BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. Sintesis fragmen gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur

20

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. KONDISI OPTIMAL REAKSI AMPLIFIKASI

Sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 dilakukan dengan teknik overlapping extension PCR. Overlapping extension PCR merupakan metode PCR yang digunakan untuk menghasilkan polinukleotida dari fragmen-fragmen kecil (Heckman & Pease 2007: 924). Amplifikasi dilakukan dengan metode HotStar PCR menggunakan enzim HotStar Taq DNA polymerase. Metode HotStar PCR sesuai digunakan karena amplifikasi menggunakan banyak pasangan primer (multiple primer pairs). Sintesis tersebut dilakukan dengan variasi penambahan pasangan primer pada selang 3 siklus dari reaksi PCR, yang terbagi ke dalam lima metode (Gambar 6--10). Metode-metode penambahan pasangan primer tersebut ditentukan berdasarkan jumlah pasangan primer yang digunakan. Pasangan primer yang digunakan berjumlah delapan pasangan primer, sehingga diperoleh metode penambahan primer, yaitu delapan pasang, empat pasang, dua pasang, dan satu pasang primer dalam satu reaksi PCR. Hal tersebut didasarkan pada proporsional jumlah pasangan primer yang ditambahkan dalam setiap reaksi PCR, sehingga jumlah pasangan primer yang ditambahkan sama untuk setiap reaksi PCR dalam satu metode. Pasangan 20

Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008

21

primer ditambahkan pada selang 3 siklus. Hal tersebut dilakukan atas dasar variasi terhadap penelitian sintesis gen HA yang dilakukan di IHVCB-UI. Penelitian sintesis fragmen 688--1119 gen HA sebelumnya telah dilakukan dengan variasi penambahan dua pasang primer dengan selang 8 siklus dalam satu reaksi PCR (Widyaningtyas, komunikasi pribadi, 25 September 2007). Keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu DNA cetakan (template), primer, buffer PCR, MgCl2, enzim DNA polimerase, suhu, waktu denaturasi, annealing, dan jumlah siklus (Sambrook & Russell 2001: 8.4--8.6). Optimasi PCR perlu dilakukan terlebih dahulu untuk mendapatkan kondisi PCR yang tepat dalam proses PCR sehingga dihasilkan produk PCR yang spesifik. Optimasi PCR perlu dilakukan karena tidak ada satu protokol pun yang sesuai digunakan untuk semua reaksi PCR (Ahmed 2006: 118). Optimasi yang dilakukan dalam amplifikasi untuk sintesis fragmen 688--1119 gen HA meliputi suhu annealing, konsentrasi MgCl2, dan konsentrasi primer. Optimasi suhu annealing pada penelitian pendahuluan dilakukan pada suhu 55° C dan 60° C. Suhu annealing tersebut ditentukan berdasarkan hasil optimasi suhu annealing yang pernah dilakukan oleh peneliti IHVCB-UI, yang juga melakukan penelitian sintesis gen HA menggunakan pasangan primer yang sama dengan penelitian sintesis fragmen 688--1119 gen HA. Hasil optimasi menunjukkan bahwa amplifikasi dengan suhu annealing 60° C selama 30 detik tidak menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik dari


22

kelima metode penambahan primer (Gambar 11). Sementara itu, amplifikasi dengan suhu annealing 55° C selama 30 detik menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik untuk metode ke-4 dan ke-5, dan menghasilkan produk PCR dimer untuk metode ke-2 dan ke-4, serta tidak menghasilkan produk PCR yang spesifik untuk metode ke-1 (Gambar 12). Amplifikasi dapat berjalan dengan suhu annealing 55° C selama 30 detik dikarenakan penggunaan Qiagen PCR buffer. Qiagen PCR buffer memungkinkan untuk tidak dilakukan optimasi suhu annealing. Hal tersebut dikarenakan Qiagen PCR buffer mampu menyediakan ruang suhu yang lebih luas (wider temperature window) (Qiagen 1997: 3). Penelitian menggunakan Qiagen PCR buffer dengan variasi suhu annealing 50-- 60° C menunjukkan bahwa suhu annealing 54--60° C menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik tanpa adanya produk dimer. Sementara itu, suhu annealing di bawah 54° C menghasilkan produk amplifikasi dimer ( Qiagen 1997: 5). Menurut Qiagen (2005: 16), suhu annealing yang disarankan berkisar antara 50--68° C selama 30 detik sampai 1 menit. Proses penempelan primer pada DNA cetakan dipengaruhi oleh ion Mg2+. Masing-masing pasangan primer memerlukan kondisi ion Mg2+ yang berbeda untuk dapat menempel pada DNA cetakan dengan optimal sehingga menghasilkan produk PCR yang spesifik (Kramer & Coen: 2001: 15.1.7). Peningkatan konsentrasi ion Mg2+ dilakukan untuk mengetahui kondisi optimal yang dibutuhkan bagi setiap pasangan primer agar dapat menghasilkan produk PCR yang spesifik.


