DE BETROKKENHEID VAN NFkappaB IN DUCHENNE MUSCULAIRE DYSTROFIE

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2009 - 2010

DE BETROKKENHEID VAN NFkappaB IN DUCHENNE MUSCULAIRE DYSTROFIE

Jasper VANHOVE

Promotor: Prof. Dr. J. De Bleecker

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot

MASTER I DE GE EESKU DE

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2009 - 2010

DE BETROKKENHEID VAN NFkappaB IN DUCHENNE MUSCULAIRE DYSTROFIE

Jasper VANHOVE

Promotor: Prof. Dr. J. De Bleecker

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot

MASTER I DE GE EESKU DE

“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

Datum

(handtekening student (en))

(handtekening promotor)

(Naam student)

(Naam promotor)

Voorwoord

Beste lezer,

Het is met veel trots en voldoening dat ik u deze scriptie voorstel. Het is het resultaat van twee jaar literatuuronderzoek en -verwerking. Doorheen deze twee jaar heb ik niet alleen over het onderwerp van deze scriptie een brede kennis verworven, ik heb ook geleerd hoe ik op een wetenschappelijk verantwoorde manier informatie omtrent een specifiek onderwerp kan opzoeken in de massa’s medische literatuur die voorhanden is. Ik ben er van overtuigd dat dit in mijn toekomstige carrière als arts van pas zal komen bij het oplossen van medische problemen.

Het schrijven van een scriptie is een tijdsrovende en arbeidsintensieve opdracht. Het combineren van deze scriptie met de op zich al drukke medische opleiding en de persoonlijke agenda is dan ook dikwijls geen gemakkelijke opdracht. Gelukkig kon ik een beroep doen op verschillende mensen die mij bij het schrijven van deze scriptie hebben begeleid. Graag wil ik dan ook in de eerste plaats mijn promotor, Prof. Dr. J. De Bleecker, bedanken voor de begeleiding en feedback die hij mij de voorbije twee jaar heeft geboden. Ten tweede wil ik Mevr. K. Creus uitdrukkelijk bedanken voor haar vele geduld en verbeterwerk. Zonder haar richtlijnen en hulp was deze scriptie niet geworden wat zij nu is. Tot slot wil ik nog mijn familie en vrienden bedanken voor hun mentale ondersteuning.

Inhoudsopgave

Abstract ................................................................................................................................................... 1 Afkortingenlijst ....................................................................................................................................... 2 Inleiding .................................................................................................................................................. 4 1. De musculaire dystrofieën ........................................................................................................... 5 1.1 Definitie ............................................................................................................................... 5 1.2 Genotype-fenotype correlatie .............................................................................................. 6 1.3 Diagnose .............................................................................................................................. 7 1.4 Therapie ............................................................................................................................... 9 2. Duchenne musculaire dystrofie ................................................................................................. 11 2.1 Introductie ......................................................................................................................... 11 2.2 Het Duchenne musculaire dystrofie gen............................................................................ 12 2.3 Het dystrofine eiwit ........................................................................................................... 13 2.4 Het ‘dystrophin-associated protein complex’ .................................................................... 14 2.5 Diermodellen ..................................................................................................................... 16 2.6 Diagnose ............................................................................................................................ 17 2.7 Therapie ............................................................................................................................. 18 3. Nucleaire Factor Kappa B ......................................................................................................... 19 3.1 De NF-κB/Rel familie ....................................................................................................... 20 3.2 De IκB familie ................................................................................................................... 21 3.3 Het IKK complex .............................................................................................................. 23 3.4 NF-κB signaling en transcriptionele activatie ................................................................... 24 Methodologie ........................................................................................................................................ 31 Resultaten .............................................................................................................................................. 32 1. Histopathologie van DMD ........................................................................................................ 32 2. Immunopathogenese van DMD................................................................................................. 33 2.1 De mechanische hypothese................................................................................................ 33 2.2 De calcium hypothese ....................................................................................................... 34 2.3 De vasculaire hypothese .................................................................................................... 35 2.4 De genregulatie hypothese ................................................................................................ 35 2.5 Tissue remodeling hypothese ............................................................................................ 35 2.6 De inflammatoire hypothese.............................................................................................. 36 3. NF-κB in Duchenne musculaire dystrofie ................................................................................. 36 3.1 NF-κB in Duchenne muismodellen ................................................................................... 36 3.2 NF-κB in Duchenne spierweefsel...................................................................................... 38 Discussie................................................................................................................................................ 40 1. NF-κB activiteit in Duchenne muismodellen. ........................................................................... 40 2. NF-κB activiteit in Duchenne spierweefsel............................................................................... 41 3. Therapeutische implicaties ........................................................................................................ 43 Conclusie ............................................................................................................................................... 45 Referenties ............................................................................................................................................. 46

Abstract

Duchenne musculaire dystrofie (DMD) is een letale X-gebonden recessieve aandoening, gekenmerkt door snel progressieve spierdegeneratie. DMD behoort tot de musculaire dystrofieën, een groep van erfelijke aandoeningen gekenmerkt door progressieve spierzwakte en spierverlies. De aandoening tast 1 op 3500 levend geboren jongens aan en presenteert zich klinisch rond de leeftijd van vier jaar met een veranderd looppatroon en typisch het teken van Gowers. Later ontwikkelen patiënten respiratoire insufficiëntie en cardiomyopathie, wat dikwijls ook de uiteindelijke doodsoorzaak is. De primaire oorzaak van DMD is een mutatie in het gen dat codeert voor dystrofine, een structureel eiwit van de spiervezel essentieel voor de stabiliteit van de spiervezelmembraan. Op welke manier de afwezigheid van dystrofine leidt tot musculaire degeneratie is echter nog steeds niet duidelijk. De progressieve aard van de aandoening doet vermoeden dat meerdere secundaire pathofysiologische en biochemische pathways bijdragen tot het ontstaan van de spierschade. Verscheidene hypothesen worden hiervoor gesuggereerd, met als belangrijkste de mechanische en de calcium hypothese. Etiologisch is vooralsnog geen therapie voor DMD beschikbaar. Momenteel probeert men met moleculaire modificatietechnieken de functie van het dystrofine gen te herstellen, maar hiervoor is aanvullend onderzoek noodzakelijk. Nucleaire factor kappa B (NF-κB) is een belangrijke transcriptiefactor die betrokken is in de cellulaire immuun, inflammatoire en proliferatieve responsen. Verscheidene studies wijzen op een mogelijke rol van NF-κB in de pathogenese van DMD. Zo werd een verhoogde NF-κB activatie waargenomen in spierweefsel van mdx muizen, een goed reproduceerbaar diermodel voor dystrofinopathieën, en DMD patiënten. Op welke manier deze activatie precies leidt tot musculaire dystrofie is nog niet bekend, maar mogelijks worden hierdoor inflammatoire pathways geïnduceerd die op hun beurt resulteren in spierschade en musculaire dystrofie. Het specifiek inhiberen van NF-κB en het identificeren van deze pathways zou therapeutische implicaties kunnen hebben met betrekking tot het vertragen en verminderen van het degeneratief proces, maar verdere studies omtrent deze aanpak zijn aangewezen gezien de delicate rol die NF-κB speelt in het evenwicht tussen celoverleving en apoptose.

1

Afkortingenlijst

AAV

Adeno-associated virus

ANK

Ankyrin repeats region

ARD

Ankyrin repeat domain

AON

Antisense oligonucleotiden

BAFF

B-cell activating factor

BCR

B-cel receptor

BMD

Becker musculaire dystrofie

Ca2+

Calcium

CBP

CREB-binding protein

CC1/2

Coiled-coil domein

CK

Creatine kinase

C-terminaal domein

Carboxy-terminaal domein

DAPC

Dystrophin-associated protein complex

DD

Regio met homologie aan een ‘death domain’

DMD

Duchenne musculaire dystrofie

ERK

Extracellular signal-related kinase

GRMD

Golden Retriever muscular dystrophy

H&E

Hematoxyline en eosine

HATs

Histone acetyltransferases

HDAC

Histone deacetylase

HFMD

Hypertrophic feline muscular dystrophy

HLH

Helix-loop-helix domein

IGF-1

Insulin-like growth factor-1

IL-1

Interleukine 1

KO

Knock-out

LGMD

Limb-girdle musculaire dystrofie

LPS

Lipopolysaccharide

LTβ

Lymphotoxin β

LZ

Leucine zipper domein

MAGUK

Membrane-associated guanylate kinase homologue

MALT

Mucosal-associated lymphoid tissue

MAP

Mitogen-activated protein

MIKK

Muscle-specific expression of IKK

2

MISR

Muscle-specific expression of IκB superrepressor

NBD

NEMO-binding domain

NEMO

NF-κB essential modulator

NF-κB

Nucleaire factor kappa B

NIK

NF-κB-inducing kinase

NLS

Nuclear localisation signal

n-NOS

Neuronaal stikstofoxide synthase

NO

Stikstofoxide

N-terminaal domein

Amino-terminaal domein

PCAF

p300/CBP-associated factor

PCR

Polymerase chain reaction

PDTC

Pyrrolidine dithiocarbamaat

PEST

Regio rijk aan proline-, serine-, aspartaat-, glutamaat-, en threonineresidu’s

PKAc

Protein kinase A catalytic subunit

PKCζ

Protein kinase zeta

PKCθ

Proteïne kinase Cθ

PRR

Pattern recognition receptor

RHD

Rel-homologie domein

RIP

Receptor-interacting serine/threonine kinase

TAD

Transactiverend domein

TAK1

Transforming growth factor beta - activated kinase

TCR

T-cel receptor

TGF-β

Transforming growth factor β

TLR

Toll-like receptor

TNF-α

Tumor necrosis factor α

VPN

Virtual Private Network

WT

Wild type

ZF

Zinc finger domein

3

Inleiding

Myopathieën of spierziekten vormen een brede groep aandoeningen waarbij primaire defecten ter hoogte van de spier (Figuur 1) gepaard gaan met spierzwakte. Myopathieën kunnen aangeboren zijn door een genetische stoornis of door een stoornis in het spiermetabolisme. Ze kunnen echter ook verworven zijn, hetzij inflammatoir (auto-immuun of infectieus), hetzij kaderend in ruimere systeemziekten. Tot slot worden ook toxische factoren zoals sommige medicaties als oorzakelijke factoren van myopathieën beschouwd.

Deze scriptie handelt over de betrokkenheid van ‘Nucleaire factor kappa B (NF-κB)’ in Duchenne musculaire dystrofie (DMD), een overerfbare genetische myopathie. Vooreerst zullen de musculaire dystrofieën, waartoe DMD behoort, en DMD zelf besproken worden. Vervolgens zal dieper ingegaan worden op NF-κB, een belangrijke transcriptiefactor met een rol in tal van cellulaire processen zoals celproliferatie en apoptose. Tot slot zal overgaan worden tot het eigenlijke doel van deze scriptie: speelt NF-κB een rol in de pathogenese van Duchenne musculaire dystrofie?

Figuur 1: Schematische weergave van de opbouw van een normale spier (Davies and Nowak, 2006).

4

1.

De musculaire dystrofieën

1.1

Definitie De musculaire dystrofieën vormen een heterogene groep spieraandoeningen waarbij patiënten

lijden aan progressieve degeneratie van de skeletspieren met spierzwakte tot gevolg. Deze spierziekten ontstaan door genetische defecten in genen coderend voor eiwitten die essentieel zijn voor de opbouw van de spiermembraan. Verscheidene musculaire dystrofieën gaan bovendien gepaard met cardiomyopathie, dat in sommige gevallen het op de voorgrond staande symptoom kan zijn van een onderliggende musculaire dystrofie (Emery, 2002a).

Op basis van de lokalisatie van de predominante spierzwakte, de leeftijd waarop de aandoening zich presenteert en tot slot het overervingspatroon, worden onder andere de volgende types dystrofieën onderscheiden (Emery, 2002a): Duchenne en Becker musculaire dystrofie (DMD en BMD), ‘Emery-Dreifuss’ musculaire dystrofie, distale musculaire dystrofie, facioscapulohumerale musculaire dystrofie, ‘limb-girdle’ musculaire dystrofie (LGMD) en oculopharyngeale musculaire dystrofie (Figuur 2).

Figuur 2: Lokalisatie van de predominante spierzwakte bij verschillende types dystrofieën. (a), Duchenne en Becker; (b), ‘Emery-Dreifuss’; (c), ‘limb-girdle’; (d), facioscapulohumerale; (e), distale; (f), oculopharyngeale (Emery, 1998).

De term musculaire dystrofie dient echter breed genoeg geïnterpreteerd te worden. Zo werden voor LGMD reeds 15 verschillende subtypes geïdentificeerd, gebaseerd op verschillende genetische defecten. Deze subtypes vertonen een grote klinische en genetische heterogeniteit. Het meest voorkomende type dystrofie in West-Europa blijft echter Duchenne musculaire dystrofie (DMD) met een incidentie van 1 op 3500 levend geboren jongens. Sommige dystrofieën presenteren zich al van bij

5

de geboorte en zijn prognostisch ongunstig, zoals de congenitale dystrofieën. Andere, relatief goedaardige, presenteren zich pas op jongere (zoals BMD) of zelfs volwassen leeftijd (zoals oculopharyngeale musculaire dystrofie). Naarmate nu meer over dystrofieën bekend wordt, is het duidelijk geworden dat er geen unieke eigenschap bestaat die alle dystrofieën kenmerkt. Daarom wordt er voor geijverd de verschillende types in te delen op basis van hun specifieke eiwitdefect: dystrofinopathieën, sarcoglycanopathieën, laminopathieën, … (Emery, 2002b).

1.2

Genotype-fenotype correlatie De relatie tussen genotype en fenotype werd het best bestudeerd voor DMD, waarbij ongeveer

70% van de mutaties in het dystrofine gen deleties zijn. In de resterende 30% gaat het om puntmutaties of zeldzaam duplicaties. De ‘reading-frame hypothese’ werd voor het eerst geformuleerd door Monaco et al. (1988) en stelt dat mutaties in het dystrofine gen waarbij het reading frame verschoven wordt, de zogenaamde ‘frame-shift mutaties’, resulteren in een niet functioneel dystrofine en bijgevolg ernstig Duchenne fenotype. Dit in tegenstelling tot zogenaamde ‘in-frame mutaties’, waarbij het reading frame bewaard blijft. Deze resulteren in een abnormaal maar gedeeltelijk functioneel dystrofine en geven bijgevolg het mildere Becker fenotype. De hypothese geldt in ongeveer 90% van de gevallen van DMD en is van diagnostisch en prognostisch belang. Verder veroorzaken deleties in de centrale regio van het gen slechts een milde spierzwakte of zijn ze asymptomatisch op een gestegen serum creatine kinase na (Emery, 2002b).

