SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
BIOANALITIKAI MÓDSZEREK KIDOLGOZÁSA FARMAKOKINETIKAI ÉS METABOLIZMUS VIZSGÁLATOK SZÁMÁRA
Doktori (Ph.D.) értekezés
DALMADINÉ KISS BORBÁLA
Témavezetõ: Dr. Klebovich Imre D.Sc.
EGIS Gyógyszergyár Rt. Farmakokinetikai Kutató Laboratórium
Budapest, 2003
Szigorlati Bizottság: Elnök: Prof. Dr. Tekes Kornélia, egyetemi tanár Tagok: Dr. Tótfalusi László Ph.D., egyetemi docens
Hivatalos bírálók: Dr. Török Ilona , a kémiai tudományok kandidátusa Dr. Szökõ Éva, a gyógyszerészeti tudományok kandidátusa
2
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ...................................................................................................... 3 Rövidítések jegyzéke ............................................................................................. 5 1. Bevezetés................................................................................................................ 7 1.2. Irodalmi áttekintés ................................................................................................................................ 9 1.2.1. A generikus gyógyszerfejlesztés során vizsgált vegyületek............................................................9 1.2.2. Bioekvivalencia vizsgálatok................................................................................................................12 1.2.3. A bioanalitikai módszerek validálása................................................................................................16 1.2.3. Metabolizmus vizsgálatok....................................................................................................................20
2. Célkitûzések........................................................................................................ 27 3. Módszerek............................................................................................................ 29 3.1. A cisapride meghatározása humán plazmából HPLC-FLD módszerrel 29
3.2.
3.1.1. Anyagok és vegyszerek........................................................................................................................29 3.1.2. Mérõmûszerek, készülékek és eszközök...........................................................................................29 3.1.3. Alkalmazott szoftverek.........................................................................................................................30 3.1.5. Kromatográfiás körülmények..............................................................................................................31 3.1.6. A validálási paraméterek méréséhez szükséges minták készítése................................................32 Az ambroxol meghatározása kutya plazmában HPLC-UV módszerrel. 35 3.2.1. Anyagok és vegyszerek........................................................................................................................35 3.2.3. Mérõmûszerek, készülékek és eszközök...........................................................................................35 3.2.4. Alkalmazott szoftverek.........................................................................................................................35 3.2.5. Kromatográfiás körülmények..............................................................................................................36 3.2.6. A validálási paraméterek méréséhez szükséges minták készítése................................................37
3.3. Deramciclane metabolitok izolálása humán vizeletbõl, kutya vizeletbõl és plazmából........................................................................................................................................................ 40 3.3.1. Anyagok és vegyszerek........................................................................................................................40 3.3.2. Élõállat és klinikai fázis:......................................................................................................................40 3.3.3. Mérõmûszerek, készülékek és eszközök...........................................................................................41 3.3.4 Alkalmazott szoftverek..........................................................................................................................41 3.3.5. Kromatográfiás körülmények..............................................................................................................41 3.3.6. Folyadékszcintillációs (LSC) mérés...................................................................................................46 3.3.7. Digitális autoradiográfiás mérés .........................................................................................................46
4. Eredmények ........................................................................................................ 47 4.1. A validálási paraméterek vizsgálata..................................................................................... 47 4.1.1. Validálási paraméterek vizsgálata a cisapride humán plazmából történõ meghatározása esetében..............................................................................................................................................................47 4.1.2. Validálási paraméterek vizsgálata az ambroxol kutya plazmából történõ meghatározása esetében..............................................................................................................................................................54
4.2. Deramciclane metabolitok izolálása kutya vizeletbõl és plazmából OPLC on-line frakciószedéssel........................................................................................................... 58 4.3. 14 plazmából folyadékkromatográfia radioaktív detektálás kapcsolt technikák .................................................................................................................................................. 61
5. Megbeszélés........................................................................................................ 68 6. Következtetés ..................................................................................................... 72 7. Köszönetnyilvánítás........................................................................................ 74
3
8. Irodalomjegyzék ............................................................................................... 75 9. Saját közlemények jegyzéke....................................................................... 81
4
Rövidítések jegyzéke
AUC
farmakokinetikai görbe alatti terület (area under the curve)
AUC0-t
farmakokinetikai görbe alatti terület az utolsó vérvételi idõpontig (t) integrálva
AUC0-∞ ∞
farmakokinetikai görbe alatti terület ∞ ideig extrapolálva
AUCREST
AUC0-∞ − AUC0-t
BST
belsõ standard
Cmax
maximális plazmakoncentráció
CNS
központi idegrendszer (central nervous system)
DAR
digitális autoradiográfia
FLD
fluoreszcens detektálás
FLR
eluens áramlási sebesség (flow rate)
GALP
Good Automatisation Laboratory Practice
GCP
Good Clinical Practice
GCoP
Good Computer Practice
GDP
Good Documentation Practice
GLP
Good Laboratory Practice
GMP
Good Manufacturing Practice
HPLC
nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (high performance liquid chromatography)
HPTLC
nagy hatékonyságú vékonyréteg kromatográfia (high performance thin layer chromatography)
λ em
emmissziós hullámhossz
λ ext
extinkciós hullámhossz
LLOQ
a mennyiségi meghatározás alsó határa (lower limit of quntitation )
LOD
a detektálhatóság határa ( limit of detection)
LSC
folyadékszcintillációs spektroszkópia
MRT
Mean Residence Time (átlagos tartózkodási idõ)
5
OPLC
optimális hatékonyságú rétegkromatográfia (optimum performance laminar chromatography)
QC minta
minõségellenõrzõ (quality controll) plazmaminta
RD
radiokémiai detektálás
RP
fordított fázis (reversed phase)
RSD%
relatív standard deviáció
SPE
szilárd fázisú extrakció (solid phase extraction)
S.D.
standard deviáció
tβ 1/2
biológiai felezési idõ
tmax
a maximális plazmakoncentrációhoz tartozó idõ
6
1. Bevezetés A farmakokinetikai és metabolizmus vizsgálatok a gyógyszerkutatás és fejlesztés folyamatába több ponton kapcsolódnak. Fontos szerepet töltenek be az originális gyógyszerkutatásban, tehát az új gyógyszerek bevezetését megelõzõ, az egészségügyi hatóságok által elõírt biztonsági vizsgálatok (toxicitási, teratológiai, karcinogenitási stb.) körében, a gyógyszerfejlesztés úgynevezett preklinikai és klinikai I. és II. fázisában egyaránt. A farmakokinetika tárgya a gyógyszerek felszívódásának, megoszlásának, lebomlásának és kiürülésének kvalitatív, illetve kvantitatív leírása. Az így nyert matematikai modellek felhasználhatók a gyógyszeres terápia optimalizálására, lehetõvé téve az egyén rasszbéli hovatartozását, korát, fizikai és egészségi állapotát – például az esetleges
csökkent
máj-
vagy
vesemûködését
-
figyelembe
vevõ
racionális
gyógyszeradagolást [1; 2; 3; 4]. A gyógyszerek a szervezet számára testidegen anyagok (xenobiotikumok), mivel a szervezet általában nem építi be õket szerkezeti elemeibe és nem használja fel energiaforrásként. A testidegen vegyületek, kémiai szerkezetüknél fogva a szervezet metabolizáló enzimeinek szubsztrátjai lehetnek, és így biokémiai átalakulást szenvednek. Ez a folyamat a gyógyszermetabolizmus, vagy biotranszformáció [5; 6; 7; 8; 9]. A metabolizmus többnyire megnöveli a gyógyszerek vízoldhatóságát, megkönnyítve kiürülésüket. Általában megszünteti a gyógyszerhatást is. Esetenként a keletkezõ egy vagy több metabolit farmakológiailag hatékonyabb, mint az eredeti vegyület. Ilyenkor a terméket, vagy termékeket aktív metabolitnak nevezzük, míg ha az anyavegyület nem hatékony, akkor „prodrug”-ként szerepel. Az in vitro és in vivo metabolizmus vizsgálatok célja ennek a folyamatnak a minél pontosabb feltárása. A gyógyszerfejlesztés preklinikai fázisában több állatfajon (egér, patkány, kutya, nyúl) fel kell térképezni a vegyület kvalitatív és kvantitatív metabolikus profilját. A metabolizmus fajspecifikussága miatt azonban még így is szükséges az ember bevonása a
metabolizmus
vizsgálatokba.
Humán
metabolizmus
vizsgálatokra
a
gyógyszerfejlesztés klinikai I. fázisában kerül sor. Ezen vizsgálatok során azonosítani kell a fõ metabolitokat, állatkísérletben toxicitás vizsgálatokat kell végezni velük, és fel kell deríteni esetleges farmakológiai hatásukat. Meg kell ismerni a kiürülési utakat (vizelet, epe), amibõl a vese és máj betegsége esetén a dózisra vonatkozó
7
megszorításokra lehet következtetni [10]. Fel kell térképezni továbbá a keringésbe jutó, úgynevezett plazma metabolitokat. Ez az információ jelentõs a hatás, toxicitás és a helyes terápia szempontjából. Fontos szerepe van továbbá a farmakokinetikai vizsgálatoknak az úgynevezett generikus gyógyszerfejlesztésben is, amelynek során a gyógyszergyár szabadalmi oltalommal nem védett készítményeket hoz forgalomba saját fejlesztés alapján. A generikus fejlesztés során nem szükséges a fent említett biztonsági vizsgálatok elvégzése, hanem úgynevezett bioekvivalencia vizsgálat kivitelezésével igazoljuk, hogy a generikus készítmény biológiailag és terápiásan egyenértékû az originális készítménnyel, tehát az innovátor készítménye a generikussal helyettesíthetõ a terápiában [11]. A biológiai egyenértékûséget a teszt és referens készítmény humán plazmában mért koncentráció-idõ adataiból származtatott farmakokinetikai paraméterek egyezésének statisztikus vizsgálatával igazoljuk. A bioekvivalencia vizsgálat klinikai és bioanalitikai fázisból áll. A klinikai fázis tervezésekor meg kell határozni a vizsgálatba bevont önkéntesek számát, a beadandó gyógyszer dózist, a vérvételek számát és idõpontját, és a kezelési periódusok között eltelt úgynevezett kiürülési idõt. A klinikai fázisnak meg kell felelnie a GCP elõírásainak. A különbözõ farmakokinetikai és bioekvivalencia vizsgálatok számára olyan validált bioanalitikai módszer kidolgozására van szükség, amely megfelel a GLP, GALP elõírásainak, alkalmas nagy számú minta gyors elemzésére, és az anyavegyület, az esetleges farmakológiailag aktív metabolit(ok)
és a belsõ standard specifikus,
szelektív egymás melletti analízisére [12]. A fejlõdés az egyre hatékonyabb gyógyszermolekulák fejlesztése irányába mutat, amelyek egyre kisebb koncentrációt érnek el az emberi vérben, így egyre alacsonyabb kimutatási határral rendelkezõ bioanalitikai módszerekre van szükség [13]. Jelen munkám a gyógyszerfejlesztés folyamatához több ponton kapcsolódik. Az általam kidolgozott, a cisapride és az ambroxol meghatározására szolgáló bioanalitikai módszerek a generikus gyógyszerfejlesztés folyamatába illeszkednek. A cisapride humán
plazmából
való
meghatározására
szolgáló
bioanalitikai
módszert
bioekvivalencia vizsgálat számára dolgoztam ki. A generikus gyógyszerfejlesztés egy korábbi fázisát szolgálja az ambroxol kutya plazmából történõ meghatározására alkalmas bioanalitikai módszer, amely a tervezett retard készítmény minõségének
8
állatkísérletes vizsgálatára alkalmas. A két bioanalitikai módszert a nemzetközi elõírásoknak megfelelõen validáltam, amely önmagában is kiterjedt vizsgálat sorozatot jelent. Munkám másik része az originális gyógyszerfejlesztéshez kapcsolódik. A deramciclane, mint nem benzodiazepin típusú új anxiolitikus hatású gyógyszerjelölt metabolizmusát vizsgáltam kutya kísérletekben, és humán vizsgálatokban egyaránt. A metabolizmus vizsgálatok során folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikákat alkalmaztam a metabolitok izolálására, tisztítására és mennyiségi meghatározására. Törekedtem az egyes technikák alkalmazásának optimalizálására az adott vizsgálati fázisokban, és azok alkalmazhatóságának vizsgálatára a metabolizmus kutatás folyamatában. Munkám hozzájárult a deramciclane igen bonyolult és fajfüggõ metabolizmusának felderítéséhez.
1.2. Irodalmi áttekintés 1.2.1. A generikus gyógyszerfejlesztés során vizsgált vegyületek
1.2.1.1. Cisapride:
A
cisapride
((±)Cis-4-amino-5-klór-N-[1-[3-(4-fluorofenoxi)propil]-3-metoxi-4-
piperidinil]-2-metoxibenzamid (1. ábra), az emésztõ traktus motoros mûködését szabályozó prokinetikus szer. A vegyület hatására fokozódik az alsó esophagus sphincter tónusa, a gyomor spontán motilitása, a pylorus sphincter elernyed, továbbá fokozódik a vékonybél felsõ szakaszán a perisztaltika és a motilitás, ennek következtében gyorsul a gyomor kiürülése. Terápiás jelentõsége van a gyomor hipomotilitása következtében kialakuló csökkent gyomorürülés kezelésében [14].
metabolitja
az
oxidatív
N-dealkilálással
keletkezõ
norcisapride.
A
cisapride
metabolitjainak nem tulajdonítható jelentõsebb farmakológiai hatás. A cisapride farmakokinetikája különbözõ orális dózisok esetén lineárisnak mutatkozik. Egyszeri, 20 ± 19 ng/ml maximális koncentráció (C max) várható emberben, a biológiai felezési idõ (tβ 1/2 ) pedig kb. 1,5 h [15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22].
9
O
CH3 NH
O
N
O
O
CH3
Cl
F
NH2 1. ábra A cisapride szerkezeti képlete
NH O
O
N
O
CH3
Cl
F
NH2
2. ábra A belsõ standard (KPH-61) szerkezeti képlete
1.2.1.2. Ambroxol Az ambroxol (transz-4-(2-amino-3,5-dibromobenzilamino)-ciklohexanol (3. ábra) mukolitikus hatású gyógyszervegyület, amelyet gyakran alkalmaznak légzõszervi megbetegedésekben, mint expektoránst és broncholitikumot. A bromhexin aktív metabolitja. A lizoszómák képzõdésének fokozásával és a hidrolázok serkentésével
10
elõsegíti a savanyú poliszacharidok hasítását. Emellett szekréciót és mucociliaris aktivitást fokozó, illetve felületi feszültséget csökkentõ surfactant képzést fokozó hatással is rendelkezik. Ez utóbbi hatás következtében a mucus letapadása a bronchus epitheliumhoz csökken. Ez szintén elõsegíti a szekrétum könnyebb kiürülését [23].
csúcskoncentrációt (56 ± 25 ng/ml) 2 óra múlva éri el a hatóanyag a plazmában. 75 mg ambroxolt tartalmazó retard készítmény egyszeri adagolását követõen, a plazma csúcskoncentráció 140 ng/ml emberben [24]. Kutyában, 10 mg/kg orális
14
C-ambroxol
legnagyobb mértékben a vizelettel ürül, de megfigyelhetõ az epén keresztüli exkréció is. Az össz radioaktivitás csúcskoncentációja kutyában az elõbb említett dózist követõen mintegy 140 µgekv/ml [25].
OH
NH CH2 NH2 Br
Br
3. ábra Az ambroxol szerkezeti képlete
11
CH3 CH3O N N
CH3O
NH2 4. ábra
1.2.2. Bioekvivalencia vizsgálatok
bioekvivalencia vizsgálatok, amelyek során egy, vagy több teszt és egy referencia gyógyszerforma farmakokinetikai paramétereit vizsgáljuk egészséges önkénteseknek történõ beadást követõen matematikai statisztikai módszerekkel. A farmakokinetikai paramétereket a vizsgálat során, az önkéntesektõl különbözõ idõpontokban gyûjtött plazmaminták gyógyszer koncentrációjának elemzésével kapott farmakokinetikai görbe (idõ-gyógyszerkoncentráció
összefüggés)
alapján
kaphatjuk
meg.
Fontos
farmakokinetikai paraméter a csúcs koncentráció (C max), a csúcs koncentráció kialakulásához szükséges idõ (tmax) és a görbe alatti terület (AUC). A referencia készítménynek az adott országban már törzskönyvezett, jól dokumentált készítménynek kell lennie [26].
1. Kémiai, gyógyszertechnológiai egyenértékûség: azonos hatóanyag tartalom, content uniformity és hatóanyag kioldódás, amelyet in vitro módszerekkel vizsgálnak.
Az
in
vitro
kioldódás
vizsgálatot
az
adott
ország
gyógyszerkönyvében megadott általános elõírások, és az adott hatóanyagra vonatkozó elõírások alapján kell kivitelezni.
12
2. Biológiai
egyenértékûség
(bioekvivalencia):
kémiailag
egyenértékû
készítmények, amelyekbõl a hatóanyag a szisztémás keringésbe azonos mennyiségben és sebességgel jut be. 3. Terápiás egyenértékûség: kémiailag és biológiailag egyenértékû készítmények, amelyek azonos terápiás hatást hoznak létre.
Ha az elsõ két egyenértékûség fennáll, akkor a terápiás egyenértékûséget nem szükséges vizsgálni, mivel az, az elsõ két adatból következik. Nem szükséges bioekvivalencia vizsgálatot végezni intravénásan adagolható készítmények, és a szubkután vagy intramuszkulárisan adagolható segédanyag nélküli vizes oldatok helyettesíthetõségének kérdésében, valamint azon külsõdleges és per os készítmények esetében, amelyek felszívódás nélkül fejtik ki hatásukat, vagy magas biológiai hasznosíthatóságúak. A hatóanyagok nagy része azonban kívül esik ezen a
Kötelezõen el kell végezni a bioekvivalencia vizsgálatot azon készítmények esetében, amelyek hatóanyaga az alábbi szempontok valamelyikének megfelel. a) kemoterapeutikumok, koronária tágítók, stb,) illetve ha a hatóanyag szûk hatásspektrumú, meredek a dózis-hatás összefüggés, vagy nagy a súlyos, nem
b) Farmakokinetikai szempont: ha nem lineáris a dózis-vérszint összefüggés a terápiás tartományban, ha a hatóanyag intenzíven metabolizálódik (az anyavegyület több, mint 70%-a), ha alacsony a biológiai hasznosíthatóság (kevesebb, mint 30%), illetve ha a hatóanyag farmakokinetikája nagy individuális különbségeket mutat. c) Fizikai kémiai, illetve kémiai szempontok: Ha a hatóanyag oldhatósága csekély (0,1%-os 7-es pH –jú pufferben, illetve 0,1 N sósavban), ha instabil a gyomorbél traktusban, vagy metastabil módosulatokat képez. d) Gyógyszerformai
sajátosság:
kontrollált
hatóanyag
transzdermális, intramuszkuláris készítmények esetén, stb.
