BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian Penelitian ini menggunakan jenis penelitian eksperimental dengan rancangan pretest post-test dengan kelompok kontrol (pre-test post-test with control group). Pengambilan sampel dilakukan dengan cara Simple Random Sampling.
B. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian telah dilaksanakan di Fakultas Teknologi dan Industri Pangan Universitas Slamet Riyadi Surakarta.Penelitian ini akan dilaksanakan antara bulan Oktober-Desember 2015. C. Populasi dan Subjek Penelitian Populasi pada penelitian ini adalah mahasiswa perokok semester III dan V UNISRI Surakarta yang berusia 18-25 tahun. Subjek penelitian ditentukan secara acak sederhana (simple randomized sampling). Masing-masing subjek dalam populasi diberi nomor, kemudian secara acak diambil sesuai estimasi jumlah sampel. Dalam penelitian ini terdapat dua kelompok yaitu : 1.Kelompok A (kelompok perlakuan) diberikan ektrak ketan hitam dengan dosis 240 mg/hari . Ekstrak pekat dengan kadar antosianin 137,82 mg/ ml , diambil 1,74 ml untuk setiap orang dan diencerkan dengan air gula konsentrasi 20% sampai volume 20 ml (berdasarkan daya terima secara organoleptik) 2.Kelompok B (kelompok kontrol) diberikan sirup kosong berupa larutan gula 20% dengan penambahan pewarna foodgrade hingga mendekati warna ekstrak ketan hitam. Penentuan kriteria sampel dilakukan dengan menggunakan dua jenis kriteria yaitu inklusi dan eksklusi.
23
24
Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah : 1. Telah menjadi perokok aktif selama 2 tahun atau lebih 2. Persetujuan mengikuti penelitian dengan menandatangani informed consent 3. Tidak mengkonsumsi suplemen vitamin / antioksidan selama mengikuti penelitian 4. IMT normal Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah : 1. Terdiagnosis penyakit atau kelainan paru, jantung, dan kelainan metabolik lainnya 2. Tidak bersedia berpartisipasi dalam penelitian 3. Memiliki kebiasaan mengkonsumsi minuman beralkohol
D. Estimasi Besar Sampel Besarnya sampel di ukur dengan rumus : n
=
2 δ2 [ Z1-/2 + Z1- 2 ( 1 - 2 )2
Keterangan : n
= jumlah sampel per kelompok
δ
= standar deviasi ( 0,251 )
δ2
= 0,063
Z1-/2 = tingkat kepercayaan 95% (1,96) Z1-
= power test (1,28)
1
= mean 1= 1,944
2
= mean 2 = 1,504
1 - 2 = 0,44 Berdasarkan data hasil penelitian Mahmood et al. (2007) diketahui standar deviasi sebesar 0.251, Z1-/2 pada tingkat kepercayaan 95% sebesar 1,96, Z1- sebesar 1,28, mean 1= 1,944 dan mean 2 = 1,504. Maka perkiraan jumlah sampel minimal yang dibutuhkan untuk tiap kelompok adalah : n
=
2 (0,251)2 [ 1,96 + 1,28 2 ( 1,944 – 1,504 )2
25
= 6,832 dibulatkan menjadi 7 sampel Berdasarkan rumus di atas maka terhitung jumlah sampel dalam penelitian ini adalah 7 orang, kemudian di tambahkan 4 0% untuk masing-masing kelompok menjadi 10 orang untuk mengantisipasi adanya sampel drop out. Proses randomisasi dilakukan dengan cara undian. Selanjutnya subjek penelitian dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok perlakuan dan kelompok kontrol.