Het dystrofine eiwit zelf komt voor onder verschillende isovormen. Er bestaan 3 ‘full-length’ transcripten waarvan de geassocieerde promotors vernoemd zijn naar het weefsel waarin ze het meest tot expressie worden gebracht, namelijk Purkinje (P), Muscle (M) en Brain (B). Verder bestaan er nog minstens 5 kortere transcripten: Dp 260, Dp 140, Dp 116, Dp 71 en Dp 40. Het Dp 140 transcript, geëxpresseerd in het ruggenmerg en de hersenen, is waarschijnlijk het belangrijkste. Zo wordt gesuggereerd dat deleties in Dp 140 een invloed zouden kunnen hebben op het intelligentiequotiënt van patiënten met DMD. Gemiddeld ligt het intelligentiequotiënt bij DMD patiënten ongeveer 1 standaarddeviatie onder het gemiddelde. Bij 20% van de patiënten wordt zelfs een intelligentiequotiënt van minder dan 70 vastgesteld. Hoe deleties in Dp 140 een invloed uitoefenen op de hersenfunctie is totnogtoe echter onbekend (Emery, 2002b; Muntoni et al., 2003).

Hoewel de eiwitten geassocieerd met de verschillende musculaire dystrofieën reeds gedeeltelijk werden geïdentificeerd (Figuur 3) is de pathogenese nog niet volledig gekend. Zo heeft men geen verklaring voor de manier waarop defecten in nucleaire membraaneiwitten resulteren in spierzwakte en cardiomyopathie. Mogelijks speelt een dysregulatie in intracellulair calciumtransport hierin een rol (Emery, 2002b).

6

Figuur 3: Gen-loci en de respectievelijke eiwitdefecten bij de verschillende vormen van musculaire dystrofie (Emery, 2002a).

1.3

Diagnose De diagnose van musculaire dystrofie wordt gesteld op basis van gestegen spierenzymgehaltes

en moleculaire technieken. Uitzonderlijk is een spierbiopsie noodzakelijk om de diagnose te bevestigen.

Een goedkope en eenvoudige manier om dystrofieën op te sporen is het bepalen van het serum creatine kinase (CK) gehalte. In DMD en BMD worden geregeld waarden gemeten die 10 tot 100 keer hoger liggen dan de normaalwaarden. Belangrijk hierbij is dat de stijging zich vooral voordoet in het begin van de aandoening en gradueel afneemt terwijl de ziekte vordert en fibrose optreedt. Bij andere types van musculaire dystrofie of myopathieën kan het CK variëren of zelfs normaal zijn. Andere enzymes die ook meer actief zijn, zijn het alanine transaminase en het aspartaat transaminase, en hun waarden correleren met de waarden van CK. Deze enzymes zijn echter weinig specifiek voor spieren en dragen bijgevolg dus niet bij tot de diagnostiek van DMD (Roland, 2000).

Op bloed kan men met moleculaire technieken zoals de ‘polymerase chain reaction (PCR)’amplificatie specifieke gendeleties en –duplicaties detecteren, en occasioneel ook puntmutaties. Deze moleculaire testen zijn nu het standaard diagnostische onderzoek in de meeste klinische centra (Yiu and Kornberg, 2008). Zo kan bij DMD een deletie in het Xp21 gen aangetoond worden bij ongeveer twee derde van de patiënten, waardoor de diagnose kan gesteld worden en een invasieve spierbiopsie kan vermeden worden (Roland, 2000). Mutatieanalyse is bovendien een essentieel onderzoek voor genetische counseling en prenatale diagnostiek (Emery, 2002a).

7

Verder kan het uitvoeren van een elektromyografie belangrijk zijn voor het bevestigen van de myopathische aard van de dystrofie en het uitsluiten van neurogene oorzaken van de spierzwakte, zoals perifere zenuwaandoeningen. Door het invasieve karakter is deze techniek echter minder aangeraden bij kinderen (Emery, 2002a).

Zelden wordt de diagnose gesteld op basis van een spierbiopsie en dit vooral bij negatieve genetische testen of een atypisch klinisch beeld. Een spierbiopsie toont degenererende necrotische spiervezels met macrofagen-infiltratie, alsook clusters van regenererende spiervezels. Toegenomen variatie in spiervezelgrootte wordt ook gezien. Uiteindelijk treedt een vervanging van het spierweefsel door vet- en bindweefsel op (Figuur 4) (Yiu and Kornberg, 2008). Dit beeld wordt vooral waargenomen bij de ernstige vormen van spierdystrofie, zoals bij DMD. In milde vormen van dystrofie, zoals bij ‘Emery-Dreifuss’ musculaire dystrofie, kan een toegenomen variatie in vezelgrootte het enige histologisch kenmerk zijn (Emery, 2002a).

Figuur 4: Spierbiopsie van een patiënt met DMD (hematoxyline en eosine kleuring) waarbij toegenomen variatie in vezelgrootte, degenererende en regenererende vezels, en vervanging van spierweefsel door vet- en bindweefsel waar te nemen is (Yiu and Kornberg, 2008).

De afwezigheid of duidelijk verminderde aanwezigheid van dystrofine in spierbiopsieën kan aangetoond worden met immunohistochemische kleuringen en/of Western blot analyse. Hierbij worden antilichamen gebruikt die het amino-terminaal deel, carboxy-terminaal deel of ‘rod-domains’ van dystrofine herkennen (Figuur 5A en -B). Bij DMD is er ten gevolge van de afwezigheid van dystrofine geen kleuring ter hoogte van de vezels in tegenstelling tot bij Becker musculaire dystrofie, waar wel nog enige kleuring kan vastgesteld worden. Western Blot analyse laat kwantificatie van de hoeveelheid dystrofine en de grootte van het aanwezig eiwit toe. Bij DMD ziet men dat slechts 5% van de normale hoeveelheid dystrofine aanwezig is bij het gebruik van carboxy-terminale antilichamen (Yiu and Kornberg, 2008).

8

Figuur 5: Immunohistochemische kleuring voor dystrofine. A) Normale subsarcolemmale localisatie van dystrofine gedemonstreerd door de lineaire perifere bruine kleuring van elke spiervezel. B) Afwezigheid van dystrofine bij DMD: er is geen kleuring ter hoogte van de vezels (Seidman, 2009; http://emedicine.medscape.com).

1.4

Therapie De behandeling van musculaire dystrofieën hangt sterk af van het type musculaire dystrofie en

de ernst ervan. Gezien de frequentie en ernst van DMD is het onderzoek naar therapieën vooral afgestemd op deze aandoening. Genezing van musculaire dystrofie is echter nog steeds onmogelijk, waardoor de behandeling zich richt op het voorkomen en behandelen van complicaties zoals respiratoir falen en cardiomyopathie (Emery, 2002a).

Medicamenteuze therapie met corticoïden is de standaard therapie van DMD. Een aantal studies suggereren een vertraging van het ziekteproces op korte termijn met glucocorticoïden, maar hun lange termijn effectiviteit moet nog bewezen worden. Het volledig begrijpen van de pathofysiologie zou bijdragen aan de ontwikkeling van een etiologisch farmacologisch middel, wat voorlopig nog ontbreekt (Emery, 2002a). Bij dystrofie patiënten wordt ook gelet op het behouden van ambulantheid met passieve stretching, vooral van de achillespees, iliotibiale banden en de heupflexoren. Het gebruik van ‘night splints’ is belangrijk voor het voorkomen van contracturen en scoliose. Wanneer na verloop van tijd toch contracturen en scoliose optreden, kan chirurgie aangewezen zijn. Voordelen van scoliosechirurgie zijn de preventie van ernstige misvormingen en ongemak, en eventueel een verbetering van de respiratoire functie. Chirurgie heeft echter geen invloed op de levensverwachting (Yiu and Kornberg, 2008).

Bij de complicaties weerhouden we enerzijds respiratoire insufficiëntie. Hierbij is een intermittente non-invasieve positieve-druk ventilatie, bijvoorbeeld met een neusmasker, aangewezen. Een electief geplande tracheostomie in combinatie met deze ventilatie verlengt de levensduur van DMD patiënten sterk. Cardiomyopathie anderzijds, wordt opgespoord met electrocardiografie en

9

echocardiografie. De behandeling van cardiale symptomen bestaat uit diuretica, ACE-inhibitoren en digitalis preparaten. Ook het vroegtijdig opsporen van conductie stoornissen, zoals deze voorkomen bij ‘Emery-Dreifuss’ musculaire dystrofie, is van belang gezien het inplanten van een pacemaker hier levensreddend kan zijn (Emery, 2002a).

Het toekomstperspectief van de behandeling berust op gentherapie en stamceltherapie. Bij gentherapie wordt gebruik gemaakt van een virale vector die gemodificeerd DNA bij de gastheer inbrengt, waardoor het eiwit van interesse wordt geëxpresseerd en zo het defect wordt opgehoffen (Figuur 6). Zo werd een verbetering van de spierfunctie waargenomen in dystrofine deficiënte muizen waarbij een ‘adeno-associated virus (AAV)’ gelinkt aan een mini-dystrofine gen werd ingebracht. Gelijkaardige resultaten werden behaald voor LGMD 2F via een AAV gelinkt aan het deltasarcoglycaan gen. Twee problemen bij deze aanpak komen echter tot uiting: hoe wordt de vector afgeleverd bij alle belangrijke spiergroepen (inclusief het hart), en hoe beperkt men het immunologisch antwoord van de gast tegen de vector en zijn product (Emery, 2002a)?

Figuur 6: Gentherapie waarbij gemodificeerd DNA wordt ingebracht bij de gastheer met behulp van een adenovirus (US National Library of Medicine).

Een andere moleculaire aanpak berust op het gebruik van oligonucleotiden om een mutatie te omzeilen of te herstellen. Door de verscheidenheid aan deleties zouden echter verschillende antisense oligonucleotiden ontwikkeld moeten worden, wat productie op grote schaal moeilijk en duur maakt. Ook aminoglycosiden, zoals gentamicine en negamicine, kunnen gebruikt worden, aangezien zij een ‘read-through’ van het stop-codon veroorzaken. Hun oto-nefrotoxiciteit beperkt wel hun gebruik, evenals het theoretisch risico op een veralgemeende ‘read-through’ van fysiologische stop-codons (Yiu and Kornberg, 2008).

10

Het opreguleren van eiwitten die compenseren voor het deficiënte eiwit kan eveneens een interessante aanpak zijn. Zo werd aangetoond dat door opregulatie van utrofine, een eiwit verwant met dystrofine, de dystrofie in mdx muizen verbeterde. Dit werd ook gezien bij muizen met congenitale musculaire dystrofie, waarbij opregulatie van agrin compenseerde voor de laminine α2 deficiëntie en de aandoening duidelijk verbeterde. De ontwikkeling van farmacologische substraten die deze eiwitten kunnen opreguleren in de mens, zou van therapeutische waarde kunnen zijn (Emery, 2002a; Miura and Jasmin, 2006; Yiu and Kornberg, 2008).

Tot

slot

wordt nog de

mogelijkheid van stamceltherapie onderzocht. Autologe

spiervezelstamcellen van mdx muizen, zogenaamde myogene stamcellen, kunnen ex vivo gencorrecties ondergaan en vervolgens opnieuw ingeplant worden. In tegenstelling tot eerdere experimenten met transplantaties van myoblasten, worden deze myogene stamcellen niet afgestoten door het immuunsysteem van de gast. Voorlopig is het echter moeilijk om voldoende myogene stamcellen te verkrijgen uit dystrofische spieren. Ook beenmergafgeleide stamcellen zijn in staat spieren te remodelleren, maar ook hier zijn nieuwe technieken nodig om voldoende van deze cellen met spierremodellerende capaciteit te isoleren (Yiu and Kornberg, 2008).

2.

Duchenne musculaire dystrofie

2.1

Introductie Duchenne musculaire dystrofie (DMD) is een erfelijke X-gebonden recessieve aandoening,

veroorzaakt door een mutatie in het gen dat codeert voor dystrofine. De aandoening komt voor bij ongeveer 1 op 3500 levend geboren jongens, en wordt gekenmerkt door progressief verlies en zwakte van de skeletspieren. Rond de leeftijd van 4 jaar ontwikkelen patiënten een typisch abnormaal looppatroon, hebben ze een verhoogde valfrequentie en ondervinden ze moeilijkheden bij het nemen van de trap. Typisch is teken van Gowers (Figuur 7) bij het rechtkomen vanuit een zittende positie. Wanneer de pelvische spieren verzwakken, ontwikkelen patiënten een lumbale lordose en een trendelenburg gang (Biggar, 2007). De spierzwakte breidt zich vervolgens uit naar de schoudergordelen bovenarmspieren, de romp en het middenrif. Pseudohypertrofie van de spieren, vooral de kuitspieren, en contracturen zijn frequent. Rond de leeftijd van 13 jaar is lopen niet meer mogelijk en leidt een verlies van ambulantheid tot skeletale afwijkingen zoals scoliose. Respiratoire insufficiëntie treedt op tussen 15 en 20 jaar. Congestieve cardiomyopathie komt bij alle patiënten voor en vormt dikwijls de doodsoorzaak. Huidige therapeutische behandelingen hebben een positieve invloed op de evolutie van de aandoening, maar de levensverwachting van gemiddeld 25 jaar blijft laag door het ontbreken van een etiologische therapie. Bijgevolg is het belangrijk de primaire en downstream mechanismen beter te begrijpen voor het ontwikkelen van nieuwe of adjuvante behandelingen.

11

Figuur 7: Het teken van Gowers: hierbij nemen jongentjes een knie-elleboogpositie aan; vervolgens worden armen en voeten zo dicht mogelijk bij elkaar geplaatst en worden de handen achtereenvolgens op de knieën en dijen geplaatst om zichzelf op te duwen (www.mdconsult.com).

2.2

Het Duchenne musculaire dystrofie gen Het DMD gen (Figuur 8) codeert voor het eiwit dystrofine, een essentieel structureel eiwit

verantwoordelijk voor de stabilisatie van het plasma membraan en tevens deel van het ‘dystrophinassociated protein complex (DAPC, zie verder)’ (Hoffman et al., 1987). Het DMD gen is gelokaliseerd op de korte arm van chromosoom X (genlocus Xp21). Het is een van de grootste gekende humane genen en vormt 0.1% van het totale genoom. Het gen bestaat uit 79 exonen en grote intronen. Door die grootte is het gevoelig aan mutaties, waarbij één derde van de mutaties spontaan ontstaan. De meerderheid van de mutaties zijn intragenische deleties (65-72%) in de ‘hot-spot’ regio, ter hoogte van exon 45-53, waarbij dan vooral deleties van exon 45 en exon 45-47 worden waargenomen. Bij 7% van de patiënten worden enkelvoudige of multi-exon duplicaties gevonden ter hoogte van de ‘minor hot spot’ (exon 2-20). Puntmutaties, kleine deleties en inserties vertegenwoordigen de resterende 20% van de patiënten. Het gaat hierbij meestal om ‘nonsense’, ‘frameshift’ of ‘splice-site’ mutaties. ‘Missense’ mutaties zijn extreem zeldzaam (Yiu and Kornberg, 2008). De ‘reading-frame hypothese’ verklaart het verschil in fenotype tussen Duchenne en Becker musculaire dystrofie. Deze hypothese stelt dat mutaties in het dystrofine gen waarbij het reading frame verschoven wordt, de zogenaamde ‘frameshift mutaties’, resulteren in een niet functioneel dystrofine en bijgevolg ernstig Duchenne fenotype. Dit in tegenstelling tot zogenaamde ‘in-frame mutaties’, waarbij het reading frame bewaard blijft. Deze resulteren in een abnormaal maar gedeeltelijk functioneel dystrofine en bijgevolg een mild Becker fenotype. De hypothese geldt in ongeveer 90% van de gevallen en is van diagnostisch en prognostisch belang (Emery, 2002b; Muntoni et al., 2003).

