BAB III
METODE PENELITIAN A. Jenis dan Desain Penelitian Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratoris dengan rancangan post-test only control group design. B. Sampel Penelitian Sampel pada penelitian ini adalah resin akrilik heat cure sebanyak 32 buah. Jumlah sampel dihitung dengan menggunakan rumus Federer. (t-1)(n-1)≥15 (2-1)(n-1)≥15 n-1≥15 n≥16 keterangan : t = banyaknya kelompok perlakuan n = banyaknya replikasi C. Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Waktu penelitian : Penelitian dilakukan pada 10-23 Desember 2016. 2. Lokasi penelitian : a. Laboratorium
Teknologi
Farmasi
Yogyakarta.
24
Universitas
Muhammadiyah
25
b. Laboratorium Mikrobiologi Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. D. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas : ekstrak kulit salak pondoh (Salacca zalacca). 2. Variabel terikat : pertumbuhan Candida albicans pada plat resin akrilik. 3. Variabel terkendali : a. Jenis plat resin akrilik : resin akrilik heat cure merk Dentsply QC 20. b. Ukuran dan bentuk plat resin akrilik : bentuk cakram, diameter 10mm dan ketebalan 2mm (Wahyuningtyas, 2008). c. Konsentrasi ekstrak kulit salak pondoh : konsentrasi 100%. d. Lama waktu perendaman plat resin akrilik dalam saliva buatan selama 1 jam pada suhu 37°C. e. Lama waktu perendaman plat resin akrilik dalam ekstrak kulit salak pondoh selama 8 jam suhu 37°C. f. Lama waktu perendaman plat resin akrilik dalam suspensi Candida albicans selama 24 jam pada suhu 37°C. g. Media pengeraman Candida albicans : sabouraud dextrose agar. h. Cara penghitungan koloni Candida albicans. i. Lama waktu inkubasi cawan petri dalam inkubator selama 48 jam. j. Sterilisasi alat dan bahan 4. Variabel tak terkendali : a. Penyebaran suspensi Candida albicans pada permukaan resin akrilik. b. Usia tanaman salak.
26
E. Definisi Operasional 1. Plat resin akrilik disimulasikan dalam bentuk cakram yang dibuat dari resin akrilik heat curing dengan diameter 10mm dan tebal 2mm. 2. Ekstrak kulit salak pondoh merupakaan sediaan cair yang didapat dengan mengekstrak kulit salak pondoh yang diambil di daerah Turi, Kabupaten Sleman dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Pada penelitian ini dibuat konsentrasi larutan ekstrak 100%. 3. Penghitungan jumlah koloni Candida albicans dengan menghitung jumlah koloni Candida albicans pada media agar, kemudian dihitung dengan menggunakan rumus : 𝑨𝒏𝒈𝒌𝒂 𝒋𝒂𝒎𝒖𝒓 =
𝑱𝒖𝒎𝒍𝒂𝒉 𝒌𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊 𝑿 𝑭𝒂𝒌𝒕𝒐𝒓 𝒑𝒆𝒏𝒈𝒆𝒏𝒄𝒆𝒓𝒂𝒏 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒉𝒊𝒕𝒖𝒏𝒈
4. Efektivitas ekstrak kulit salak pondoh adalah nilai hambat pertumbuhan Candida albicans yang lebih sedikit jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. F. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat-alat yang digunakan pada penelitian : a. Inkubator (Memmert) b. Vortex mixer (Gemmy VM-300, Taiwan) c. Pinset d. Lampu spiritus e. Tabung reaksi (IWAKI Pyrex, Japan) f. Pipet (IWAKI, Japan)
27
g. Pipet h. Ose i. Cawan petri (Herma) j. Press dan kuvet k. Becker glass (IWAKI Pyrex, Japan) l. Rotary evaporator (IKA RV 10) m. Rubber bowl dan spatula n. Timbangan analitik (Mettler Toledo AL-204) 2. Bahan yang digunakan pada penelitian : a. Kulit salak pondoh b. Alkohol 70% c. Sediaan Candida albicans 108 CFU/ml d. Media untuk pembiakan Candida albicans e. Media Sabouraud Dextrose Agar (Merck KGaA, Germany) f. Saliva buatan Saliva buatan diperoleh dari Laboratorium Kimia Analitik FMIPA Universitas Gajahmada. Komposisi dalam 1 Liter saliva buatan mengacu pada metode McDougall terdiri dari NaHCO3 9,8 gram, Na2HPO4 + 2H2O 3,71 gram, KCl 0,57 gram, NaCl 0,47 gram, MgSO4 + 7H2O 0,12 gram, CaCl2 0,05 gram dengan pH 6,8. g. Gips h. Model malam i. Could Mould Seal (Detrey, England)
28
j. Aquades G. Jalannya Penelitian 1. Tahap persiapan penelitian a. Pembuatan plat resin akrilik heat cure Model cetakan dibuat dengan menggunakan malam merah, kemudian model tersebut ditanam di dalam kuvet bagian bawah dengan menggunakan gips, ditunggu sampai mengeras kemudian seluruh permukaan model malam dan gips yang telah mengeras diolesi dengan vaselin. Membuat kontra dengan cara memasang kuvet bagian atas dan diisi dengan gips, dipress dan ditunggu hingga gips mengeras, kemudian dipanaskan, setelah mendidih diangkat dan dibiarkan sampai cukup dingin, lalu kuvet dibuka. Dilakukan boiling out sampai bersih sehingga terbentuk mould untuk kemudian diisi dengan resin akrilik. Bubuk dan cairan bahan resin akrilik diaduk dalam pot porselen dengan perbandingan 5,75 gram bubuk : 2,5 ml cairan sesuai dengan petunjuk pabrik. Aduk bubuk dan cairan hingga konsistensi dough stage kemudian tuang adonan ke dalam mould
yang sebelumnya
diolesi vaselin kemudian di press. Akrilik dalam kuvet dimasukkan ke dalam curing unit selama 30 menit (sesuai petunjuk pabrik). Setelah processing selesai, kuvet dibiarkan sampai mencapai suhu kamar kemudian kuvet dibuka, plat resin akrilik diambil dan dihilangkan akses-akses dengan arkansas stone bur kemudian dihaluskan dengan ampelas.