13
leadású,
rektális,
Az azonos g
bioekvivalencia vizsgálat. Ha a készítmények proporcionálisak, de a hatóanyag farmakokinetikája nem lineáris, vagy nem azonos a készítmények kioldódási profilja, dózisonként kell elvégezni a bioekvivalencia vizsgálatot. Különbözõ erõsségû, eltérõ segédanyag összetételû (nem proporcionális) készítmények esetében pedig külön-külön végzendõ a bioekvivalencia vizsgálat. Bioekvivalencia vizsgálat végzéséhez több feltételnek kell egyidejûleg teljesülnie. A teszt és a referencia készítménynek kémiailag egyenértékûeknek kell lennie, azaz azonos in vitro kioldódási profillal és stabilitással kell rendelkeznie, és a teszt készítmény elõállításának a GMP szerinti gyártás feltételeinek meg kell felelnie. Teljes kémiai és gyógyszerészeti dokumentációval kell rendelkezni, amely bizonyítja a készítmény elvárásoknak megfelelõ hatóanyag tartalmát és szennyezés profilját. A vizsgálat megkezdésekor rendelkezni kell továbbá az egészségügyi hatóság helyi etikai bizottsága által jóváhagyott klinikai protokollal, és a plazmaminták elemzésére alkalmas, validált bioanalitikai módszerrel. Megbízható klinikai háttérre van szükség, ahol biztosítottak a GLP, GALP, GCoP, GCP és GDP szabályoknak megfelelõ körülmények [27]. A bioekvivalencia vizsgálat tervezése során meg kell határoznunk a vizsgálatba bevonandó egészséges önkéntesek számát, a kezelési elrendezést, a vérvételi idõpontok számát és idõpontját, a vizsgálat két fázisa közötti úgynevezett kiürülési idõt és a vizsgálat egyéb körülményeit (étkezés, fogyasztott folyadék mennyiség, stb.) [28]. szükség. A mai gyakorlatban az egészséges önkéntesek száma általában minimálisan 24, de ez egyes készítmények esetében emelkedhet [29]. Az egyének közötti különbségek minél teljesebb kizárása érdekében „standardizált” önkénteseket válogatnak be a vizsgálatba. Ennek alapján az esetek többségében 18 és 40 év közötti, nem dohányzó, standardizált testalkatú (testmagasság, testsúly), egészséges férfiak vehetnek részt a vizsgálatban. Kizáró tényezõ például az alkohol vagy drogfüggõség, vese, vagy máj betegség, rendszeres gyógyszerfogyasztás, lényeges betegség a vizsgálat elõtti négy hétben, vagy gyógyszer bevétel a vizsgálat elõtt nyolc napon belül, versenyszerû sport. Feltétel továbbá az együttmûködõ készség és a pszichológiai alkalmasság is.
14
Egy teszt és egy referencia készítmény összehasonlításakor (két utas vizsgálat) a bioekvivalencia vizsgálat két fázisból áll. A két fázis között eltelt kezelésmentes idõtartamot kiürülési periódusnak nevezzük, amely idõtartam alatt a hatóanyag kiürül a szervezetbõl, így nem befolyásolja a második kezelést követõen kialakuló gyógyszer koncentrációt.
A
kiürülési
periódus
hosszát
az
adott
gyógyszervegyület
farmakokinetikai tulajdonságai, elsõsorban a biológiai felezési idõ alapján határozhatjuk meg. Általában a biológiai felezési idõ öt-hatszorosa a kiürülési periódus, de jó, ha minimálisan egy hét, mivel így a vérvételek okozta fiziológiai változások kiegyenlítõdnek, és nem befolyásolják a vizsgálat eredményét. Mivel egy bioekvivalencia vizsgálat klinikai fázisa több hétig is eltarthat, a vizsgálati körülmények változása okozta hibalehetõség kiküszöbölésére a kezelési elrendezést az úgynevezett latin négyzet elrendezés alapján valósítják meg [30].
farmakokinetikai görbe (felszívódási, megoszlási és kiürülési szakasz) meghatározható legyen.
Általában a biológiai felezési idõ háromszorosának megfelelõ idõtartamra
osztanak el minimálisan tizenöt vérvételi pontot. Így a teljes kiürüléshez szükséges idõre nem esik vérvételi idõpont, ezért a görbe kiürülési szakaszának ezt a részét már csak extrapolálni tudjuk. A görbe ezen szakaszának területe az AUC Rest értékével adható meg, amely terület nem haladhatja meg a görbe alatti terület 20%-át. A gyûjtött plazmaminták elemzése validált bioanalitikai módszerrel történik. A mennyiségi meghatározást belsõ standard módszerrel kell végezni, az individuálisan várható csúcskoncentráció 10%-át még mérni kell tudni, és a plazmakoncentrációt a biológiai felezési idõ (tβ 1/2 LLOQ meghatározásánál figyelembe kell venni a
plazmakoncentráció egyes
vegyületeknél tapasztalt jelentõs egyének közötti szórását is. Ez esetben a bioanalitikai módszernek jelentõs tartalékkal kell rendelkeznie az LLOQ tekintetében. A kapott farmakokinetikai eredmények statisztikai értékelése a logaritmált adatokból számított 90%-os konfidencia intervallum, négy utas variancia analízis, Shuirmann teszt, valamint nem paraméteres tesztek segítségével történhet [31; 32; 33; 34].
15
1.2.3. A bioanalitikai módszerek validálása A farmakokinetikai vizsgálatokat ma már csak validált analitikai módszer alkalmazásával lehet egyértelmûen elfogadhatóvá tenni. A validálás olyan eljárások összessége, amely azt bizonyítja, hogy az adott módszer az adott elemzési feladatra megbízhatóan, ismert jellemzõk mellett alkalmazható. A validálás a teljes analitikai folyamatra vonatkozik [35; 36; 37; 38;].
1.2.3.1. Specificitás/szelektivitás vizsgálat A szelektivitás vizsgálata során azt kell bizonyítanunk, hogy a meghatározandó komponensek retenciós tartományában nincs interferáló komponens. A szelektivitást több -általában hat- egyedi plazmaminta és készített plazmaminta kromatogramjának összehasonlításával igazoljuk. További, kiegészítõ információt kaphatunk csúcstisztaság vizsgálattal, ha rendelkezésre áll diódasoros UV detektor. Intenzív metabolizmus esetén szükség lehet pilot (tájékozódó) vizsgálatra is az esetleges metabolit interferencia
Mérési tartomány ( Range ): a mérési tartomány az a koncentráció tartomány, ahol a mért detektor válaszjel a mérendõ alkotó koncentrációjának egyértelmû függvénye. Linearitás: a módszer linearitása azt fejezi ki, hogy a detektor válaszjel egyenesen arányos az alkotó koncentrációjával. Korrelációs koefficiens r = 0,995 feletti érték fogadható el. A korrelációs koefficiens megadása a legújabb elõírások szerint nem kötelezõ. A kalibrációs tartományt átfogó, legalább 6 különbözõ koncentrációjú plazma minta mérési eredményeire számítógép segítségével egyenest illesztünk legkisebb négyzetek módszerével, vagy kombinatórikus módszerrel. Szükség esetén mód van súlyfüggvény alkalmazására is. Megadandó az egyenes egyenlete. [39; 40] A mennyiségi meghatározás alsó határa (LLOQ ): biológiai mintákból történõ nyomelemzéseknél azt a koncentrációt tekintjük a mérhetõség határának, amely még mérhetõ az analitikai célnak megfelelõ, bioanalitikai módszerek esetén 20%-ot meg nem haladó pontossággal és torzítatlansággal.
16
A detektálhatóság ( kimutathatóság ) határa ( LOD ): Az anyagnak azt a legkisebb koncentrációját jelenti, amely még kimutatható a mintában az adott kísérleti körülmények között. Számszerûleg azt a koncentrációt jelenti, ahol a jel-zaj arány minimálisan 3:1.
1.2.3.3. Megbízhatóság vizsgálatok A
megbízhatóság
vizsgálatokon
belül
megkülönböztetünk
A pontosság (precision) az eredmények középérték körüli szórásával jellemezhetõ, számértéke az S.D., illetve az RSD%. A torzítatlanság (accuracy) megmutatja, hogy párhuzamos méréseink átlaga mennyire tér el a valódi értéktõl. A kalibrációs koncentráció-sorozat mérési pontjaiból számított regressziós egyenes egyenlete alapján számoljuk a koncentrációkat, és ezeket hasonlítjuk össze az általunk elméletileg bemért koncentrációkkal. Számértékkel kifejezve a mért koncentráció nominálistól való eltérés százaléka. Biológiai minták elemzésénél a pontosság és torzítatlanság maximális értéke 15%, kivéve a kalibrációs tartomány legalsó koncentráció értékét, ahol ez maximálisan 20% lehet.
apon legalább hat pontból álló kalibrációt készítünk, és a kapott mérési pontokra egyenest illesztünk. A kalibrációs mintákkal együtt legalább három - a kalibrációs tartományba esõ egy alacsony, egy közepes és egy magas koncentráció szinten analízist végzünk koncentráció szintenként három-három, ismert koncentrációjú párhuzamossal (QC minták.). A kalibrációs pontokra illesztett egyenesek egyenletei alapján számítjuk a QC minták koncentrációit, és a pontosság és torzítatlanság értékeket, amelyeknek a fent említett határokon belül kell maradniuk. A kalibrációs pontok együttes és külön-külön számított pontosság és torzítatlanság értékeinek is a megadott határokon belül kell maradniuk.
17
Napon belüli megbízhatóság vizsgálata
A napon belüli megbízhatóság vizsgálatakor legalább három koncentráció szinten, öt-öt párhuzamos analízist végzünk ismert koncentrációjú minták feldolgozásával, és ugyanazon a napon felvett kalibrációs egyenes egyenlete alapján számítjuk a QC minták koncentrációját. A kapott adatok alapján vizsgáljuk a pontosságot és torzítatlanságot, amelyekre a fent említett határok érvényesek [41; 42].
1.2.3.4. Extrakciós hatásfok Az extrakciós a vizsgálandó komponensek plazmából való kinyerésére kidolgozott extrakciós módszer hatékonyságáról ad tájékoztatást. Definíció szerint a hozzáadott és visszanyert anyagmennyiség aránya, %-ban kifejezve. Az extrakciós hatásfokot meg kell adni a vizsgált komponens(ek)re és a belsõ standardra egyaránt. Vizsgálata során a meghatározandó komponensek standard oldatainak (nem extrahált minta) analízise során kapott csúcsterületekhez viszonyítjuk, és annak százalékában adjuk meg az extrahált, készített plazmaminták analízise során kapott csúcsterületeket. 1.2.3.5. A rendszeralkalmasság vizsgálata A rendszeralkalmasság vizsgálatával azt bizonyítjuk, hogy a kromatográfiás rendszer
reprodukálhatóan mûködik. Egy alacsony, egy közepes és egy magas
koncentrációjú
mintából
öt-öt
injektálást
végzünk
és
a
maghatározandó
komponens/belsõ standard csúcsterület arányok szórását, szükség szerint pedig, ha interferáló komponens jelentkezik a meghatározandó vegyület, vagy a belsõ standard retenciós idejéhez közel, akkor a felbontóképesség értékét is vizsgáljuk.
1.2.3.6. A kalibráció kiterjesztése plazmával való hígítással Erre a validálási paraméterre azért van szükség, hogy az esetlegesen az egyének közötti különbségekbõl származó kiugró plazmakoncentrációk is értékelhetõek legyenek a kalibrációs tartományon belül. Bizonyítjuk tehát, hogy a kalibrációs tartományon kívül esõ, adott koncentrációjú minta hígítható plazmával úgy, hogy az így kapott koncentrációja már a kalibrációs tartományon belül essék. A vizsgálat során a
18
kalibrációs tartományt meghaladó koncentrációjú spikolt plazma mintát készítünk, és plazmával többszörösére hígítjuk, és aliquotját elemezzük. Vizsgáljuk az így mért koncentrációnak a hígítással elérni kívánttól való százalékos eltérését. Akkor fogadjuk el az eredményt, ha a százalékos eltérés 15%-nál kisebb.
n vizsgálnunk kell a meghatározandó komponensek hosszú és rövid távú stabilitását plazmában. A stabilitás vizsgálat kezdetekor (kiindulási érték) és a stabilitás vizsgálat jellegének megfelelõ tárolást követõen elemzést végzünk három koncentráció szinten (a kalibrációs tartomány egy alacsony, egy közepes és egy magas koncentráció szintje) három-három párhuzamossal. Vizsgáljuk a kapott koncentrációk százalékos eltérését a kiindulási illetve a nominális koncentrációtól. Stabilnak ítéljük a mintát, ha a kétféle módon számolt eltérés legalább nyolc esetben a mért kilenc mintából nem haladja meg a 15 %-ot.
Hosszú távú stabilitás vizsgálatok Ezen vizsgálatok során bizonyítjuk, hogy a plazma tervben leírt, a bioekvivalencia vizsgálatból származó „éles” vizsgálati minták tárolási körülményeivel megegyezõ körülmények között (általában –20 ºC-on, vagy –70 ºC-on történõ tárolás), az elsõ mintavételtõl az utolsó minta elemzéséig eltelt idõ alatt. A validálási tervben megadott idõközönként három koncentráció szinte három-három párhuzamos elemzést végzünk, és a fent leírt módon értékeljük az eredményeket [43].
Rövid távú stabilitás vizsgálatok Felolvasztásos stabilitás vizsgálata
A bioekvivalencia vizsgálat során elõfordul (pl. ismételt elemzés), hogy egy mintát többször fel kell olvasztani fagyott állapotából, ezért szükséges bizonyítanunk, hogy a bioanalitikai módszer a plazma minta többszöri fagyasztása-olvasztása után is pontos és reprodukálható eredményt szolgáltat..
19
Autosampler stabilitás vizsgálata
A bioekvivalencia vizsgá latok során elemzendõ minták nagy száma következtében a minták egy része csak a minta elõkészítést követõen órák múlva kerül elemzésre, addig szobahõmérsékleten, az automata mintaadagolóban, feldolgozott állapotban kell, hogy tároljuk. Bizonyítanunk kell tehát, hogy a mintánk stabil feldolgozott állapotban, °C-on való tárolást követõen.
1.2.3. Metabolizmus vizsgálatok 1.2.3.1. Deramciclane-fumarát: A deramciclane (EGIS-3886; (1R, 2S, 4R)-(-)-N,N-dimetil-2-{(1,7,7-trimetil-2fenilbiciklo-[2,2,1]-hept-2-il)oxi}-etánamin-2-(E)-hidrogénfumarát)
(5.
ábra)
fõ
farmakológiai hatása alapján a nem benzodiazepin típusú anxiolitikumok közé tartozik [44; 45]. Anxiolitikus hatása több állatkísérletes tesztrendszerben igazolható, (Vogel-féle teszt, szociális interakció teszt, gyöngytemetõ viselkedésen alapuló teszt, két kompartment teszt) amelyek elõrevetítik az anxiolitikus hatást emberben is [46; 47; 48].
H3C
CH3 O
H3C
NH
CH3 CH3
5. ábra A deramciclane bázis szerkezeti képlete
20
A deramciclane nagy affinitást mutat az 5-HT2C és az 5-HT2A típusú szerotonin receptorokhoz.