12

Figuur 8: Het DMD gen. De zwarte verticale lijnen tonen de 79 exonen van het gen. De pijlen tonen de verschillende promotoren zoals ‘Brain (B)’, ‘Muscle (M)’ en ‘Purkinje (P)’. Ieder van deze promotoren heeft een eigen weefselspecifieke expressie en produceert een ‘messenger’-RNA van een andere lengte. Het is nog niet duidelijk wat de functie van al deze genproducten is (Muntoni et al., 2003).

2.3

Het dystrofine eiwit Dystrofine is een eiwit dat behoort tot de β-spectrine/α-actinine familie en deel uitmaakt van

het zogenaamde ‘dystrophin-associated protein complex (DAPC)’. Dystrofine is gelokaliseerd aan de cytoplasmatische zijde van het sarcolemma en vormt daar de zogenaamde costameren. Via een uitgebreid netwerk van proteïnen (het DAPC) worden deze costameren en zo het sarcolemma gekoppeld aan de Z-schijf van myofibrillen. Dystrofine is een 427 kDa eiwit bestaande uit 4 domeinen (Figuur 9). Het amino (N)-terminaal domein bestaat uit een koppel CH domeinen die samen een functioneel actine-bindend domein vormen. Het tweede en grootste domein bestaat uit 24 ‘triple helical spectrine like repeats’ (SR), waartussen 4 ‘putative hinge modules’ aanwezig zijn (H1-H4). Dit domein zou verantwoordelijk zijn voor de verlengde en flexibele staafvorm van dystrofine. Het derde domein, het ‘cysteïne-rijk domein’, omvat 2 EF modules gebonden door WW en ZZ modules. Tot slot is er nog het carboxy (C)-terminaal domein, belangrijk voor binding aan syntrophines en αdystrobrevin-2. Uit studies met transgene mdx muizen blijkt dat voor een minimale functie van het dystrofine het cysteïne-rijk domein in ‘cis’ met ofwel het amino-terminaal domein of met gedeelten van het staaf-domein, noodzakelijk is (Ervasti, 2007).

13

Figuur 9: Het dystrofine eiwit met zijn 4 domeinen (van Deutekom and van Ommen, 2003).

Afwezigheid van dystrofine leidt tot desorganisatie van de costameren, fragiliteit van het sarcolemma, spierzwakte en necrose. Dit wordt verergerd door mechanische stress, maar verbeterd door immobilisatie. Hieruit kan men besluiten dat dystrofine instaat voor de stabilisatie van het sarcolemma gedurende spiercontractie en –uitrekking (Ervasti, 2007).

2.4

Het ‘dystrophin-associated protein complex’ In skelet- en hartspieren vormt het dystrofine samen met andere eiwitten het ‘dystrophin-

associated protein complex (DAPC)’ (Figuur 10). Dit complex speelt een structurele rol in de verankering van het actine-cytoskelet aan de extracellulaire matrix, waardoor het sarcolemma bij herhaalde contracties en relaxaties gestabiliseerd wordt en de krachten afkomstig van de sarcomeren worden doorgegeven aan de extracellulaire matrix. Verder neemt men ook aan dat het DAPC betrokken is bij celsignalisatie door interacties met oa. calmodulin, Grb2 en n-NOS. Verschillende leden van dit DAPC spelen een rol bij spierziekten, wat de belangrijke rol van het DAPC in het bewaren van spierintegriteit illustreert.

Figuur 10: Het ‘dystrophin-associated protein complex’ (Davies and Nowak, 2006).

14

Zoals eerder vermeld is dystrofine een belangrijk onderdeel van het DAPC. De α- en βdystroglycanen vormen echter de kern van het DAPC. Zij zijn verantwoordelijk voor de transmembranaire link tussen dystrofine en laminine-2. Bij de mens zijn hiervan geen mutaties bekend. Ook voor sarcospan, een 25 kDa membraan eiwit met 4 transmembranaire domeinen en intracellulaire N- en C-termini, zijn bij de mens vooralsnog geen gekende mutaties bekend. De sarcoglycanen behoren ook tot het DAPC. Mutaties die leiden tot afwezigheid van 1 van de 5 transmembranaire sarcoglycanen (α, β, γ, δ, ε), resulteren in recessieve LGMD-2D, -2E, -2C en -2F. De α-dystrobrevine-familie vervolgens, bestaat uit 5 isovormen, waarbij enkel het α-dystrobrevine-2 zich vooral bevindt ter hoogte van het sarcolemma. Dystrobrevin is gebonden met dystrofine via coiled-coil interacties, maar ook een onafhankelijke link tussen sarcoglycan en sarcospan kan bestaan. Opvallend is dat afwezigheid van dystrobrevine leidt tot een DMD-fenotype, ondanks een aanwezig DAPC en dus een bewaarde sarcolemma-integriteit. Verder leidt een verlies aan dystrobrevine tot een stoornis in de syncoilin-gemediëerde link tussen het DAPC en desmine filamenten (zie verder), wat mogelijks kan bijdragen tot dystrofie. De syntrophines (α1 en β1 isovormen) dragen bij tot het aantrekken van signaal-eiwitten naar het sarcolemma en het DAPC: interacties bestaan met spier natrium-kanalen, neuronaal stikstofoxide synthase (n-NOS), serine-threonine kinases, … De Cterminale aminozuren (die het ‘syntrophin-unique’ domein vormen) vormen waarschijnlijk verankeringsplaatsen voor leden van de dystrofine-familie. Bij de mens is geen pathologie bekend waarbij mutaties in de syntrophines een rol kunnen spelen. Syncoiline dan, komt in hoge mate voor ter hoogte van het sarcolemma, de Z-junctie en de neuromusculaire junctie. Men veronderstelt dat door interactie met desmine een link ontstaat tussen het sarcolemma en het ‘intermediate filament protein network’. Bij verschillende musculaire dystrofinopathieën zou een upregulatie van dit eiwit een compensatiemechanisme kunnen zijn voor de spierschade. De productie van stikstofoxide door het nNOS is belangrijk voor de toename van de bloodflow bij een verhoogde metabole nood van contraherende spieren, zoals tijdens inspanning. Zo ziet men bij DMD een abnormale bloedvatconstrictie, vermoedelijk door gebrek aan dit n-NOS ter hoogte van het sarcolemma. Dit komt bovendien overeen met de mogelijke rol van het DAPC in celsignalisatie en de bijdrage van ischemie aan spierdegeneratie. Laminines binden met α-dystroglycan en het integrine complex. Ze vormen het structurele deel van de basale membraan, samen met collageen IV, nidogen en perlecan. Mutaties van het α2 gen veroorzaken ernstige congenitale musculaire dystrofie, ondanks de bewaarde sarcolemmaintegriteit. Caveolin-3 tot slot behoort niet tot het eigenlijke DAPC, maar studies tonen een belangrijke relatie aan met het DAPC. Het interageert met dystroglycan, sarcoglycan en dystrofine, en toont een verhoogde expressie in DMD. LGMD-1C, hyperCKemie en ‘rippling muscle disease’ zijn geassocieerd met mutaties in het caveolin-3 gen (Ehmsen et al., 2002; Ervasti, 2007).

15

2.5

Diermodellen Deze scriptie handelt over Duchenne musculaire dystrofie bij de mens, hoewel DMD

homologen ook voorkomen bij verschillende dieren zoals honden, katten, muizen, vissen en ongewervelden. Deze diermodellen (Figuur 11) worden aangewend bij het exploreren van potentiële therapieën zoals celtransplantaties en gentherapieën (Collins and Morgan, 2003).

Muizen met musculaire dystrofie, de zogenaamde ‘mdx muizen’, zijn een van de eerste diermodellen en werden intussen uitgebreid bestudeerd. Deze modellen werden afgeleid van een C57BI/10 kolonie (Bulfield et al., 1984). De spierpathologie bij mdx muizen is het meest uitgesproken tussen de tweede en achtste week na de geboorte. Cyclische degeneratie en regeneratie piekt tussen week drie en vier. Milde myopathie en geassocieerde fibrose zijn chronisch en evolueren naar een acute vorm bij oudere muizen. Sommige spieren, zoals de Musculus masseter worden relatief gespaard, terwijl andere, zoals de Musculus gastrocnemius en vooral het diafragma, ernstig worden aangetast bij oudere muizen. Hoewel hun fenotype dus eerder mild is in vergelijking met humaan DMD, blijkt het een adequaat genetisch en biochemisch model voor DMD te zijn. Deze mdx muizen worden gebruikt voor het testen van nieuwe therapeutische technieken (Collins and Morgan, 2003). Zo werden virale en non-virale gentherapieën getest (Wells and Wells, 2002), en ook oligonucleotide therapieën werden reeds succesvol toegepast (Rando, 2002). Toch kan men deze resultaten niet zomaar extrapoleren naar de mens, vermits deze testen niet werden uitgevoerd op een groter en meer homoloog model van humaan DMD.

De ‘Golden Retriever muscular dystrophic (GRMD) dog’ komt hiervoor wel in aanmerking gezien hun body-mass beter te vergelijken is met de body-mass van DMD patiënten en hun pathogenese sterk gelijk loopt met de humane DMD pathogenese. Deze homologie tussen GRMD en humaan DMD maakt de GRMD hond tot een ideaal model voor klinische testen (Collins and Morgan, 2003).

Dystrofine deficiëntie bij katten resulteert in ’hypertrophic feline muscular dystrophy (HFMD)’. Hierbij ondergaan de skeletspieren repetitieve cyclussen van degeneratie, maar de karakteristieke fibrose die gezien wordt bij DMD en GRMD is afwezig. Door de beperkte pathologische overeenkomst met humaan DMD wordt dit model dan ook weinig gebruikt (Collins and Morgan, 2003).

Recent werden ook zebravis- en C. Elegans-modellen van musculaire dystrofie ontwikkeld. Hoewel deze species evolutionair ver staan van de mens en de resultaten dus niet direct kunnen veralgemeend worden voor de humane DMD patiënt, kunnen ze wel gebruikt worden voor het

16

identificeren en testen van mogelijke nieuwe therapieën in zoogdier homologen (Collins and Morgan, 2003).

Figuur 11: Dystrofinopathieën bij verschillende species (Khurana and Davies, 2003).

2.6

Diagnose De diagnose van DMD bij kinderen moet vermoed worden in geval van abnormale

spierfunctie, het detecteren van een gestegen serum creatine kinase of wanneer gestegen transaminasen (toevallig) ontdekt worden (Figuur 12). Frequent vallen, vertraagd stappen of problemen met het nemen van de trap kunnen de initiële symptomen zijn. Het teken van Gowers moet de diagnose DMD steeds doen vermoeden. Het vertraagd bereiken van ontwikkelingsmijlpalen, zoals onafhankelijk stappen of taalproblemen, moet eveneens aan DMD doen denken. Uiteraard dient men ook bij een positieve familiale anamnese een verhoogde waakzaamheid te hanteren, en een lage drempel voor testen van het creatine kinase is dan aangewezen.

Bij vermoeden van DMD worden genetische testen uitgevoerd om de diagnose al dan niet te bevestigen. De meest uitgevoerde en minst dure test is de PCR multiplex, maar andere testen zijn eveneens beschikbaar. Met deze genetische testen kan de mutatie in het dystrofine gen opgespoord worden. Als analyse door een van deze testen leidt tot de identificatie en volledige karakterisatie van een dystrofine mutatie, is verder onderzoek niet nodig. Indien met genetische testen geen bevestiging van de diagnose kan bekomen worden, is spierbiopsie noodzakelijk. Met behulp van immunohistochemie en Western Blot analyse kan in dat geval de afwezigheid van dystrofine aangetoond worden op de spierbiopt (Bushby et al., 2010).

17

Figuur 12: Diagnose van DMD: de pathway van vermoeden tot bevestiging (Bushby et al., 2010).

2.7

Therapie De standaardtherapie die wordt toegepast omvat het gebruik van corticosteroïden om de

progressie van spierzwakte tegen te gaan, een afterload-reductie voor de cardiomyopathie en een noninvasieve ventilatie voor het respiratoir falen (Wagner, 2008).

Glucocorticoïden zijn de enige klasse van medicijnen met bewezen effect op de spierkracht. De precieze werking van glucocorticoïden is onbekend, maar hun mogelijke positieve effecten zijn: inhibitie

van

spierproteolyse,

stimulatie

van

myoblast

proliferatie,

stabilisatie

van

de

spiervezelmembranen, stijging van het myogene herstel, anti-inflammatoir en immunosuppressief effect, reductie van cytosolische calcium concentraties, verhoogde expressie van utrofine en differentiële regulatie van genen in spiervezels. Dagelijkse inname van orale prednisone, met een startdosis van 0.75 mg/kg/dag, bevordert de spiersterkte en –functie bij kinderen, en dit is dan ook het eerste keuze preparaat. Op lange termijn resulteert dit in langere onafhankelijkheid en verminderde scoliose-vorming. Uiteraard moet met de nevenwerkingen (gewichtstoename, afname botdensiteit) van corticosteroïden rekening gehouden worden, waardoor soms na verloop van tijd tot een vermindering in dosis moet overgaan worden. Deflazacort, een gerelateerd corticosteroïd, kan als tweede keus gebruikt worden in geval van pre-existent overgewicht. Uit dubbel blind gerandomiseerd onderzoek

18

(0.9mg/kg/dag deflazacort vs 0.75mg/kg/dag prednisone of placebo) blijkt geen statistisch significant verschil in spiersterkte of –functie op te treden (Wagner et al., 2007; Wagner, 2008; Bushby et al., 2010).

