Biosenzory Helena Uhrová
L.C.Clarc, článek o O2 elektrodě, 1956
1962, symposium v New Yorku
oxidoredukční enzym glukózooxidáza byl uchycen na dialyzační membránu a s ní na kyslíkovou elektrodu - enzymová elektroda
→
První biosenzor
glukózooxidáza katalyzuje reakci
glukóza + O2 kyselina glukonová + H2O2
→
Úbytek kyslíku - úměrný koncentraci glukózy – byl měřen kyslíkovou elektrodou
První komerční senzor
Stanovení glukózy přímo v krvi
Na principu úbytku kyslíku – první model 1974 1973 – Yellow Springa Instrument Company – ampérometrické měření vzniklého peroxidu vodíku
Definice biosenzoru
Citlivé analytické zařízení převádějící fyzikální nebo chemický signál na jiný, lépe měřitelný. Rozpoznávací část tvoří prvek biologického původu. Biosenzor je složen z bioreceptoru a převodníku. Obě složky integrovány v jednom senzoru.
Bioreceptory Biomolekuly rozpoznávají analytický cíl:
Enzymy Protilátky Receptorové bílkoviny Mikroorganismy Nukleové kyseliny Rostlinné a zvířecí tkáně
enzymy
Nejúčinnější katalyzátory s vysokou strukturní specifitou –katalyzují přeměnu jedné látky, ostatní ignorují Vysoká enzymová aktivita - nutné udržení vhodné teploty a pH prostředí Z izolovaných enzymů je jen několik set je vhodných pro komerční užití v senzorech
Velmi často se užívají oxidoreduktázy, katalyzující oxidaci (odnímání elektronů) nebo redukci (dodávání elektronů) enzymového substrátu. Oxidoreduktázy jsou spojeny s elektrochemickými procesy, jejich přeměnu je snadnější sledovat elektrochemickou detekcí. Reálným problémem je ale přenos elektronů z/na aktivní místa.
protilátky
tvoří okolo 20% veškerých bílkovin plasmy a jsou souhrnně označovány jako imunoglobiny Nejjednodušší protilátky-„molekuly tvaru Y“ s dvěma identickými vazebnými místy pro antigen základní strukturní jednotka složena ze 4 řetězců – 2 lehkých a 2 těžkých reversibilně se váží se specifickým antigenem
receptorové bílkoviny
molekuly se specifickou afinitou k hormonům, protilátkám, enzymům a dalším biologicky aktivním látkám nejčastěji vázány na membrány chuťové receptory, čichové receptory i fotoreceptory očí
mikroorganismy
Bakterie Kvasinky Plísně Rychlé rozmnožování Odolnost Přizpůsobivost Široká škála živin
nukleové kyseliny
Využití k identifikaci : jiné DNA jiné RNA některých mutagenů Próba: obsahuje imobilizovanou jednovláknovou DNA s určité sekvenci – hybridizace s komplementární sekvencí- hledaná DNA zůstane navázána
rostlinné a zvířecí tkáně Nevýhody: Buňky s omezenou funkcí Obtížná manipulace Nesnadná a drahá kultivace mimo mateřský organismus Nutnost dodržování životních podmínek Výhoda: biologická odpověď podobná jako u živého organismu
skladba biosenzorů – analyt – bioreakční (rozpoznávací)vrstva – převodník – elektronická jednotka – výstupní signál
Konstrukce biosenzorů
volba vhodné imobilizační techniky imobilizace biologického materiálu do pevného materiálu připojení detekčního zařízení (závisí na povaze signálu, který dává biologický materiál) připojení záznamového zařízení
membrány Slouží: k
ochraně před usazeninami K eliminaci interferencí Ke kontrole operačního režimu biosenzorů
elektrochemické převodníky
využívá je nejvíce senzorů - pro konstrukční jednoduchost - a dobrou cenu s úspěchem využívány pro stanovení organických látek v potravinách
Dělení převodníků i biosenzorů podle metody detekce
Potenciometrické biosenzory
Ampérometrické biosenzory
Konduktometricko/impedimetrických biosenzory
Potenciometrické biosenzory
vyžadují měření potenciálu při nulovém proudu potenciál je úměrný logartimu koncentrace stanovované látky Využívají např. iontově selektivních elektrod k stanovení změn koncentrace vybraných iontů (např.H+).
složeny z ISE kombinované s imobilizovaným enzymem- v ISE je generovaný elektrodový potenciál úměrný logaritmu koncentrace analytu. koncentrace závisí na potenciálu E
RT aox = E0 + ln E aredrozbitnost, Nevýhody:velkýnF odpor,
erozivita a citlivost na kapacitu pufrů při měření roztoků.