Kötõdésekor
antagonizálja
az
5-HT2C-mediált
foszfoinozitol
hidrolízist, amely az 5-HT2C képezi. Viszonylag nagy affinitást mutat a szigma-receptorokhoz is. Mérsékelten kötõdik a D2 dopamin receptorokhoz, kevésbé a D1 és a H1 receptorokhoz. Nem kötõdik viszont az adrenalin receptorokhoz. Anxiolitikus hatása fõként a szerotonin [49]. A
receptorokhoz (5-HT2A és az 5-HT2C
farmakológiai hatás 1:3 arányban tudható be az 5-HT2A és az 5-HT2C szerotonin receptoroknak. Egészséges önkénteseken végzett pozitron emissziós tomográfiás (PET) vizsgálatok igazolták a deramciclane kortikális szerotonin receptorokhoz való szelektív kötõdését [50]. A deramciclane-nak antidepresszáns hatása van az anxiolitikus hatás kialakulásához szükséges dózisnál nagyobb dózisban alkalmazva, továbbá kimutatható hatása a szociális fóbiákban is. In vivo körülmények között, az alkalmazott dózisokban nem mutatható ki a molekula dopaminnal szembeni antagonizmusa, illetve a D2
hatása, nem potencírozza az alkohol narkotikus hatását. Patkányon végzett kísérletben nem interferál a barbiturátokkal, bár az egérkísérletek arra utalnak, hogy jobb az együttes adagolást elkerülni. Nem mutatható ki perifériás antihisztamin hatása, nincs hatással sem a központi kolinerg, sem a perifériás adrenerg rendszerre, így valószínûleg nincsenek káros mellékhatásai az extrapiramidális rendszerre nézve, nem károsítja a mozgáskoordinációt és nem okoz izomrelaxációt . Több állatfajon kiterjedt farmakokinetikai vizsgálatok folytak a deramciclane orális, szubkután, intravénás és intraperitoneális adagolását követõen [51; 52; 53; 54; 55; 56]. Autoradiográfiás kísérletekben vizsgálva intravénás adás után a deramciclane megoszlását a különbözõ szervekben megállapítható, hogy a vizsgált 32 szervbõl - a véren kívül - tizenötben mutatható ki radioaktivitás. A beadást követõ ötödik percben nagy koncentrációban van jelen a tüdõben, jelentõs a májban, a mellékvesékben, a vesékben és az agyban. A gyógyszer hatása szempontjából elhanyagolhatatlan tény, hogy átjut a vér-agy-gáton. Jelentõs radioaktív koncentráció volt tapasztalható a gyomorfalban és a belekben, ami a deramciclane és/vagy metabolitjainak intenzív, epe
21
általi kiválasztására utal. Két órával a kezelés után a radioaktivitás szintje a legtöbb szervben csökkent (kivéve a heréket, a petefészkeket, a mellékveséket és a csontvelõt), jóllehet ez a szint jóval magasabb volt az aktuális vérszintnél. Huszonnégy órával a kezelés után a radioaktivitás a legtöbb szervben és szövetben a kimutatási határ alá csökkent, de tetemes radioaktivitás volt mérhetõ a belekben, és az eliminációban résztvevõ
szervekben.
autoradiográfiás
Lényeges
vizsgálatakor
biztonsági
alacsony
adat,
hogy
radioaktivitás-szint
vemhes volt
patkányok mérhetõ
a
méhlepényben, és egyáltalán nem volt kimutatható a magzatban. 14
C és 3 H izotóppal jelzett deramciclane farmakokinetikáját vizsgálva patkányban
egyszeri 10 mg/kg dózisú orális illetve intraperitoneális kezelést követõen, a farmakokinetikai görbe két kompartmentes modellel írható le mind az anyavegyületre, mind a vizsgált, farmakológiailag aktív N-dezmetil metabolitra, és kétfázisú enterohepatikus recirkuláció mutatható ki. Az abszorpció és a "first pass" metabolizmus igen gyors, mivel a csúcskoncentráció orális adagolást követõen 0,5 órával kialakul mindkét vegyület esetében [57]. Mind a vizsgá lt állati modellekben (egér, patkány, nyúl, kutya), mind pedig a humán vizsgálatokban teljes mértékben felszívódik a vékonybél különbözõ szakaszaiból. A humán vizsgálatokban a deramciclane biztonságosnak és jól tolerálhatónak bizonyult mind egyszeri, mind pedig többszöri adagolást követõen [58; 59]. Emberben, a CNS vegyületek esetében különös fontosságú in vivo gyógyszer-etanol interakciós vizsgálatban sem a deramciclane, sem az etanol vérszintje nem változott [60]. A metabolizmus vizsgálatok során nagy fajok közötti különbségek voltak tapasztalhatók [61]. A humán plazma metabolizmus vizsgálatok során tizenhat plazma metabolitot sikerült humán plazmából izolálni, ezek közül tizenöt
metabolit szerkezete volt
azonosítható. A kilenc fõ (major) metabolit kvantitatív elemzése is megtörtént, és a farmakokinetikai paraméterek is elemzésre kerültek, ahol ez lehetséges volt. A deramciclane és N-dezmetil deramciclane esetében kapott eredmények jól egyeztek a korábbi farmakokinetikai vizsgálatok eredményeivel [62].
22
1.2.3.2. Folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikák szerepe Egy gyógyszerjelölt metabolikus profiljának felderítéséhez mind állati, mind humán vizsgálatban speciális mûszerek, tisztítási és izolálási technikák és az analitikai és mikro-, vagy szemipreparatív eljárások kombinációja szükséges [63; 64]. A vizsgált vegyületek radioaktív jelzésének és a radioaktív detektálásnak fontos, és fõleg a metabolizmus kutatás kezdeti szakaszában megkerülhetetlen szerepe van a gyógyszerjelöltek metabolikus profiljának felderítésében [65; 66]. Fontos szerepe van a radiokémiai detektálásnak (RD), a digitális autoradiográfiának (DAR) [67; 68] és a folyadékszcintillációs spektroszkópiának (LSC) [69; 70]. A radiokémiai detektor szilárd szcintillátorral mûködik, míg az LSC esetében a szcintillátor anyag folyékony halmazállapotú. A szcintillációs módszernél
egyes anyagok azon tulajdonságát
használják fel, hogy bennük nagy energiájú sugárzás hatására fényfelvillanás, „szcintilláció” keletkezik, azaz a sugárzás energiája adott hatásfokkal 350-600 nm közötti hullámhosszúságú fotonokat produkál. A szcintillációs detektálás folyamata során elsõ lépésként a sugárzás energiája fényenergiává alakul (fényfelvillanás). A fényfelvillanásokat a fotoelektronsokszorozó elektromos impulzussá alakítja, amelyeket elektronikus segédberendezések erõsítenek, szétválogatják, mérik, regisztrálják stb. A szcintillátor anyagok lehetnek folyadék és szilárd halmazállapotúak. A leggyakrabban használt folyadékszcintillátor anyagok négy- és öttagú gyûrûs, többségükben heterociklusos részt is tartalmazó vegyületek. A szilárd szcintillátorok lehetnek szerves és szervetlen kristályok egyaránt. A szerves szcintillátorok többsége különbözõ nem aromás helyettesítéseket tartalmazó aromás szénhidrogén. Az alkalmazott szervetlen kristályok fõleg alkáli-halogenidek, amelyek aktivátorként kis mennyiségû adalékot tartalmaznak [71]. A digitális autoradiográfia esetében a készülék méri az ionizáló sugárzás helyzetét, intenzitását és eloszlását a HPTLC rétegen. A detektálás alapja a proporcionális számlálás. A proporcionális számláló lényegében olyan ionizációs kamra, amelyben a részecskék ionizációja által létrehozott elektronok nagy elektromos térerõsség hatására úgy sokszorozódnak, hogy az összes ionpárok száma arányos a primer ionpárok számával [72]. Az érzékeny detektálási terület 20 x 20 cm. Az anód potenciál 900 és 2000V között változtatható.
23
metabolitok különbözõ testnedvekbõl és exkrétumokból (plazma, vizelet, széklet, nyál, anyatej, stb.) történõ izolálásához. Fõleg a nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) és a planár kromatográfiás módszerek leghatékonyabbja, az OPLC [73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82]. A folyadékkromatográfia radioaktív detektálás kapcsolt technikák alkalmazásakor nagy hatékonyságú elválasztás és szelektív detektálás párosul, amelyekre nagy szükség van a metabolizmus kutatás során. Az OPLC esetében a detektálás mind off-line, mind pedig on-line módon megvalósítható. Off-line detektálás esetén az elválasztás és a detektálás térben és idõben elkülönülten zajlik (6. ábra). Ilyen kapcsolt technika az OPLC-DAR, amely lehetõvé teszi az elválasztott metabolitok vékonyrétegen történõ in-situ detektálását [83]. Nagy elõnye ennek a technikának a kontakt autoradiográfiával szemben, hogy napok, hetek helyett pár óra alatt elkészíthetõ a felvétel még alacsony radioaktív koncentrációjú minták esetében is.
A detektálás idejének helyes megválasztásával csökkenthetõ a
kimutatási határ. Off-line kivitelezett elválasztás esetén a metabolit foltok a DARfelvétel alapján lekaparhatók a rétegrõl, és megfelelõ oldószerrel leoldhatók. Az így kapott metabolit frakció további sorsa a mennyiségétõl és tisztaságától függ. Megfelelõ tisztaság és mennyiség esetén szerkezetvizsgálat végezhetõ. Nem megfelelõ tisztaság esetén az izolált anyag további tisztítási lépéseknek vethetõ alá. Ilyen lehetõség az online frakciógyûjtés, amikor a metabolit frakciókat a rétegen túlfuttatjuk, és [84]. A gyûjtött minták radioaktív koncentrációját folyadékszcintillációs számlálással határozhatjuk meg. Új lehetõség a metabolit frakciók OPLC-s elválasztást követõ on-line detektálására, az OPLC-RD kapcsolt technika, amelynek során az elválasztott metabolit frakciókat radiokémiai detektorral detektáljuk, és a detektorjel alapján gyûjtjük (7. ábra). A gyûjtött metabolit frakciókat szükség esetén további HPLC-s elválasztásnak vethetjük alá a nagyobb tisztaság elérése érdekében. A futtatás után DAR technikával ellenõrizhetõ, hogy nem maradt-e a rétegen radioaktív anyag [85]. A kromatográfiás elválasztást - sok esetben több lépéses – minta elõkészítés elõzi
vizsgálandó fajtól (ember, vagy állat), a metabolitok számától és a mátrixtól. Állatkísérletben nagyobb radioaktív dózis alkalmazható, és a kisebb megoszlási térfogat
24
miatt a radioaktívan jelzett metabolitok nagyobb koncentrációt érnek el az exkrétumokban illetve a plazmában, mint humán vizsgálat esetén. A kis radioaktív koncentrációjú minták esetében nagy mennyiségû mintát kell feldolgozni, így nagy kapacitású minta elõkészítési eljárásokra van szükség. Elõfordulhat olyan bonyolult izolálási, tisztítási feladat is, amikor az OPLC és HPLC radioaktív detektálás kapcsolt technikák kombinálása vezet eredményre. Ilyenkor kihasználjuk és kombináljuk az egyes technikák elõnyeit [86; 87; 88; 89]. A HPLC nagy hatékonysága és szelektivitása kiegészül az OPLC-s elválasztás által felkínált nagy kapacitással, az eltérõ szelektivitással, és azzal a vitathatatlan elõnnyel, hogy az OPLC esetében a startról el nem mozduló metabolitok is detektálhatók. Ennek nagy szerepe lehet a módszer kidolgozás szakaszában, mivel meggyõzõdhetünk arról, hogy nem veszítünk el radioaktív anyagot az elválasztás során. Fontos szerepe van az OPLC-DAR technikának a gyors, tájékozódó (fingerprint) vizsgálatok esetében is. Így például sikerrel alkalmazható a metabolit konjugátumok meglétének vizsgálatakor, amikor az enzimes hidrolízis korlátozza a felhasználható mintamennyiséget. Az enzimesen emésztett és nem emésztett minta egy rétegen történõ, egyidejû futtatásával gyors eredmény
kapható
a
konjugátumok
25
meglétérõl,
vagy
hiányáról.
KI
Front
Távolság
OPLC-DAR
minta BE
Start
idõ Off-line OPLC
6.ábra Off-line OPLC-DAR . ábra detektálás
ON-LINE
OPLC- RD
t
minta BE
idõ komponensek 7. ábra On-line OPLC-RD detektálás és off-line OPLC-DAR detektálás összehasonlítása 26
OPLC-DAR
off-line radioktív
Távolság
OFF-LINE
KI
2. Célkitûzések HPLC módszer kidolgozása volt a célom fluoreszcens detektálással a cisapride humán plazmából történõ meghatározására 5-200 ng/ml tartományban a Cisaprid és Coordinax 5 és 10 mg-os tabletták bioekvivalencia vizsgálata számára. Új bioanalitikai módszer kidolgozására volt szükség, mert az irodalomban fellelhetõ módszerek nehezen hozzáférhetõ belsõ standardot alkalmaznak, szelektivitásuk nem megfelelõ, 2 ml plazmából indulnak ki, vagy a cisapride újszülött plazmában történõ meghatározására alkalmasak [90;91;92;93]. A meghatározandó vegyületek plazmából történõ kinyerését szilárd fázisú extrakcióval kívántam megoldani. Célom volt a módszer validálásakor a nemzetközi elõírások figyelembe vétele.
Célom volt egy új HPLC-UV módszer kidolgozása az ambroxol kutya plazmából történõ meghatározására. A módszer kidolgozására azért volt szükség, mert állatkísérlet segítségével kívántuk igazolni az EGIS Rt. saját fejlesztésû 75 mg-os retard ambroxol kapszulájának retard hatását, illetve a majdani bioekvivalencia vizsgálata számára
a
megfelelõ
referens
készítményt
kiválasztani
(Mucosolvan,
vagy
Ambrobene). A korábban, humán plazmára kidolgozott módszer [94] nem volt teljes
várható nagyobb plazma csúcskoncentráció miatt. Az irodalomban sem találtam teljes egészében átvehetõ módszert [95;96;97;98], ezért szükség volt a kalibrációs tartomány kiterjesztésére, és a megfelelõ elválasztást biztosító eluensrendszer kidolgozására. Validálási vizsgálataimmal igazolni kívántam, hogy az új HPLC-UV módszer 25 - 2000 ng/ml koncentráció tartományban
alkalmas az ambroxol kutya plazmából történõ
meghatározására.
A deramciclane metabolit profiljának humán és kutya vizeletben illetve plazmában való feltérképezésére szándékoztam alkalmazni a folyadékkromatográfiaradioaktív detektálás kapcsolt technikákat. Célom volt ezen kívül az egyes technikák módszertani összehasonlítása, és alkalmazhatóságuk vizsgálata a metabolizmus kutatás folyamatában. A kutya vizelet és plazma metabolitok esetében az off-line OPLC-DAR
27
technikát illetve az on-line frakciógyûjtést kívántam alkalmazni. Célul tûztem ki, hogy a humán vizelet és plazma metabolitokat a Farmakokinetikai Kutató Laboratóriumban kifejlesztett HPLC-RD, OPLC-RD és OPLC-DAR módszerekkel, illetve azok kombinációjával izoláljam. A metabolitok kvantitatív meghatározását a HPLC-RD technikával terveztem megoldani. Törekedtem arra, hogy a deramciclane metabolit profiljának felderítése során felmerülõ feladatokat a legmegfelelõbb, leggazdaságosabb technika alkalmazásával oldjam meg. A metabolizmus kutatás során jelentkezõ sokrétû izolálási feladatokat a fent említett új, folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikák kombinált alkalmazásával kívántam megoldani.
28
3. Módszerek
3.1. A cisapride meghatározása humán plazmából HPLC-FLD
3.1.1. Anyagok és vegyszerek Cisapride(Cis-4-amino-5-klór-N-[1-[3-(4-fluor-fenoxi)propil]-3-metoxi-4-piperidinil]2-metoxi-benzamid) (EGIS Gyógyszergyár Rt. Budapest, Magyarország); KPH-61
4-amino-5-klór-N-{1-[3-(4-fluor-fenoxi)-propil]-piperidin-4-il}-2-metoxi-
benzamid (EGIS Gyógyszergyár Rt.); (2. ábra) Az analitikai munka során alkalmazott vegyszerek analitikai, vagy jobb minõségûek voltak. A vizes oldatok készítéséhez Millipore Q készülékbõl nyert ultratiszta desztillált vizet használtam. A víz minõségét spektrofotometriásan ellenõriztem. A felhasznált gyógyszermentes humán plazma az EGIS Gyógyszargyár Rt. orvosi rendelõjében szervezett véradásból származik. Véralvadás gátló szerként CPD-oldatot alkalmaztam. 8 ml vérhez 1,3 ml CPD oldatot adtam. A levett vért centrifugáltuk (10 perc 3000 rpm). Az elkülönített plazmát egyénenként külön, felcímkézett, csiszolt dugós csövekbe mértük automata pipettával, és lefagyasztottuk. A plazmát °C-on tároltuk. A véralvadásgátló CPD-oldat a következõ összetevõket tartalmazta:
D-glükóz
18,90 g
trinátrium-citrát
13,25
nátrium-dihidrogén-foszfát
0,98 g
citromsav
1,62 g
A desztillált vízben feloldott sókat 500 ml-es mérõlombikba öntöttük, és jelig töltöttük desztillált vízzel.
3.1.2. Mérõmûszerek, készülékek és eszközök
29
Hewlett-Packard 1090 Series II/M folyadékkromatográf (három csatornás pumpa, nagy nyomású gradiens képzéssel, pneumatikus automata mintaadagoló; Hewlett-Packard 1046A programozható fluoreszcens detektor; LiChroCART 250-4 Purospher RP-18 (5 µm) HPLC kolonna (Merck
Darmstadt, Németország); LiChroCART 4-4
Purospher RP-18 endcapped (5 µm) (Merck Darmstadt, Németország); Chromabond C8 (100 mg) (MACHEREI-NAGEL, Düren, Németország) SPE oszlop kerültek
Hettich Micro Rapid/K laboratóriumi centrifuga; Junior III. laboratóriumi centrifuga; Orion 520A pH-mérõ; Block-Therm termosztát; Mettler AT261 DeltaRange analitikai mérleg; Mettler PM 4800 DeltaRange mérleg; Heidolph MR2002 melegíthetõ mágneses keverõ; Heidolph Reax 2000 kémcsõkeverõ; Supelco szilárd fázisú extrakciós vákuum készülék; (Merck, Darmstadt, Németország); Millipor Q RG ioncserélõ berendezés; Miele mosogatógép; Finn pipetták, centrifugacsövek, mintatartó edények, mintatartó üvegbetét, Eppendorf csövek, amelyeket a vizsgálatokban alkalmaztam.
3.1.3. Alkalmazott szoftverek HP ChemStation for LC Rev. A.06.03 software HP ChemStation for LC Rev. A.05.04 software Windows NT Ver. 4.0
MS-DOS Ver. 4.0 Windows 3.11. Excel 5.0 Winword 6.0. HP-UX System Administration Manager HP-UX Release 10.01
30
3.1.5. Kromatográfiás körülmények 3.1.5.2. Minta elõkészítés A cisapride szilárd fázisú extrakciója humán plazmából A cisapride szilárd fázisú extrakciója humán plazmából 100 mg töltetet tartalmazó Chromabond C8 típusú SPE oszlopon történt. Az oszlopot 2 x 1 ml 2%-os ecetsavas metanollal, majd 2 x 1 ml desztillált vízzel aktiváltam. 1 ml plazmamintát vittem fel az oszlopra, amelyhez elõzõleg 20 µl 5 µ oldatot adtam. Az oszlopot 2 x 1 ml desztillált vízzel mostam, 5 percig szárítottam, majd 1 ml 1%-os ecetsavas metanollal oldottam le a mintát, amelyet ezután 40 °C-on N2-áram alatt szárazra pároltam. A bepárlási maradékot 100 µl eluensben oldottam, majd 10 percig 11500 min-1 fordulatszámmal centrifugáltam. A felülúszót automata pipettával vittem át a betétcsövet tartalmazó mintatartó edénybe.