23

Optimasi konsentrasi ion Mg2+ dalam reaksi amplifikasi dilakukan dengan konsentrasi 1,5 mM MgCl2 dan 2 mM MgCl2. Campuran reaksi PCR dengan final concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM tidak perlu ditambahkan larutan 25 mM MgCl2 karena larutan 10x HotStar PCR buffer [Qiagen] telah mengandung 1,5 mM MgCl2. Pembuatan campuran reaksi PCR dengan final concentration MgCl2 sebesar 2 mM dilakukan dengan menambahkan 0,26 µL 25 mM MgCl2. Cara menghitung jumlah volume MgCl2 yang harus ditambahkan ke dalam campuran reaksi PCR dengan final concentration MgCl2 2 mM dapat dilihat pada Lampiran 10. Hasil optimasi menunjukkan bahwa final concentration MgCl2 sebesar 2 mM menghasilkan pita DNA yang lebih tebal daripada final concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM. Namun, final concentration MgCl2 sebesar 2 mM menghasilkan produk dimer untuk 3 metode penambahan primer, sedangkan final concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM hanya menghasilkan produk dimer untuk 2 metode penambahan primer (Gambar 11 dan 12). Konsentrasi MgCl2 yang dianjurkan untuk reaksi PCR dengan konsentrasi dNTP sebesar 200 µM adalah 1,5 mM (Hanegariu 1997: 1). Berdasarkan hasil tersebut maka reaksi amplifikasi menggunakan final concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM yang telah terkandung dalam 10x HotStar PCR buffer [Qiagen] yang digunakan dalam reaksi amplifikasi. Konsentrasi primer merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap spesifitas produk PCR. Konsentrasi primer yang digunakan dalam


24

reaksi PCR sebaiknya berkisar antara 0,1--0,5 µM (Qiagen 1997: 3). Konsentrasi primer yang terlalu tinggi dapat menyebabkan penempelan primer pada sekuen DNA cetakan yang tidak spesifik, sedangkan konsentrasi primer yang terlalu rendah akan menghasilkan sedikit produk PCR (Muladno 2002: 66). Menurut Qiagen (1997: 5), konsentrasi primer 0,2 µM memberikan hasil amplifikasi yang memuaskan. Penelitian yang dilakukan menggunakan variasi konsentrasi primer 0,1--1,0 µM menunjukkan bahwa konsentrasi primer 0,1--0,2 µM menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik. Sementara itu, konsentrasi primer 0,5--1,0 µM menghasilkan produk amplifikasi dimer (Qiagen 1997: 5). Konsentrasi primer yang digunakan dalam penelitian adalah 0,3 µM (Lampiran 9) untuk pasangan H896F + H923R dan 0,5 µM untuk pasangan H869F + H953R, H843F + H979R, H819F + H1003R, H791F + H1028R, H765F + H1051R, H729F + H1078R, dan H703F + H1104R. Konsentrasi primer-primer tersebut diperoleh berdasarkan hasil optimasi pada penelitian pendahuluan. Konsentrasi primer dibedakan untuk pasangan primer H896F + H923R. Hal tersebut dikarenakan pasangan primer tersebut memiliki daerah overlapping pada ujung 3’ sebesar 9 pb, yang nantinya akan teramplifikasi membentuk produk yang akan dijadikan cetakan (template) pada reaksi PCR berikutnya. Daerah overlapping yang akan teramplifikasi hanya berukuran 9 basa dengan amplifikasi sebanyak 3 siklus. Oleh karena itu, konsentrasi primer dari pasangan primer tersebut dibuat lebih rendah dari


25

pasangan primer yang lainnya, sehingga dapat menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik yang nantinya akan menjadi cetakan (template).