E. Bagan Rancangan Penelitian O 1 Sampel memenuhi kriteria
20 orang subjek penelitian
O 2
Randomisasi
X O 3
0
O 4
2 minggu
Gambar 3.1 Bagan rancangan penelitian Pengaruh Pemberian Ketan Hitam Terhadap Kadar MDA dan Status Antioksidan Total Mahasiswa Perokok Keterangan : O1 =
Observasi awal kelompok kontrol (pemeriksaan kadar MDA dan SAT)
O2 =
Observasi akhir kelompok kontrol (pemeriksaan kadar MDA dan SAT)
O3 =
Observasi awal kelompok perlakuan dan pemberian ketan hitam (pemeriksaan kadar MDA dan SAT)
O4 =
Observasi akhir kelompok perlakuan dan pemberian ketan hitam merah (pemeriksaan kadar MDA dan SAT)
X
=
Pemberian ketan hitam
26
F. Kerangka Alur Penelitian Mahasiswa Smt III & V UNISRI Inklusi Mahasiswa Perokok
Randomisasi
Kelompok Perlakuan
Kelompok Kontrol
Pemeriksaan kadar MDA dan SAT awal
Pemeriksaan kadar MDA dan SAT awal
Tanpa Perlakuan
Pemberian Ekstrak KH
Pemeriksaan kadar MDA dan SAT akhir
Pemeriksaan kadar MDA dan SAT akhir
Analisis Data
Gambar 3.2 Kerangka Alur Penelitian Pengaruh Pemberian Ekstrak Ketan hitam Terhadap Kadar MDA dan Status Antioksidan Total (SAT) mahasiswa perokok
27
G. Variabel Penelitian Klasifikasi variabel diukur menurut tujuan penelitian dan digolongkan dalam beberapa variabel sebagai berikut : 1. Variabel bebas : Ekstrak Ketan Hitam (Oryza sativa var. glutinosa) 2. Variabel tergantung : Variabel tergantung adalah variabel yang akan diteliti, yaitu kadar MDA dan Status Antioksidan Total (SAT) 3. Variabel perancu : Variabel perancu pada penelitian ini adalah asupan bahan makanan, jumlah konsumsi rokok (batang per hari), dan jenis rokok yang akan dipantau melalui Food Recall
H. Definisi Operasional 1. Pemberian ekstrak ketan hitam Pemberian ekstrak ketan hitam pada penelitian ini berupa ektrak ketan hitam dengan kadar antosianin 137,82 mg/ml yang diambil 1,74 ml/orang/hari dengan cara diencerkan dengan larutan gula konsentrasi 10% sampai volume 20 ml air (berdasarkan daya terima secara organoleptik). Tiap pemberian ekstrak ketan hitam berisi antosianin 240 mg. Pemberian sirup ekstrak ketan hitam dilakukan setiap pagi hari antara pukul 07.30-09.00 WIB. Perhitungan dosis tersebut berdasarkan kadar antosianin ektrak ketan hitam yang efektif untuk menurunkan kadar MDA pada penelitian Pramayanti (2011). Parameter : 1. Dikonsumsi 2. Tidak dikonsumsi Skala
: Nominal
2. Malodyaldehid (MDA) MDA merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid di dalam tubuh, dapat pula terbentuk dari dekmposisi asam amino, karbohidrat kompleks, pentose, dan
28
heksosa. MDA merupakan produk yang dihasilkan radikal bebas melalui reaksi ionisasi. Persyaratan & Jenis Sampel
: Whole Blood
Stabilitas Sampel
: 1 hari pada suhu 15 - 30°C atau 7 hari pada suhu 2 - 8°C
Metode
: TBARS
Skala
:kontinu
Satuan
: mmol/ml
3. Status Antioksidan Total (SAT) Status antioksidan total (Total Antioxidant Status) merupakan hasil pengukuran terhadap Kapasitas antioksidan total (Total Antioxidant Capacity / TAC), yaitu pengukuran kemampuan suatu sampel biologis yang terdiri dari beberapa komponen antioksidan. Persyaratan & Jenis Sampel
: Serum atau plasma
Stabilitas Sampel
: 36 jam dengan penyimpanan 2 -8oC 14 hari dengan penyimpanan beku
Skala
: kontinu
Satuan
: mmol/l
I. Instrumen Penelitian Instrumen yang digunakan pada penelitian ini adalah : 1. Formulir food recall. 2. Software analisis asupan bahan makanan dengan nutrisurvey. 3. Surat persetujuan bersedia menjadi subyek penelitian sesuai dengan protokol penelitian. 4. Ketan hitam 5. Satu set perlengkapan pengambilan darah subjek penelitian, kerjasama dengan Poliklinik Universitas Slamet Riyadi Surakarta.