3.1.5.3. A cisapride HPLC-FLD elválasztása humán plazmában A
cisapride
folyadékkromatográfiás
elválasztása
során
LiChroCART
250-4
Purospher RP-18 (5 µm) típusú analitikai oszlopot alkalmaztam. Az analitikai oszlop élettartamának növelése érdekében LiChroCART 4-4 Purospher RP-18 endcapped (5 µm) elõtétoszlopot használtam. A késõn eluálódó endogén plazmakomponenseket gradiens elúcióval távolítottam el az oszlopról. Az „A” eluens 30% 0,2 %-os trietilamin oldatot - amelynek pH-ját 4,5-re állítottam be foszforsavval- és 70% acetonitrilt tartalmazott. A „B” eluens összetétele 66% 0,2%-os trietilamin (pH=4,5) és 34% acetonitril volt. A gradiens program során az eluens összetétel a 8. percig 100% B, a 8,1-16 perc között 100% A, és 16,1-21 perc között újra 100% B volt. A trietilaminra azért volt szükség, mert enélkül a kromatográfiás csúcsok tailing-esek voltak. Az eluens áramlási sebessége 0,75 ml/perc volt, az analitikai oszlop 40 °C-ra volt termosztálva. Az injektált mintamennyiség 50 µl volt. A fluoreszcens detektálás során a λex 295 nm, a λem pedig 350 nm volt.
31
3.1.6. A validálási paraméterek méréséhez szükséges minták készítése 3.1.6.1. Oldatok A térfogat méréseket kalibrált automata pipettákkal és hitelesített mérõlombikokkal végeztem. A cisapride törzsoldatot 0,5 mg/ml koncentációban készítettem el a hatóanyagot metanolban oldva. A hígított cisapride törzsoldatokat 50 µg/m és 5 µg/ml koncentrációban készítettem el. A hígításokat 0,2%-os trietilamin oldattal (pH=4,5 foszforsavval beállítva) végeztem.
3.1.6.2. Kalibrációs minták A kalibrációs tartomány 5-200 ng/ml volt. A 200 ng/ml-es minta készítéséhez 5 µg/mles cisapride törzsoldatból 880 µl-t 22 ml-re egészítettem ki humán plazmával. A többi kalibrációs pont ebbõl készült tovafutó hígítással humán plazmával, amelyek koncentrációi 150; 100; 50, 25; 10 és 5 ng/ml voltak. A plazmaminták 1 ml-es részleteit Eppendorf csövekbe mértem és -20°C-on tároltam. Feldolgozáskor adtam hozzá a 20 µl hígított (5 µ
koncentrációi 150; 50 és 10 ng/ml voltak. A 150 ng/ml-es minta készítésekor 960 µl 5 µg/ml-es törzsoldatot 32 ml-re egészítettem ki humán plazmával. A többi koncentráció ebbõl készült tovafutó hígítással. A plazmaminták 1 ml-es részleteit Eppendorf csövekbe mértem és -20°C-on tároltam. Feldolgozáskor adtam hozzá a 20 µl hígított (5 µ 3.1.6.4. Mintakészítés a napon belüli megbízhatóság vizsgálatához 5-5 darab 150; 50; és 10 ng/ml-es mintát készítettem az 5 µg/ml-es hígított cisapride törzsoldat humán plazmával történõ hígításával. A mintákat koncentráció szintenként
32
egyedileg készítettem. A mintákat 1 ml-enként szétmértem, és 5-5 ml-t dolgoztam fel, µl hígított (5 µ
3.1.6.5. Mintakészítés az extrakciós hatásfok vizsgálatához
A kinyerési hatásfokot 10; 100 és 200 ng/ml koncentrációknál vizsgáltam a cisapride esetében, és 100 ng/ml koncentrációnál a belsõ standard minta esetében. Minden koncentráció szinten 5-5 mintát mértem le. A 10 ng/ml-es cisapride minta készítéséhez az 5 µg/ml-es hígított cisapride törzsoldatot, 100 ng/ml-es és 200 ng/ml-es cisapride µg/ml-es hígított cisapride törzsoldatot hígítottam eluenssel. A 100 ng/ml-es belsõ standard minta készítéséhez az 50 µg/ml-es hígított belsõ standard törzsoldatot hígítottam eluenssel. A kapott mintákból 50-50 µl-t injektáltam a HPLC-be. 3.1.6.6. Mintakészítés rendszer alkalmassági teszthez
A rendszeralkalmasság vizsgálatához 50; 100; és 200 ng/ml koncentrációjú mintákat µg/ml-es cisapride törzsoldat humán plazmával történõ hígításával. Minden koncentrációnál 5 x 1 ml-t mértem szét és dolgoztam fel. Az azonos koncentrációhoz tartozó mintákat összeöntöttem, és ötször 50 µl-t injektáltam.
3.1.6.7. A kalibráció kiterjesztése plazmával való hígítással 400 és 300 ng/ml koncentrációjú mintákat készítettem az 5 µg/ml-es hígított cisapride törzsoldat humán plazmával történõ hígításával. A mintákat 1 ml-ként szétmértem, majd 1-1 ml plazmát adtam hozzájuk. Az ily módon hígított mintákból 1-1 ml-t dolgoztam fel 20 µl hígított (5 µ
3.1.6.8. Plazma stabilitási minták készítése A rövid és hosszútávú stabilitást 200; 100 és 10 ng/ml koncentráció szinteken vizsgáltam. A 200 ng/ml koncentrációjú minta készítésekor 1920 µl 5 µg/ml hígított
33
készítettem tovafutó hígítással. A mintákat 1 ml-enként szétmértem, és az adott stabilitás vizsgálatnak megfelelõ módon tároltam, vagy dolgoztam fel. Feldolgozás elõtt adtam a mintához 20 µl hígított (5 µg/ml) belsõ standard oldatot.
3.1.6.9. Törzsoldatok stabilitásának vizsgálata A cisapride és belsõ standard törzsoldatok és hígított törzsoldatok stabilitásának vizsgálatához a következõ mintákat készítettem: 0,5 mg/ml cisapride és belsõ standard törzsoldat vizsgálata: 100 µl törzsoldatot 1 ml-re hígítottam 0,2%-os trietilamin oldattal (pH=4,5 foszforsavval beállítva) (50 µg/ml), és 20 µl-t 1 ml-re egészítettem ki eluenssel. 50 µ g/ml-es hígított cisapride és belsõ standard törzsoldat vizsgálata: 50 µg/ml-es törzsoldatból 20 µl-t 1 ml-re egészítettem ki eluenssel. 5 µ g/ml-es hígított cisapride törzsoldat és belsõ standard vizsgálata: 5 µg/ml-es µl-t 1 ml-re egészítettem ki eluenssel. A kapott mintákból 50-50 µl-t injektáltam a HPLC-be.
34
3.2. Az ambroxol meghatározása kutya plazmában HPLC-UV
3.2.1. Anyagok és vegyszerek Ambroxol
hidroklorid
(transz-4-(2-amino-3,5-dibróm-benzilamino)-ciklohexanol
hidroklorid (EGIS Gyógyszergyár Rt.); Nerisopam (EGIS-6775) (EGIS Gyógyszergyár
Az analitikai munka során alkalmazott vegyszerek analitikai, vagy jobb minõségûek voltak. A vizes oldatok készítéséhez Millipore Q készülékbõl nyert ultratiszta desztillált vizet
A felhasznált gyógyszermentes kutyaplazma a Wo-Be Kft-tõl származik (Budapest, 1164. Garmada u. 10.). A kutyatelepen levett vért lecentrifugáltuk (10 perc 3000 rpm). A plazmát egyedenként külön, felcímkézett, heparinozott csiszolt dugós csövekbe mértük automata pipettával, és lefagyasztottuk. A plazmát fagyott állapotban, szárazjég között, hûtõtáskában szállítottuk a Farmakokinetikai Kutató Laboratóriumba, és ott feldolgozásig -20°C-on tároltuk.
3.2.3. Mérõmûszerek, készülékek és eszközök Hewlett-Packard 1090 Series II/M folyadékkromatográf (három csatornás pumpa, nagy nyomású gradiens képzéssel, pneumatikus automata mintaadagoló; UV dióda soros detektor (DAD)); BDS Hypersil C18, 5 µm, 250 X 2,1 mm (Supelco, Bellefonte, P.A., µm, 10 X 2,1 mm (Supelco, Bellefonte, P.A., USA); Bond Elut C18 (100 mg) SPE oszlop (Merck, Darmstadt, Németország) kerültek
Az fentieken kívül alkalmazott készülékek és eszközök megegyeztek a 3.1.2. pontban
3.2.4. Alkalmazott szoftverek Az alkalmazott szoftverek megegyeztek a 3.1.3. pontban leírtakkal.
35
3.2.5. Kromatográfiás körülmények 3.2.5.1. Mintaelõkészítés
Az ambroxol szilárd fázisú extrakciója kutya plazmából Az ambroxol szilárd fázisú extrakcióját kutya plazmából, 100 mg töltetet tartalmazó BondElut C18 típusú SPE oszlop segítségével oldottam meg. Az oszlopot 2 x 1 ml metanollal, majd 1 ml desztillált vízzel aktiváltam. 1 ml, 10 µl belsõ standardot (500 ng) tartalmazó plazmamintát vittem fel az oszlopra, amelyet 2 x 1 ml desztillált vízzel, 500 µl 0,5%-os ammmónium-karbonát oldattal, 50 µl metanol-desztillált víz 1:1 arányú eleggyel, majd 50 µl metanollal mostam. A leoldás 1 ml metanollal történt, majd a °C-on N2 -áram alatt szárazra pároltam. A bepárlási maradékot 20 µl acetonitril és 130 µl 3-as pH-jú foszfát pufferben oldottam. A mintát 11500 min-1 fordulatszámmal 10 percig centrifugáltam, majd a felülúszót betétcsövet tartalmazó
3.2.5.2. Az ambroxol HPLC-UV elválasztása kutya plazmában
Az ambroxol, kutya plazmában történõ folyadékkromatográfiás elválasztása során BDS Hypersil C18, 250 X 2,1 mm, (5 µm) típusú analitikai oszlopot használtam, amelyet azonos töltetet tartalmazó, 20X2,1 mm-es elõtétoszloppal védtem a kutyaplazmából és az
eluensbõl
származó
szennyezõdésektõl.
A
késõn
eluálódó
endogén
plazmakomponenseket gradiens elúcióval távolítottam el az analitikai oszlopról. Az „A” eluens 93,7%, 0,2% trietilamint tartalmazó, 0,01 M foszfát puffer (pH=3) és 6,3% tetrahidrofurán volt. A „B” eluensben 70% volt az acetonitril, és 30% a foszfát puffer aránya. A gradiens program során az eluens összetétel a 33. percig 100% A, a 33,1. és 38. perc között 100% B, a 38,1. perctõl a 45. percig újra 100% A volt. A B eluensben alkalmazott foszfát puffer a kialakult egyensúly megõrzését és a 100% szerves oldószer alkalmazásával járó só kiválás elkerülését szogálta. Az eluens áramlási sebessége 0,35 ml/perc, az injektált mintamennyiség 100 µl volt. Az UV detektálás 210 nm-en történt. Az oszlop termosztátot 40 °C-ra állítottam be.
36
3.2.6. A validálási paraméterek méréséhez szükséges minták készítése 3.2.6.1. Oldatok A térfogat méréseket kalibrált automata pipettákkal és hitelesített mérõlombikokkal végeztem. 0,1 mg/ml koncentrációjú ambroxol törzsoldatot készítettem a hatóanyagot metanol és 0,01 M foszfát puffer (pH=3) 9:16 arányú elegyében oldva. A belsõ standard törzsoldat koncentrációja 0,1 mg/ml volt. A nerisopamot metanol és desztillált víz 9:16 arányú elegyében oldottam.
3.2.6.2. Kalibrációs minták
A kalibrációs tartomány 25-2000 ng/ml volt. A 2000 ng/ml-es minta készítéséhez 0,1 mg/ml-es ambroxol törzsoldatból 300 µl-t 15 ml-re egészítettem ki kutya plazmával. A többi kalibrációs pont ebbõl készült tovafutó hígítással kutya plazma felhasználásával. A kalibrációs pontok koncentrációi 1000; 500; 200; 100; 50 és 25 ng/ml voltak. A plazmaminták 1 ml-es részleteit Eppendorf csövekbe mértem és -20°C-on tároltam. Feldolgozáskor adtam hozzá a 10 µl hígított (50 µ
A minõségellenõrzõ (QC) mintákat 1500; 750; 150 és 75 ng/ml koncentrációban készítettem el. Az 1500 ng/ml-es minta készítésekor 300 µl 0,1 mg/ml-es törzsoldatot adtam 19,7 ml plazmához. A többi koncentráció ebbõl készült tovafutó hígítással. A mintákat 1 ml-es részletekben szétmértem és feldolgozásig –20 °C-on tároltam. Feldolgozáskor adtam hozzá a 10 µl hígított (50 µ A mintákat 1 ml-enként szétmértem, és 5-5 mintát dolgoztam fel koncentráció
37
3.2.6.4. Mintakészítés napon belüli megbízhatósághoz 5-5 darab 50; 500; és 2000 ng/ml-es mintát készítettem az alábbiak szerint: 1. oldat: 5 ml 0,1 mg/ml-es ambroxol törzsoldatot 10 ml-re hígítottam foszfát pufferrel (50 µg/ml) 2. oldat: 1 ml 1-es oldatot 10 ml-re hígítottam foszfát puferrel (5 µg/ml) 2000 ng/ml-es minta: 120 µl 100 µg/ml-es törzsoldatot adtunk 5,88 ml plazmához 500 ng/ml-es minta: 60 µl 1-es oldatot adtam 5,94 ml plazmához 50 ng/ml-es minta: 60 µl 2-es oldatot adtam 5,94 ml plazmához 3.2.6.5. Mintakészítés az extrakciós hatásfok méréséhez 50; 500 és 1000 ng/ml koncentrációknál vizsgáltam. Minden koncentráció szinten 6-6 µg/ml és 5 µg/ml koncentrációjú oldatokat készítettem a 100 µg/ml-es ambroxol törzsoldat foszfát pufferrel való hígításával. és 100 µl-t injektáltam. 1000 ng/ml-es minta készítése: 10 µl 100 µg/ml-es ambroxol törzsoldat + 140 µl foszfát puffer (pH=3) 500 ng/ml-es minta készítése: 10 µl 50 µg/ml-es ambroxol hígított törzsoldat + 140 µl foszfát puffer (pH=3) 50 ng/ml-es minta készítése: 10 µl 5 µg/ml-es ambroxol hígított törzsoldat + 140 µl foszfát puffer (pH=3) A kapott mintákból 100 µl-t injektáltam.
3.2.6.6. Mintakészítés rendszer alkalmassági teszthez
A rendszer alkalmasságot az 1000; 500; és 200 ng/ml koncentráció szinteken vizsgáltam. A minták készítéséhez 100 µg/ml-es, 50 µg/ml-es és 5 µg/ml-es hígított ambroxol törzsoldatokat készítettem és hígítottam tovább kutya plazmával. Minden koncentrációnál 2 x 1 ml-t mértem szét és dolgoztam fel. Az azonos koncentrációhoz tartozó mintákat összeöntöttem, és ötször 50 µl-t injektáltam.
38
3.2.6.7. Hosszútávú stabilitási minták készítése
A mintákat a 3.2.6.4. pont szerint készítettem.
39
3.3. Deramciclane metabolitok izolálása humán vizeletbõl, kutya
3.3.1. Anyagok és vegyszerek A 14 C-deramciclanet (2-([U- 14 C]-fenil)-borneol-dimetilamino-etil-éter hidrogénfumarát) 3
H-kámfor-3-deramciclane-fumarátot a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai
Kutatóközpont Kémia Intézete (Budapest, Magyarország) állította elõ. Az analitikai munka során alkalmazott vegyszerek analitikai, vagy jobb minõségûek voltak. A vizes oldatok készítéséhez Millipore Q készülékbõl nyert ultratiszta desztillált vizet
Az egy éves hím Beagle kutyák a Wo-Be Kft-tõl származtak. A kutyákat két külön kísérletben 10 mg/kg
14
C-fenil-deramciclane-fumaráttal és 3 H-kámfor-3-deramciclane-
fumaráttal kezelték. Plazma és vizelet mintákat gyûjtöttek. Jelen vizsgálatban a 2,5-12 órás egyesített plazmafrakció 20 ml-ét, illetve a 0-24 órás egyesített vizelet frakció 20
A humán vizelet metabolizmus vizsgálat klinikai fázisa az SGS Biopharma (B-1301 Wavre, Belgium) Radioizotóp Laboratóriumában zajlott. Az egészséges férfi önkéntesek egyszeri dózisban 55 mg
14
C deramciclane-fumarátot kaptak. A radioaktív
dózis 1,77 MBq volt. Széklet, vizelet és plazma minták kerültek gyûjtésre. A vérvételek 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6; 8; 10; 12; 14; 24; 36; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 144;168; 192; 216; 240 órával a kezelést követõen keröltek sorra. A vizelet minták 0-4; 4-8; 8-14; 14-24; 24-36; 36-48; 48-72; 72-96; 96-120; 120-144; 144-168; 168-192; 192-
A humán plazma metabolizmus vizsgálat klinikai fázisa az SGS Biopharma (B-1301 Wavre, Belgium) Radioizotóp Laboratóriumában zajlott. Öt egészséges férfi önkéntes 40 mg
14
C-deramciclane bázist kapott orális adagolásban. A radioaktív dózis átlagosan
4,09 MBq volt. a vérmintákat 1; 2; 3; 4; 6; 12; 24 és 48 órával a kezelést követõen
40
Hewlett-Packard 1090 Series II/M folyadékkromatográf (három csatornás pumpa, nagy nyomású gradiens képzéssel,
pneumatikus automata mintaadagoló, Berthold HPLC
radiokémiai detektor LB-506 C-1 YG150U4D detektorcella; EG&G Berthold Autoradiograph; DAR signal analyzer; RM6 LAUDA termosztát; Wallac 1410 folyadékszcintillációs számláló;
CAMAG Linomat IV automata mintafelvivõ;
LiChroCART 250-4 Purospher RP-18 (5 µm) HPLC kolonna (Merck Darmstadt, Németország); LiChroCART 4-4 Purospher RP-18 endcapped (5 µm) (Merck Darmstadt, Németország); HPTLC -Alufolien 20 X 20 Kieselgel 60 F254 vékonyréteg (Merck, Darmstadt, Németország); LiChrolut RP-18 200 mg és 500 mg SPE cartridge; kerültek alkalmazásra. A fentieken kívül alkalmazott készülékek és eszközök megegyeztek a 3.1.2. pontban
3.3.4 Alkalmazott szoftverek WinDAR 1.09 Digital Autoradiograph software Winflow 1.21 software System Master 1.2 MultiCalc 105 software KineticaT M ver. 2.01. Gina Star Radiochromatography system A fentieken kívül a 3.1.3. pontban leírt szoftvereket használtam.