Konduktometricko/impedimetrické biosenzory Stanovují změny v konduktanci změny v impedanci v důsledku změn vyvolaných v daném prostředí náboji Nevyžadují referenční eldu (tenkovrstvé technologie), jsou dobře kompatibilní s elektrickými obvody a počítačovým rozhraním
Optické biosenzory Využívají měření světla změn optických vlastností biomateriálů ( barva opticky nebo spektrofotometricky) fluorescenční spektroskopie luminiscence optická vlákna – nanesená vrstva produkuje světelné signály nebo je mění
Piezoelektrické biosenzory
Využívají vibrace v elektrickém poli které se mění s tloušťkou krystalu Výhody: nízká cena, rychlá odezva Nevýhody: vysoká citlivost na vnější podmínky (vlhkost vzdúchu) DNA čipy – Si matrice v pravidelné mřížce imobilizovány různé sekvence DNA – fluorescenčně vyfotografován – analýzou lze určit sekvenci
imunosenzory
Savčí buňky – zdroj protilátek Senzory detekují i stopová množství Modifikované protilátky – navěšená fluorescenční nebo enzymová značka Vymývací krok ELISA - o analyt soutěží volná a imobilizovaná protilátka – kvantitativní stanovení analytu
Biosenzory s povrchovou plazmovou rezonancí
na rozhraní kov - dielektrikum vzniká při totálním odrazu světla opticko-elektrický jev při určitém úhlu (max. přenos energie světla na plasmony - elektrony atomů kovu v povrchové vrstvě) klesne intenzita odraženého světla modifikace kovové vrstvy komplexem protilátka-antigen – posun rezonančního maxima
Kalometrické biosenzory
Změny teploty při biochemické reakci
Přesná čidla nárůstu teploty – nejsou častá
Analogově-číslicové převodníky
Charakteristiky převodníků
Rozlišovací schopnost převodníku - dána počtem rozlišitelných úrovní analogového signálu. (Pro n-bitový binární převodník je to 2n úrovní, pro m-místný dekadický převodník je to 10m úrovní). Krok kvantování (citlivost převodníku) - nejmenší rozlišitelná velikost analogové veličiny - rozdíl dvou hodnot analogové veličiny, při kterých nastává přechod od jednoho kódového slova k druhému
Chyba kvantování je maximální rozdíl mezi hodnotou analogové veličiny a hodnotou odpovídající danému kódovému slovu -obvykle polovina kroku kvantování. Rychlost převodníku se určuje počtem převodů za jednotku času. Kód převodníku - v jakém kódu převodník pracuje (nejčastěji přímý binární kód a binárnědekadický tzv. BCD-kód)
Přesnost převodníku
Součtová (aditivní) chyba je nezávislá na hodnotě analogového signálu a je pro celý rozsah konstantní. Je způsobená např. posunutím nuly, chybou kvantování apod. Součinová (multiplikativní) chyba závisí na hodnotě analogového signálu a je způsobená chybou zesílení analogových částí a nelinearitou převodníku.
Stabilita převodníku vyjadřuje stálost vlastností převodníku při působení různých rušivých vlivů, jako je teplota, čas, vlhkost apo
Číslicově-analogové převodníky
převádí vstupní slovo na analogovou veličinu (napětí nebo proud), která je přímo úměrná vstupní informaci. Vstupní slovo je číslo, které vyjadřuje okamžitou hodnotu určité veličiny a sestává z určitého počtu bitů. Pro vyjádření tohoto čísla se používá nejčastěji přirozeného binárního kódu nebo kódu BCD.
Analogově-číslicové převodníky
Analogově-číslicový převod lze rozdělit na tři základní fáze: vzorkování, kvantování a kódování. výstup ní slo vo
ana logo vý si gnál VZORKOVÁNÍ
KVANTOVÁNÍ
KÓDOVÁNÍ
vzorkování
Metody imobilizace
K převodníku musí být připojen selektivní element. Existuje několik klasických metod: Adsorpce na povrchu Mikrozapouzdření –záchyt v gelové matrici, pastě nebo polymeru mezi dvěma membránami
•
•
•
Záchyt – selektivní element je zachycen v gelové matrici, pastě nebo polymeru – velmi populární metoda. Kovalentní vazba – jsou vytvořeny chemické kovalentní vazby mezi selektivní složkou a převodníkem. Příčné vazby – selektivní složka je chemicky vázána dvojfunkčním činidlem k převodníku. Často se užívá v kombinaci s metodami adsorpce či mikrozapouzření.
CO OD SENZORŮ POŽADUJEME
Selektivitu Citlivost Přesnost Dobu odpovědi Ralaxační čas Životnost Pracovní podmínky Cenová dostupnost
Uplatnění biosenzorů v praxi
farmakologie a v medicína monitorování škodlivin životního prostředí Zemědělství armáda fermentační procesy Off-line: ve vzdálených laboratořích s významnou dobou zdržení Off-line: drobné kontroly s krátkou dobou zdržení On-line: monitorování i kontrola probíhající v reálním čase
Problémy
není možná jejich sterilace pracují jen v limitovaném rozsahu koncentrace analytu při použití enzymů se obvykle liší optimální provozní pH enzymu od pH prostředí.