B. ANALISIS METODE PENAMBAHAN PRIMER

1. Metode ke-1 (Delapan pasang primer ditambahkan secara bersamaan pada awal siklus untuk satu kali reaksi PCR)

Delapan pasang primer yang ditambahkan secara bersamaan pada awal siklus untuk satu kali reaksi PCR tidak berhasil membentuk pita DNA yang spesifik pada reaksi PCR pertama (Gambar 13, Lajur 1). Hal tersebut dikarenakan belum terbentuknya DNA cetakan (template) pada reaksi PCR tersebut. Reaksi PCR yang dilakukan tidak menggunakan DNA cetakan (template). DNA cetakan (template) terbentuk karena adanya overlap 9 basa pada ujung 3’ dari pasangan primer H896F + H923R. Pasangan-pasangan primer yang dicampurkan secara bersamaan di awal siklus tidak memberikan waktu yang cukup untuk amplifikasi pasangan primer H896F + H923R membentuk diri sebagai DNA cetakan (template). DNA cetakan (template) merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap spesifisitas produk PCR (Sambrook & Russell 2001: 8.5). Tanpa adanya DNA cetakan (template) maka tidak ada tempat bagi primer untuk menempel pada tahap annealing sehingga tidak akan terbentuk produk PCR yang spesifik. Faktor lain yang mengakibatkan tidak terbentuknya produk amplifikasi yang tidak spesifik pada metode ke-1 adalah adanya penempelan antara


26

pasangan-pasangan primer yang saling berkomplemen pada daerah ujung 3’. Primer-primer tersebut dapat menempel pada daerah ujung 3’ yang berkomplemen karena konsentrasi primer yang terlalu tinggi (Muladno 2002: 66). Terdapat 8 pasang primer dalam reaksi PCR dengan konsentrasi pasangan primer H896F + H923R sebesar 0,3 µM dan 7 pasangan primer lainnya masing-masing primer sebesar 0,5 µM. Dengan demikian, total konsentrasi primer dalam reaksi PCR tersebut cukup tinggi, yaitu 3,8 µM sehingga tidak dihasilkan produk PCR yang spesifik. Konsentrasi primer yang digunakan dalam reaksi PCR sebaiknya berkisar antara 0,1--0,5 µM (Innis & Gelfand 1990: 5; Qiagen 1997: 3). Menurut Qiagen (1997: 5), amplifikasi dengan menggunakan konsentrasi primer 0,2 µM memberikan hasil amplifikasi yang memuaskan. Sementara itu, amplifikasi dengan menggunakan konsentrasi primer 0,5 µM cenderung menghasilkan produk amplifikasi yang tidak spesifik, yaitu produk dimer.

2. Metode ke-2 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam satu kali reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi PCR)

Lajur 2 pada Gambar 13 menunjukkan hasil visualisasi produk amplifikasi dari metode ke-2. Delapan pasang primer yang ditambahkan dalam satu kali reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi PCR; berhasil membentuk pita DNA berukuran 134 pb, tetapi ukuran pita DNA yang dihasilkan tersebut tidak sesuai dengan yang