3.3.5. Kromatográfiás körülmények 3.3.5.1. Vizelet és minták enzimatikus emésztése A vizelet mintához 1 ml nátrium-acetát puffert (pH=4,5) és 50 µl enzimet ( βglükuronidáz / aril-szulfatáz, illetve β-glükuronidáz) adtam milliliterenként. A mintákat 37 °C-on inkubáltam huszonnégy órán keresztül, majd a 3.3.2.2. a) pont szerint dolgoztam fel.
41
3.3.5.2. Mintaelõkészítés
a) A deramciclane szilárd fázisú extrakciója kutya vizeletbõl és plazmából
A kutya vizelet és plazma 1-1 ml-ét LiChrolut RP-18 (200 mg) szilárd fázisú extrakciós oszlopon dolgoztam fel. Az oszlopot 3 x 1 ml 2%-os ecetsavas metanollal, majd 3 x 1 ml desztillált vízzel aktiváltam. A mintafelvitelt követõen az oszlopot 2 x 2 ml desztillált vízzel, majd 1 ml acetonitrillel mostam, ezt követõen 5 percig szárítottam. A leoldás 1 ml 1%-os ecetsavas metanollal történt. Az eluátumot 40 °C-on N2 áram alatt szárazra pároltam, majd a bepárlási maradékot 1 ml metanolban oldottam. A mintát automata mintafelvivõvel, a réteg alsó szélétõl 2,5 cm csíkban, vagy foltban vittem fel a HPTLC rétegre. A csíkok szélessége az adott minta radioaktív koncentrációjától függött, az elõkísérletek tapasztalatai alapján. Az elõkísérletekben optimáltuk a radioaktív és egyéb komponensek megfelelõ elválasztáshoz szükséges felületi koncentrációját.
b) A deramciclane szilárd fázisú extrakciója humán vizeletbõl és plazmából A vizeletet feldolgozás elõtt 15 percig 3000 min-1 fordulatszámmal centrifugáltam, a felülúszó 10 ml-éhez 2 ml 0,3%-os ammónium-karbonát oldatot adtam. A mintafeldolgozás 500 mg töltetet tartalmazó LiChrolut RP-18 szilárd fázisú extrakciós oszlopon történt. Az oszlopot 2 ml metanollal, majd 2 ml desztillált vízzel, ezt követõen pedig 2 ml 1 M nátrium-klorid oldattal aktiváltam. A mintát 2 milliliterenként vittem fel az oszlopra, amelyet ezt követõen 2 x 2 ml desztillált vízzel mostam, majd 5 percig szárítottam. A mintát 3 ml 2%-os ecetsavas metanollal oldottam le. A mintákat HPLC-s µl-ig bepároltam N2 áram alatt, és 300 µl eluenst (acetonitril : 0,015 M ammónium-acetát puffer pH=2,75 = 20 : 80) (plazmaminták esetében a µl
volt) adtam hozzá. Kvantitatív mérés esetén a
µl-re kalibrált kémcsövekben végeztem. A mintából a kvantitatív elemzés µl-t injektáltam a HPLC-be. OPLC-s futtatást megelõzõen az eluátumot 150 µl-ig pároltam be, és 1 ml metanolt
42
3.3.5.3. A deramciclane metabolitjainak elválasztása humán vizeletben és
a) A deramciclane metabolitjainak elválasztását humán vizeletben LichroCART 250-4 Purosphere RP-18 (5µm) típusú analitikai oszlop segítségével oldottam meg. Az analitikai oszlop elé azonos töltetet tartalmazó, és az analitikai oszloppal megegyezõ átmérõjû, 4 mm-es elõtét oszlopot kötöttem be az oszlop életidejének meghosszabbítása érdekében. Az összetett mintára való tekintettel a feladatot gradiens elúcióval oldottam meg. Az „A” eluens acetonitril, a „B” eluens pedig 0,015 M ammónium-acetát puffer volt, amelynek pH-ját 2,75-re állítottam be hangyasavval . A gradiens program a következõ volt: 0,01-3,00 perc 95% B; 14,00, perc 83% B; 23,00. perc 80% B; 29,00. perc 76% B; 35,00. perc 65% B; 45,00. perc 60% B; 46,00-65,00. perc 0 % B; 65,01-80,00 perc 95% B. Az eluens áramlási sebessége 0,95 ml/perc volt, az injekált minta. µl volt. Az elválasztás 40 °C hõmérsékleten zajlott. A detektálás szilárd fázisú szcintillátort tartalmazó, YG150U4D típusú radioaktív detektor
b) A deramciclane metabolitjainak elválasztása humán plazmában a fent leírtak szerint történt, csak a gradiens program került módosításra az alábbi táblázat szerint:
43
3.3.5.4.
A
Idõ
Eluens összetétel
Áramlási sebesség
(perc)
(Térfogat% B)
(ml/perc)
0.01
95
0.95
3.00
95
0.95
14.00
86
0.95
25.00
83
0.95
29.00
76
0.95
35.00
70
0.95
50.00
40
0.95
52.00
0
1.50
60.00
0
1.50
61.01
95
0.95
70.00
95
0.95
deramciclane
metabolitjainak
elválasztása
túlnyomásos
Az OPLC-s elválasztásokat megelõzõen a mintákat a HPTLC rétegre automata mintafelvivõvel vittem fel a 3.3.5.2. pontnak megfelelõen.
Kutya vizelet analízise
A széllezárt HPTLC réteglapokat
40 ml metanol-víz 80:20 arányú elegyével
elõmostuk. Az on-line mintagyûjtést megelõzõ OPLC elválasztás paramétereit az alábbi táblázat foglalja össze:
44
Paraméter
Érték
Eluens összetétel
A: acetonitril B: acetonitril : n-butanol : ecetsav : víz = 50:34:8:8
Gradiens program
0-26 perc: A eluens 27 perc-STOP: B eluens
Külsõ nyomás (MPa)
5
Áramlási sebesség (µl/perc)
1000
Start pozíció (mm)
25
Gyûjtött frakciók száma
45
Gyûjtött frakciók térfogata (µl)
1000-2000
Humán vizelet analízise A széllezárt HPTLC réteglapokat egy semleges eluensû, két lépcsõs elúciós tisztítási módszerrel elõmostuk, mivel a korábban szerzett tapasztalatok alapján az oldható ragasztó frakció, valamint a légtérbõl adszorbeált szennyezõk eltávolítása szükséges a tömegspektrometriás
mérések
során
jelentkezõ
interferáló
komponensek
kiküszöböléséhez. a) Pext = 5,0 MPa, FLR = 2000 µl/min, Vol R = 500 µl, Vol A = 3000 µl, amelynél a zavarok nagyságát és az α-, valamint β-front távolságát ellenõriztük a kazetta teflon borítójára jegyzett jellel. Ezt követte szárítás nélkül a következõ ún. túlfuttatás. b) Pext = 5,0 MPa, FLR = 1000 µl/min, Vol R = 50 µl, Vol A = 1000 µl, Vol B= 4000 µl, Vol A∗ = 6000 µl
A, A∗ : acetonitril-víz, 85+15, v+v B : acetonitril-víz, 70+30, v+v
45
A kamra kimeneténél átlagosan 9,5 - 9,8 ml eluenst regisztrálhattunk. Az aktuális adatot minden egyes réteglapnál feljegyeztük. Ugyancsak feljegyeztük a mindkét ciklusban elõálló végsõ eluens oldali nyomást, amely a réteg vastagságának eltérésére utaló adat.
Az off-line OPLC-s elválasztáshoz a következõ eluens rendszert alkalmaztuk: n-butanol-jégecet-víz, 6+1+1, v+v Pext = 5,0 MPa, FLR = 250 µl/min, Vol R = 250 µl, Vol A (I.) = 3750-4000 µl
Humán vizelet on-line OPLC-RD elválasztásának paraméterei Érték Eluens összetétel
bután-1-ol, ecetsav és víz 4:1:1 elegye
A kifejlesztés idõtartama (perc)
160
Nyomás (MPa)
5
Áramlási sebesség (µl/perc)
250
Minta térfogat (µl)
200
Start pozíció (mm)
25
3.3.6. Folyadékszcintillációs (LSC) mérés Az izolált metabolit frakció 50 µl-ét folyadékszcintillációs küvettába mértem, amely 11 ml
OptiPhase
‘HiSafe’3
univerzális
szcintillációs
koktélt
tartalmazott.
A
folyadékszcintillációs számlálás során automatikus quench korrekciót alkalmaztam.
3.3.7. Digitális autoradiográfiás mérés A DAR mérések során metilállal (formaldehid-dimetil-acetal) telített argon-metán gázelegy 9:1 arányú keverékét használtam számlálógázként. A gáz hõmérséklete 3,4 °C volt, áramlási sebessége 5 ml/perc. A mérések idõtartama 1,5-4 óra volt, a feladattól és a
46
4. Eredmények 4.1. A validálási paraméterek vizsgálata 4.1.1. Validálási paraméterek vizsgálata a cisapride humán plazmából történõ meghatározása esetében A cisapride validálásakor vizsgáltam a specificitást
és szelektivitást; a kalibrációs
függvény linearitását; meghatároztam a detektálhatóság és mennyiségi meghatározás határát; a napok közötti és napon belüli megbízhatóságot; a kinyerési hatásfokot; a rendszeralkalmasságot és a hosszútávú stabilitást. Vizsgáltam ezen kívül a rövidtávú és törzsoldat stabilitást, és bizonyítottam, hogy a kalibráció kiterjeszthetõ plazmával való hígítással.
4.1.1.1. Specificitás/szelektivitás vizsgálat
Hat különbözõ személytõl levett plazmát vizsgáltam meg és hasonlítottam össze az extrahált mintákkal annak érdekében, hogy bizonyítsam, a cisapride és a belsõ standard retenciós tartományában nincs interferáló plazmakomponens. (8. ábra) A vizsgálatok alapján a módszert szelektívnek találtam, mivel sem a cisapride, sem pedig a belsõ standard retenciós tartományában nem található interferáló komponens.
47
Szelektivitás vizsgálat (cisapride); Vak plazmaminta (A) illetve 100 ng belsõ standardot (B) és 50 ng cisapride-ot (C) tartalmazó plazmaminta HPLC-FLD
4.1.1.2. A kalibrációs függvény vizsgálata Hat független napon egy-egy kalibrációs sort készítettem és mértem le a 3.1.6.2. pont szerint. A kapott pontokra a legkisebb négyzetek módszerével illesztettem egyenest, 1/Y2 súlyfaktorral súlyozva. A torzítatlanság és pontosság értékeket a KalibJ, - a laboratóriumban kifejlesztett- validált statisztikai programmal számítottam. A cisapride kalibrációs függvényének vizsgálatakor mért 42 kalibrációs pont esetében
a
torzítatlanság értékek egyszer sem haladták meg a megengedett határokat. Az átlag
48
kalibrációs
egyenes
maximális
torzítatlanság
értéke
3,78%
volt
100
ng/ml
koncentrációnál. A hat kalibrációból számított RSD értékek is a megengedett határokon belül maradtak, a maximális érték 10,13% volt 5 ng/ml koncentrációnál. Az átlag egyenes egyenlete Y= -0,0095634 + 0,012077*X volt. A regressziós együttható
4.1.1.3. A mennyiségi meghatározás alsó határának (LLOQ) megállapítása A validálás alapján az LLOQ a cisapride meghatározás esetében 5 ng/ml-nek adódott.
4.1.1.4. A kimutatási határ (LOD) meghatározása A cisapride meghatározás esetében az LOD 1,5 ng/ml volt a kidolgozott új bioanalitikai
4.1.1.5. A napok közötti megbízhatóság mérése A 3.1.6.3. pontban leírt kalibrációs és QC mintákat készítettem el. A kalibrációs pontokra egyenest illesztettem 1/Y2 -tel súlyozva. A kapott kalibrációs egyenes egyenletével számítottam ki a QC minták koncentrációját. Ezek felhasználásával számítottam a nominálistól való eltérést (torzítatlanságot) és a pontosságot (RSD%). A mért 54 QC minta pontossága 10 ng/ml koncentrációnál 7,48%, 50 ng/ml koncentrációnál 3,62%, 150 ng/ml koncentrációnál pedig 4,02% volt. A torzítatlanság értéke 10 ng/ml koncentrációnál 0,31%, 50 ng/ml koncentrációnál 0,05%, 150 ng/ml koncentrációnál pedig 1,94%-nak adódott. A kapott értékek a megengedett határokon
4.1.1.6. A napon belüli megbízhatóság vizsgálata A 3.1.6.4 pontban leírtak szerint 5-5 db 10; 50 és 150 ng/ml-es mintát készítettem, és mértem le ugyanazon a napon. Az RSD értékek a megengedett 15% alatt maradtak, a maximális érték 8,54% volt. A torzítatlanság maximális értéke 12,28% volt.
49
4.1.1.7. Az extrakciós hatásfok meghatározása A 3.1.6.5. pontban leírt oldatokat (10; 100 és 200 ng/ml cisapride, 100 ng/ml belsõ standard) mértem le. A csúcs alatti területeket a megfelelõ koncentrációjú kalibrációs pontok csúcs alatti területeihez viszonyítottam. A belsõ standard extrakciós hatásfokának számításához 100 ng/ml KPH-61 esetében, a 3.1.6.5. pontban leírt és a kalibrációs minták csúcs alatti területeit használtam. A vizsgálat alapján az extrakciós hatásfok a cisapride esetében 10 ng/ml koncentrációnál 31,96%, 100 ng/ml koncentrációnál 46,92%, 200 ng/ml-nél pedig 60,28% volt. A belsõ standard extrakciós hatásfoka 100 ng/ml koncentrációnál 40,54% volt.
4.1.1.8. Rendszeralkalmassági teszt mérése A 3.1.6.6. pontban leírt módon készített 300-300 µl-es mintákból ötször 50 µl-t injektáltam, és vizsgáltam a kapott csúcs alatti terület arányok (cisapride/belsõ standard) szórását. A kapott RSD értékek 0,20 és 0,60 % között változtak.
4.1.1.9. A kalibráció kiterjesztése plazmával való hígítással A 3.1.6.7. pontban leírtak szerint készített mintákból 3-3 párhuzamost mértem le. Vizsgáltam a hígítással elérni kívánt koncentrációtól való eltérés százalékos értékét, amely átlagosan 6,87%-nak adódott.
4.1.1.10. Rövidtávú stabilitás mérése
A 3.1.6.8. pontban leírt mintákból 3-3 párhuzamost mértem le egyszeri, illetve ötszöri felolvasztást követõen. Kiindulási értéknek a 3.1.6.8. pontban leírt, elsõ injektálásból származó eredményeket tekintettem. Az átlagos eltérés a bemérttõl egyszeri olvasztás után –2,97%, a kezdeti értéktõl +1,35%. Ötszöri felolvasztást követõen az átlagos eltérés a bemérttõl –3,68%, a kezdeti értéktõl pedig –0,12% volt. A kapott eltérés százalék értékek egy esetben sem haladták meg a megengedett határokat. A vizsgálat
50
alapján a plazmaminták bomlás nélkül öt alkalommal felolvaszthatók fagyott
Autosampler stabilitás mérése
A 3.1.6.8. pontban leírtak szerint készített mintákból 2 sorozatot dolgoztam fel 3-3 párhuzamossal. A bepárlás után az azonos koncentrációjú mintákat páronként µl-es mintákból 50-50 µl-t injektáltam, majd az automata minta adagolóban 24 óra szobahõmérsékleten való tárolás után újból lemértem a fennmaradó mintát. Kiindulási értéknek a 3.1.6.8. pontban leírt, elsõ injektálásból származó eredményeket tekintettem. Az átlagos eltérés a kezdeti értéktõl 24 óra szobahõmérsékleten való tárolást követõen 10 ng/ml koncentrációnál –1,16%, 100 ng/ml koncentrációnál –0,84%, 200 ng/ml koncentrációnál pedig –1,88 % volt. A kapott eltérés százalék eredmények egy esetben sem haladták meg a megengedett határokat. A vizsgálat alapján az extrahált minták stabilak, 24 óra, szobahõmérsékleten történõ
Plazmaminta stabilitása szobahõmérsékleten, extrahálás elõtt:
A
3.1.6.8.
pontban
leírt
mintákból
koncentrációnként
3-3
párhuzamost
szobahõmérsékleten állni hagytam 4 órán keresztül, majd feldolgoztam. Kiindulási értéknek a 3.1.6.8. pontban leírt, elsõ injektálásból származó eredményeket tekintettem. Az átlagos eltérés a kezdeti értéktõl 4 óra szobahõmérsékleten való tárolást követõen 10 ng/ml koncentrációnál –1,74%, 100 ng/ml koncentrációnál +4,02%, 200 ng/ml koncentrációnál pedig –10,93 % volt. A kapott eltérés százalék eredmények egy esetben sem haladták meg a megengedett határokat. A vizsgálat alapján a plazmaminták stabilak 4 óra szobahõmérsékleten való tárolást követõen. Feldolgozott minta stabilitása +10 °C-on:
A 3.1.6.8. pontban leírt mintákból 2 sorozatot dolgoztam fel koncentrációnként 3-3 párhuzamossal. A mintákat 24 illetve 48 óra hûtõszekrényben (+10 °C) való tárolást
51
követõen mértem le. Kiindulási értéknek a 3.1.6.8. pontban leírt, elsõ injektálásból
hûtõszekrényben való tárolást követõen 10 ng/ml koncentrációnál –1,14%, 100 ng/ml koncentrációnál +9,84%, 200 ng/ml koncentrációnál pedig –8,63% volt. 48 óra hûtõszekrényben való tárolást követõen 10 ng/ml koncentrációnál –0,87%, 100 ng/ml koncentrációnál +4,32%, 200 ng/ml koncentrációnál pedig –3,48% volt a kiindulási értéktõl való eltérés átlaga. A kapott eltérés százalék eredmények egy esetben sem haladták meg a megengedett határokat. A vizsgálat alapján az extrahált minták 48 órán keresztül bomlás nélkül eltarthatók hûtõszekrényben, + 10 °C-on (8. táblázat).