29
6. Satu set perlengkapan analisis kadar MDA subyek penelitian, kerjasama dengan Laboratorium PAU Pangan dan Gizi UGM. 7. Satu set perlengkapan analisis status antioksidan total plasma subjek penelitian, kerjasama dengan Laboratorium PAU Pangan dan Gizi UGM. 8. Buku catatan. 9. Alat tulis
J. Pelaksanaan Penelitian 1. Tahap Persiapan a. Mengurus ethical clearance ke Fakultas Kedokteran UNS/RSUD Dr. Moewardi Surakarta, mengurus perijinan tempat penelitian dan mengurus kerjasama dengan laboratorium Polikinik Universitas Slamet Riyadi Surakarta dan Laboratorium klinik Prodia. b. Seleksi calon subjek penelitian di lingkungan Universitas Slamet Riyadi. c. Pembuatan Ekstrak Ketan Hitam Pembuatan ektrak ketan hitam. Pembuatan ekstrak antosianin dari ketan hitam menggunakan metode maserasi 24 jam (Simanjuntak et al., 2014; Hermawati et al., 2015). Bahan baku ketan hitam dibuat tepung, kemudian ditimbang sebanyak 250 gram dan direndam dengan 500 ml larutan asam sitrat 1% selama 24 jam pada suhu 5oC. Selanjutnya dilakukan penyaringan vakum untuk memisahkan ekstrak antosianin. Setelah itu ekstrak yang terkumpul diuapkan menggunakan Rotary Vacuum Evaporator pada suhu 60oC selama 4 jam, hingga diperoleh ekstrak antosianin pekat dengan kadar antosianin rata-rata 137,82 mg/ml. Ekstrak pekat yang diperoleh disimpan dalam botol gelap dan tetutup. Ekstrak pekat tersebut disimpan pada suhu 5oC sampai digunakan untuk penelitian selanjutnya. d. Pembuatan sirup ektrak ketan hitam sesuai dosis yang diperlukan yaitu 240 mg / hari (Pramayanti, 2011). Berdasarkan perbandingan kadar antosianin ektrak yang diperolah dengan dosis yang diperlukan, maka diketahui jumlah ektrak ketan hitam yang diperlukan untuk setiap subjek adalah 1,74 ml/hari.
30
e. Pengujian Kadar Antosianin ekstrak ketan hitam. Kadar antosianin ekstrak ketan hitam dianalisis menggunakan metode sprektrofotometri (Giusti dan Worstald (2001). Pada metode ini kadar antosianin dihitung berdasarkan perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 700 nm dan 512 nm pada pH 1 dan pH 4,5 (Lampiran 6) f. Uji organoleptik untuk mengetahui daya terima terhadap ektrak ketan hitam Uji organoleptik dilakukan dengan melibatkan 30 orang panelis terlatih yang terdiri dari mahasiswa semester V Fakultas Teknologi Industri Pangan yang telah mengikuti mata kuliah dan praktikum Uji Sensoris. Ektrak ketan hitam yang diujikan berupa 1,74 ml ektrak yang telah diencerkan dengan 20 ml air gula 0%, 10 %, 15%, 20% dan 25%.
2. Tahap Pelaksanaan a. Semua responden yang menjadi sampel penelitian diambil darahnya sebelum dilakukan penelitian untuk diperiksa kadar MDA dan SAT. b. Semua sampel diberikan penjelasan tentang penelitian yang dilakukan . Pada kelompok perlakuan, diberikan ekstrak ketan hitam dengan dosis 240 mg antosianin /orang/hari. Pemberian ekstrak ketan hitam dilakukan setiap hari selama 14 hari. Penetapan 14 hari perlakuan berdasarkan dosis pemeliharaan short-term step up (GINA, 2015). c. Melakukan food recall dengan dibantu oleh enumerator berpengalaman yang ditunjuk dengan kriteria minimum berpendidikan d3 gizi. Food recall menggunakan formulir standar yang telah disiapkan (terlampir). Food recall dilaksanakan 3 kali selama penelitian yaitu pada hari ke-1, hari ke-7 dan hari ke-14. d. Pemberian ektrak ketan hitam dilakukan setiap hari di Laboratorium Bakery Fakultas Teknologi dan Industri Pangan pada pagi hari (pk. 07.30-09.00) sebelum subjek mengikuti perkuliahan.
31
e. Setelah 14 hari dilakukan intervensi, semua sampel penelitian dilakukan pemeriksaan kadar MDA dan SAT. Pengambilan sampel darah dilakukan siang hari pada pukul 13.00 – 14.00.
K. Tehnik Analisis Data Data yang terkumpul dikelompokkan berdasarkan perlakuan, diberi kode dan dimasukkan dalam file komputer. Data dianalisis secara statistik dengan menggunakan program SPSS 20.0 dengan urutan : a. Uji normalitas data dengan menggunakan uji Saphiro Wilk untuk kadar MDA dan SAT. b. Analisis data perbedaan mean dalam satu kelompok menggunakn uji paired ttest untuk mengetahui perbedaan rerata pre-test dan post-test dalam satu kelompok setelah dilakukan perlakuan. c. Analisis data perbedaan mean antara dua kelompok perlakuan dan kelompok kontrol dianalisis dengan uji independent t-test untuk mengetahui perbedaan selisih rerata pretest dan post test antara kelompok yang diberi perlakuan berbeda. d. Analisis pengaruh jumlah konsumsi rokok per hari, asupan vitamin A, asupan vitamin C, dan asupan vitamin E terhadap perubahan kadar MDA dan SAT e. Batas derajat kemaknaan yang akan dicapai adalah p < 0,05 dan confidence interval sebesar 95 %. f. Asupan gizi dari makanan hasil Food Recall dianalisis dengan menggunakan program Nutri Survey.