27

diharapkan yaitu 446 pb. Hal tersebut dikarenakan konsentrasi primer yang tinggi dengan selang siklus yang cukup pendek antara penambahan satu pasang primer dengan pasangan primer berikutnya. Pasangan primer H896F + H923R dengan konsentrasi 0,3 µM dimasukkan pada awal siklus PCR. Konsentrasi primer sebesar 0,3 µM cukup untuk mengamplifikasi daerah overlap pasangan primer H896F + H923R yang hanya berukuran 9 pb, sebanyak 3 siklus. Dengan demikian, DNA cetakan (template) telah terbentuk pada selang 3 siklus pertama. Pasangan primer H869F + H953R dimasukkan ke dalam reaksi PCR dengan konsentrasi 0,5 µM pada siklus ketiga. Pasangan primer H869F + H953R berhasil mengamplifikasi DNA cetakan (template) yang telah terbentuk pada selang 3 siklus pertama, sehingga terbentuk produk amplifikasi berukuran 134 pb. Pasangan primer H843F + H979R dimasukkan ke dalam reaksi PCR dengan konsentrasi 0,5 µM pada siklus keenam. Demikian seterusnya, pasangan-pasangan primer berikutnya dimasukkan ke dalam reaksi PCR hingga kedelapan pasangan primer digunakan dalam reaksi PCR pada metode ke-2. Pasangan primer H843F + H979R tidak berhasil mengamplifikasi DNA cetakan (template) yang telah terbentuk pada selang 3 siklus sebelumnya, terlihat dari pita DNA yang dihasilkan hanya berukuran 134 pb yang merupakan hasil amplifikasi antara pasangan primer H869F + H953R dengan pasangan primer H896F + H923R. Hal tersebut dikarenakan pada saat penambahan pasangan primer H843F + H979R, pasangan primer H869F + H953R belum teramplifikasi dengan sempurna akibat selang siklus


28

yang cukup pendek sehingga pasangan primer H843F + H979R tidak ada tempat untuk menempel pada tahap annealing. Demikian seterusnya terjadi pada pasangan primer H819F + H1003R, H791F + H1028R, H765F + H1051R, H729F + H1078R, dan H703F + H1104R yang tidak ada tempat untuk menempel pada tahap annealing akibat belum sempurnanya amplifikasi pasangan primer H869F + H953R. Dengan demikian, produk amplifikasi yang dihasilkan hanya berukuran 134 pb, yang merupakan hasil amplifikasi pasangan primer H869F + H953R dengan pasangan primer H896F + H923R. Produk amplifikasi yang dihasilkan tidak sesuai dengan yang diharapkan, yaitu 446 pb. Produk amplifikasi yang dihasilkan pada metode ke-2, disamping tidak spesifik, juga terlihat adanya produk dimer. Produk dimer tersebut terlihat dengan adanya pita DNA tipis di bawah pita DNA berukuran 134 pb tersebut (Gambar 13, Lajur 2). Produk dimer tersebut akan mengurangi spesifitas produk PCR yang dihasilkan. Produk dimer terbentuk karena adanya amplifikasi antara ujung 3’ dari salah satu primer dengan ujung 5’ dari primer lainnya yang saling berkomplemen (Singh & Kumar 2001: 29). Produk dimer dapat terjadi karena konsentrasi primer yang terlalu tinggi. Konsentrasi primer yang tinggi dapat meningkatkan mispriming, akumulasi produk amplifikasi yang tidak spesifik, dan meningkatkan kemungkinan terjadinya reaksi amplifikasi antar primer yang akan menghasilkan produk dimer (Innis & Gelfand 1990: 7). Percobaan reaksi amplifikasi menggunakan variasi konsentrasi primer 0,1; 0,2; 0,5; dan 1,0 µM menunjukkan bahwa reaksi


29

amplifikasi dengan konsentrasi primer 0,5 dan 1,0 cenderung menghasilkan produk dimer (Qiagen 1997: 5).

3. Metode ke-3 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam dua kali reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi PCR)