Het nadeel van glucocorticoïden is dat ze endocriene en metabole nevenwerkingen teweegbrengen, zoals gewichtstoename, hyperglycemie, hypertensie en vermindering van de botdensiteit. Bovendien is hun effectiviteit op lange termijn niet bewezen. Bijgevolg is er nood aan andere en betere therapieën, zoals moleculaire modificatie technieken. Moleculaire modificatie heeft als doel het herstellen van de dystrofine-functie. Hiervoor tracht men het dystrofine gen te herstellen of toe te dienen, waardoor de dystrofine-expressie hersteld wordt en spiernecrose vermindert. Verschillende methoden werden hiervoor voorgesteld. Ten eerste is er de methode die gebruik maakt van een ‘adeno-associated virus (AAV)’. Dit is gebaseerd op het exogeen toedienen van het dystrofine gen, gebonden op een virale vector (bv. cytomegalovirus). Actueel zijn hiervoor klinische trials aan de gang om de veiligheid en effectiviteit van deze methode te bepalen. Tevens wordt getest of men met behulp van gemodificeerd creatine kinase de expressie van dystrofine kan beperken tot de skelet- en hartspieren, waardoor eventuele toxiciteit wordt verminderd. In tegenstelling tot de AAV-methode probeert men bij de ‘antisense oligonucleotiden (AON)’ methode het endogeen dystrofine op het niveau van pre-mRNA te bewaren. Door het gebruik van ‘antisense oligonucleotiden' wordt de afbraak van dystrofine verhinderd, en blijft er een verkort maar functioneel dystrofine over. Hierdoor wordt een Becker fenotype bekomen. Tot slot wordt bij de ‘nonsense-suppression methode’ getracht om het ribosoom zodanig te stabiliseren dat het in staat is om de nonsense mutatie in het dystrofine gen ‘door te lezen’. Hierdoor wordt een volledig dystrofine eiwit geproduceerd, met 1 missense mutatie. Het antibioticum gentamycine wordt in sommige studies naar voor geschoven als werkzaam middel, andere studies ontkrachten dit dan weer. Spiervezels hebben de intrinsieke eigenschap om via progenitor stamcellen te regenereren. Dit gebeurt onder invloed van een groot aantal endogene groeifactoren, waaronder insulin-like growth factor-1 (IGF-1) en leden van de transforming growth factor-β (TGF-β) superfamilie. Hoewel de regeneratie bij spierpathologie, zoals DMD, niet optimaal is door het ontstaan van fibrose en vet infiltratie, ziet men in deze methode toch een functioneel voordeel vermits de grootte en kracht van minimaal aangetaste spieren toeneemt. Myostatine is een lid van de TFG-β familie en een endogene negatieve regulator van spiergroei. Verlies van functie van dit myostatine leidt tot massieve spierhypertrofie. Medicijnen die spiergroei en –regeneratie stimuleren zullen in de toekomst meer en meer gebruikt worden, vooral als adjuvante therapie (Wagner, 2008).

3.

Nucleaire Factor Kappa B Nucleaire factor kappa B (NF-κB) speelt een essentiële rol in tal van cellulaire processen zoals

inflammatie, immuniteit, cel proliferatie en apoptose. De transcriptiefactor is echter niet alleen

19

betrokken bij normale fysiologische processen. Tal van studies duiden er ook op dat NF-κB zeer nauw betrokken is in pathologische mechanismen. Zo is een dysregulatie van NF-κB geassocieerd met verschillende aandoeningen waaronder atherosclerose, AIDS, astma, arthritis, tumoren en musculaire dystrofie (Kumar et al., 2004). In dit deel zullen de verschillende leden van de NF-κB/Rel familie besproken worden. Verder zal besproken worden door wie en hoe NF-κB activiteit wordt gereguleerd, welke de signaalpathways zijn, en tot slot wat de fysiologische rol van NF-κB is.

3.1

De NF-κB/Rel familie De vijf leden van de NF-κB/Rel transcriptiefactor familie, NF-κB1 (p50/p105), NF-κB2

(p52/p100), p65 (RelA), RelB en c-Rel vormen in ongestimuleerde cellen homo- of heterodimeren die gebonden zijn op IκB eiwitten. Ze worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een 300 aminozuren-Rel homologie domein (RHD) gelokaliseerd aan de N-terminus. Dit RHD is verantwoordelijk voor de dimerisatie, interactie met IκB en binding met DNA (May and Ghosh, 1997; Hayden and Ghosh 2004). Verder wordt de familie onderverdeeld in 2 subfamilies op basis van hun transactiverende capaciteit: enerzijds is er de groep bestaande uit RelA, c-Rel en RelB, die C-terminale transactiverende domeinen bevatten. Rel B bevat daarenboven een N-terminaal ‘leucine zipper-likeregion’ en beide N- en C-terminale domeinen zijn noodzakelijk voor een volledig actief RelB (May and Ghosh, 1997). Anderzijds is er de groep bestaande uit p50 en p52. Deze subunits bevatten geen transactiverend domein en worden gesynthetiseerd uit de precursor moleculen p105 en p100 respectievelijk. p50 en p52 zullen dus niet instaan voor gen expressie, tenzij ze dimeren vormen met leden van de eerste subfamilie (Gilmore, 2006). p105 en p100 bevatten aan de C-terminale zijde multipele kopieën van ‘ankyrin repeats’, die ook gezien worden bij leden van de IκB familie. p100 en p105 kunnen dan ook beide de nucleaire lokalisatie en transcriptionele activiteit van de NF-κB/Rel eiwitten waarmee ze dimeriseren, inhiberen (Figuur 13) (May and Ghosh, 1997; Gilmore, 2006).

Figuur 13: De leden van de NF-κB/Rel familie (RHD: Rel-homologie domein; TAD: transactiverend domein; LZ: ‘leucine zipper’ domein; ANK: ‘ankyrin repeats’-regio; DD: regio met homologie aan een ‘death domain’) (Perkins, 2007).

20

Homo- of heterodimeren gevormd door Rel familieleden komen voor zowel in het cytoplasma als de nucleus van een cel. De meest voorkomende NF-κB dimeer is p65/p50, maar ook andere NF-κB subunits vormen homo- of heterodimeren (Tak and Firestein, 2001). RelB vormt een uitzondering, aangezien het enkel kan binden met p50 of p52. Men veronderstelt dat deze dimeren chronisch actief zijn in nuclei van lymfoïde cellen. Actieve NF-κB dimeren binden op specifieke bindingsplaatsen, de zogenaamde κB-sites, in de promotor/enhancer regio van het doelgen (May and Ghosh, 1997). Deze κB-sites vertonen een grote mate aan variabiliteit en hebben als consensus sequentie 5’GGGRNWYYCC-3’ (R= A of G; N= elk nucleotide; W= A of T; Y= C of T) (Gilmore, 2006).

Om de functie van de NF-κB subunits in immuniteit na te gaan werden knock-out (KO) muizen voor verschillende NF-κB eiwitten gecreëerd. Daaruit bleek dat NF-κB eiwitten een rol spelen in de bescherming van de gastheer tegen pathogenen. Zo vertoonden RelA KO muizen embryonale sterfte en leverdegeneratie, in tegenstelling tot p50 of RelB KO muizen die immunodeficiënt waren maar zich wel normaal ontwikkelden. RelB speelt verder nog een rol in de ontwikkeling en differentiatie van dendritische cellen, en een mutatie in het RelB gen leidt tot gestoorde antigen presentatie. Ook voor c-Rel en p52 werd op die manier aangetoond dat ze essentieel zijn voor een normale immuunfunctie (Tak and Firestein, 2001).

3.2

De IκB familie Een eerste mechanisme waardoor de NF-κB activiteit wordt gereguleerd, is via regulatie van

zijn bindingscapaciteit met DNA. Zogenaamde IκB eiwitten, een subfamilie van de ‘Ankyrin repeat domain (ARD)’ superfamilie, binden NF-κB, waardoor DNA binding en nucleaire accumulatie wordt geblokkeerd (Hoffmann et al., 2006). Er werden reeds zes structureel verwante IκB eiwitten beschreven: IκB-α, IκB-β, IκB-ε, IκB-γ, Bcl-3 en IκB-R (May and Ghosh, 1997).

IκB eiwitten bevatten tussen de drie en zeven ‘ankyrin repeats’, een structureel motief noodzakelijk voor NF-κB interactie (zie verder). Verder zien we bij IκB-α, IκB-β en IκB-ε ter hoogte van hun N-terminale zijde twee serine residues gescheiden door drie aminozuren, essentieel voor de controle op hun inhibitorische functie. Tot slot bevatten IκB-α en IκB-β een C-terminale regio rijk aan proline-, glutamaat-, aspartaat-, serine- en threonineresidues, het zogenaamde PEST-domein. Dit domein is een fosforylatie-site en speelt mogelijks een rol in de stabiliteit en inhibitorische functie van het IκB (Figuur 14) (Whiteside and Israël, 1997).

21

Figuur 14: De leden van de IκB familie (ANK: ‘ankyrin repeats’-regio; PEST: regio rijk aan proline-, serine-, aspartaat-, glutamaat- en threonineresidu’s) (Perkins, 2007).

Inhibitie van NF-κB/Rel eiwitten gebeurt via eiwit-eiwit interacties tussen de ‘ankyrin repeats’ van de IκB eiwitten en regio’s van het RHD van NF-κB/Rel dimeren (Whiteside and Israël, 1997). Met uitzondering van Bcl-3 en een ongefosforyleerde vorm van IκB-β, leidt deze interactie tot het maskeren van het ‘nuclear localisation signal’ (NLS) waardoor nucleaire translocatie van de NFκB/Rel dimeren wordt verhinderd (May and Ghosh, 1997). De verscheidene IκB moleculen vertonen verschillen in binding en inhibitie van de NF-κB/Rel complexen. Zo zullen IκB-α en IκB-β interageren met heterodimere complexen van p50 of p52 en RelA of c-Rel, evenals homo- en heterodimeren van RelA en c-Rel. Dit in tegenstelling tot IκB-ε, dat enkel complexen vormt met RelA en/of c-Rel (Whiteside and Israël, 1997) en Bcl-3, dat enkel homodimeren van p50 of p52 inhibeert (May and Ghosh, 1997). IκB-β inhibeert p50-p65 complexen sterker dan dat het p50-relB en p50-c-Rel complexen inhibeert, terwijl IκB-α een gelijkaardig effect heeft op al deze complexen (Tak and Firestein, 2001). Uiteindelijk verschillen IκB moleculen ook in hun reactie op NF-κB inducers. IκB-α degradeert snel bij NF-κB inductie maar wordt vervolgens op een NF-κB-afhankelijke manier geresynthetiseerd, aangezien het als enige IκB eiwit een herkenningssequentie in zijn promotor-regio heeft. Men veronderstelt dan ook dat IκB-α een rol speelt in de transiënte NF-κB activatie. IκB-β en IκB-ε daarentegen, degraderen traag in antwoord op NF-κB-inducers en men neemt aan dat IκB-β een rol speelt in chronische NF-κB activatie: in gestimuleerde cellen is het NF-κB gebonden op hypogefosforyleerd IκB-β waardoor IκB-α niet kan binden en waardoor het NF-κB ontsnapt aan controle. Dit complex transloceert naar de kern, waar IκB-β wordt gedegradeerd of gedissocieerd. Het IκB-α gen met zijn herkenningssequentie voor NF-κB wordt gesynthetiseerd, waarna het nieuw geëxpresseerd/gemodificeerd eiwit dan terug de nucleus binnendringt en het geactiveerde NF-κB exporteert naar het cytoplasma. Hierdoor wordt de activatie van gen expressie beëindigd. Dit in tegenstelling tot IκB-β en IκB-ε, welke niet geïnduceerd worden door NF-κB (Whiteside and Israël, 1997; Tak and Firestein, 2001).

22

3.3

Het IKK complex Degradatie van IκB door middel van signaal-geïnduceerde fosforylatie, is een cruciale

regulatorische stap in de activatie van NF-κB, en wordt geregeld door het IκB kinase (IKK) complex (Li and Verma, 2002). Het IKK complex is een 700-900 kDa complex, bestaande uit 3 subunits: 2 kinase subunits IKKα (IKK1) en IKKβ (IKK2), en een regulatorische subunit ‘NF-κB essential modulator (NEMO/IKKγ). Het NEMO bevat geen intrinsieke kinase activiteit, maar zijn ‘helix-loophelix’ en ‘leucine-zipper’ domeinen zijn betrokken bij eiwit-eiwit-interacties. Het vormt als het ware een platform voor de twee kinase subunits (Figuur 15) (Li and Verma, 2002; Hayden and Ghosh, 2004).

Figuur 15: De verschillende subunits van het IKK-complex (LZ: ‘leucine-zipper’ domein; HLH: ‘helix-loop-helix’ domein; CC1/2: ‘coiled-coil’ domeinen; ZF: ‘zinc-finger’ domein; NBD: NEMO-bindend domein) (Perkins, 2007).

NF-κB signaaltransductie gebeurt op verschillende manieren. In de klassieke activatie pathway (zie verder) komt IKKβ tussen in de fosforylatie van IκB-α op serines (Ser) 32 en 36, en IκBβ op Ser 19 en 23. De rol van IKKα in de klassieke pathway is onduidelijk, hoewel recente studies suggereren dat het de gen expressie reguleert door het modificeren van de fosforylatie-status van histonen. De alternatieve pathway (zie verder) hangt enkel af van IKKα. Dit kinase staat in voor de fosforylatie van p100 (Hayden and Ghosh, 2004). Het moleculaire mechanisme waarbij het IKK complex wordt geactiveerd, is tot nog toe onduidelijk. Zo zou een upstream IKK kinase geactiveerd kunnen worden door ligand-gebonden receptoren of zou een ‘scaffolding’ eiwit het IKK complex dicht bij de receptor kunnen brengen, waardoor een conformationele verandering leidt tot IKK autofosforylatie (Li and Verma, 2002).

Uit muisstudies is gebleken dat IKKα en IKKβ beiden noodzakelijk zijn voor het overleven van de embryo’s. Ze spelen echter een verschillende rol in de embryonale ontwikkeling. Zo heeft

23

IKKα een unieke functie in B-cel maturatie en huid- en skeletontwikkeling, en afwezigheid ervan kan niet gecompenseerd worden door IKKβ. IKKβ daarentegen speelt een onmisbare rol bij geïnduceerde NF-κB-activatie als antwoord op pro-inflammatoire en pro-apoptotische stimuli. KO van NEMO tot slot, leidt tot ernstige leverdegeneratie en embryonale sterfte (Kumar et al., 2004).

3.4

NF-κB signaling en transcriptionele activatie De activatie van NF-κB is een respons op diverse stimuli zoals pathogenen, stress en pro-

inflammatoire cytokines, en deze activatie kan via verschillende pathways verlopen. Hoewel voor deze pathways een bijna universele sequentie van IKK-activatie, IκB-degradatie en toename van de transcriptionele activiteit van NF-κB bestaat, kennen ze ook een bepaalde mate aan variabiliteit (Hayden and Ghosh, 2004). Activatie veronderstelt fosforylatie van IκB door het IKK-complex. Geactiveerd IKK initieert IκB-α fosforylatie, waarna IκB-α wordt gedegradeerd door het 26S proteasoom. Hierdoor treedt een ontkoppeling op van NF-κB-dimeren afkomstig van het cytoplasmatische NF-κB-IκB complex. De vrije NF-κB-dimeren dringen nadien de nucleus binnen, waar ze binden aan specifieke sequenties in de promotor-regio’s van de doelgenen. Deze genen staan onder andere in voor de expressie van enzymes, pro-inflammatoire cytokines, chemokines en immuunreceptoren. In dit deel zullen de meest courante pathways besproken worden (Figuur 15).

