlaagd tot expressie komt [101]. De opregulatie van miR-184 werd ook aangetoond in het spinocellulair carcinoom van de tong. Dit miRNA zou celtransformatie en carcinogenese induceren [102]. MiR-203 is naast psoriasis ook betrokken bij celveroudering. Het is een antagonist van p63, een transcriptiefactor met een essentiële rol in het behoud van stamcellen. We verwachten dus een verhoogde expressie van miR-203 bij de oudere populatie [103]. Maar in SCC werd net een verlaagde expressie gevonden, en dus een verhoogde stamcelpopulatie en hogere proliferatieve capaciteit. Dit past bij de eigenschappen van SCC. Het is ook interessant dat UV-stralen de expressie van miRNAs kunnen veranderen. UVA verhoogt de expressie van miR-203, wat overeenkomt met de differentiatie en veroudering van keratinocyten na blootstelling aan de zon [101].

27

4. MiRNAs in diagnose en therapie Studies over de verschillende expressieniveaus van miRNAs bij bepaalde huidaandoeningen zijn klinisch van belang wanneer men miRNAs wil gebruiken voor diagnostische en therapeutische doeleinden.

4.1. MiRNAs als biomerker Zoals eerder vermeld kunnen miRNAs potentiële biomerkers zijn voor de prognose van psoriasis en melanoom. Door een profiel te maken van miRNA-expressieniveaus kan men de aandoening classificeren. Mogelijks kan op die manier de ziekteprogressie en prognose voorspeld worden aan de hand van specifieke miRNA-expressies. Recent is aangetoond dat miRNAs detecteerbaar zijn in bijna alle lichaamsexcreties zoals urine, faeces, speeksel, traanvocht, peritoneaal vocht, pleuravocht en vruchtwater [104-106]. miRNAs blijken relatief resistent te zijn tegen externe invloeden zoals enzymatische degradatie, vriezen en ontdooien of intense pH-condities [107, 108]. Deze stabiliteit is waarschijnlijk te danken omdat ze zich bevinden in lipiden- of lipoproteïnencomplexen [109]. Uit deze eigenschappen kan afgeleid worden dat miRNAs potentieel veelbelovende biomerkers zijn. De rol van miRNAs als biomerkers werd reeds aangetoond voor de prognose van melanoom. De signatuur van miRNAs in gemetastaseerd melanoomweefsel kan voorspellend zijn voor de overleving. Zo werd aangetoond dat patiënten met hogere expressieniveaus van een bepaalde set van miRNAs een langere overleving hebben [91]. Nu ook de expressie van miRNAs in het bloed kan gescreend worden, kunnen ze gebruikt worden als nietinvasieve biomerkers [92]. MiRNAs zijn stabiel en gemakkelijk detecteerbaar in serum en plasma, dit in contrast met andere circulerende nucleïnezuren Het is een voordeel dat een biopsie of een andere invasieve techniek op die manier niet nodig is. MiRNAs in het serum zouden in de toekomst de vingerafdruk van verschillende aandoeningen kunnen vormen. Vooraleer miRNAs in de praktijk gebruikt worden als biomerker, is verder gedetailleerd onderzoek nodig.

28

4.2. MiRNAs als therapie 4.2.1. Antagomirs Antagomirs zijn chemisch gemodificeerde enkelstrengige oligonucleotiden die gebruikt worden om miRNA te onderdrukken. Het zijn synthetische RNA-analogen die complementair zijn met specifieke miRNAs en deze vervolgens inhiberen. Het is nog onduidelijk hoe de onderdrukking van miRNAs precies werkt. Farmacologische silencing van miRNAs met behulp van antagomirs kan er voor zorgen dat de mRNA-doelwitgenen geen translationele repressie ondergaan. Dit effect kan gewenst zijn bij aandoeningen waarin bepaalde miRNAs opgereguleerd zijn of bij aandoeningen waarbij reductie van miRNAs een therapeutisch voordeel is. Sinds de ontdekking van RNAi, zit de antisense-technologie in een stroomversnelling [110, 111]. Het effect van antagomirs is langdurig. Eén van de eerste studies in vivo met antagomirs toonde aan dat wanneer antagomir-122 geïnjecteerd werd in de venen van de staart van een muis, er voor 23 dagen lang geen miR-122-levels detecteerbaar waren. Het fysiologisch effect was een daling van 44% van het plasmacholesterol. Een andere eigenschap is de brede biodistributie. Bij een muis behandeld met antagomir-16, waren overal levels van anatagomir-16 teruggevonden behalve in de hersenen. Antagomirs kunnen dus miRNAs onderdrukken in de meeste weefsels in vivo. Antagomirs werken specifiek. Vele miRNA-genen zijn dicht bij elkaar gelokaliseerd in een cluster. Deze polycistronische miRNA-genen resulteren in lange pri-miRNAs die dan later in de biogenese verder verwerkt worden tot mature miRNAs. Antagomirs die een polycistronisch miRNA als target hebben, blijven specifiek en hebben geen effect op de expressie van de andere miRNAs die in dezelfde cluster gelegen zijn [111]. Zoals eerder vermeld bij de wondheling heeft het hypoxamiR-210 een nadelige invloed op de proliferatieve fase van het wondherstel. Een reductie van miR-210 door een antagomir zou hier dus een potentiële therapie kunnen zijn voor een snellere wondheling [53]. Een ander voorbeeld van een antagomir die als therapie zou kunnen gebruikt worden bij huidziekten is antagomir-155. In vivo inhibitie van miR-155 door intraveneus toegediende antagomirs bij muizen, toont een vermindering van granulocyte-macrophagecolony stimulating factor (GM-CSF). GM-CSF is betrokken bij inflammatie [112]. Wat de rol is voor miR-155 in psoriasis, is nog niet gekend. Maar aangezien het een centrale rol speelt in de algemene immuunrespons en in rheumatoïde arthritis, zou de anatogmir-155 ook een gunstig effect kunnen hebben bij psoriasis. 29