Hosszútávú stabilitási minták mérése A 3.1.6.8. pontban leírt mintákból 3-3 párhuzamost mértem le 2 hét, 1 és 3 hónap -20 °C-on történõ tárolás után. Kiindulási értéknek a 3.1.6.8. pontban leírt, elsõ injektálásból származó eredményeket tekintettem. Az átlagos eltérés százalék a bemérttõl két hét -20 °C-on történõ tárolás után +9,59%volt, 1 hónap után +10,33% volt, 3 hónap után +0,33 % volt. A kezdeti értéktõl való átlagos eltérés százalékos értéke két hét -20 °C-on történõ tárolás után +0,35%, 1 hónap után 5,03%, 3 hónap után pedig –4.52% volt. A kapott eltérés százalék eredmények egy esetben haladták meg a ° koncentrációjú plazmaminta esetében. A vizsgálat alapján a mintákat 3 hónapig °C-on történõ tárolást követõen. A cisapride és belsõ standard törzsoldatok stabilitását 1 hét, 2 hét, 1 illetve 3 hónap elteltével vizsgáltam. Kiindulási értéknek a 3.1.6.9. pont szerint készített, elsõként lemért 3-3 párhuzamos mérés eredményeit tekintettem. A kiindulási értéktõl való ± 5%os eltérést tekintettem elfogadhatónak. A 3.1.6.9. pont szerint készített mintákból 3-3 párhuzamost mértem le minden alkalommal. A cisapride törzsoldat esetében az átlagos eltérés százalék a kezdeti értéktõl 1 hét hûtõben való tárolást követõen –0,27% két hét után –0,8376%, 4 hét után pedig –6, 73% volt. A belsõ standard törzsoldat esetében az átlagos eltérés százalék a kezdeti értéktõl egy hét után 0,6354%, két hét után –0,08%, négy hét után +2,83% 8 hét után pedig –5,83%-nak adódott. Az 50 µg/ml-es cisapride hígított törzsoldat esetében egy hét után –0,49%, két hét után +0,95%, négy hét után
52
+1,14%, két hónap után pedig +4,41% volt a kezdeti értéktõl való eltérés százalékos értéke. Az 5 µg/ml-es cisapride hígított törzsoldat esetében egy hét után –0,03%, két hét után –0,46%, négy hét után +1,50%, két hónap után pedig –0,30% volt a kezdeti értéktõl való eltérés százalékos értéke. Az 50 µ esetében a kezdeti értéktõl való százalékos eltérést 1 hét után +0,73%-nak, két hét után –0,95%-nak, négy hét után +1,14%-nak, nyolc hét után pedig +4,41%-nak találtam. Az 5 µg/ml-es hígított belsõ standard oldat esetében a kezdeti értéktõl való százalékos eltérést 1 hét után +0,24%-nak, két hét után +0,75%-nak, négy hét után –4,17%-nak, nyolc hét után pedig –5,64%-nak találtam. A stabilitás vizsgálat eredményei alapján a cisapride törzsoldatot két hétig, a belsõ standard törzsoldatot pedig négy hétig találtam stabilnak. Az 50 és 5 µg/ml-es cisapride hígított törzsoldatok két hónapig tarthatók el hûtõben. Az 50 µg/ml-es belsõ standard oldatot nyolc hétig, az 5 µg/ml-es belsõ standard oldatot pedig négy hétig találtam stabilnak hûtõben tárolva.
53
meghatározása esetében Az ambroxol esetében vizsgáltam a specificitást
és szelektivitást; a kalibrációs
függvény linearitását; meghatároztam a detektálhatóság és mennyiségi meghatározás határát; a napok közötti és napon belüli megbízhatóságot; a kinyerési hatásfokot; a rendszeralkalmasságot és a hosszútávú stabilitást.
4.1.2.1. Specificitás/szelektivitás vizsgálat
Hat különbözõ egyedi kutyaplazmát vizsgáltam meg és hasonlítottam össze az extrahált mintákkal. Ezen kívül csúcstisztaság vizsgálatot végeztem mindkét komponensre. Ennek alapján a módszer szelektívnek bizonyult, mivel nem jelent meg interferáló kromatográfiás csúcs a meghatározandó vegyületek retenciós tartományában (9. ábra).
Szelektivitás vizsgálat (ambroxol); 500 ng belsõ standardot és 500 ng ambroxolt tartalmazó plazmaminta (I.) és vak plazmaminta (II.) HPLC-UV összehasonlítása
54
4.1.2.2. A kalibrációs függvény vizsgálata Öt független napon egy-egy kalibrációs sort készítettem és mértem le a 3.2.6.2. pont szerint. A kapott pontokra a legkisebb négyzetek módszerével illesztettem egyenest, 1/Y2 súlyfaktorral súlyozva. A torzítatlanság és pontosság értékeket a KalibJ, - a laboratóriumban kifejlesztett- validált statisztikai programmal számítottam. Az ambroxol kalibrációs függvényének vizsgálatakor mért 35 kalibrációs pont esetében a torzítatlanság értékek egyszer sem haladták meg a megengedett határokat. Az átlag kalibrációs egyenes maximális torzítatlanság értéke 4,73% volt 1000 ng/ml koncentrációnál. Az öt kalibrációból számított RSD értékek is a megengedett határokon belül maradtak, a maximális érték 9,73% volt 100 ng/ml koncentrációnál. Az átlag egyenes egyenlete Y= -0,00432+ 0,00219*X volt. A regressziós együttható r=0,998-nak
4.1.2.3. A mennyiségi meghatározás alsó határának (LLOQ) megállapítása A validálás alapján az LLOQ az ambroxol meghatározás esetében 25 ng/ml-nek adódott a kidolgozott új bioanalitikai módszerrel.
4.1.2.4. A kimutatási határ (LOD) meghatározása Az ambroxol meghatározás esetében az LOD 5 ng/ml-nek adódott.
4.1.2.5. Napok közötti megbízhatóság mérése A 3.2.6.3. pontban leírt kalibrációs és QC mintákat készítettem el. A kalibrációs pontokra egyenest illesztettem 1/Y2 -tel súlyozva. A kapott kalibrációs egyenes egyenletével számítottam ki a QC minták koncentrációját. Ezek felhasználásával számítottam a nominálistól való eltérést (torzítatlanságot) és a pontosságot (RSD). A pontosság értéke 75 ng/ml koncentrációnál átlagosan 7,99%, 150 ng/ml koncentrációnál 10,70%, 750 ng/ml koncentrációnál 3,08%, 1500 ng/ml koncentrációnál 7,16% volt. A torzítatlanság
átlagos
értéke
75
ng/ml
koncentrációnál
3,43%,
150
ng/ml
koncentrációnál 2,26%, 750 ng/ml koncentrációnál 3,38%, 1500 ng/ml koncentrációnál 8,03% volt. A kapott torzítatlanság és pontosság értékek minden esetben a megengedett
55
4.1.2.6. Napon belüli megbízhatóság mérése A 3.2.6.4 pontban leírtak szerint 5-5 db 50; 500 és 2000 ng/ml-es mintát készítettem, és mértem le ugyanazon a napon. Az RSD értékek a megengedett 15% alatt maradtak, a maximális érték 10,31% volt. A torzítatlanság maximális értéke 14,28% volt.
4.1.2.7. Extrakciós hatásfok mérése
A 3.2.6.5. pontban leírt oldatokat (50; 500 és 1000 ng/ml) mértem le. A csúcs alatti területeket a kalibrációs pontok csúcs alatti területeihez viszonyítottam. A belsõ standard extrakciós hatásfokának számításához, a
napi standardok és a
kalibrációs minták csúcs alatti területeit használtam. Az extrakciós hatásfok az ambroxol esetében 50 ng/ml koncentrációnál 82,06%, 500 ng/ml koncentrációnál 91,51%, 1000 ng/ml koncentrációnál pedig 88,62% volt. Az 500 ng/ml belsõ standard minták esetében az extrakciós hatásfok 86,79%-nak adódott.
4.1.2.8. Rendszeralkalmassági teszt mérése A 3.2.6.6. pontban leírt módon készített 300-300 µl-es mintákból ötször 50 µl-t standard) szórását. A kapott RSD értékek 0,43 és 1,37 % között változtak.
Hosszútávú stabilitási minták mérése A 3.2.6.8. pontban leírt mintákból 3-3 párhuzamost mértem le 1 hónap -20 °C-on történõ tárolás után, és vizsgáltam a nominálistól, illetve a kiindulási értéktõl való eltérést. Egy hónap -20 °C-on történõ tárolást követõen
a bemérttõl való eltérés
százalék átlagos értéke +7,70%, a kiindulási értéktõl való eltérés százalék átlagos értéke pedig
–0,21% volt. Az eltérés százalék értékek egy esetben sem haladták meg a
megengedett határokat. A vizsgálat alapján a mintákat 1 hónapig stabilnak találtam -20 °
56
Az ambroxol és belsõ standard törzsoldatokat, illetve a hígított törzsoldatokat az EGIS Dok. No.: 5922 alapján két hétig tároltam + 10 °C alatt hûtõszekrényben.
57
OPLC on-line frakciószedéssel Kutya vizeletbõl illetve plazmából izoláltam deramciclane metabolitokat OPLC on-line frakció gyûjtéssel. A gyûjtött frakciók radioaktív anyag tartalmát folyadékszcintillációs számlálással határoztam meg.
14
C-deramciclane metabolit profilja 0-24 órás kutya vizelet frakcióban OPLC
58
Az eredmények alapján egyes frakciókat egyesítettem. Az eredményeket a 10. ábra mutatja a gyûjtött frakciók egyesítésével együtt. Az on-line frakciógyûjtést követõen az egyes egyesített metabolit frakciókat OPLC-vel újra megfuttattuk, DAR-ral detektáltam, majd a foltokat a rétegrõl lekapartam. A második OPLC-s futtatás eredményét az IXIV-es egyesített vizelet metabolit frakciók esetében a 11. ábra mutatja. A radioaktív anyagokat a szilikagélrõl leoldottam, amelyek ezután kerültek.
59
szerkezet meghatározásra
Az I-XIV. metabolit frakció (10. ábra) OPLC-DAR vizsgálata
60
számlálóval készített 3 H-deramciclane metabolit profilt a 12. ábra mutatja.
3
H-deramciclane metabolit profilja 2,5-12 órás kutya plazma frakcióban OPLC
4.3. 14 plazmából folyadékkromatográfia radioaktív detektálás kapcsolt technikák alkalmazásával A
14
C-dearamciclane metabolitjainak
folyadékkromatográfia-radioktív
detektálás
kapcsolt
technikát
alkalmaztam.
A
glükuronid metabolitok jelenléte fontos kérdés volt a metabolit kutatás során, többek között azért is, mivel a HPLC-MS-MS módszert ennek megfelelõen kellett kidolgozni a szerkezetkutatás során. A kérdés gyors eldöntésére off-line OPLC-DAR módszert alakalmaztam. β-glükuronidázzal emésztett és emésztetlen vizelet mintákat vittem fel 14
C-dearamciclane standard kíséretében.
61
14
C-deramciclane metabolit konjugátumok vizsgálata 0-24 órás humán vizelet β -glükuronidázos emésztés nélkül, B: standard, C: β glükuronidázos emésztéssel
62
A 13. ábrán jól látszik a különbség az enzimmel emésztett és nem emésztett minták között, amely feltételezte a glükuronid metabolit konjugátumok jelenlétét. E feltevés a késõbbi vizsgálatok során be is igazolódott.
β-
14
glükuronidázzal emésztett 0-24 órás humán vizelet frakcióban
A glükuronid konjugátumok vizsgálatát HPLC-RD technikával is elvégeztem. Ugyancsak 0-24 órás vizelet frakciót vizsgáltam β-glükuronidázos emésztéssel, illetve anélkül. Az eredményeket a 14. és 15 . ábrák mutatják. Az elválasztott metabolit frakciókat a radioaktív jel alapján legyûjtöttem, és szerkezetvizsgálatra küldtem. Azokat a frakciókat, amelyek esetben a szerkezetvizsgálat nem volt lehetséges a szennyezõk miatt, vagy több metabolitot tartalmaztak, tovább tisztítottam. A tömegspektrometriás szerkezet azonosítás HPLC-MS-MS módszerrel történt az oldalláncot tartalmazó metabolitok esetében. A metabolikus átalakulás során oldallánc vesztett metabolitok tömegspektrometriás azonosítására GC-MS módszert
63
alkalmaztunk. Az NMR vizsgálatot 40-120 µgeqv radioaktívan jelzett anyagot tartalmazó izolátumból végeztük. A deramciclane metabolitok humán vizeletbõl való izolálására alkalmaztam az on-line OPLC-RD technikát is, kihasználva a normál fázisú elválasztás által felkínált eltérõ szelektivitást. Elõnye továbbá a technikának az off –line OPLC-s technikákkal szemben, hogy a metabolit frakciók közvetlenül legyûjthetõk a kimenetnél, nincs szükség a foltok szilikagélrõl való leoldására. A kapott kromatogramot összevetve az elõzõleg készült off-line OPLC-DAR felvétellel, az egyes kromatográfiás csúcsok megfeleltethetõk a DAR-felvételen kapott foltoknak. Az eredmények a 14. ábrán láthatók. A mintagyûjtést követõen DAR-ral ellenõriztem, hogy nem maradt-e radioaktív anyag a HPTLC rétegen.
14
humán vizelet frakcióban
64
A 16. ábrán ♦-val jelzett kromatográfiás csúcsot legyûjtést követõen további HPLCRD elválasztásnak vetettem alá. A 16. ábra alapján az
OPLC-RD elválasztáskor
egységesnek mutatkozó kromatográfiás csúcs további négy metabolit frakcióra volt
CPS
14C
33.90
B
200
♦
100
31.28
119.30
28.65 18.32 20
40
60
80
100
min
START
FRONT
A
0
45.68
KIFEJLESZTÉS IRÁNYA
14
C-deramciclane metabolitok on-line OPLC-RD (A) és off-line OPLC-DAR (B) izolálása humán vizeletbõl
65
CPS
22.90
15
21.68 10
25.95 5
25.08
0 10
30
20
40
perc
17. ábra A humán vizelet OPLC-RD analízisével kapott, ♦ -val jelzett 14 C-deramciclane metabolit frakció HPLC-RD elválasztása
A deramciclane metabolitok humán plazmából történõ izolálására, és az egyes metabolitok kvantitatív elemzésére farmakokinetikai paramétereik meghatározásához HPLC-RD módszert alkalmaztam. (A közölt adatok szigorúan titkosak, nem publikálhatók.) A vizsgálat kezdetekor az öt önkéntes plazmafrakcióinak 5-5 ml-es részleteit egyesítettem vérvételi idõpontonként, és ezek a minták kerültek HPLC-RD elemzésre a metabolit profil idõbeni változásának kvalitatív elemzése céljából. Példaként a 3 órával a kezelést követõen levett, egyesített plazmafrakció HPLC-RD kromatogramját a 18 . ábra mutatja. A késõbbiekben az önkéntesek plazmamintái
66
egyénenként és idõpontonként kerültek elemzésre az egyes metabolitok kvantitatív elemzéséhez
a
farmakokinetikai
paraméterek
(Cmax,
tmax,
AUC0-t,
tβ 1/2 )
meghatározása érdekében.