3.4.1 Effectoren van celactivatie en hun receptoren Extracellulaire pathogenen worden herkend door specifieke ‘pattern-recognition receptors (PRR’s)’ die zich ontwikkeld hebben in het herkennen van pathogeen-specifieke substraten zoals lipopolysaccharide (LPS) peptidylglycanen, lipoproteïnen, bacterieel DNA en dubbelstrengig RNA. De meest gekende PRR’s zijn de Toll-like receptoren (TLR’s), een groep van transmembranaire eiwitten. Deze TLR’s herkennen extracellulaire pathogenen direct of indirect en mediëeren de activatie van intracellulaire signaalpathways. Tot nog toe zijn reeds elf leden (TLR1 tot TLR11) van de familie bekend, waarbij vooral TLR2 en TLR4 essentieel zijn voor het herkennen van bacteriële celwandcomponenten (Li and Verma, 2002; Hayden and Ghosh, 2004). Verder vormen proinflammatoire cytokines zoals Interleukine 1 (IL-1) en Tumor necrosis factor α (TNF-α) essentiële factoren van NF-κB activatie. Ze worden geproduceerd door geactiveerde macrofagen en monocyten en dragen bij tot de lymfocyt- en leukocytenactivatie. IL-1 activeert NF-κB op een soortgelijke wijze als LPS omwille van de homologie tussen de cytoplasmatische signaaldomeinen van de IL-1-receptor (IL-1R) en TLR’s (Li and Verma, 2002; Hayden and Ghosh, 2004). ‘Mitogen-activated protein (MAP) /extracellular signal-regulated kinase (ERK) kinase 3’ (MEKK3) en ‘receptor-interacting serine/threonine kinase (RIP) spelen waarschijnlijk een rol in de link tussen TNF-α en activatie van IKK (Li and Verma, 2002).

24

Tenslotte zijn er de T-cel receptor (TCR) en de B-cel receptor (BCR). Zij zijn belangrijk voor antigen-specifieke proliferatie en maturatie van lymfocyten in effector-cellen. De pathway van deze twee antigen receptoren is functioneel analoog, maar moleculair verschillend (Hayden and Ghosh, 2004). TCR-geïnduceerde activatie in perifere T-cellen vereist een costimulatoir signaal van CD28, en de activatie van proteïne kinase Cθ (PKCθ) en IKKβ. PKCθ is essentieel in deze pathway, maar de link tussen PKCθ en IKKβ is echter nog onvolledig begrepen. Trimoleculaire complexen van ‘membrane-associated guanylate kinase homologue’ (MAGUK) en ‘mucosal-associated lymphoid tissue (MALT)-lymphoma-associated proteins’, BCL-10 en MALT1 spelen een rol in de link tussen PKCθ en IKK complexen (Li and Verma, 2002). BCL-10 is tevens cruciaal voor NF-κB activatie via de B-cel receptor (Hayden and Ghosh, 2004).

Figuur 16: De NF-κB-activatie pathways. Het IKK complex, bestaande uit IKKα, IKKβ en NEMO, is een convergentiepunt voor elk van de drie pathways. (a): activatie door binding van LPS aan Toll-like receptor 4 (TLR4); (b): activatie door binding van TNF-α op TNFR1; (c): T-cel receptor geïnduceerde activatie (Li and Verma, 2002).

25

3.4.2

Downstream intracellulaire pathways Twee types van NF-κB activatie pathways werden de voorbije jaren gekarakteriseerd en deze

verschillen in het type van stimuli, de betrokken IKK componenten en de NF-κB subunits (Figuur 17) (Scheidereit, 2006).

De klassieke,‘canonical’ pathway wordt geïnduceerd door alle fysiologische NF-κB-stimuli zoals inflammatoire cytokines (TNF-α), pathogeen-geassocieerde moleculen (LPS) en antigen receptoren (TCR). Ze wordt gekenmerkt door IKKβ- en NEMO-afhankelijke degradatie van IκB eiwitten met nucleaire translocatie van vooral RelA-heterodimeren (Scheidereit, 2006). Modificatie van de regulatorische NEMO subunit door ubiquitinatie op lysine 63, leidt tot rekrutering van kinases zoals ‘transforming growth factor beta (TGF-β)- activated kinase’ (TAK1). Dit kinase staat dan weer in voor fosforylatie van Ser 177 en 181 in de ‘activation loop’ van IKKβ (Perkins, 2007). IKKβ wordt vervolgens verder gefosforyleerd ter hoogte van serine-residues C-terminaal van het HLH-motief, vermoedelijk via autofosforylatie (Hayden and Ghosh, 2004). Deze processen leiden verder tot fosforylatie van IκB-α ter hoogte van Ser32 en 36 en tot ubiquitinatie gevolgd door degradatie in het 26S proteasoom (Perkins, 2007). De daaruit volgende vrijstelling van de NF-κB heterodimeer p50/p65 laat translocatie toe naar de nucleus.

De alternatieve, ‘non-canonical’ pathway, maakt gebruik van het IKKα. Stimuli zoals ‘B-cell activating factor’ (BAFF), ‘lymphotoxin β’ (LTβ) en TNF-gerelateerde stimuli, activeren deze pathway en geven aanleiding tot downstream fosforylatie en synthese van p52 uit p100 (Scheidereit, 2006). Activatie van IKKα door het ‘NF-κB-inducing kinase’ (NIK, lid van de MAP3K familie) zou, naar men vermoedt, een functionele samenwerking teweegbrengen tussen de twee eiwitten. Er zou bijvoorbeeld een ‘docking’ plaats kunnen gecreëerd worden voor p100 aan IKKα. Dit proces leidt op zijn beurt tot de rekrutering van het SCFβ-TrCP ubiquitinatie ligase en de proteasomale processing van p100 tot p52. Dit leidt tot de vorming van p52-RelB heterodimeren die dan weer instaan voor de expressie van hun specifieke doelwitgenen (Scheidereit, 2006).

Er moet opgemerkt worden dat hoewel beide pathways apart beschreven worden, deze toch in nauw verband staan met elkaar vermits de expressie van p100 en RelB onder de controle van de canonical pathway staat. Verder zijn er inducers, zoals LPS, die operatief zijn in beide pathways. Karakteristiek voor de non-canonical pathway is de trage kinetiek van de p100 tot p52 conversie, die uren duurt in vergelijking met de snelle, in orde van minuten, degradatie van IκB in de canonical pathway. Bovendien resulteert de non-canonical pathway meestal in langdurende NF-κB-activatie en is het gevoelig aan ribosomale inhibitie, in tegenstelling tot de klassieke pathway (Scheidereit, 2006).

26

Vandaar ook dat men vermoedt dat de alternatieve, non-canonical, pathway een belangrijkere rol speelt in chronische inflammatie.

Figuur 17: De klassieke of canonical en alternatieve of non-canonical pathway (Chen and Greene, 2004).

3.4.3 Ubiquitinatie en 26S proteasoom Activatie van NF-κB houdt de fosforylatie, degradatie en ubiquitinatie in van zijn inhibitor IκB. Eens een ligand gebonden is op zijn receptor, zal bijvoorbeeld downstream IκB-α gefosforyleerd worden. Hierdoor wordt het herkend door SCFβ-TrCP, een E3-ligase dat deel uitmaakt van het 26S proteasoom. Oorspronkelijk dacht men dat het ubiquitinatie-proteolyse systeem enkel tussenkwam in de verwijdering van aberrant functionerende eiwitten. Het proteolytisch systeem speelt echter ook een rol in het controleren van de overmaat aan functioneel regulatorische eiwitten zoals transcriptiefactoren, celgroeimediatoren, signaaltransducers, oncoproteïnen en celcyclus eiwitten (Karin and Ben-Neriah, 2000).

Degradatie door middel van ubiquitinatie van onder andere IκB-α bestaat uit verschillende stappen die op een sequentiële en hiërarchische wijze samenwerken: nadat IκB-α gefosforyleerd wordt, zal een link gemaakt worden tussen een ‘ubiquitin-activating-enzyme’ (E1) en een ubiquitine molecule. Vervolgens treedt door transacylatie een ubiquitine transfer op naar een of meerdere ‘ ubiquitin-conjugating-enzymes’ (E2). Tot slot worden met behulp van ‘protein-ubiquitin-ligases’ (E3), die een interactie aangaan met E2, ubiquitine polymeren gevormd aan de Serine-ε-amino-groep van gefosforyleerd IκB-α (pIκB-α). pIκB-α bevat daarvoor een herkenningssequentie voor het SCFβ-TrCP,

27

een E3-ligase, gevormd door ‘DS*GXXS’ (S* staat voor fosfoserine). Deze ‘short peptide stretch’ is één van de meest gedefinieerde E3-herkenningsmotieven. Een lysine residu, gelokaliseerd 9-12 aminozuren NH2-terminaal van de herkenningssequentie, wordt dan geselecteerd door SCFβ-TrCP complex en een specifiek E2, UbcH5, voor de aanhechting van een poly-ubiquitinatie ketting. Tot slot wordt het gefosforyleerd IκB-α selectief gedegradeerd door het 26S proteasoom (Figuur 18) (BenNeriah, 2002).

Figuur 18: Het 26S proteasoom, verantwoordelijk voor de degradatie van geubiquitineerde eiwitten. Het 20S-deel bevat het catalytisch domein. Het 19S-deel herkent de poly-ubiquitineerde eiwitten, ontplooit en verwijdert ubiquitine van het substraat (Marteijn et al., 2006).

3.4.4 Nucleaire migratie en DNA-binding Degradatie van IκB-α en nucleaire translocatie van NF-κB is niet voldoende voor een maximale NF-κB-transcriptionele activiteit. Het NF-κB complex moet hiervoor bijkomende posttranslationele modificaties ondergaan onder de vorm van fosforylatie (Figuur 19). De p65 subunit van NF-κB heeft hiervoor zowel in het RHD- als de TAD-regio specifieke ‘fosfoacceptor’ sites die een doelwit vormen voor fosforylatie door verschillende kinasen zoals ‘protein kinase A catalytic subunit (PKAc)’, ‘mitogen- and stress-activated kinase’ en ‘protein kinase zeta (PKCζ)’. Deze kinasen functioneren zowel in het cytoplasma als in de kern en worden geïnduceerd door verscheidene stimuli (Li and Verma, 2002; Chen and Greene, 2004). Het resultaat van deze fosforylatie is een gemakkelijkere rekrutering van verscheidene transcriptionele co-activatoren zoals ‘p300/CREBbinding protein (CBP)’ en ‘p300/CBP-associated factor (PCAF)’, en het gemodificeerd NF-κB complex is nadien beter in staat om het transcriptioneel repressieve ‘histone deacetylase (HDAC)’ complex te verwijderen (Chen and Greene, 2004). Transcriptionele activiteit wordt immers gecontroleerd via de werking van ‘histon acetyltransferases (HATs)’ zoals CBP/p300 en ‘histon deacetylases (HDAC)’. De histon-acetylatie status beïnvloedt het chromatine en bepaalt de toegankelijkheid van DNA voor gen expressie. Associatie van p65 en HDAC-1 en -2 inhibeert de expressie van NF-κB-gereguleerde genen, zowel bij basale als bij gestimuleerde spiegels van NF-κB. Gefosforyleerd p65 echter, associeert met p300/CBP en dit complex verwijdert op zijn beurt het p50-

28

HDAC-1 complex van DNA waardoor NF-κB-afhankelijke gen expressie kan starten. Ook de acetylatie status van p65 heeft een regulatorische functie, gezien het de duur van de NF-κB transcriptionele antwoorden kan beïnvloeden. Deacetylatie van p65 door HDAC-3 versterkt immers de binding aan IκB-α (Li and Verma, 2002). Het IκB-α diffundeert heen en weer uit de nucleus door actieve nucleaire import en export signalen, en binding van het NF-κB complex aan IκB-α leidt tot export van het NF-κB complex uit de nucleus waardoor de transcriptie wordt beëindigd (Chen and Greene, 2004).

Figuur 19: Een model van de manier waarop NF-κB fosforylatie zijn transactiverende functie reguleert (Li and Verma, 2002).

3.4.5 Fysiologische rol van NF-κB Zoals reeds eerder vermeld is NF-κB een transcriptiefactor die een essentiële rol speelt in de regulatie van een brede waaier aan genen betrokken bij tal van cellulaire processen zoals inflammatie, immuniteit, celproliferatie en apoptose. Dysregulatie van NF-κB is geassocieerd met verschillende ziekten zoals astma en arthritis en aanvullende gegevens suggereren tevens een rol in genetische aandoeningen zoals musculaire dystrofieën (Kumar et al., 2004).

Uit verscheidene studies blijkt dat NF-κB een belangrijke rol speelt in de suppressie van apoptose. Zo blijkt immers dat RelA deficiënte muizen vroeg in hun leven sterven ten gevolge van excessieve leverapoptose. Bovendien wordt vastgesteld dat activatie van NF-κB leidt tot een daling van de pro-apoptotische activiteit van TNF-α. De anti-apoptotische activiteit van NF-κB hangt af van gen-inductie, meer bepaald leidt NF-κB tot de expressie van een aantal producten die de apoptose

29

inhiberen zoals ‘cellular inhibitors of apoptosis’, ‘caspase-8-c-FLIP’ en ‘TNFR-associated-factor 1’ (Karin and Lin, 2002). Gezien de anti-apoptotische eigenschappen van NF-κB, verwachtte men dat deze ook een invloed had op de ontwikkeling van het immuunsysteem. Zo toonden gen-KO en transgene degradatie-resistente IκB-expressie in muizen overtuigend aan dat stoornissen in de NF-κBfamilie leidden tot een verstoorde humorale immuunrespons. Hoewel er geen stoornis in de B-cel maturatie werd gezien bij muizen waar slechts één NF-κB-eiwit ontbrak, waren verschillende B-cel functies toch defectief. Ook waren de B-cellen van p50-deficiënte muizen onresponsief voor LPS. De afwezigheid van meerdere NF-κB-eiwitten resulteerde in duidelijke B-cel ontwikkelingsdefecten. Uit deze studies kan men concluderen dat NF-κB-eiwitten noodzakelijk zijn voor B-cel-ontwikkeling, proliferatie, en –effectorfuncties. Verder suggereren studies dat NF-κB-activatie door IKKα of IKKβ essentieel is voor de productie en overleving van mature T-cellen, en dat IKKβ een additionele rol speelt in regulatoire en geheugen T-cel ontwikkeling. NF-κB is ook betrokken bij de ontwikkeling van dendritische cellen en de verwerking en antigenpresentatie aan T-cellen. NF-κB controleert de expressie van cytokines zoals IL-18 en interferon-γ, noodzakelijk voor de T-cel respons. NF-κB is dus van belang voor de proliferatie van T-cellen (Kumar et al., 2004).

30

Methodologie

Het doel van deze scriptie was om na te gaan of NF-κB een rol speelt in de pathogenese van DMD. Om een antwoord te vinden op deze onderzoeksvraag werd gestart met de zoektocht naar algemene publicaties met betrekking tot Duchenne musculaire dystrofie, dit om een beeld te krijgen van de aandoening en zijn verloop. Hiervoor werd gebruik gemaakt van Pubmed. Algemene zoektermen zoals ‘Duchenne muscular dystrophy’ en ‘Duchenne muscular dystrophy review’ leverden lange lijsten van publicaties op, maar enkele relevante overzichtsartikelen konden hieruit weerhouden worden. Dezelfde strategie werd gevolgd om een beeld te krijgen van de musculaire dystrofieën, waartoe DMD behoort. Vanuit deze overzichtsartikelen werden de referenties nagekeken, en relevante artikelen werden opnieuw weerhouden. Ook via de ‘related articles’ die Pubmed zelf aangeeft, konden enkele publicaties geïncludeerd worden.