Het stilleggen van oncomiRs door antagomirs vormt eveneens mogelijks een interessante toekomstige therapie. Er zijn nog geen gegevens over antagomirs in vivo toegediend in menselijke melanoomcellen. Wel werd er aangetoond dat antagomir-182, intraperitoneaal geïnjecteerd bij de muis, resulteert in verminderde metastasen voor de lever en de milt [113].

4.2.2. Mimics MiRNA-mimics (of mimetics) kunnen gebruikt worden bij aandoeningen waar miRNAs gereduceerd zijn of bij aandoeningen waar overexpressie van miRNAs een therapeutisch voordeel zou zijn. Het zijn synthetische kleine RNAs die meestal de exacte sequentie van het endogene miRNA bevat. In plaats van een enkele streng toe te dienen, zijn miRNA-mimics perfect complementaire duplexen. Deze zijn gelijkaardig aan de bouw van siRNAs. RNAs afkomstig van een duplex worden efficiënter verwerkt door RISC dan RNAs die afkomstig zijn van een enkele streng. Deze synthetische miRNAs kunnen een krachtiger effect hebben dan hun natuurlijk voorkomende vormen [114]. De mogelijkheid dat miRNA-mimics de expressie van tumorsuppressor-miRNAs verhogen, kan in de toekomst een interessante behandeling voor melanoom vormen.

4.2.3. Wijze van toediening Lokale toediening heeft het voordeel dat de dosis lager mag zijn. Een topische behandeling zorgt ook voor minder ongewenste effecten die mogelijks wel aanwezig zijn bij een systemische toediening. Aangezien de huid gemakkelijk bereikbaar is, lijkt een topische behandeling bij een huidziekte de beste methode om een behandeling met een antagomir of een mimic toe te passen. Antagomirs en mimics hebben structureel veel gelijkenissen met siRNAs. Technieken ontwikkeld voor toediening van siRNAs kunnen dus overgenomen worden voor deze twee klassen van miRNA-therapie [115, 116]. De huid vormt met zijn verschillende lagen een sterke barrière. Intradermale injecties voorkomt het obstakel van het netwerk van het stratum corneum. Andere succesvolle lokale toedieningen van siRNAs relevant voor dermatologie die beschreven zijn bij de muis zijn elektroporatie en vaginale instillatie. Bij elektroporatie worden korte pulsen van een hoog voltage gegeven waardoor de celmembraan doorlatend wordt [117, 118]. Deze methoden zijn echter invasief of vragen speciale materialen. Topische applicatie waarbij antagomirs of mimics via vectoren dieper in de huid dringen, zou makkelijker in gebruik zijn. Als vectoren kunnen nanosomen (kleine liposomen) gebruikt worden. Voor de toediening van siRNAs werden reeds ultravervormbare nanosomen ontworpen. Deze nieuwe nanosomen

bevatten

DOTAP

(1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropaan,

een

liposomaal

afgiftesysteem), cholesterol, natriumcholaat als surfactant en 30% ethanol. Dit surfactant-ethanol30

cholesterol-osome, ‘SECosome’ genoemd, is in staat om doorheen het stratum corneum te penetreren en siRNAs tot in de keratinocyten te brengen. Dit werd aangetoond in gekweekte huidcellen en ex vivo menselijke huid. Het synergistisch effect van ethanol en natriumcholaat zorgt voor een goede vervormbaarheid met als gevolg een snellere migratie en penetratie door het stratum corneum [119]. Vooraleer therapieën gebaseerd op miRNAs echter kunnen gebruikt worden in de praktijk, moeten de technieken van lokale toediening van mimics of antagomirs geoptimaliseerd worden zodat deze veilig en efficiënt zijn.