Visualisasi produk amplifikasi dari reaksi PCR pertama pada metode ke-3 terlihat pada lajur 3 dari Gambar 13. Berdasarkan hasil visualisasi tersebut, terlihat bahwa produk amplifikasi pada metode ke-3 serupa dengan produk amplifikasi pada metode ke-2. Produk amplifikasi yang dihasilkan hanya berukuran 134 pb, tidak sesuai dengan yang diharapkan yaitu 239 pb. Hal tersebut juga dikarenakan belum sempurnanya amplifikasi pasangan primer H869F + H953R pada selang 3 siklus kedua (siklus keempat sampai keenam) terhadap pasangan primer H896F + H923R yang telah menjadi cetakan (template) pada selang 3 siklus sebelumnya. Dengan demikian, pasangan primer H843F + H979R yang dimasukkan ke dalam reaksi PCR pada siklus keenam tidak ada tempat untuk menempel secara sempurna pada tahap annealing, sehingga tidak menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik. Hal tersebut juga terjadi pada pasangan primer H819F + H1003R yang dimasukkan ke dalam reaksi PCR pada siklus kesembilan (Gambar 7). Pasangan primer yang tidak menempel secara sempurna pada DNA cetakan (template) akan saling menempel antara ujung 3’ dengan ujung 5’ yang berkomplemen. Kondisi tersebut akan menghasilkan produk dimer


30

(Kaufman dkk. 1993: 552). Produk dimer juga terbentuk pada reaksi PCR pertama dari metode ke-3 Gambar 13, Lajur 3). Produk dimer terlihat dengan adanya pita DNA lain yang berukuran kurang dari 134 pb. Produk dimer terbentuk ketika ujung 3’ dari salah satu primer menempel pada ujung 5’ dari primer lainnya pada tahap annealing (Kramer & Coen: 2001: 15.1.9). Adanya produk dimer tersebut akan mengurangi spesifitas produk PCR yang dihasilkan (Singh & Kumar 2001: 29). Produk amplifikasi dan produk dimer yang dihasilkan pada metode ke-3 tampak lebih jelas daripada metode ke-2. Hal tersebut kemungkinan dikarenakan pada metode ke-3 jumlah siklus PCR yang tersisa setelah penambahan pasangan primer terakhir dalam satu reaksi PCR lebih banyak daripada metode ke-2. Metode ke-2 menggunakan delapan pasang primer dalam satu reaksi PCR, sehingga dibutuhkan sebanyak 21 siklus PCR untuk penambahan pasangan primer ke dalam reaksi PCR. Dengan demikian, jumlah siklus PCR yang tersisa hanya 14 siklus. Sementara itu, metode ke-3 menggunakan empat pasang primer dalam satu reaksi PCR, sehingga hanya dibutuhkan sebanyak 9 siklus PCR untuk penambahan pasangan primer ke dalam reaksi PCR. Metode ke-3 masih menyisahkan sebanyak 26 siklus PCR untuk menyelesaikan satu reaksi PCR. Jumlah siklus PCR yang sedikit akan menghasilkan sedikit produk amplifikasi yang spesifik, sehingga pita DNA yang terbentuk lebih tipis (Innis & Gelfand 1990: 6). Reaksi PCR pertama dari metode ke-3 tidak menghasilkan produk PCR yang spesifik, sehingga tidak ada produk PCR yang akan dijadikan DNA


31

cetakan (template). Oleh karena itu, pada metode ke-3 tidak dilanjutnya untuk reaksi PCR kedua.

4. Metode ke-4 (Delapan pasang primer ditambahakan dalam empat kali reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi PCR)

Reaksi PCR pertama dari metode ke-4 menghasilkan produk amplifikasi sesuai yang diharapkan, yaitu berukuran 134 pb (Gambar 13 Lajur 4). Hal tersebut dikarenakan reaksi PCR pertama pada metode ke-4 hanya menggunakan 2 pasang primer, sehingga tersedia jumlah siklus yang cukup untuk amplifikasi setelah ditambahkannya pasangan primer kedua pada siklus ketiga. Pasangan primer H896F + H923R dimasukkan pada awal siklus reaksi PCR pertama dengan konsentrasi 0,3 µM, selanjutnya reaksi PCR dijalankan sampai siklus ketiga. Pasangan primer H896F + H923R dengan konsentrasi 0,3 µM berhasil teramplifikasi dalam rentang 3 siklus. Hal tersebut dikarenakan bagian overlap (berperan sebagai DNA cetakan) pada pasangan primer H896F + H923R yang teramplifikasi hanya berukuran 9 pb. Menurut Davis dkk. (1994: 119), proses amplifikasi lebih efisien untuk fragmen pendek yang diapit oleh beberapa primer oligonukleotida. Fragmen DNA cetakan yang terlalu panjang kurang efisien karena fragmen tersebut dapat berasosiasi kembali dengan untai komplemen dengan cepat dan membentuk untai ganda kembali. Hal tersebut