Vervolgens werd literatuur gezocht over ‘Nucleaire factor kappa B’. Opnieuw werd hiervoor Pubmed geconsulteerd. De lijst met resultaten was echter zeer lang en daarom werden met behulp van Mesh specifieke zoektermen toegevoegd: ‘NF-κB AND genetics’, ‘NF-κB and classification’, ‘NF-κB AND physiology’… De meeste vooruitgang werd echter geboekt door het nalezen van een overzichtsartikel, waarin verscheidene referenties werden aangehaald die veel informatie bevatten. Zo bleek dat over dit onderwerp een aantal auteurs veelvuldig werden geciteerd, en deze artikels waren dan ook een betrouwbare bron van informatie.

Tot slot werd de link tussen Duchenne musculaire dystrofie en NF-κB onderzocht. De zoekterm ‘Duchenne muscular dystrophy AND NF-κB’ volstond om hiervoor de nodige publicaties te verzamelen. Opnieuw werd dit nog verder uitgebreid via de referentielijsten.

Alle geselecteerde publicaties werden online verkregen met de licentie van de Universiteitsbibliotheek Gent en dit gebeurde ofwel via de Biomedische Bibliotheek van het Universitair Ziekenhuis Gent, ofwel van thuis uit waarbij gebruik werd gemaakt van een VPN-verbinding.

31

Resultaten

1.

Histopathologie van DMD Spierbiopsieën bij DMD patiënten vertonen karakteristieke necrotische of degenererende

spiervezels die dikwijls geclusterd zitten. De necrotische spiervezels trekken door vrijstelling van verscheidene toxische mediatoren inflammatoire cellen aan, voornamelijk macrofagen en CD4+ lymfocyten (Figuur 20, Figuur 21). Zij zullen uiteindelijk instaan voor de fagocytose van de necrotische spiervezel. In de beginstadia van de aandoening treedt spierregeneratie op vanuit myoblasten, waarbij kleine, immature vezels gevormd worden. Naarmate de aandoening echter vordert, neemt de regenererende capaciteit af en wordt spierweefsel vervangen door fibrose en vetweefsel (Deconinck and Dan, 2007). Een bijkomend karakteristiek kenmerk is het voorkomen van ‘hypercontracted fibers’ (Figuur 21). Deze zouden ontstaan door een verhoogde calcium-influx ter hoogte van de defecte spiervezelmembranen (Lotz and Engel, 1987). Ten laatste kunnen ook ‘revertant fibers’ worden waargenomen, die ten gevolge van een tweede mutatie in het dystrofine gen hun dystrofine-producerende functie hebben hersteld (Seidman, 2009, http://emedicine.medscape.com).

Figuur 20: Spierbiopsie van een DMD patiënt met een typische necrotische vezel en fagocytaire mononucleaire cellen (ster), prominente fibrose en een verhoogde variatie in spiervezelgrootte (Seidman, 2009, http://emedicine.medscape.com).

Spierbiopsieën laten eveneens toe de dystrofine deficiëntie aan te tonen door middel van immunohistochemische onderzoeken (Figuur 5). Hierbij worden antilichamen gebruikt die gericht zijn tegen N-terminale, ‘mid-rod’, of C-terminale regio’s van dystrofine (Bushby et al., 2010). Bij normale skeletspieren wordt de aanwezigheid van dystrofine ter hoogte van de spiermembraan waargenomen; dit in tegenstelling tot spierbiopsieën bij DMD patiënten waarbij dystrofine afwezig is (Seidman Seidman, 2009, http://emedicine.medscape.com).

32

Figuur 21: hematoxyline en eosine kleuring van verschillende DMD biopsieën. A) ‘hypercontracted fiber’ (ster); B) necrotische spiervezel (ster); C) necrotische spiervezel (ster) met inflammatie; D) endomysiale inflammatie (ster) (Persoonlijke communicatie met Prof. Dr. De Bleecker).

2.

Immunopathogenese van DMD Zoals eerder vermeld is de link tussen de dystrofine deficiëntie en de daaropvolgende

musculaire degeneratie nog niet volledig begrepen. De dramatisch progressieve evolutie van dystrofine deficiëntie in mensen en honden, maar niet in katten en knaagdieren, impliceert dat er belangrijke, secundaire downstream effectoren van spierzwakte en spieratrofie moeten bestaan. De klinische verschillen tussen de menselijke DMD en zijn dieranalogen ondersteunen deze stelling (Chen et al, 2000). Verschillende pathofysiologische hypothesen worden naar voor geschoven, met als belangrijkste de mechanische en de calcium hypothese. Het volledig begrijpen van de pathofysiologie is echter noodzakelijk voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsmethoden voor DMD (Deconinck and Dan, 2007).

2.1

De mechanische hypothese Deze hypothese stelt dat de afwezigheid van dystrofine of een ander eiwit van het DAPC de

stabiliteit van de spiermembraan verstoort, vooral na aangehouden contracties. Het DAPC en andere

33

proteïnes zoals vinculin, desmine en spectrine vormen in normale omstandigheden costameren die het cytoskelet verankeren aan de extracellulaire matrix. De costameren zorgen voor een evenredige verdeling van de contractiele krachten over het sarcolemma en de basale lamina waardoor een uniforme sarcomeerlengte over de spiervezel wordt behouden. Een verstoring in het DAPC leidt tot een verlies van functie van de costameren, met membraan instabiliteit en spierschade tot gevolg (Deconinck and Dan, 2007).

2.2

De calcium hypothese Voor een normale spierfunctie is een strikte regeling van de inwendige calcium (Ca2+) –balans

noodzakelijk. De waarneming van accumulatie van Ca2+ in spierbiopsieën leidde tot onderzoek naar de rol van Ca2+ in DMD. Verhoogde influx door een dystrofine deficiënte membraan werd gedemonstreerd. Wanneer mechanische stress microlesies veroorzaakt in de spiervezels zal influx optreden van extracellulair Ca2+. De vezel zal onder invloed van deze hoge influx niet in staat zijn een fysiologische Ca2+-concentratie te bewaren, waardoor de aangehouden verhoogde Ca2+-levels in het cytosol uiteindelijk zullen leiden tot activatie van cellulaire proteasen en de celmembraan zal vernietigd worden. De Ca2+ influx zal op die manier nog toenemen, waardoor tot slot celdood optreedt (Figuur 22). De verhoogde cytosolische calcium concentratie zou ook kunnen leiden tot de productie van vrije zuurstofradicalen die verantwoordelijk kunnen zijn voor eiwit en membraanschade. Verder kunnen deze vrije zuurstofradicalen leiden tot de activatie van inflammatoire pathways die bijdragen tot het dystrofisch proces (Whitehead et al., 2006; Deconinck and Dan, 2007).

Figuur 22: Dystrofine deficiënte spiercellen kennen een verstoorde calcium homeostase, wat uiteindelijk spiernecrose veroorzaakt (Constantin et al., 2006).

34

2.3

De vasculaire hypothese Stikstofoxide (NO) is werkzaam als dilatator en zorgt voor een correcte toevoer van zuurstof

naar de spieren. Het wordt geproduceerd in spiercellen door ‘neuronal nitric oxide synthase’ (n-NOS), dat ter hoogte van het sarcolemma is gebonden op sarcolemmale eiwitten zoals dystrobrevine en syntrofine. In dystrofine deficiënte spiervezels is dit n-NOS niet langer sarcolemmaal gebonden door een verstoorde eiwitverankering en is zijn hoeveelheid verminderd. Bijgevolg wordt ook minder NO geproduceerd en treedt een vermindering op van de zuurstofaanvoer naar de spier. Dit leidt vervolgens tot ischemie en spierschade. Studies in n-NOS KO muizen toonden echter aan dat deze muizen geen spierziekte ontwikkelden, wat suggereert dat n-NOS geen directe rol speelt bij DMD maar bijdraagt tot schade en inflammatie in de spiervezels (Crosbie, 2001; Deconinck and Dan, 2007).

2.4

De genregulatie hypothese Het DAPC speelt naast zijn rol als membraanstabilisator ook een rol in andere processen zoals

mechano-transductie, i.e. spieractiviteit-gerelateerde gen expressie. Een verstoring in het DAPC bij DMD patiënten resulteert in een veranderde expressie van verschillende genen. Zo werd in het hart van mdx muizen aangetoond dat genen zoals calcineurin, p38 mitogen-activated protein kinase en cJun N-terminal kinases onder mechanische stress werden opgereguleerd. Recente studies tonen aan dat gelijkaardige gen expressie-patronen voorkomen bij Duchennes en gezonde individuen die uithoudingstraining ondergingen. Deze studies doen vermoeden dat bij Duchennes een mechanisme in werking wordt gesteld als compensatie voor de afwezigheid van het dystrofine eiwit. Vermoed wordt dat vooral de integrine signaal pathway hierin een grote rol speelt (Deconinck and Dan, 2007). Intracellulaire signaalwegen, vooral deze met betrekking tot inflammatie, zouden verantwoordelijk zijn voor het starten van de initiële fasen en het reguleren van de dystrofie. Expressie van genen verantwoordelijk voor deze inflammatoire signalisatie (zoals cytokines, chemokines, …) zijn al in vroege fases van dystrofie verhoogd. Verder wordt verondersteld dat verhoogde expressie van deze genen ook extracellulaire signalisatie triggert, die resulteert in infiltratie en activatie van immuuncellen in dystrofische spieren. Het beïnvloeden van deze verhoogde expressiepatronen zou een gunstig effect kunnen hebben op DMD (Evans et al., 2009).

2.5

Tissue remodeling hypothese Gezien de verstoorde spierregeneratie in DMD spieren kan de spier zichzelf niet herstellen bij

spierschade. Het verstoord evenwicht tussen spierschade en spierherstel resulteert in spierverlies en uiteindelijk een afname van de functionele capaciteit van de spier. Het behoud van de spiermassa bij DMD patiënten zou deze functionele afname vertragen. Het gebruik van groeifactoren voor het

35

bekomen van een positieve eiwitbalans kan hiervoor in aanmerking komen. Zo werd aangetoond dat ‘insulin growth factor 1’ bij mdx muizen leidde tot een toegenomen spiermassa, verhoogde specifieke kracht en geïnduceerde spierhyperplasie (Barton et al., 2002). Een tweede optie berust op het gebruik van anabole steroïden, hoewel hiervoor wisselende successen en bijwerkingen werden gerapporteerd (Deconinck and Dan, 2007).

2.6

De inflammatoire hypothese De inflammatoire hypothese tot slot gaat uit van secundaire inflammatoire veranderingen in

spiervezels van DMD patiënten. De veranderingen vertonen het patroon van een chronisch inflammatoir antwoord: cytokine- en chemokine-signaling, leukocyten-adhesie en diapedese, en complement activatie (Deconinck and Dan, 2007). Depletie van CD4+ en CD8+ T-cellen bij mdx muizen op de piek van ziekteprogressie resulteerde in een enorme vermindering in de mate van histologisch waarneembare pathologie. Op welke manier deze cellen leiden tot dystrofische pathologie is echter onbekend, maar de rol van het immuunsysteem als een bijdragende factor tot dystrofinopathieën kan leiden tot nieuwe therapeutische mogelijkheden (Spencer et al., 2001). Gebaseerd op deze inflammatoire hypothese en hun krachtige anti-inflammatoire werking vormen corticosteroïden de huidige basistherapie voor DMD (Deconinck and Dan, 2007).

3.

NF-κB in Duchenne musculaire dystrofie Verschillende studies toonden reeds aan dat het ontstaan van DMD gepaard gaat met een

inflammatoire respons waarbij leukocyten infiltreren in het spierweefsel en waarbij verscheidene inflammatoire mediatoren worden vrijgesteld (Kumar et al., 2004). Aangezien NF-κB een belangrijke rol speelt in het moduleren van de inflammatoire, proliferatieve en cellulaire immuunrespons, werd de mogelijke rol van NF-κB in de pathogenese van DMD onderzocht.

3.1

NF-κB in Duchenne muismodellen Mdx muizen vertonen histopathologisch een milder fenotype van DMD. De spierpathologie is

vrij matig en de mechanische functie is minder ernstig aangetast waardoor zij een vrij normale levensloop hebben. Desondanks worden zij sinds de ontdekking van het dystrofine gen beschouwd als een genetisch en biochemisch homoloog van humaan DMD (Collins and Morgan, 2003).

Kumar et al. (2003) bestudeerden het effect van passieve mechanische stretch op de activatie van NF-κB in skeletspieren van normale en mdx muizen. De DNA-bindingsactiviteit van NF-κB in het diafragma was verhoogd ten gevolge van de axiale mechanische stretch op een tijdsafhankelijke wijze.

36

Deze verhoogde NF-κB activiteit ging samen met een stijging van de IκB kinase activiteit en de degradatie van IκB-α. Met behulp van antilichamen tegen p50, p65 of een combinatie van deze subunits, kon men bepalen dat het mechanisch stretch-geactiveerd complex vooral bestond uit p50 en p65 eiwitten. Vergeleken met controle muizen bleek de activatie van NF-κB significant hoger te zijn bij mdx muizen en de data demonstreerde dat NF-κB activatie het optreden van dystrofie voorafgaat (Kumar and Boriek, 2003).

Door inhibitie van de lipide peroxidatie en oxidatieve stress pathways wordt de activatie van NF-κB geblokkeerd en het effect hiervan op het dystrofische proces in mdx muizen werd bestudeerd door Messina et al. (2006a). Als gevolg van de inhibitie bleek de DNA-bindingsactiviteit van NF-κB en de TNF-α expressie te verzwakken. Hierdoor trad een verminderde spiernecrose op en een toegenomen regeneratie (Messina et al., 2006a). Messina et al. (2006b) evalueerden, eveneens in 2006, het effect van ‘pyrrolidine dithiocarbamaat’ (PDTC), een gekende NF-κB inhibitor, op het dystrofisch proces bij mdx muizen, waarbij vergelijkbare resultaten werden bekomen (Messina et al., 2006b).

Ook Acharyya et al. (2007) vonden een significant hogere NF-κB bindingsactiviteit in spieren van mdx muizen vergeleken met controles. Gefosforyleerd, en dus actief p65, werd vooral gezien in immuuncellen en regenererende spiervezels en dit expressiepatroon kon men ook waarnemen bij spieren van DMD patiënten (Figuur 23). In tegenstelling tot de resultaten van andere auteurs, bleek deze activiteit echter vooral te berusten op p50 en minder op p65. Zowel bij wild type (WT) als mdx muizen zag men tijdens de eerste levensweken een verhoogde NF-κB activatie die tijdens de volgende weken van postnatale ontwikkeling afnam. Bij de mdx muizen echter, werd de NF-κB activiteit opnieuw verhoogd na de initiële afname en bleef deze aangehouden over een lange periode. Tot slot stelde men zich de vraag of farmacologische inhibitie van IKK met ‘Nemo-binding domain (NBD) peptide’ een mogelijke therapeutische optie zou kunnen zijn in de behandeling van DMD. Hierbij kon men vaststellen dat er een verbetering van de pathologie en spierfunctie optrad bij de mdx muizen (Acharyya et al., 2007).