31

VIII DISCUSSIE EN CONCLUSIE Sinds miRNAs bestudeerd werden in C. Elegans, zijn deze kleine niet-coderende RNAs bezig aan een ware opmars. MiRNAs worden niet langer gezien als junk-DNA. Hun regulerende rol in ontwikkeling en pathologie is nu duidelijk. Het ernstig afwijkend fenotype bij muizen zonder Dicer of Dgcr8 in de huid bevestigt de essentiële betrokkenheid van miRNAs hierin. Verschillende studies profileerden de differentiële expressie van miRNAs uit fysiologische (bijvoorbeeld keratinocytenproliferatie en vorming van haarfollikels) en pathologische processen (bijvoorbeeld psoriasis en maligne melanoom). Ontregelde expressie van miRNAs komt voor bij verschillende huidziekten. Enkele gepubliceerde reviews gaven reeds een samenvatting over dit onderwerp. Deze masterproef bundelt de huidziekten die in verband gebracht werden met miRNAs. Doorheen deze review werden enkele specifieke miRNAs genoemd die betrokken zijn bij huidziekten. Tabel 5 geeft een overzicht weer. De vele studies die het expressieprofiel van verschillende miRNAs bestudeerden, kwamen meestal tot dezelfde resultaten i.v.m. specifieke miRNAs. Dit was echter niet altijd het geval. Zibert et al. bevestigt in 2010 de opregulatie in psoriasishuid van o.a. miR-203, miR-146a en miR-21 die ook Sonkoly et al. rapporteerden in 2007 [63, 68]. Maar geen enkel van de miRNAs die verlaagd tot expressie kwamen in de studie van Sonkoly et al. werden door Zibert et al. gevonden. Integendeel, miR-22 en miR-30 kwamen zelfs verhoogd tot expressie. Dit kan eventueel verklaard worden door de steekproefpopulatie die twee maal zo groot was. Ook maakten ze gebruik van de miRbase 12.0 tegenover miRbase 8.0 die bij Sonkoly et al.gebruikt werd [63, 68]. In dit literatuuronderzoek werden ook enkele miRNAs gevonden die betrokken zijn bij systeemziekten met een huidcomponent, zoals systemische lupus erythematosus en sclerodermie (of systeemsclerose) [120, 121]. Deze aandoeningen werden niet besproken omdat dit eerder auto-immuunziekten zijn die meerdere systemen treffen dan louter de huid. Daarnaast zijn er nog vele frequent voorkomende huidaandoeningen waarvan er nog geen data over de rol van miRNAs gevonden kan worden. Het zou nuttig zijn om het miRNA-profiel van huidziekten zoals acne, vitiligo, alopecia, niet-melanoom huidkankers en herpes te bestuderen. De recente vooruitgang in siRNA-technologie biedt een goede basis voor het ontwikkelen van miRNAbehandelingen van huidziekten. Er zijn echter wel nog vele obstakels die aangepakt moeten worden vooraleer miRNA-therapie routine kan worden in de kliniek. Een grote hindernis zijn de eventuele ongewenste bijwerkingen. Zo kunnen er off-target effecten zijn en productie van toxische metabolieten. Daarnaast is ook de wijze van toediening een punt van discussie. Topische applicatie van antagomirs of 32

mimics lijkt interessant. De barrière van het stratum corneum moet hierbij wel overwonnen worden. Het inbrengen van siRNAs met gebruik van SECosomen was reeds succesvol op ex vivo menselijke huid. Deze resultaten zijn veelbelovend voor toekomstige in vivo experimenten. Verder onderzoek naar de identificatie en verificatie van doelwitgenen van miRNAs is nodig. Zo kan de bestaande bio-informatica zich verder optimaliseren. Enkel wanneer de functie en pathways van miRNAs in verschillende situaties volledig gekend is, zal therapie op basis van miRNAs werkelijkheid worden. In conclusie, de kleine miRNAs spelen een grote rol bij huidziekten. Onderzoeken naar de differentiële expressie en hun doelwitgenen van specifieke miRNAs bij huidaandoeningen zijn van belang. Zo kan een expressieprofiel per huidaandoening opgesteld worden. Dit biedt naar de toekomst toe veelbelovende diagnostische en therapeutische vooruitzichten.