32

menyebabkan terganggunya proses amplifikasi karena untai ganda DNA tidak dapat menyediakan cetakan untuk siklus berikutnya. Pasangan primer H869F + H953R dimasukkan ke dalam reaksi PCR pada siklus ketiga dengan konsentrasi 0,5 µM. Pasangan primer tersebut dapat menempel pada DNA cetakan (template) yang telah terbentuk sebelumnya dari pasangan primer H896F + H923R, sehingga menghasilkan produk amplifikasi yang spesifik berukuran 134 pb. Siklus PCR sebanyak 32 siklus (rentang siklus ke-3 sampai siklus ke-35) memberikan waktu yang cukup bagi pasangan primer H869F + H953R untuk mengamplifikasi DNA cetakan (template) tersebut. Menurut Qiagen (2005: 16), jumlah siklus optimal pada reaksi HotStar PCR berkisar antara 25--35 siklus. Polimerisasi akhir selama 10 menit memberikan waktu bagi pasangan primer H869F + H953R untuk menyempurnakan proses amplifikasi. Produk PCR yang dihasilkan pada reaksi PCR pertama dijadikan DNA cetakan (template) pada reaksi PCR kedua dengan penambahan pasangan primer H843F + H979R pada awal siklus dan pasangan primer H819F + H1003R pada siklus ke-3, dengan konsentrasi masing-masing 0,5 µM. Reaksi PCR kedua menghasilkan produk PCR yang spesifik berukuran 239 pb. Produk PCR kedua dijadikan DNA cetakan (template) pada rekasi PCR ketiga dengan penambahan pasangan primer H791F + H1028R pada awal siklus dan pasangan primer H765F + H1051R pada siklus ke-3, dengan konsentrasi masing-masing 0,5 µM. Reaksi PCR ketiga juga menghasilkan produk PCR yang spesifik berukuran 344 pb. Produk PCR ketiga selanjutnya


33

dijadikan DNA cetakan (template) pada reaksi PCR keempat dengan penambahan pasangan primer H729F + H1078R pada awal siklus dan pasangan primer H703F + H1104R pada siklus ke-3, dengan konsentrasi masing-masing 0,5 µM. Reaksi PCR keempat menghasilkan produk PCR yang spesifik berukuran 446 pb (Gambar 14). Dengan demikian, metode ke-4 berhasil membentuk fragmen 688--1119 gen HA secara utuh berukuran 446 pb.

5. Metode ke-5 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam delapan kali reaksi PCR)

Visualisasi produk amplifikasi dari reaksi PCR pertama pada metode ke-5 menunjukkan terbentuknya pita DNA yang spesifik berukuran 83 pb, sesuai dengan yang diharapakan (Gambar 13, Lajur 5). Pasangan primer H896F + H923R dimasukkan pada awal siklus dengan konsentrasi 0,3 µM, selanjutnya PCR dijalankan sampai 35 siklus. Konsentrasi primer sebesar 0,3 µM dari pasangan primer H896F + H923R telah cukup untuk mengamplifikasi daerah overlap pada ujung 3’ dari masing-masing primer tersebut selama 35 siklus. Produk PCR yang dihasilkan pada reaksi PCR pertama selanjutnya dijadikan DNA cetakan (template) pada reaksi PCR kedua. Produk PCR yang dihasilkan pada reaksi PCR kedua dijadikan DNA cetakan (template) pada rekasi PCR ketiga. Demikian seterusnya hingga reaksi PCR kedelapan dan dihasilkan produk PCR berukuran 446 pb (Gambar 15), sesuai dengan yang diharapkan.