37

Figuur 23: Consecutieve secties van normaal spierweefsel en DMD weefsel. Boven telkens H&E en onder geactiveerd p65 (DAB) (Acharyya et al., 2007).

Hnia et al. (2008) demonstreerden dat door het toedienen van L-arginine, het substraat van nNOS, de inflammatie verminderde en de spierregeneratie toenam in mdx muizen. Klassieke stimulatoire signalen zoals interleukin-6 en TNF-α waren door dit L-arginine eveneens verlaagd, wat resulteerde in een verlaagde NF-κB- concentratie en -activiteit (Hnia et al., 2008). Ook toediening van curcumine, een potente inhibitor van NF-κB, leidde tot een verbetering van de spierdystrofie bij mdx muizen (Pan et al., 2008).

3.2

NF-κB in Duchenne spierweefsel Monici et al. (2003) rapporteerden dat de predominante infiltrerende cellen bij DMD

macrofagen en CD4+ cellen waren. Slechts weinig CD8+ cytotoxische T-cellen en CD22+ B-cellen werden vastgesteld. NF-κB immunoreactiviteit was afwezig in controle spiervezels, inflammatoire cellen en alle types nuclei. Bij DMD werd echter immunoreactiviteit voor NF-κB vastgesteld in 20 tot 30 % van necrotische vezels en in alle regenererende vezels. Dit patroon van immunoreactiviteit werd ook waargenomen bij inflammatoire myopathieën zoals polymyositis en dermatomyositis. De resultaten in immunohistochemie werden vervolgens bevestigd met Western Blot. De NF-κB subunit p65 werd aangetoond in nucleaire extracten van DMD, polymyositis en dermatomyositis patiënten, wat wijst op een verhoogde activatie van p65. In normale controles was nucleair p65 afwezig (Figuur 24) (Monici et al., 2003).

Figuur 24: Voorbeeld van een Western Blot analyse van een extract van de NF-κB p65 subunit. In laantjes 5 en 6 werden extracten van een normale controle geladen (C: controle) (Monici et al., 2003).

In 2000 toonden Chen et al. extensieve remodellering van dystrofische spieren, inclusief activatie van immuunresponsen en dendritische cellen, verlies van metabole capaciteit en bindweefselremodellering. Deze dataset werd in 2005 uitgebreid naar drie leeftijdscategorieën

38

(foetaal, presymptomatische zuigelingen en symptomatische kinderen) om te bepalen of een deel van deze weefselremodelleringpathways geassocieerd kon worden met vroegtijdige ziektestadia en andere met laattijdige. De auteurs onderzochten de aanwezigheid van NF-κB activatie in DMD biopsieën met behulp van immunofluorescentie (Figuur 25). De p65 subunit van NF-κB bleek aan te kleuren ter hoogte van de nucleaire en subsarcolemmale regio in spiervezels van zuigelingen, die nog asymptomatisch zijn, en symptomatische Duchennes. Diffuse cytoplasmatische aankleuring van NFκB werd echter ook gezien in sommige spiervezels van controles. De ‘transforming growth factor (TGF)-β pathway’ werd sterk geïnduceerd in symptomatische patiënten, maar niet in spieren van zuigelingen (Chen et al., 2005).

Figuur 25: A) Immunofluorescentie van DMD biopsieën toont subsarcolemmale en perinucleaire NF-

κB accumulatie (rood). B) Ook in controle spiervezels was diffuse cytoplasmatische aankleuring van NF-κB waar te nemen in sommige vezels (Chen et al., 2005). Uit een studie van Creus et al. (2009) bleek dat NF-κB subunits p50 en p65 toch voorkwamen in normale spiervezels, meer bepaald in de nuclei. Dit NF-κB kon door vorige auteurs niet worden aangetoond in myonuclei en dit zou te wijten kunnen zijn aan sensitiviteits- en technische problemen. In bloedvaten van normale controles en DMD was NF-κB afwezig of slechts gering geëxpresseerd. Dit in tegenstelling tot de inhibitor IκB-α die zowel in DMD als in normale controles voorkwam. Atrofische spiervezels toonden diffuse sarcoplasmatische p65 en IκB-α aanwezigheid (Creus et al., 2009).

39

Discussie

1.

NF-κB activiteit in Duchenne muismodellen. In de studie van Kumar et al. (2003) werd gedemonstreerd dat mechanische stretch NF-κB

activeert in skeletspieren van mdx muizen. Deze activatie zou leiden tot expressie van verscheidene NF-κB-gereguleerde inflammatoire moleculen, die op hun beurt opnieuw leiden tot een verhoging van de NF-κB activiteit (Figuur 26). Zo bleek immers dat een verhoogde expressie van TNF-α en IL-1β optrad bij mdx muizen, in tegenstelling tot bij controle muizen. Wanneer dan de accumulatie van deze katabole cytokines een bepaalde drempelwaarde overschrijdt, kan spierschade en dystrofie optreden. De moleculaire pathway van de NF-κB activatie in mdx muizen is echter niet gekend. Dystrofine deficiëntie impliceert wel dat de skeletspieren gevoeliger zijn voor mechanische beschadiging. Het is dan ook mogelijk dat mechanische stretch van dystrofine deficiënte spieren in mdx muizen leidt tot een opregulatie van NF-κB activiteit. Aangehouden stimulatie door mechanische krachten of positieve feedbackloops die betrekking hebben tot pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en IL-1β kunnen dan resulteren in overstimulatie van NF-κB en uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van musculaire dystrofie. Bovendien werd door Langen et al. (2001) aangetoond dat NF-κB interfereert in het proces van skeletspierdifferentiatie, meer bepaald door een inhibitie van de myogene differentiatie. Mogelijks is dit ook een verklaring voor de manier waarop NF-κB leidt tot spieratrofie, vermits NF-κB wordt geactiveerd door inflammatoire cytokines.

Figuur 26: Mechanische stress leidt tot de activatie van NF-κB. Overstimulatie van NF-κB door proinflammatoire cytokines kan dan uiteindelijk resulteren in musculaire dystrofie (Kumar et al., 2003).

40

Verschillende studies suggereren dat NF-κB bijdraagt tot de progressie van het dystrofisch proces. Het falend mechanisme dat instaat voor de verwijdering van vrije radicalen zou aan de basis liggen van NF-κB activatie (Zhou et al., 2001; Nakae et al.,2004; Messina et al., 2006a). De resultaten van Messina et al. wijzen er op dat het anti-oxidant afweermechanisme niet in staat zou zijn de verhoogde vrijstelling van zuurstofradicalen op te vangen, wat een toegenomen oxidatieve stress teweegbrengt. Dit zou dan leiden tot een verhoging van de NF-κB activiteit. De activatie van NF-κB in mdx muizen veroorzaakt een verhoogde expressie van inflammatoire moleculen zoals TNF-α. De inhibitie van de lipide peroxidatie/oxidatieve stress resulteert in een verminderde expressie van TNFα, wat een mogelijke verklaring zou kunnen zijn voor de verminderde spiernecrose en toegenomen spierregeneratie. Samengevat suggereren Messina et al. dat er bij mdx muizen een interactie bestaat tussen lipide peroxidatie/oxidatieve stress en NF-κB, waardoor een inflammatoire cascade op gang wordt gebracht die bijdraagt tot de spierschade. NF-κB zou bijdragen tot de progressie van dystrofische schade en blokkade ervan zou bevorderlijke effecten hebben op functioneel, biochemisch en morfologische parameters, wat belangrijke klinische implicaties kan hebben in de farmacologische behandeling van patiënten met DMD.

De resultaten van Acharyya et al. (2007) bieden genetisch bewijs voor de rol die de IKKβ/NFκB pathway speelt in de pathogenese van musculaire dystrofie. In tegenstelling tot vorige studies, blijkt deze activiteit wel geassocieerd te zijn met zowel immuuncellen als regeneratieve cellen. Ook zien we geen postnatale downregulatie van NF-κB activiteit in mdx muizen in tegenstelling tot controle muizen. Omwille van het feit dat deze activatie samen optreedt met de eerste fasen van mdx pathologie vermoeden de auteurs dat inflammatoire signalen betrokken zijn in deze regulatie. Een van de mogelijke mechanismen waarop IKK/NF-κB interactie schijnt bij te dragen tot dystrofie is door het bevorderen van chronische inflammatie. Gezien de brede range aan NF-κB doelwitgenen, vermoeden de auteurs dat NF-κB-gemediëerde transcriptie zou dienst doen als een amplificatie signaal voor de aanhoudende immuun respons in dystrofische spieren. Samengevat kunnen we de IKK/NF-κB interactie pathway beschouwen als een mogelijk doelwit voor therapie.

Ook de resultaten van Hnia et al. (2008) wijzen op de betrokkenheid van NF-κB bij het dystrofisch proces. Immers, L-arginine resulteerde in een downregulatie van NF-κB in mdx spieren en dit leidde tot een verminderde expressie van verschillende componenten van de NF-κB pathway, waarna men een vermindering van inflammatie en toegenomen spierregeneratie waarnam.

2.

NF-κB activiteit in Duchenne spierweefsel De resultaten van Monici et al. (2003) toonden de activatie van de NF-κB pathway in DMD,

polymyositis en dermatomyositis. De immunoreactiviteit voor de p65 subunit in alle regenererende

41

vezels en ongeveer een derde van de necrotische vezels suggereert de dissociatie van NF-κB van IκB. Hierdoor kan NF-κB de nucleus binnendringen, waar het tot slot kan binden op de promotor regio’s van doelwitgenen. De afwezigheid van NF-κB immunoreactiviteit in de celnuclei en inflammatoire cellen zou verklaard kunnen worden door een gebrek aan sensitiviteit of een technisch probleem. De activatie van de NF-κB pathway kon echter bevestigd worden met behulp van Western Blot. De NFκB/DNA-bindingsactiviteit is eveneens verhoogd en het identificeren van de genen die onder controle staan van NF-κB zou zeer waardevol kunnen zijn. Mogelijke moleculen die hiervoor gesuggereerd worden zijn cytokines, chemokines, complementfactoren, HLA-moleculen, adhesiemoleculen, … Heel wat van deze eiwitten hebben nood aan NF-κB activatie voor hun inductie. De auteurs konden echter niet uitsluiten dat de activatie van NF-κB een downstream fenomeen was dat de skeletspieren aantast, onafhankelijk van zijn oorzaak. Om te besluiten suggereerden Monici et al. dat NF-κB een rol zou spelen in de regulatie van myogenese en dat modulatie van NF-κB activiteit in spierweefsel bevorderlijk zou kunnen zijn voor spierherstel.

Chen et al. (2005) beschreven in DMD spierweefsel de sterke inductie van NF-κB pathways snel na de geboorte. De inflammatoire component is dus een van de eerste geïnduceerde pathways in dystrofine deficiënte spieren, maar deze inflammatie treedt niet gelijktijdig op met het begin van de symptomen. De auteurs stellen een model voor waarin membraanschade in DMD spiervezels leidt tot stimulatie van de TLR pathways, die op hun beurt resulteren in NF-κB activatie, infiltratie/proliferatie van dendritische cellen en een wijdverspreide inductie van inflammatoire pathways. Dit proces begint dus al kort na de geboorte en de chronische activatie en interactie van TLR, NF-κB en inflammatoire pathways zou later resulteren in activatie van de TGF-β1 pathway en klinisch waarneembare spierschade. Ondanks de manifeste deterioratie van de spier in de latere fase van de aandoening is er geen verandering met de leeftijd in de mate van activatie van de inflammatoire pathways. De auteurs stellen hierdoor dat NF-κB, TLR’s en inflammatoire pathways verantwoordelijk zijn voor de vroegtijdige spierschade in DMD, maar dat de laattijdige spierschade een gevolg is van falende regeneratie door inductie van TGF-β1 pathways en interactie tussen TGF-β1, IGF-1 en de constitutief actieve NF-κB, TLR’s en inflammatoire pathways. Tot slot dient opgemerkt te worden dat slechts weinig of geen remodellering werd vastgesteld in DMD foetaal spierweefsel, maar in deze studie werden slechts twee DMD foetussen en twee controles geïncludeerd. Verdere studies dienen dan ook uitgevoerd te worden om de sensitiviteit voor de meest vroegtijdige veranderingen in dystrofine deficiënte spieren te verhogen. De nucleaire lokalisatie van NF-κB in normale spiervezels beschreven door Creus et al. (2009) wijst in de richting van een rol van NF-κB in de normale spierfysiologie, mogelijks bij de bescherming van de spiervezel tegen apoptose door inductie van overlevingsgenen. De aanwezigheid van p65 en IκB-α in atrofische spiervezels suggereert tevens een algemene rol van de NF-κB pathway in

42

spiervezelatrofie. Deze bevindingen werden bevestigd door in vivo analyse van ‘muscle-specific expression of IKK’ (MIKK) en ‘muscle-specific expression of IκB superrepressor’ (MISR) transgene muizen, bij wie de klassieke NF-κB pathway volstond voor inductie van spiervezelatrofie door inductie van de proteolytische pathway.

3.

Therapeutische implicaties Grounds et al. (2004) toonden aan dat farmacologische blokkade van TNF-α met Remicade®

resulteerde in een vertraagde en verminderde afbraak van dystrofische spieren in mdx muizen. De resultaten van Messina et al. (2006a) doen vermoeden dat het protectieve effect van Remicade ® op spierschade, op zijn minst gedeeltelijk, te verklaren is door inhibitie van NF-κB activiteit. Het beïnvloeden van de oxidatieve stress pathway, en dus inhibitie van NF-κB, die de inflammatoire cascade op gang brengt zou mogelijks een therapeutische benadering kunnen zijn om de spierschade in dystrofinopathieën te beperken. Deze hypothese dient echter verder onderzocht te worden om de mogelijkheden te exploreren. Andere inhibitoren van NF-κB zijn eveneens mogelijk, waarbij gedacht wordt aan curcumine of PDTC (Pan et al., 2008; Messina et al., 2006b).

Ook Hnia et al. (2008) zien in deze hypothese een mogelijke therapeutische optie. Hun resultaten suggereren immers dat het blokkeren van NF-κB met L-arginine de groei en regeneratie van nieuwe spiervezels zou kunnen bevorderen in antwoord op spierdegeneratie. Het feit dat L-arginine eveneens de cytokine-secretie downreguleert en interfereert met inflammatoire cascades, doet deze hypothese nog versterken. Het verminderen van de inflammatie door het blokkeren van NF-κB in een vroegtijdig stadium van dystrofie zou de initiële uitputting van de regenererende capaciteit, door de vroegtijdige repetitieve cycli van regeneratie en degeneratie, in dystrofische spieren kunnen vertragen. In latere fase van de aandoening zou een aangehouden inhibitie door L-arginine dystrofische spieren dan kunnen toelaten om te recupereren en te herstellen. Vermits NF-κB regulatie een delicate balans in stand houdt tussen cel-overleving en apoptose, en bovendien cruciaal is in immuunmechanismen, moet men voor de ontwikkeling van dit soort therapieën stilstaan bij de specificiteit en duur van de NF-κB inhibitie. Het zou dan ook aangewezen kunnen zijn om een matige inhibitie na te streven, eerder dan het blokkeren van de basale NF-κB activiteit. In dit opzicht wordt door Acharyya et al. (2007) ‘NEMO-binding domain (NBD)’ peptide, een specifieke IKK inhibitor, als mogelijke therapie gezien. Immers, NBD peptide zou de basale NF-κB activiteit niet blokkeren en toont bovendien geen duidelijke tekenen van toxiciteit.