33

Tabel 5: Enkele miRNAs betrokken bij huidziekten.

miRNA

Level

Gevolg

Potentieel doelwitgen

Ref.

miR-203

↑

Keratinocytenproliferatie

SOCS-3

[63]

miR-146

↑

TNF-α ↑

IRAK-1, TRAF-6

[63]

miR-21

↑

/

/

[63]

miR-125b

↓

Keratinocytenproliferatie

FGFR2

[67]

miR-221/222

↑

Reductie van TIMP3

TIMP3

[68]

miR-99a

↓

Keratinocytenproliferatie

IGF-1R

[66]

miR-424

↓

Keratinocytenproliferatie

MEK1

[69]

miR-21/31/378

↑

Neo-angiogenese

/

[73]

↑

Celproliferatie

CTLA-4

[78]

miR-137

↑

Neerregulatie van MITF

MITF

[88]

miR-182

↑

Migratie en metastase

MITF, FOXO3

[90]

miR-221/222

↑

Celproliferatie, migratie en invasie

P27, c-Kit receptor

[93]

Let-7a

↓

Invasie

Integrin β3

[94]

Let-7b

↓

Proliferatie

Cyclin D1, Bsg

[95, 96]

miR-196a

↓

Migratie

HOX-B7, HOX-C8

[97, 98]

miR-193b

↓

Proliferatie

Cyclin D1

[99]

miR-205

↓

Proliferatie

E2F1

[100]

PSORIASIS

ATOPISCH ECZEEM miR-155

MELANOOM

34

IX REFERENTIELIJST 1. Felekkis K, Touvana E, Stefanou C, Deltas C. microRNAs: a newly described class of encoded molecules that play a role in health and disease. Hippokratia. 2010 Oct;14(4):236-40. 2. Sand M, Gambichler T, Sand D, Skrygan M, Altmeyer P, Bechara F. MicroRNAs and the skin: Tiny players in the body's largest organ. Journal of Dermatological Science. 2009;53(3):169-75. 3. Shah AA, Meese E, Blin N. Profiling of regulatory microRNA transcriptomes in various biological processes: a review. Journal of applied genetics. 2010;51(4):501-7. 4. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 1990 Apr;2(4):279-89. 5. Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995 May 19;81(4):611-20. 6. Fire A, Albertson D, Harrison SW, Moerman DG. Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C. elegans muscle. Development. 1991 Oct;113(2):503-14. 7. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11. 8. Hamilton AJ, Baulcombe DC. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 1999 Oct 29;286(5441):950-2. 9. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP. RNAi: double-stranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 2000 Mar 31;101(1):25-33. 10. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993 Dec 3;75(5):843-54. 11. Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, Martindale MQ, Kuroda MI, Maller B, et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 2000 Nov 2;408(6808):86-9. 12. Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE, et al. The 21nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 2000 Feb 24;403(6772):901-6. 13. Huang Y, Shen XJ, Zou Q, Zhao QL. Biological functions of microRNAs. Bioorganicheskaia khimiia. 2010 Nov-Dec;36(6):747-52. 14. Bartel B, Bartel DP. MicroRNAs: at the root of plant development? Plant Physiol. 2003 Jun;132(2):709-17. 15. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, et al. A uniform system for microRNA annotation. RNA. 2003 Mar;9(3):277-9.

35

16. Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004 Jan 23;116(2):281-97. 17. Krek A, Grun D, Poy MN, Wolf R, Rosenberg L, Epstein EJ, et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nature genetics. 2005 May;37(5):495-500. 18. Lau NC, Seto AG, Kim J, Kuramochi-Miyagawa S, Nakano T, Bartel DP, et al. Characterization of the piRNA complex from rat testes. Science. 2006 Jul 21;313(5785):363-7. 19. Vagin VV, Sigova A, Li C, Seitz H, Gvozdev V, Zamore PD. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 2006 Jul 21;313(5785):320-4. 20. Vaucheret H. Post-transcriptional small RNA pathways in plants: mechanisms and regulations. Genes Dev. 2006 Apr 1;20(7):759-71. 21. Ying SY, Lin SL. Current perspectives in intronic micro RNAs (miRNAs). Journal of biomedical science. 2006 Jan;13(1):5-15. 22. Han J, Lee Y, Yeom KH, Kim YK, Jin H, Kim VN. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev. 2004 Dec 15;18(24):3016-27. 23. He L, Hannon GJ. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 2004;5(7):522-31. 24. Williams AE. Functional aspects of animal microRNAs. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2008 Feb;65(4):545-62. 25. Barnes MR, Deharo S, Grocock RJ, Brown JR, Sanseau P. The micro RNA target paradigm: a fundamental and polymorphic control layer of cellular expression. Expert opinion on biological therapy. 2007 Sep;7(9):1387-99. 26.

Gawkrodger D. Dermatology: an illustrated coulour text. fourth edition ed: Elsevier; 2008.