34

Pita DNA yang dihasilkan pada metode ke-5 lebih tebal daripada metode ke-4. Hal tersebut dikarenakan pada metode ke-5 memiliki waktu amplifikasi yang lebih lama karena dalam satu reaksi PCR selama 35 siklus hanya dimasukkan 1 pasang primer. Amplifikasi pasangan primer H896F + H923R yang akan membentuk DNA cetakan (template) berlangsung selama 35 siklus, sehingga amplifikasi akan sempurna dan menghasilkan pita DNA yang tebal. Sementara itu, pada metode ke-4 amplifikasi pasangan primer H896F + H923R hanya berlangsung selama 3 siklus, sehingga amplifikasi kurang sempurna dan pita DNA yang dihasilkan lebih tipis. Jumlah siklus yang sedikit akan menghasilkan produk amplifikasi spesifik dalam jumlah kecil, sehingga pita DNA yang terbentuk menjadi tipis (Innis & Gelfand 1990: 6).

C. EFISIENSI WAKTU SERTA EFEKTIVITAS PENGGUNAAN BAHAN DAN BIAYA

1. Efisiensi waktu

Salah satu kriteria untuk menentukan metode optimal dalam sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 adalah efisiensi waktu. Waktu yang dibutuhkan untuk sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 bervariasi untuk masing-masing metode penambahan


35

primer. Waktu tersebut meliputi waktu untuk reaksi amplifikasi dan waktu untuk running elektroforesis (Tabel 1). Kriteria utama untuk menentukan metode optimal dalam sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 adalah dapat terbentuknya fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 sintetik dengan ukuran 446 pb. Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa metode ke-4 dan metode ke-5 berhasil membentuk fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 dengan ukuran 446 pb. Oleh karena itu, untuk melihat efisiensi waktu maka yang akan dibandingkan adalah metode ke-4 dan ke-5. Berdasarkan hasil pengamatan dan penghitungan, maka metode ke-4 memiliki total waktu sintesis lebih singkat dibandingkan metode ke-5, yaitu 13 jam (Tabel 1). Dengan demikian, berdasarkan efisiensi waktu maka metode ke-4 lebih optimal daripada metode ke-5. Perbandingan efisiensi waktu antara metode ke-4 dan metode ke-5 terlihat dari Gambar 14 dan 15 yang menunjukkan visualisasi produk amplifikasi dari setiap reaksi PCR pada kedua metode tersebut. Metode ke-4 membutuhkan waktu sintesis yang lebih cepat, yaitu hanya membutuhkan empat kali reaksi PCR (Gambar 14). Sementara itu, metode ke-5 membutuhkan waktu sintesis yang lebih lama, mencapai dua kali lipat waktu sintesis pada metode ke-4, yaitu delapan kali reaksi PCR (gambar 15). Berdasarkan hal tersebut, metode ke-4 lebih optimal daripada metode ke-5.


36

2. Efektivitas penggunaan bahan dan biaya

Efektivitas penggunaan bahan dan biaya juga merupakan kriteria untuk menentukan metode optimal dalam sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005, disamping efisiensi waktu. Efektivitas penggunaan bahan dan biaya meliputi bahan dan biaya untuk reaksi amplifikasi dan running elektroforesis (Tabel 2--5). Berdasarkan hasil penelitian, hanya metode ke-4 dan ke-5 yang berhasil membentuk fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 sintetik dengan ukuran 446 pb, maka hanya kedua metode tersebut yang akan dibandingkan untuk kriteria efektivitas penggunaan bahan dan biaya. Berdasarkan hasil perhitungan (Tabel 4 dan 5), metode ke-4 membutuhkan biaya untuk reaksi amplifikasi sebesar Rp 170.815,10 dan untuk running elektroforesis sebesar Rp 87.058,14, sehingga total biaya yang dibutuhkan untuk sintesis sebesar Rp 257.873,24. Sementara itu, metode ke-5 membutuhkan biaya untuk reaksi amplifikasi sebesar Rp 202.065,02 dan untuk running elektroforesis sebesar Rp 174.116,27, sehingga total biaya yang dibutuhkan sebesar Rp 376.181,29. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode ke-4 lebih optimal daripada metode ke-5 karena membutuhkan biaya sintesis yang lebih murah.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. Sintesis fragmen gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur

Recommend Documents