29
b. Pembuatan ekstrak kulit salak pondoh Kulit salak sebanyak 3850 gram dimasukkan ke mesin penyerbuk dengan suhu pemanas 45°C dan lama pemanasan selama 90 jam, berat setelah dipanaskan yaitu 811,21 gram dan berat serbuk yang dihasilkan yaitu 805 gram. Ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70% dengan perbandingan serbuk dan pelarut 1:5. Serbuk kulit salak sebanyak 300 gram di ekstraksi dengan pelarut etanol 70% sebanyak 1,5 liter, kemudian di rendam selama 7 hari dan di aduk setiap 24 jam. Setelah didapatkan filtrat kemudian pelarut diuapkan dengan evaporator hingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 23 gram. c. Pembuatan suspensi Candida albicans Candida albicans yang digunakan diperoleh
dari stok milik
Laboratorium Mikrobiologi Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Candida albicans yang dibiakkan di media sabouraud dextrose agar diambil sebanyak 3-5 koloni menggunakan ose steril kemudian dilarutkan dalam NaCl fisiologis dan diinkubasikan selama 5-8 jam pada 37°C. Suspensi ditambah aquades sebanyak 9 ml sesuai dengan standar konsentrasi kuman 108 CFU/ml.
30
2. Tahap pelaksanaan penelitian a. Plat resin akrilik sebanyak 32 buah dimasukkan dalam satu wadah disterilisasi menggunakan alkohol 70%, kemudian direndam dalam saliva buatan selama 1 jam. b. Kontaminasi plat resin akrilik dengan suspensi Candida albicans selama 24 jam pada 37°C dalam satu wadah. c. Tiga puluh dua plat resin akrilik dibagi ke dalam 2 kelompok, 16 plat resin akrilik sebagai kontrol negatif direndam dalam masing-masing tabung reaksi yang berisi aquades dan 16 plat resin akrilik direndam dalam masing-masing tabung reaksi yang berisi ekstrak kulit salak. d. Plat resin akrilik diambil, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades 1 ml, masing-masing tabung reaksi dikocok menggunakan vortex mixer selama 1 menit. e. Dilakukan pengenceran seri hingga 10-3 dengan cara memasukkan 1 ml tabung pertama ke tabung kedua yang berisi 9 ml aquades, dilakukan berulang hingga tabung ke empat, kemudian diambil 0,01 ml larutan uji dari pengenceran 10-3, kemudian diratakan menggunakan ose steril pada media sabouraud dextrose agar dan di inkubasikan selama 48 jam pada 37°C. f. Perhitungan jumlah koloni Candida albicans dengan rumus :
𝑨𝒏𝒈𝒌𝒂 𝒋𝒂𝒎𝒖𝒓 =
𝑱𝒖𝒎𝒍𝒂𝒉 𝒌𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊 𝑿 𝑭𝒂𝒌𝒕𝒐𝒓 𝒑𝒆𝒏𝒈𝒆𝒏𝒄𝒆𝒓𝒂𝒏 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒉𝒊𝒕𝒖𝒏𝒈
31
Skema Jalannya Penelitian
Plat resin akrilik disterilisasi menggunakan alkohol 70%, kemudian direndam dalam saliva buatan selama 1 jam
Kontaminasi plat resin akrilik dengan suspensi Candida albicans selama 24 jam pada 37°C
16 plat resin akrilik direndam dalam ekstrak kulit salak
16 plat resin akrilik sebagai kontrol negatif direndam dalam aquades
Plat resin akrilik diambil, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades 1 ml, masing-masing tabung reaksi dikocok menggunakan vortex mixer selama 1 menit.
Dilakukan pengenceran seri hingga 10-3
0,01 ml dari hasil pengenceran seri diambil dan ditanam di sabouraud dextrose agar
Perhitungan jumlah koloni Candida albicans Analisis data
32
H. Analisis Data Data yang diperoleh diuji normalitas dengan Shapiro-wilk, kemudian dianalisis menggunakan Independent t-test.