27. Segre JA. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. The Journal of clinical investigation. 2006 May;116(5):1150-8. 28. Stenn KS. Molecular insights into the hair follicle and its pathology: a review of recent developments. International journal of dermatology. 2003 Jan;42(1):40-3. 29. Schneider MR, Schmidt-Ullrich R, Paus R. The hair follicle as a dynamic miniorgan. Current biology : CB. 2009 Feb 10;19(3):R132-42. 30. Ma DR, Yang EN, Lee ST. A review: the location, molecular characterisation and multipotency of hair follicle epidermal stem cells. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 2004 Nov;33(6):784-8. 31.

Wong DJ, Chang HY. Skin tissue engineering. StemBook. Cambridge (MA)2008.

32. Ross FP, Christiano AM. Nothing but skin and bone. The Journal of clinical investigation. 2006 May;116(5):1140-9. 33. Segre J. Complex redundancy to build a simple epidermal permeability barrier. Current opinion in cell biology. 2003 Dec;15(6):776-82. 36

34. Yi R, O'Carroll D, Pasolli HA, Zhang Z, Dietrich FS, Tarakhovsky A, et al. Morphogenesis in skin is governed by discrete sets of differentially expressed microRNAs. Nature genetics. 2006 Mar;38(3):356-62. 35. Andl T, Murchison EP, Liu F, Zhang Y, Yunta-Gonzalez M, Tobias JW, et al. The miRNAprocessing enzyme dicer is essential for the morphogenesis and maintenance of hair follicles. Current biology : CB. 2006 May 23;16(10):1041-9. 36. Yi R, Pasolli HA, Landthaler M, Hafner M, Ojo T, Sheridan R, et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jan 13;106(2):498-502. 37. Yi R, Fuchs E. MicroRNA-mediated control in the skin. Cell death and differentiation. 2010 Feb;17(2):229-35. 38. Aberdam D, Candi E, Knight RA, Melino G. miRNAs, 'stemness' and skin. Trends Biochem Sci. 2008 Dec;33(12):583-91. 39. Yi R, Poy MN, Stoffel M, Fuchs E. A skin microRNA promotes differentiation by repressing 'stemness'. Nature. 2008 Mar 13;452(7184):225-9. 40. Wei T, Orfanidis K, Xu N, Janson P, Stahle M, Pivarcsi A, et al. The expression of microRNA203 during human skin morphogenesis. Experimental dermatology. 2010 Sep;19(9):854-6. 41. Lena AM, Shalom-Feuerstein R, Rivetti di Val Cervo P, Aberdam D, Knight RA, Melino G, et al. miR-203 represses 'stemness' by repressing DeltaNp63. Cell death and differentiation. 2008 Jul;15(7):1187-95. 42. Senoo M, Pinto F, Crum CP, McKeon F. p63 Is essential for the proliferative potential of stem cells in stratified epithelia. Cell. 2007 May 4;129(3):523-36. 43. Mardaryev AN, Ahmed MI, Vlahov NV, Fessing MY, Gill JH, Sharov AA, et al. Micro-RNA-31 controls hair cycle-associated changes in gene expression programs of the skin and hair follicle. FASEB J. 2010 Oct;24(10):3869-81. 44. Zhang L, Stokes N, Polak L, Fuchs E. Specific microRNAs are preferentially expressed by skin stem cells to balance self-renewal and early lineage commitment. Cell Stem Cell. 2011 Mar 4;8(3):294308. 45. Hildebrand J, Rutze M, Walz N, Gallinat S, Wenck H, Deppert W, et al. A Comprehensive Analysis of MicroRNA Expression During Human Keratinocyte Differentiation In Vitro and In Vivo. The Journal of investigative dermatology. 2010 Sep 9. 46. Shilo S, Roy S, Khanna S, Sen CK. MicroRNA in cutaneous wound healing: a new paradigm. DNA and cell biology. 2007 Apr;26(4):227-37. 47.

Shaw TJ, Martin P. Wound repair at a glance. J Cell Sci. 2009 Sep 15;122(Pt 18):3209-13.