De werking van corticosteroïden, die reeds toonden te leiden tot een vermindering van necrose en een toegenomen spierregeneratie in DMD en dus de basisbehandeling van DMD vormen, zou eveneens gedeeltelijk verklaard kunnen worden door een inhibitie van NF-κB activatie en de daarmee

43

verbonden downregulatie van cytokines en adhesiemoleculenexpressie. Corticosteroïden interfereren met de transcriptie van genen, maar hoe zij specifiek een invloed hebben op DMD is niet bekend. Verschillende mogelijkheden werden voorgesteld zoals een verandering in de regulatie van genen in spiervezels, een vermindering van cytotoxische T-cellen en een daling van de cytosolische calcium concentraties.

Gezien de vroegtijdige activatie van de inflammatoire respons in DMD spieren beschouwen Chen et al. (2005) het vroegtijdig, presymptomatisch, toedienen van steroïden als een mogelijke behandelingswijze. De TGF-β1 pathway staat bekend als een regulator van tal van cellulaire processen zoals celproliferatie, -differentiatie, -migratie en apoptose. Deze pathway is bovendien bekend als een krachtige modulator van inflammatie, fibrosevorming en myogenese. Deze pathway wordt echter niet geactiveerd in zuigelingen met DMD ondanks de duidelijke inflammatoire respons die in dit stadium van de aandoening toch kan worden verwacht. De activatie van de TGF-β1 pathway lijkt dan ook geassocieerd te zijn met symptomen en spierverlies in DMD en een therapeutische interventie tegen deze TGF-β1 pathway is volgens de auteurs dan ook aangewezen.

44

Conclusie

Hoewel Duchenne musculaire dystrofie (DMD) veroorzaakt wordt door een mutatie in het dystrofine gen, is nog steeds niet volledig begrepen hoe de afwezigheid van dystrofine leidt tot musculaire degeneratie. Gezien de progressieve aard van de aandoening, wordt vermoed dat verscheidene secundaire pathofysiologische en biochemische mechanismen bijdragen tot de progressie van de dystrofie. Meerdere studies suggereren een mogelijke rol van NF-κB in het dystrofisch proces. Zo werd de activatie van NF-κB vastgesteld in spierweefsel van mdx muizen, een goed reproduceerbaar diermodel van DMD, maar ook in spierweefsel van DMD patiënten werd dit vastgesteld. Op welke manier deze activatie van NF-κB precies leidt tot musculaire dystrofie is niet bekend. Mogelijks induceert NF-κB inflammatoire pathways die resulteren in spierschade. Zo werd in DMD de activatie vastgesteld van de TGF-β1 pathway, een krachtige modulator van inflammatie en myogenese, en dit zou gebeuren onder invloed van NF-κB.

Gezien de rol van NF-κB in de pathogenese van musculaire dystrofie opent dit mogelijkheden naar nieuwe therapeutische technieken in de behandeling van DMD. De huidige standaardbehandeling van DMD berust op het gebruik van corticosteroïden, en vermoed wordt dat ook hun werking op zijn minst voor een deel ligt in de inhibitie van NF-κB activatie. Specifieke inhibitie van NF-κB subunits en/of de signaling pathways waarin bepaalde subunits betrokken zijn, zou de inflammatoire pathways kunnen inhiberen en bijgevolg de spierschade kunnen beperken. Curcumine, PDTC, Remicade® en Larginine worden hiervoor als mogelijke inhibitoren gesuggereerd. Gezien echter de fysiologische rol van NF-κB in immuunprocessen en cellulaire processen zoals proliferatie en apoptose, moet deze strategie nog verder onderzocht worden op het vlak van duur en specificiteit van de inhibitie. In dit opzicht zou ‘NEMO binding domain (NBD) peptide’, een specifieke IKK inhibitor, een interessante optie kunnen zijn, gezien werd aangetoond dat dit NBD peptide de basale NF-κB activiteit niet inhibeert en geen toxische effecten heeft. Ook de inhibitie van de TGF-β1 pathway biedt mogelijks nieuwe vooruitzichten.

Samengevat kan worden gesteld dat verscheidene studies wijzen op de betrokkenheid van NFκB, en dan vooral van de p50 en p65 subunits, in de pathogenese van DMD. Dit opent nieuwe perspectieven voor de behandeling van deze letale aandoening, maar aanvullend onderzoek is noodzakelijk om deze therapeutische opties verder te exploreren.

45

Referenties

Acharyya S., Villalta S.A., Bakkar N., Bupha-Intr T., Janssen P.M., Carathers M., Li Z.W., Beg A.A., Ghosh S., Sahenk Z., Weinstein M., Gardner K.L., Rafael-Fortney J.A., Karin M., Tidball J.G., Baldwin A.S., Guttridge D.C. Interplay of IKK/NF-kappaB signaling in macrophages and myofibers promotes muscle degeneration in Duchenne muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 2007; 117: 889-901.

Barton E.R., Morris L., Musaro A., Rosenthal N., Sweeney H.L. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice. J. Cell Biol. 2002; 157: 137-148.

Ben-Neriah Y. Regulatory functions of ubiquitination in the immune system. Nat. Immunol. 2002; 3: 20-26.

Biggar W.D. Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Rev. 2006; 27: 83-88.

Bulfield G., Siller W.G., Wight P.A., Moore K.J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81: 1189-1192.

Bushby K., Finkel R., Birnkrant D.J., Case L.E., Clemens P.R., Cripe L., Kaul A., Kinnett K., McDonald C., Pandya S., Poysky J., Shapiro F., Tomezko J., Constantin C., for the DMD Care Considerations Working Group. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 2010; 9: 77-93.

Chen L.F., Greene W.C. Shaping the nuclear action of NF-kappaB. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5: 392401.

Chen Y.W., Nagaraju K., Bakay M., McIntyre O., Rawat R., Shi R., Hoffman E.P. Early onset of inflammation and later involvement of TFGβ in Duchenne muscular dystrophy. Neurology. 2005; 65: 826834.

Chen Y.W., Zhao P., Borup R., Hoffman E.P. Expression profiling in the muscular dystrophies: identification of novel aspects of molecular pathophysiology. J. Cell. Biol. 2000; 151: 1321-1336.

Collins C.A., Morgan J.E. Duchenne's muscular dystrophy: animal models used to investigate pathogenesis and develop therapeutic strategies. Int. J. Exp. Pathol. 2003; 84: 165-172.

Constantin B., Sebille S., Cognard C. New insights in the regulation of calcium transfers by muscle dystrophin-based cytoskeleton: implications in DMD. J. Muscle Res. Cell. Motil. 2006; 27: 375-386.

46

Creus K.K., De Paepe B., De Bleecker J.L. Idiopathic inflammatory myopathies and the classical NF-κB complex: Current insights and implications for therapy. Autoimmun. Rev. 2009; 8: 627-631.

Crosbie R.H. NO vascular control in Duchenne muscular dystrophy. Nat. Med. 2001; 7: 27-29.

Davies K.E., Nowak K.J. Molecular mechanisms of muscular dystrophies: old and new players. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7: 762-773.

Deconinck N., Dan B. Pathophysiology of Duchenne Muscular Dystrophy: Current hypotheses. Pediatr. Neurol. 2007; 36: 1-7.

Ehmsen J., Poon E., Davies K. The dystrophin-associated protein complex. J. Cell Sci. 2002; 115: 28012803.

Emery A.E. Muscular dystrophy into the new millennium. Neuromuscul. Disord. 2002b; 12: 343-349.

Emery A.E. The muscular dystrophies. BMJ. 1998; 317: 991-995.

Emery A.E. The muscular dystrophies. Lancet. 2002a; 359: 687-695.

Ervasti J.M. Dystrophin, its interactions with other proteins, and implications for muscular dystrophy. Biochim. Biophys. Acta. 2007; 1772: 108-117.

Evans N.P., Misyak S.A., Robertson J.L., Bassaganya-Riera J., Grange R.W. Dysregulated intracellular signaling and inflammatory gene expression during initial disease onset in Duchenne muscular dystrophy. Am. J. Phys. Med. Rehabil. 2009; 88: 502-522.

Gilmore T.D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. 2006; 25: 6680-6684.

Grounds M.D., Torrisi J. Anti-TNFα (Remicade®) therapy protects dystrophic skeletal muscle from necrosis. FASEB J. 2004; 18: 676-682.

Hayden M.S., Ghosh S. Signaling to NF-kappaB. Genes Dev. 2004; 18: 2195-2224.

Hayden M.S., West A.P., Ghosh S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 2006; 25: 6758-6780.

Hnia K., Gayraud J., Hugon G., Ramonatxo M., De La Porte S., Matecki S., Mornet D. L-arginine decreases inflammation and modulates the nuclear factor-kappaB/matrix metalloproteinase cascade in mdx muscle fibers. Am. J. Pathol. 2008; 172: 1509-1519.

47

Hoffman E.P., Brown R.H., Kunkel L.M. Dystrophin: The protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 1987; 51: 919-928.

Hoffmann A., Natoli G., Ghosh G. Transcriptional regulation via the NF-kappaB signaling module. Oncogene. 2006; 25: 6706-6716.

Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-kappaB activity. Annu. Rev. Immunol. 2000; 18: 621-663.

Karin M., Lin A. NF-kappaB at the crossroads of life and death. Nat. Immunol. 2002; 3: 221-227.

Khurana T.S., Davies K.E. Pharmacological strategies for muscular dystrophy. Nat. Rev. Drug Discov. 2003; 2: 379-390.

Kumar A., Boriek A.M. Mechanical stress activates the nuclear factor-kappaB pathway in skeletal muscle fibers: a possible role in Duchenne muscular dystrophy. FASEB J. 2003; 17: 386-396.

Kumar A., Takada Y., Boriek A.M., Aggarwal B.B. Nuclear factor-kappaB: its role in health and disease. J. Mol. Med. 2004; 82: 434-448.

Langen R.C., Schols A.M., Kelders M.C., Wouters E.F., Janssen-Heininger Y.M. Inflammatory cytokines inhibit myogenic differentiation through activation of nuclear factor-kappaB. FASEB J. 2001; 15: 11691180.

Li Q., Verma I.M. NF-kappaB regulation in the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2: 725-734.

Lotz B.P., Engel A.G. Are hypercontracted muscle fibers artifacts and do they cause rupture of the plasma membrane? Neurology 1987; 37: 1466-1475.

Marteijn J.A., Jansen J.H., van der Reijden B.A. Ubiquitylation in normal and malignant hematopoiesis: novel therapeutic targets. Leukemia. 2006; 20: 1511-1518.

May M.J., Ghosh S. Rel/NF-kB and IkB proteins: an overview. Cancer biology. 1997; 7: 63-73.

Messina S., Altavilla D., Aguennouz M., Seminara P., Minutoli L., Monici M.C., Bitto A., Mazzeo A., Marini H., Squadrito F., Vita G. Lipid peroxidation inhibition blunts nuclear factor-kappaB activation, reduces skeletal muscle degeneration, and enhances muscle function in mdx mice. Am. J. Pathol. 2006a; 168: 918-926.

48

Messina S., Bitto A., Aguennouz M., Minutoli L., Monici M.C., Altavilla D., Squadrito F., Vita G. Nuclear factor kappa-B blockade reduces skeletal muscle degeneration and enhances muscle function in mdx mice. Exp. Neurol. 2006b; 198: 234-241.

Miura P., Jasmin B.J. Utrophin upregulation for treating Duchenne or Becker muscular dystrophy: how close are we? Trends Mol. Med. 2006; 12: 122-129.

Monaco A.P., Bertelson C.J., Liechti-Gallati S., Moser H., Kunkel L.M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 1988; 2: 90-95.

Monici M.C., Aguennouz M., Mazzeo A., Messina C., Vita G. Activation of nuclear factor-κB in inflammatory myopathies and Duchenne muscular dystrophy. Neurology. 2003; 60: 993-997.

Muntoni F., Torelli S., Ferlini A. Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol. 2003; 2: 731-740.

Nakae Y., Stoward P.J., Kashiyama T., Shono M., Akagi A., Matsuzaki T., Nonaka I. Early onset of lipofuscin accumulation in dystrophin-deficient skeletal muscles of DMD patients and mdx mice. J. Mol. Histol. 2004; 35: 489-499.

Pan Y., Chen C., Shen Y., Zhu C.H., Wang G., Wang X.C., Chen H.Q., Zhu M.S. Curcumin alleviates dystrophic muscle pathology in mdx mice. Mol. Cells. 2008; 25: 531-537.

Perkins N.D. Integrating cell-signalling pathways with NF-kappaB and IKK function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 49-62.

Rando T.A. Oligonucleotide-mediated gene therapy for muscular dystrophies. Neuromuscul. Disord. 2002; 12 Suppl 1: S55-60.

Roland E. Muscular dystrophy. Pediatr. Rev. 2000; 21: 233-237.

Scheidereit C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 2006; 25: 6685-6705.

Seidman R.J., 2009; http://emedicine.medscape.com.

Spencer M.J., Montecino-Rodriguez E., Dorshkind K., Tidball J.G. Helper (CD4(+)) and cytotoxic (CD8(+)) T cells promote the pathology of dystrophin-deficient muscle. Clin. Immunol. 2001; 98: 235-243.

Tak P.P., Firestein G.S. NF-kappaB: a key role in inflammatory diseases. J. Clin. Invest. 2001; 107: 7-11.

49

Van Deutekom J.C., van Ommen G.J. Advances in Duchenne muscular dystrophy gene therapy. Nat. Rev. Genet. 2003; 4: 774-783.

Wagner K.R. Approaching a new age in Duchenne muscular dystrophy treatment. Neurotherapeutics. 2008; 5: 583-591.

Wagner K.R., Lechtzin N., Judge D.P. Current treatment of adult Duchenne muscular dystrophy. Biochim. Biophys. Acta. 2007; 1772: 229-237.

Wells D.J., Wells K.E. Gene transfer studies in animals: what do they really tell us about the prospects for gene therapy in DMD? Neuromuscul. Disord. 2002; 12 Suppl 1: S11-22.

Whiteside S.T., Israël A. IkB proteins: structure, function and regulation. Cancer biology. 1997; 8: 75-82.

Whitehead N.P., Yeung E.W., Allen D.G. Muscle damage in mdx (dystrophic) mice: role of calcium and reactive oxygen species. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2006; 33: 657-662.

Yiu E.M., Kornberg A.J. Duchenne muscular dystrophy. Neurol. India. 2008; 56: 236-247.

Zhou L.Z., Johnson A.P., Rando T.A. NF-kappaB and AP-1 mediate transcriptional responses to oxidative stress in skeletal muscle cells. Free Radic. Biol. Med. 2001; 31: 1405-1416.

50