Integration
C:\GINA_NT\DERAM0101\0503003
51,58
1 1 CPS
14C
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0 0
10
20
30
40
50
60
min
18. ábra 14
C-deramciclane HPLC-RD metabolit profilja egyesített humán plazma frakcióban 3 órával a kezelést követõen
Példaképpen a 2-es önkéntes 12 órás plazmamintájának kromatogramját mutatom be a 19. ábrán. Az egyes kromatográfiás csúcsokat legyûjtöttem, és az azonos retenciós idõvel eluálódó frakciókat egyesítés után szerkezetvizsgálatnak vetettük alá. A szerkezetvizsgálat HPLC-MS-MS, illetve GC-MS módszerrel történt. A
vizsgálat
alapján meghatározott tizenhat metabolitból kilenc tekinthetõ fõ metabolitnak amelyek farmakokinetikai paramétereit sikerült meghatározni. Példaként a 20. ábra a kámforhidroxi-fenilkámfén-szulfát (M8-as metabolit), farmakokinetikai görbéjét mutatja. C:\GINA_NT\DERAM0101\061906 7,0 CPS
14C
6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0
10
20
30
40
50
60
67
min
19. ábra A 2-es számú önkéntes 12 órás plazmamintájának HPLC-RD kromatogramja
Metabolit koncentráció (ngeq/ml)
50
40
30
20
10
0 01234
6
12
24
20. ábra M8-as humán plazma metabolit farmakokinetikai görbéje 40 mg 14
5. Megbeszélés Új HPLC-FLD bioanalitikai módszert dolgoztam ki és validáltam 5-200 ng/ml koncentráció tartományban a cisapride humán plazmában történõ meghatározására. Ez a koncentráció tartomány az egyszeri 20 mg cisapride dózis beadását követõ plazma koncentrációk mérését teszi lehetõvé. A 20 mg-os dózist 2 db 10 mg-os tabletta bevételével kívántuk biztosítani, amelyet a cisapride lineáris farmakokinetikája lehetõvé tesz. A módszer kidolgozása szükséges volt, mivel az irodalomban a kidolgozáskor fellelhetõ bioanalitikai módszerek adaptálását a következõ tényezõk nehezítették:
68
48
nehezen hozzáférhetõ belsõ standardot alkalmaztak; a minta elõkészítés 2 ml plazmából indult ki, ami etikai okokból nem kedvezõ, mivel nagyban megnöveli az önkéntesektõl
alkalmas; vagy nem volt elég szelektív. Az újszülött plazmára kidolgozott módszer is elsõsorban szelektivitási okokból nem volt átvehetõ. Az általam kidolgozott bioanalitikai módszer LOQ-ja alacsonyabb az irodalomban fellelhetõkénél, amelyeknél az LOQ általában 8 ng/ml volt. Egy módszert találtam, ahol az LOQ-t 1 ng/ml-ben jelölik meg a szerzõk (R. Woestenborghs és munkatársai), de ugyanakkor az LOD-re is ezt a koncentrációt adják meg. A módszer adaptálását a nehezen hozzáférhetõ belsõ standard is nehezítette volna. McLean és munkatársai írnak le egy módszert, ahol az LOQ 5 ng/ml, de a módszer egyéb jellemzõi, például a szelektivitás, kromatogram hiányában az olvasó számára nem értékelhetõk. A minta elõkészítés szilárd fázisú extrakcióval történt. Belsõ standardként 4-amino-5klór-N-[1-[3-(4-fluorofenoxi)propil]-4-piperidinil]-2-metoxibenzamidot
(KPH-61)
használtam. A validálást a nemzetközi elõírások figyelembe vételével végeztem. A módszer szelektivitása megfelõnek bizonyult, mivel nem jelentek meg a kromatogrammon a vizsgált vegyületekkel interferáló csúcsok. A kvantitatív mérés alsó határa (LLOQ) 5 ng/ml-nek adódott. A vizsgált koncentráció tartományban a koncentráció csúcs alatti terület arány összefüggés lineárisnak bizonyult (r= 0.997). A cisapride-ot 3 hónapig stabilnak találtam humán plazmában, -20°C-on történõ tárolás után. A vizsgált validálási paraméterek megfeleltek a nemzetközi elvárásoknak. A validálás eredményei alapján a bioanalitikai módszer alkalmas a cisapride humán plazmában történõ meghatározására 5-200 ng/ml koncentráció tartományban, illetve bioekvivalencia és más farmakokinetikai vizsgálat kivitelezése céljára. Új HPLC-UV módszert dolgoztam ki és validáltam 25-2 tartományban
az
ambroxol
kutya
plazmában
történõ
meghatározására.
A
mintaelõkészítés szilárd fázisú extrakcióval történt. A validálást a nemzetközi elõírások figyelembevételével végeztem. Belsõ standardként nerisopamot (EGIS-6775) [99] alkalmaztam. A módszer kidolgozására azért volt szükség, mert állat kísérlet segítségével kívántam igazolni az EGIS Rt. saját fejlesztésû 75 mg-os retard ambroxol kapszulájának retard hatását, illetve a tervezett bioekvivalencia vizsgálata számára a megfelelõ referens készítményt kiválasztani (Mucosolvan, vagy Ambrobene). A
69
kutyakísérletben várható magasabb plazmakoncentrációt és a retard készítmény esetében elõre jelezhetõ elnyújtottabb plazmakoncentráció-idõ összefüggést vettem figyelembe a kalibrációs tartomány meghatározásakor. A minta elõkészítést és a kromatográfiás elválasztást a kutyaplazma endogén komponenseinek megfelelõen optimáltam. A korábban humán plazmára kidolgozott módszer eluensrendszere nem volt alkalmas az ambroxol kutya plazmában történõ elválasztására az eltérõ plazma endogének miatt. Az egyébként nem igazán kedvelt tetrahidrofurán alkalmazására is szelektivitási okok miatt volt szükség, mivel egy plazmaendogént csak ennek segítségével tudtam az ambroxol csúcstól elválasztani. A módszer szelektivitása megfelelõnek bizonyult, mivel nem jelentek meg a kromatogramon a vizsgált vegyületekkel interferáló csúcsok. A kvantitatív mérés alsó határa (LLOQ) 25 ng/ml-nek adódott. A vizsgált koncentráció tartományban a koncentráció csúcs alatti terület arány összefüggés lineárisnak bizonyult (r= 0.998). Az ambroxolt 1 hónapig stabilnak találtam kutya plazmában, -20°C-on történõ tárolás után. A vizsgált validálási paraméterek megfeleltek a nemzetközi elvárásoknak. A validálás eredményei alapján a bioanalitikai módszer alkalmas az ambroxol kutya plazmában történõ meghatározására
25-2000 ng/ml koncentráció tartományban, és 75 mg
ambroxol tartalmú retard kapszulák kutya kísérletben történõ vizsgálatára.
Sikerrel alkalmaztam a folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikákat a deramciclane metabolit profiljának feltérképezésére kutya és humán
A kutya vizelet és plazma esetében OPLC on-line frakciógyûjtést, folyadékszcintillációs számlálást és off-line OPLC-DAR módszert alkalmaztam a metabolitok izolálására. Az on-line mintagyûjtést követõ, második OPLC-s elválasztás során 14 metabolit frakció elválasztására volt lehetõség egyazon rétegen. A detektálást DAR technikával végeztem. A DAR kép alapján lekapart foltok, a szilikagélrõl való leoldást követõen alkalmasak voltak a szerkezet azonosításra. A vizsgálat fontos adatokat szolgáltatott a deramciclane metabolit profiljának megismeréséhez kutya plazmában és vizeletben. A humán vizelet metabolitok izolálását a folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikák kombinált alkalmazásával sikerült megoldani kihasználva az egyes technikák eltérõ szelektivitását, kapacitását, mintaigényét, kimutatási határát és
70
gyorsaságát. A glükuronid metabolitok gyors fingerprint vizsgálatára off-line OPLCDAR technikát alkalmaztam. A metabolitok szerkezetvizsgálatához (HPLC-MS-MS, NMR) és kvantitatív meghatározásához HPLC-RD elválasztást követõen gyûjtöttem anyagot. Különösen az NMR vizsgálatokhoz volt szükség nagy anyagmennyiségre, amelyet HPLC-RD elválasztást követõen gyûjtöttem. A problémásabb
tisztítási
feladatoknál kihasználtam az on-line OPLC-RD által felkínált eltérõ szelektivitás és az azonnali mintagyûjtés lehetõségét. Az off-line DAR detektálás alkalmazása az on-line elválasztást követõen lehetõvé tette az esetlegesen a HPTLC rétegen maradt eluálatlan radioaktív komponensek meglétének vizsgálatát. Ez a tény fontos abból a szempontból, hogy ily módon a startponton maradó, vagy kis Rf értékkel eluálódó komponensek is detektálhatók. A leírt módszerek alkalmazásával huszonhat major és minor metabolitot sikerült azonosítani humán vizeletbõl. Az új, komplex metabolit kutatási módszer alkalmas a major metabolitokon kívül, a minor metabolitok izolálására, tisztítására is. A kapott eredmények a deramciclane humán vizelet metabolit profilját illetõen összhangban vannak a plazmában megjelenõ metabolitok feltérképezése érdekében végzett humán plazma metabolizmus vizsgálat eredményeivel. A humán plazma metabolizmus vizsgálat során tizenhat metabolit szerkezetét sikerült azonosítani. Ezek közül kilenc tekinthetõ fõ metabolitnak, amelyek farmakokinetikai paramétereit sikerült meghatározni. A példaként bemutatott kámfor-hidroxi-fenilkámfén-szulfát esetében a tmax 3 óra, a Cmax 3,57 ngeqv/ml, az AUC 0-t 655 ngeqv*h/ml, a tβ 1/2 13,23 óra, az MRT pedig 48,46 óra volt.
71
6. Következtetés
bioanalitikai módszer a validálás eredményei alapján alkalmas tartalmú
orális
gyógyszerkészítmények
bioekvivalencia
20 mg cisapride
vizsgálata,
és
egyéb
farmakokinetikai vizsgálatok végzése céljára. Megállapítható, hogy a kidolgozott HPLC-FLD bioanalitikai módszer a kidolgozáskor az irodalomban fellelhetõ bioanalitikai módszereknél szelektívebb, etikai szempontokból megfelelõbb, mivel a minta elõkészítés csak 1 ml plazmából indul ki, a mennyiségi meghatározás határa alacsonyabb az irodalomban megjelent értékelhetõ eredményekénél. A minta elõkészítés gyors, munkaegészségügyi szempontból is kedvezõbb, szilárd fázisú extrakcióval történt. A validálást a nemzetközileg elfogadott elõírások alapján végeztem. Eredményei alapján a bioanalitikai módszer alkalmas a cisapride humán plazmában történõ meghatározására 5-200 ng/ml tartományban. Az ambroxol kutya plazmában történõ meghatározására kidolgozott új HPLCUV bioanalitikai módszert a nemzetközi elõírások figyelembe vételével validáltam. A validálás eredményei alapján a bioanalitikai módszer alkalmas az ambroxol kutya plazmában történõ meghatározására 25-2000 ng/ml koncentráció tartományban, és ezzel együtt a 75 mg ambroxol tartalmú késleltetett hatóanyag kioldódású (retard) orális gyógyszerkészítmények kutyakísérletben történõ összehasonlító vizsgálatára. A deramciclane metabolit profiljának kutya és humán vizeletben illetve plazmában történõ feltérképezésére alkalmazott új, komplex metabolit kutatási módszer alkalmas a fõ metabolitokon kívül a minor metabolitok izolálására és tisztítására is. A folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás technikák kombinált alkalmazása nagy mértékben hozzájárult a deramciclane igen bonyolult, faj- és biológiai mátrix függõ metabolizmusának felderítéséhez és ezáltal a gyógyszerbevezetés folyamatához. A laboratóriumban kifejlesztett új technikák (OPLC on-line frakciógyûjtés, OPLC-DAR, on-line
OPLC-RD,
HPLC-RD)
alkalmasak
egyéb
gyógyszervegyületek
metabolizmusának vizsgálatára is. A vizsgálat során mód nyílt az egyes technikák alkalmazhatóságának vizsgálatára is a metabolizmus kutatás során. Ennek alapján megállapítható, hogy az off-line OPLCDAR technika alkalmazásával kis mennyiségû minta felhasználásával igen gyors
72
szerepe van a technikának a módszerkidolgozás szakaszában is, mivel a startról el nem mozduló komponensek is detektálhatók a vékonyrétegen. Ezáltal elkerülhetõ az esetleges anyagveszteség. Az on-line OPLC frakciógyûjtéssel elkerülhetõ a radioaktív foltok szilikagélrõl való leoldásával járó esetleges anyagveszteség. A szerkezetkutatás vizsgálatok – különösen az NMR vizsgálatok - számára nagy mennyiségû, tiszta metabolit izolálására van szükség. Ennek a feladatnak az elvégzésére alkalmas a HPLCRD illetve az általunk kifejlesztett on-line OPLC-RD technika, ahol a nagy kapacitás szelektív detektálással párosul. A két kromatográfiás módszer kombinálása eredményes lehet a metabolit frakciók tisztításában, az állófázisok eltérõ szelektivitása révén. A HPLC-RD technika a metabolitok kvantitatív meghatározásában is szerepet játszik. Az OPLC-RD felkínálta további lehetõség, hogy DAR vizsgálattal ellenõrizhetõ, hogy nem maradt-e eluálatlan komponens a vékonyrétegen. Mindezek alapján megállapítható, hogy a folyadékkromatográfia-radioaktív detektálás kapcsolt technikák alkalmazása a metabolizmus kutatásban lehetõvé teszi az egyes tisztítási, izolálási és mennyiségi meghatározási feladatok idõben és költségben optimális megoldását, és így fontos szerepet kapnak az originális gyógyszerfejlesztés során végzett kutatásban.
73
7. Köszönetnyilvánítás Köszönöm Prof. Dr. Orbán Istvánnak, az EGIS
Rt. vezérigazgatójának,
hogy Ph.D. tanulmányaimhoz hozzájárult. Köszönetemet fejezem ki Prof. Dr. Blaskó Gábornak
az
EGIS
Rt.
Kutatási
igazgatójának
és
dr.
Szentpéteri
Imre
fõosztályvezetõnek, hogy doktori tanulmányaimat és kísérletes munkámat támogatta és lehetõvé tette. Köszönöm Prof. Dr. Magyar Kálmánnak a Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Experimentális és klinikai farmakológia doktori program vezetõjének, hogy a programban való részvételemet támogatta. Hálás vagyok Dr.
Klebovich
Imrének,
témavezetõmnek,
az
EGIS
Gyógyszergyár
Rt.
Farmakokinetikai Kutató Laboratóriuma vezetõjének, hogy Ph.D tanulmányaim megkezdésére buzdított, kísérletes munkámat támogatta és segítette, köszönöm a sok bátorítást, publikációim és az értekezés elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm kollégáimnak, Baloghné Dr. Nemes Katalinnak, Dr. Szúnyog Józsefnek és Grézal Gyulának a szakmai tanácsokat és a sok bátorítást. Külön köszönet illeti Dr. Morovján Györgyöt az értekezés elkészítéséhez nyújtott hasznos tanácsaiért. Hálás vagyok Dr. Mincsovics Emilnek az OPLC-s vizsgálatok kivitelezésében nyújtott segítségéért. Köszönöm Dr. Vékey Károlynak és munkacsoportjának, különösképpen Dr. Drahos Lászlónak és Dr. Ludányi Krisztinának a HPLC-MS-MS és GC-MS vizsgálatokban végzett munkáját. Köszönöm Dr. Újszászy Kálmánnak, az EGIS Gyógyszergyár
Rt.
Szerkezetkutatási
Osztálya
nyugalmazott
vezetõjének
a
szerkezetkutatási vizsgálatok összehangolását és irányítását, illetve Dr. Kövesdi Istvánnak az NMR vizsgálatokban végzett munkáját. Köszönet illeti szerzõtársaimat a publikációk elkészítésekor végzett közös munkáért. Külön köszönöm Haász Rozália Máriának a kísérletek elvégzésében nyújtott segítségét, a sok biztatást és kedvességet. Köszönöm Filó Gabriellának és Deli Edinának a kísérletek elvégzésében nyújtott segítségét. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm családomnak a támogatást, türelmet és segítséget, amely nélkül ez az értekezés nem jöhetett volna létre.
74
8. Irodalomjegyzék [1] Vizi E. Sz.: Humán farmakológia, MEDICINA Könyvkiadó Rt. Budapest, 2002. 81-86. [2] L.Z. Benet, N. Massoud, J.G. Gambertoglio; Pharmacokinetic Basis for Drug Treatment, Raven Press, New York, 1984. [3] M. Gibaldi; Biopharmaceutics and Clinical Pharmacokinetics, Lea and Febiger, Philadelphia, 1984. [4] W. A. Ritcshel, G. L. Kearns; Handbook of Basic Pharmacokinetics, 5th Ed. [5] T.D. Porter, M. Coon; J. Biol. Chem., 266, 1991. 13469-13472. [6] M. S. Dension, J.P. Whitlock; J. Biol. Chem., 270, 1995. 18175-18178. [7] Gachályi B.: Az orvostudomány aktuális problémái, 52, 45-56. [8] Mandl J. Biotranszformáció-méregtelenítés. Orvosi Biokémia (Ádám V., Faragó A., Machovich R., Mandl J. szerk. Ádám V.) Medicina Budapest, 1996. [9] T. F. Wolf. : Handbook of Drug Metabolism, Marcel Dekker, Inc. New York, 2001. [10] Fürst Zs.: Gyógyszertan MEDICINA Könyvkiadó Rt. Budapest, 1998. 112-116. [11 ] H. Blume, E. Mutschler; Bioequivalence, Govi-Verlag, Frankfurt am Main, 1991. [12] L. Huber; Agilent Technologies, Waldbronn, Germany, 2000. Publication Number: 5968-6193E [13] Klebovich I; Acta Pharmaceutica Hungarica, 68, 1998. 234-248. [14] Fürst Zs.: Gyógyszertan MEDICINA Könyvkiadó Rt. Budapest, 1998. pp. 637-638. [15 ] Colin Dollery; Therapeutic Drugs, Churchill Livingstone Second Edition, 1999. pp.235-239. [16] GOODMAN and GILMANS`s; The pharmacological basis of therapeutics, Pergamon Press, 8th edition, 929 [17] H. Zhou et al.; Clin. Ther., 20, No.2. 1998. 292-298. [18] T. Hedner et al.; Eur. J. Clin. Pharmacol., 38, 1990. 629-631. [19] J. A. Barone et al.; Clin. Pharm., 6, 1987. 640-645. [20] U. Gladziwa et al.; Clin. Pharmacol. Ther., 50, No. 6 1991. 673-681.
75
[21 ] G. M. Ferron et al.; J. Clin. Pharmacol., 39, 1999. 945-950. [22] W. Meuldermans et al.; Drug Metab. Disp., 16, No.3., 1987. 403-409. [23] Fürst Zs.: Gyógyszertan MEDICINA Könyvkiadó Rt. Budapest, 1998. 563-564. [24] Bioäquivalenz Qualitätsbevertung wirkstoffgleicher Fertigarzneimittel ; eds. H. Blume, E. Mutschler, Govi-Verlag, Frankfurt am Main, 1996. [25] R. Hammer, G. Bozler, R. Jauch, F.W. Koss; Arzneim.-Forsch./Drug Res., 28, 1978. 899-903. [26] Conference on Bioavailability and bioequivalence and Dissolution Testing, London, UK., March 26-27, 2003. [27] Gachályi B. , Lakner G., Borvendég J. (Eds).; Klinikai farmakológia a gyakorlatban. A humán gyógyszerfejlesztés módszertana, Springer, Budapest, 2003. [28] Food-Effect Bioavailability and Fed Bioequivalence Studies, US. Dept. of Health and Human Services FDA/CDER/CVM/December 2002. [29] E. Diletti, O. Hauschke and V. W. Steinijans; Sample size determination for bioequivalence assessment by means of confidence intervals Department of Biometry Byk Gulden Pharmaceuticals, W-7750 Konstanc, Germany [30] Kemény Sándor, Deák András; Mérések tervezése, eredmények értékelése, Mûszaki Könyvkiadó, Budapest, 1990. [31] Donald J. Schuirmann; Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, Vol. 15, No. 6, 1987. [32] Vincze István, Varbanova Mária; Nemparaméteres matematikai statisztika , Budapest 1993. [33] Vereckey László, Kapás Margit, Szentirmai Zsolt; Acta Pharmaceutica Hungarica 61, 1991. 214-226. [34] Tóthfalusi L., Borvendég J.; Gyógyszereink, 53, 2002. 168-170. [35] H.T.Karnes, S.G. Shiu V.P. Shah; Pharm. Res., 8, No.4 1991. 421-426. [36] V.P. Shah, K.K. Midha, S. Dighe; Pharm. Res., 9, No.4 1991. 588-592. [37] V.P. Shah, K.K. Midha, S. Dighe, I. J. McGilveray et al.; Eur. J. Drug Metab.