48. Tonnesen MG, Feng X, Clark RA. Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 2000 Dec;5(1):40-6.

37

49. Kuehbacher A, Urbich C, Zeiher AM, Dimmeler S. Role of Dicer and Drosha for endothelial microRNA expression and angiogenesis. Circ Res. 2007 Jul 6;101(1):59-68. 50. Shilo S, Roy S, Khanna S, Sen CK. Evidence for the involvement of miRNA in redox regulated angiogenic response of human microvascular endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Mar;28(3):471-7. 51. Raja SK, Sivamani K, Garcia MS, Isseroff RR. Wound re-epithelialization: modulating keratinocyte migration in wound healing. Front Biosci. 2007;12:2849-68. 52. Chan SY, Loscalzo J. MicroRNA-210: a unique and pleiotropic hypoxamir. Cell Cycle. 2010 Mar 15;9(6):1072-83. 53. Biswas S, Roy S, Banerjee J, Hussain SR, Khanna S, Meenakshisundaram G, et al. Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Apr 13;107(15):6976-81. 54. van Rooij E, Sutherland LB, Thatcher JE, DiMaio JM, Naseem RH, Marshall WS, et al. Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 2;105(35):13027-32. 55. Griffiths CE, Barker JN. Pathogenesis and clinical features of psoriasis. Lancet. 2007 Jul 21;370(9583):263-71. 56. Lowes MA, Bowcock AM, Krueger JG. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):866-73. 57.

Lebwohl M. Psoriasis. Lancet. 2003 Apr 5;361(9364):1197-204.

58. Rott S, Mrowietz U. Recent developments in the use of biologics in psoriasis and autoimmune disorders. The role of autoantibodies. BMJ. 2005 Mar 26;330(7493):716-20. 59. Elder JT, Bruce AT, Gudjonsson JE, Johnston A, Stuart PE, Tejasvi T, et al. Molecular dissection of psoriasis: integrating genetics and biology. The Journal of investigative dermatology. 2010 May;130(5):1213-26. 60.

Nestle FO, Kaplan DH, Barker J. Psoriasis. N Engl J Med. 2009 Jul 30;361(5):496-509.

61.

Wolf R, Ruocco V. Triggered psoriasis. Adv Exp Med Biol. 1999;455:221-5.

62. Islam MT, Paul HK, Zakaria SM, Islam MM, Shafiquzzaman M. Epidemiological determinants of psoriasis. Mymensingh Med J. 2011 Jan;20(1):9-15. 63. Sonkoly E, Wei T, Janson PC, Saaf A, Lundeberg L, Tengvall-Linder M, et al. MicroRNAs: novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis? PloS one. 2007;2(7):e610. 64. Sonkoly E, Stahle M, Pivarcsi A. MicroRNAs: novel regulators in skin inflammation. Clinical and experimental dermatology. 2008 May;33(3):312-5. 65. Tili E, Michaille JJ, Cimino A, Costinean S, Dumitru CD, Adair B, et al. Modulation of miR-155 and miR-125b levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock. Journal of immunology. 2007 Oct 15;179(8):5082-9. 38

66. Lerman G, Avivi C, Mardoukh C, Barzilai A, Tessone A, Gradus B, et al. MiRNA expression in psoriatic skin: reciprocal regulation of hsa-miR-99a and IGF-1R. PloS one. 2011;6(6):e20916. 67. Xu N, Brodin P, Wei T, Meisgen F, Eidsmo L, Nagy N, et al. MiR-125b, a microRNA downregulated in psoriasis, modulates keratinocyte proliferation by targeting FGFR2. The Journal of investigative dermatology. 2011 Jul;131(7):1521-9. 68. Zibert JR, Lovendorf MB, Litman T, Olsen J, Kaczkowski B, Skov L. MicroRNAs and potential target interactions in psoriasis. J Dermatol Sci. 2010 Jun;58(3):177-85. 69. Ichihara A, Jinnin M, Yamane K, Fujisawa A, Sakai K, Masuguchi S, et al. microRNA-mediated keratinocyte hyperproliferation in psoriasis vulgaris. The British journal of dermatology. 2011 Nov;165(5):1003-10. 70. Lowes MA, Kikuchi T, Fuentes-Duculan J, Cardinale I, Zaba LC, Haider AS, et al. Psoriasis vulgaris lesions contain discrete populations of Th1 and Th17 T cells. The Journal of investigative dermatology. 2008 May;128(5):1207-11. 71. Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 2005 Jan 14;120(1):15-20. 72. Ichihara A, Jinnin M, Oyama R, Yamane K, Fujisawa A, Sakai K, et al. Increased serum levels of miR-1266 in patients with psoriasis vulgaris. European journal of dermatology : EJD. 2011 Nov 30. 73. Joyce CE, Zhou X, Xia J, Ryan C, Thrash B, Menter A, et al. Deep sequencing of small RNAs from human skin reveals major alterations in the psoriasis miRNAome. Hum Mol Genet. 2011 Oct 15;20(20):4025-40. 74. Wang S, Olson EN. AngiomiRs--key regulators of angiogenesis. Curr Opin Genet Dev. 2009 Jun;19(3):205-11. 75. Kay J, Gawkrodger DJ, Mortimer MJ, Jaron AG. The prevalence of childhood atopic eczema in a general population. Journal of the American Academy of Dermatology. 1994 Jan;30(1):35-9. 76. Leung DY, Jain N, Leo HL. New concepts in the pathogenesis of atopic dermatitis. Curr Opin Immunol. 2003 Dec;15(6):634-8. 77. Zollman C, Vickers A. ABC of complementary medicine. Complementary medicine and the patient. BMJ. 1999 Dec 4;319(7223):1486-9. 78. Sonkoly E, Janson P, Majuri ML, Savinko T, Fyhrquist N, Eidsmo L, et al. MiR-155 is overexpressed in patients with atopic dermatitis and modulates T-cell proliferative responses by targeting cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. The Journal of allergy and clinical immunology. 2010 Sep;126(3):581-9 e1-20. 79. de Groot A, Toonstra J. Kanker en huid: dermato-oncologie voor de huisarts: Bohn Stafleu van Loghum; 2010. 80.

Garbe C, Leiter U. Melanoma epidemiology and trends. Clin Dermatol. 2009 Jan-Feb;27(1):3-9.

81. Holterheus C, de Vries E, Nijsten T. De epidemiologie van huidkanker: zorg om de zorg. Nederlands tijdschrift voor dermatologie en venereologie. 2009;19(8):451-5. 39

82. Kuvat SV, Gucin Z, Keklik B, Ozyalvacli G, Basaran K. Basal cell carcinoma in a child. J Skin Cancer. 2011;2011:752901. 83. Sand M, Sand D, Brors D, Altmeyer P, Mann B, Bechara FG. Cutaneous lesions of the external ear. Head Face Med. 2008;4:2. 84. Mocellin S, Pasquali S, Pilati P. Oncomirs: from tumor biology to molecularly targeted anticancer strategies. Mini Rev Med Chem. 2009 Jan;9(1):70-80. 85. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 Jun 9;435(7043):834-8. 86. Gaur A, Jewell DA, Liang Y, Ridzon D, Moore JH, Chen C, et al. Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines. Cancer Res. 2007 Mar 15;67(6):2456-68. 87. Zhang L, Huang J, Yang N, Greshock J, Megraw MS, Giannakakis A, et al. microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jun 13;103(24):9136-41. 88. Bemis LT, Chen R, Amato CM, Classen EH, Robinson SE, Coffey DG, et al. MicroRNA-137 targets microphthalmia-associated transcription factor in melanoma cell lines. Cancer Res. 2008 Mar 1;68(5):1362-8. 89. Cui R, Widlund HR, Feige E, Lin JY, Wilensky DL, Igras VE, et al. Central role of p53 in the suntan response and pathologic hyperpigmentation. Cell. 2007 Mar 9;128(5):853-64. 90. Segura MF, Hanniford D, Menendez S, Reavie L, Zou X, Alvarez-Diaz S, et al. Aberrant miR-182 expression promotes melanoma metastasis by repressing FOXO3 and microphthalmia-associated transcription factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Feb 10;106(6):1814-9. 91. Segura MF, Belitskaya-Levy I, Rose AE, Zakrzewski J, Gaziel A, Hanniford D, et al. Melanoma MicroRNA signature predicts post-recurrence survival. Clin Cancer Res. 2010 Mar 1;16(5):1577-86. 92. Leidinger P, Keller A, Borries A, Reichrath J, Rass K, Jager SU, et al. High-throughput miRNA profiling of human melanoma blood samples. BMC Cancer. 2010;10:262. 93. Felicetti F, Errico MC, Bottero L, Segnalini P, Stoppacciaro A, Biffoni M, et al. The promyelocytic leukemia zinc finger-microRNA-221/-222 pathway controls melanoma progression through multiple oncogenic mechanisms. Cancer Res. 2008 Apr 15;68(8):2745-54. 94. Muller DW, Bosserhoff AK. Integrin beta 3 expression is regulated by let-7a miRNA in malignant melanoma. Oncogene. 2008 Nov 6;27(52):6698-706. 95. Fu TY, Chang CC, Lin CT, Lai CH, Peng SY, Ko YJ, et al. Let-7b-mediated suppression of basigin expression and metastasis in mouse melanoma cells. Exp Cell Res. 2011 Feb 15;317(4):445-51. 96. Schultz J, Lorenz P, Gross G, Ibrahim S, Kunz M. MicroRNA let-7b targets important cell cycle molecules in malignant melanoma cells and interferes with anchorage-independent growth. Cell Res. 2008 May;18(5):549-57.