76
Pharmacokin., 16, 1991. 249-255. [38] F. Bresolle; M. Bromet-Petit; M. Audran; J. Chromatogr. B., 686, 1996. 3-10. [39] Validation of Analytical Methods: Definitions and Terminology CPMP/ICH/381/95. Valid from 1995.06.01. [40] Validation of Analytical Procedures: Methodology CPMP/ICH/281/95 Valid from 1997. 06.01. [41] L. Hubert; LC-GC International, 1998, 11, 96-104. [42] Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation US. Dept. of Health and Human Services FDA/CDER/CVM/May 2001. [43] Guidance for Industry Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products-General Considerations, US. Dept. of Health and Human Services FDA/CDER/CVM/October 2002. [44] Investigator's brochure of deramciclane fumarate ( EGIS-3886 ), EGIS Doc. No.:5963/A 1994. [45] Frazer A. et al.; Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30, 1990. 307-348. [46] Gacsályi I.; Internal report, Egis Doc. No. 5619/A Dept. of Pharmacology, EGIS Pharmaceuticals Ltd. 1995. [47] Gacsályi I.; Internal report, Egis Doc. No. 5622-1/A., Dept. of Pharmacology, EGIS Pharmaceuticals Ltd. 1994. [48 ] Lang A. et al.; Internal report Study No. 11/1992. Department of Pharmacology and Toxicology, University of Helsinki, 1993. [49] Gacsályi I. et al.; Pharmaceut. and Pharmacol. Letters, 6, No.2. 1996. 82-85. [50] H. Kanerva, H. Vilkman, N. Kjell, O. Kilkku, M. Kuoppamäki, P.T. Männistö, E. Syvälahti, J. Hietala; Psychopharmacology 136, 1998. 99-104. [51 ] J. Lengyel, E. Bojti, A. Bolehovszky, Gy. Grézal, I. Klebovich, K. Magyar; Arzneim.-Forsch/Drug. Res,. 48, 1998. 1063-1068. [52] J. Lengyel, A . Bolehovsky, I . Klebovich, M. Abermann,, K. Magyar; Arzneim.-Forsch./Drug. Res., 48, 1998. 455-460. [53] K. Magyar, J . Lengyel, I. Ürmös, Gy. Grézal; Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin., 23, 1998. 125-131.
77
[54] I. Klebovich, H. Kanerva, E. Bojti, A. Urtti, S. Drabant; Pharm. Pharmacol. Commun., 4, 1998. 129-136. [55] I. Hazai, M. Pátfalusi, I. Klebovich, I. Ürmös; J. Pharm. Pharmacol. 51, 1999. 165-174. [56] K. Balogh Nemes, M. Abermann, E. Bojti, Gy. Grézal, S. Al-Behaisi,I. Klebovich; J. Pharm. Pharmacol. 52, 2000. 47-51. [57] DERAMCICLANE Investigator’s Brochure 2002 November; EGIS Dok. 7816/A [58] H. Kanerva, O. Kilkku, E. Heinonen, A. Alhonen-Raattesalmi, T. Nevalainen, A. Urtti; Biopharm. Drug. Dispos. 19, 1998. 531-539. [59] H. Kanerva, O. Kilkku, A. Helminen, J. Rouro, S. Tarpila, M. Scheinin, R. Huuponen, I. Klebovich, S. Drabant, A. Urtti; Int. J. Clin. Pharm. Ther. 37, 1999. 589-597. [60] Katalin Balogh Nemes et al.; Internal report, EGIS Dok. No. 9676/A [61] I. Klebovich, H. Kanerva, E. Bojti, A. Urtti, S. Drabant; Pharm. Pharmacol. Commun. 4, 1998. 129-136. [62] B. Dalmadi Kiss, et al.; Internal report, EGIS Dok. No.: 8421/A [63] P.R. Bieck (Ed.) Colonic Drug Absorption and Metabolism, Marcel Dekker, New York, 1993. [64] I.D. Wilson and J.W. Morden; J. Planar Chromatogr. 9 1996. 84-91. [65] P.O’Conor, S. Fremont, J. Schneider, H. Dowty, M. Jaeger, G. Talaska and D. Warshawsky; J. Chromatogr. B, 700, 1997. 49-57. [66] K.O. Börnsen; International Laboratory, August 2000. 6-8. [67] J. Sherma; Anal. Chem., 70, 1998. 7R-26R [68] H. Parvez, A. R. Reich, S. Lucas-Reich and S. Parvez (Eds.) Progress in HPLC, Vol.3. Flow-Through Radioactivity Detection in HPLC, VSP, Utrecht, The Netherlands, 1988. [69] E.P. Stranley and B.A. Scogins (Eds), Liquid Scintillation Countin, Academic Press, New York, London 1974. [70] M.J. Kessler; Liquid Scintillation and Analysis, Science and Technology, Canberra Packard, Meriden, CT, USA, 1989.
78
[71] Nagy L. Gy., Nagyné László K.; Radiokémia és izotóptechnika, MÛEGYETEMI KIADÓ, 1997. 274-287. [72] Nagy L. Gy., Nagyné László K.; Radiokémia és izotóptechnika, MÛEGYETEMI KIADÓ, 1997. 265. [73] E. Tyihák, E. Mincsovics, H. Kalász; J. Chromatogr., 174, 1979. 75-81. [74] E. Mincsovics, E. Tyihák, H. Kalász; J. Chromatogr., 191, 1980. 293-300. [75] H. Kalász, J. Nagy, E. Tyihák, E. Mincsovics; J. Liq. Chromatogr., 3, 1980. 845-855. [76] E. Mincsovics, M. Garami, L. Kecskés, B. Tapa, Z. Végh, Gy. Kátay, 82, 1999. 587-598. [77 ] E. Mincsovics, E. Tyihák, A.M. Siouffi; J. Planar Chromatogr., 1, 1988. 309-312. [78] I. Hazai, I. Ürmös, I. Klebovich; J. Planar Chromatogr., 8, 1995. 92-97. [79] K. Ludányi, Á. Gömöry, I. Klebovich, K. Monostory, L. Vereczkey, K. Újszászy, K. Vékey; J. Planar Chromatogr., 10, 1997. 90-96. [80] I. Klebovich, J. Szúnyog, I. Hazai; J. Planar Chromatogr., 10, 1997. 399-405. [81] J. Szúnyog, E. Mincsovics, I. Hazai and I. Klebovich; J. Planar Chromatogr., 11, 1998. 25-29. [82] E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihák in J. Sherma and B. Fried (Eds), Handbook of Thin-Layer Chromatography, Marcel Dekker, New York, 1991. 171-203 [83] I. Hazai, I. Klebovich; Thin-layer radiochromatography, In: Handbook of Thin-Layer Chromatography, Third Edition, Revised and Expanded, (Eds.: J. Sherma, B. Fried) , Marcel Dekker, Inc., New York, 2003. 339-360. [84] K. Ludányi, K. Vékey, J. Szúnyog, E. Mincsovics, T. Karancsi, K. Újszászy, K. Balogh Nemes, I. Klebovich; J. AOAC Int., 82, 1999. 231-238. [85] H. Filthut; J. Planar Chromatogr., 2, 1989. 198-202. [86] I. Davies; J. Planar Chromatogr., 10, 1997. 152-156 [87] D. Dalvie; Curr. Pharm. Design., 6, 2000. 1009-1028. [88] Sz. Nyiredy; Trends. Anal. Chem., 20, 2001. 91-101.
79
[89] T.E. Beesley; Quantitative Chromatographic Analysis, Marcel Dekker, New York, 2001. pp. 364-366. [90] R. Woestenborghs et al.; J. Chromatography, 424, 1988. 195-200. [91] Y. Preechagoon, B.G. Charles; J. of Chromatography B., 670, 1995. 139-143. [92] S. Cisternino, J. Schlatter, J. L. Saulnier; J. J. of Chromatography B., 714, 1998. 395-398. [93] C. F. McLean, M. T. Kluger, H. Owen ; Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 1991. Suppl. 18, 40 [94] Ürmös Iván, Grézal Gyula, Klebovich Imre; EGIS Dok. No.: 5922 [95] M.H.A. Botterblom, T.J. Janssen, P.J.M. Guelen; J. Chrom. Biomed. Appl., 421, 1987. 211-215. [96] M. Nieder, H. Jaeger; J. High Resol. Chromatogr. & Chromatogr. Commun. 9, 1986. 561-565. [97] F.J. Flores-Murietta, C. Hoyo-Vadillo, E. Hong, G. Castaneda-Hernandez; J. Chrom. Biomed. Appl., 490, 1989. 464-469. [98] M. Nobilis, J. Pastera, D. Svoboda, J. Kvetina, J. Chrom. Biomed. Appl., 581, 1992. 251-255. [99] K. Róna, K. Ary, B. Gachályi, I. Klebovich, É. Tomori; J. Chrom. Biomed. Appl., 678, 1996. 63-72.
80
9. Saját közlemények jegyzéke Az értekezés alapját képezõ közlemények: I. Imre Klebovich, Emil Mincsovics, József Szunyog, Krisztina Ludányi, Tamás Karancsi, Borbála Dalmadi Kiss Isolation and identification of metabolites of 3 H- and 14C-deramciclane by OPLCdigital autoradiography on-line sample collection and mass spectrometry, JPC J. Planar Chromatogr., 11, 394-399 1998.
II. Borbála Dalmadi Kiss, Katalin Balogh Nemes, Iván Ürmös, József Szúnyog, Imre Klebovich, Determination of ambroxol in dog plasma by high performance liquid chromatography and UV detection, Chromatographia, 51, S217-220 2000.
III. Borbála Dalmadi Kiss, Emil Mincsovics, Katalin Balogh Nemes, Imre Klebovich, Applications of OPLC-DAR and HPLC-RD tecniques in metabolite research, JPC, J. Planar Chromatogr., 13, 257-260 2000.
IV. E. Mincsovics, B. Dalmadi Kiss, Gy. Morovján, K. Balogh-Nemes, I. Klebovich, A New Tool in Metabolism Research: Combination of OPLC On-line Radioactivity Detection with HPLC-RD Technique, JPC, J. Planar Chromatogr., 14, 312-317 2001.
V. Gy. Morovján, B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, E. Mincsovics, Metabolite Analysis, Isolation and Purity Assessment Using Various Liquid Chromatographic Techniques Combined with Radioactivity Detection, Journal of Chromatogr. Sci., 40, 603-605. 2002.
VI. B. Dalmadi Kiss, K. Balogh Nemes, I. Klebovich, Determination of Cisapride in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography and Fluorescence Detection Chromatographia 57, January (No. 1/2) 47-50 2003.
81
Egyéb publikációk: VII. I. Klebovich, E. Mincsovics, J. Szunyog, K. Ludányi, T. Karancsi, K. Újszászy, B. Dalmadi Kiss, K. Vékey, Isolation and identification of deramciclane metabolites by OPLC-(DAR) on-line sample collection combined with MS techniques, in: Proceedings of Instrumental Planar Chromatography 1998. (Eds: Sz. Nyíredy, B. Szabady, R.E. Kaiser, A. Studer), Published by Research Institute for Medicinal Plants, Budakalász, Springer Hungaria, Budapest, 322-331. 1998.
VIII. Baloghné Nemes Katalin, Grézal Gyula, Dalmadiné Kiss Borbála, Tömlõ Judit, Patai Valentina, Nagy Lajos, Mózsik Gyula, Csörgõ Margit, Szentpéteri Imre, Klebovich Imre, Telviran és Zovirax 800 mg acyclovir hatóanyagtartalmú tabletták összehasonlító farmakokinetikája egészséges önkénteseken, Acta Pharm. Hung., 69, 36-45 1999.
IX. Katalin Balogh Nemes, Borbála Dalmadi Kiss, Imre Klebovich, Determination of acyclovir in dog plasma by column switching technique, Chromatographia, 51, S211-216 2000.
X. B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, E. Mincsovics, Katalin Balogh Nemes, Application of OPLC-DAR and HPLC-RD techniques in metabolite research in: Proceedings of Planar Chromatography 2000 (Eds: Sz. Nyíredy), Published by ResearchInstitute for Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, 57-65 2000.
XI. E. Mincsovics, B. Dalmadi-Kiss, Gy. Morovjan, K. Balogh-Nemes, I. Klebovich, A New Tool in Metabolism Research: Combination of OPLC On-line Radioactivity Detection with HPLC-RD Technique, New Milestones in TLC - Planar Chromatography 2001, Lillafured, June 23-25., L-13.113-126 2001.
82
Az értekezéshez kapcsolódó elõadások:
I. Klebovich, E. Mincsovics, J. Szúnyog, K. Ludányi, T. Karancsi, K. Újszászy, B. Dalmadi Kiss, K. Vékey, Isolation and identification of deramciclane metabolites by OPLC-(DAR) on-line sample collection combined with MS techniques, 10th International Symposium on Instrumental Planar Chromatography, Visegrád, May 16-19, 1998. Proceedings of Instrumental Planar Chromatography, 322-331. 1998.
II. Baloghné Nemes Katalin, Dalmadiné Kiss Borbála, Klebovich Imre, Acyclovir meghatározása humán plazmában HPLC módszerrel, Elválasztástudományi Vándorgyûlés ’98, Lillafüred, 1998. szeptember 30-október 2., Abstr. p. 39.
III. Klebovich Imre, Baloghné Nemes Katalin, Dalmadiné Kiss Borbála Kálmán, Karancsi Tamás, Ludányi Krisztina, Kövesdi István, Vékey Károly, Deramciclane metabolitok izolálása HPLC-Radiokémiai detektorral és azonosítása különbözõ spektroszkópiai módszerekkel kutya vizeletbõl, Elválasztástudományi 1998. szeptember 30-október 2., Abstr. p. 15.
IV. Katalin B. Nemes, Gyula Grézal, Nagy,
Gyula
Mózsik,
Margit
, Judit Tömlõ, Valentina Patai, Lajos Csörgõ,
Imre
Szentpéteri,
Imre
Klebovich,
Bioequivalence study of 800 mg acycovir-containing Telviran and Zovirax containing tablets in healthy volunteers, 7th European ISSX Meeting, Budapest, Hungary, August 22-26, 1999., ISSX Proceeding, 14, 90 (1999).
V. Borbála K. Dalmadi, Imre Klebovich, József Szúnyog, Emil Mincsovics, Krisztina Ludányi, Kálmán Újszászy, Tamás Karancsi, Károly Vékey, István Hazai, Isolation and identification of deramciclane metabolites by OPLC-DAR-MS-(MS) technique from dog urine and plasma 7th European ISSX Meeting, Budapest, Hungary, August 22-26, 1999, ISSX Proceeding, 14, 93 (1999).
83
VI. K. Balogh Nemes, B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, Determination of ambroxol in dog plasma using column switching technique, Balaton Symposium ’99 on High Performance Separation Methods, Siófok,Hungary, September 1-3, 1999, Abstr. p. 107.
VII. B. Dalmadi Kiss, K. Balogh Nemes, I. Ürmös, J. Szúnyog, I. Klebovich, Determination of ambroxol in dog plasma by high performance liquid chromatography and UV detection, Determination of ambroxol in dog plasma using column switching technique, Balaton Symposium ’99 on High Performance Separation Methods, Siófok, Hungary, September 1-3, 1999, Abstr. p. 117.
VIII. B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, E. Mincsovics, Katalin Balogh Nemes, E. Mincsovics, Katalin Balogh Nemes, Application of OPLC-DAR and HPLC-RD techniques in metabolite research, Proceedings of the International Symposium on Planar Separations, Planar Chromatography 2000, Lillafüred, Hungary, 24-26 June 2000., Abstr. p. L-08.
IX. K. Balogh Nemes, Gy. Grézal, B. Dalmadi Kiss, I. Klebovich, Pharmacokinetic dose linearity study of 200, 400 and 800 mg acyclovir containing Telviran tablets in dog, 6th European Congress of Pharmaceutical Sciences, EUFEBS 2000, Budapest, Hungary, September 16-19, 2000, Abstr. No. PO-176: EUR. J: Pharm. Sci., (Suppl. 1), S87-88. (2000).
X. Dalmadiné Kiss Borbála, Baloghné Nemes Katalin, Klebovich Imre, A cisapride meghatározása humán plazmában nagyérzékenységû RP-HPLC-FLD bioanalitikai módszerrel, Elválasztástudományi Vándorgyûlés 2000, Visegrád, 2000 november 8-10, Abstr. p. PO3.
XI. E. Mincsovics, B. Dalmadi Kiss, Gy. Morovján, K. Balogh Nemes, I. Klebovich, A New Tool in Metabolite Research: Combination of OPLC On-Line Radioactivity Detection with HPLC-RD Technique, New Milestones in TLC-Planar Chromatography 2001, 23-25 June 2001, Lillafüred, Hungary, pp. 113-126.
84
Szabadalom Gacsályi István, Lévay György, Lukács Gyula, Mezei Tibor, Klebovich Imre, Simig Gyula, Schmidt Éva, Baloghné Nemes Katalin, Kompagne Hajnalka, Leveleki Csilla, Egyed András, Hársing László Gábor [2.2.1.] heptán-2-on-származékok, 2002. Magyar Szabadalmi bejelentés, 3410/2002.
85