40

97. Braig S, Mueller DW, Rothhammer T, Bosserhoff AK. MicroRNA miR-196a is a central regulator of HOX-B7 and BMP4 expression in malignant melanoma. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2010 Oct;67(20):3535-48. 98. Mueller DW, Bosserhoff AK. MicroRNA miR-196a controls melanoma-associated genes by regulating HOX-C8 expression. Int J Cancer. 2011 Sep 1;129(5):1064-74. 99. Chen J, Feilotter HE, Pare GC, Zhang X, Pemberton JG, Garady C, et al. MicroRNA-193b represses cell proliferation and regulates cyclin D1 in melanoma. The American journal of pathology. 2010 May;176(5):2520-9. 100. Dar AA, Majid S, de Semir D, Nosrati M, Bezrookove V, Kashani-Sabet M. miRNA-205 suppresses melanoma cell proliferation and induces senescence via regulation of E2F1 protein. J Biol Chem. 2011 May 13;286(19):16606-14. 101. Dziunycz P, Iotzova-Weiss G, Eloranta JJ, Lauchli S, Hafner J, French LE, et al. Squamous cell carcinoma of the skin shows a distinct microRNA profile modulated by UV radiation. The Journal of investigative dermatology. 2010 Nov;130(11):2686-9. 102. Wong TS, Liu XB, Wong BY, Ng RW, Yuen AP, Wei WI. Mature miR-184 as Potential Oncogenic microRNA of Squamous Cell Carcinoma of Tongue. Clin Cancer Res. 2008 May 1;14(9):2588-92. 103. Rivetti di Val Cervo P, Lena AM, Nicoloso M, Rossi S, Mancini M, Zhou H, et al. p63microRNA feedback in keratinocyte senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1133-8. 104. Link A, Balaguer F, Shen Y, Nagasaka T, Lozano JJ, Boland CR, et al. Fecal MicroRNAs as novel biomarkers for colon cancer screening. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2010 Jul;19(7):1766-74. 105. Gilad S, Meiri E, Yogev Y, Benjamin S, Lebanony D, Yerushalmi N, et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 2008;3(9):e3148. 106. Chen X, Ba Y, Ma L, Cai X, Yin Y, Wang K, et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 2008 Oct;18(10):997-1006. 107. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jul 29;105(30):10513-8. 108. Kroh EM, Parkin RK, Mitchell PS, Tewari M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 2010 Apr;50(4):298-301. 109. Kosaka N, Iguchi H, Ochiya T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 2010 Oct;101(10):2087-92. 110.

Czech MP. MicroRNAs as therapeutic targets. N Engl J Med. 2006 Mar 16;354(11):1194-5.

111. Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, Rajeev KG, Tuschl T, Manoharan M, et al. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature. 2005 Dec 1;438(7068):685-9.

41

112. Worm J, Stenvang J, Petri A, Frederiksen KS, Obad S, Elmen J, et al. Silencing of microRNA-155 in mice during acute inflammatory response leads to derepression of c/ebp Beta and down-regulation of G-CSF. Nucleic Acids Res. 2009 Sep;37(17):5784-92. 113. Huynh C, Segura MF, Gaziel-Sovran A, Menendez S, Darvishian F, Chiriboga L, et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 2011 Mar 24;30(12):1481-8. 114. Love TM, Moffett HF, Novina CD. Not miR-ly small RNAs: big potential for microRNAs in therapy. The Journal of allergy and clinical immunology. 2008 Feb;121(2):309-19. 115. Gondi CS, Rao JS. Concepts in in vivo siRNA delivery for cancer therapy. J Cell Physiol. 2009 Aug;220(2):285-91. 116. Whitehead KA, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 2009 Feb;8(2):129-38. 117. Palliser D, Chowdhury D, Wang QY, Lee SJ, Bronson RT, Knipe DM, et al. An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection. Nature. 2006 Jan 5;439(7072):8994. 118. Inoue T, Sugimoto M, Sakurai T, Saito R, Futaki N, Hashimoto Y, et al. Modulation of scratching behavior by silencing an endogenous cyclooxygenase-1 gene in the skin through the administration of siRNA. J Gene Med. 2007 Nov;9(11):994-1001. 119. Geusens B, Van Gele M, Braat S, De Smedt S, Stuart M, Prow T, et al. Flexible nanosomes (SECosomes) enable efficient siRNA delivery in cultured primary skin cells and in the viable epidermis of ex vivo human skin. Advances Functional Materials. 2010;20:4077-90. 120. Dai Y, Huang YS, Tang M, Lv TY, Hu CX, Tan YH, et al. Microarray analysis of microRNA expression in peripheral blood cells of systemic lupus erythematosus patients. Lupus. 2007;16(12):939-46. 121. Maurer B, Stanczyk J, Jungel A, Akhmetshina A, Trenkmann M, Brock M, et al. MicroRNA-29, a key regulator of collagen expression in systemic sclerosis. Arthritis and rheumatism. 2010 Jun;62(6):1733-43.

42